DE69105811T2

DE69105811T2 - Verfahren zur Extraktion von bestimmten Nukleinsäurefragmenten.

Info

Publication number: DE69105811T2
Application number: DE69105811T
Authority: DE
Inventors: Toshihiko Kishimoto; Shin-Ichiro Niwa; Atsushi Uno
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1990-05-17
Filing date: 1991-05-17
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2011-05-18
Also published as: EP0457343B1; CA2042808A1; DE69105811D1; EP0457343A1; CA2042808C; US5252724A; RU2060278C1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion eines besonderen Nukleinsäurefragmentes aus einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäuregemisch.
Heutzutage ist mit dem Fortschritt bei der genetischen Ingenieurtechnik die Notwendigkeit auf verschiedenen Gebieten, einschließlich der Medizin und der Landwirtschaft, gestiegen, ein besonderes Nukleinsäurefragment aus einer Nukleinsäure oder aus Nukleinsäuregemischen zu extrahieren oder abzutrennen. Ein Verfahren zur Extraktion eines besonderen Nukleinsäurefragmentes, das eine bekannte Basensequenz enthält, aus einer Nukleinsäure oder aus Nukleinsäuregemischen ist bereits bekannt (Cell Engineering, Bd.1, Nr.7, 1989). Nach dem bekannten Verfahren werden zwei oder drei verschiedene Sonden, jede aus 20 bis 30 Basen bestehend, auf der Grundlage der Basensequenz eines interessierenden Nukleinsäurefragmentes hergestellt. Diese Sonden werden dann an ihrem Terminal an einen Träger, wie einen Gel oder einer Membran, über eine kovalente Bindung angebracht, wodurch immobilisierte Sonden gebildet werden. Andererseits wird eine Nukleinsäure, die das gewünschte Nukleinsäurefragment enthält, zusammen mit anderen Nukleinsäuren aus Zellen gesammelt, gefolgt von einer Wärmedenaturierung. Die wärmedenaturierten Säuren werden mit den immobilisierten Sonden für eine Hybridisierung gemischt, wonach die so hybridisierten Sonden durch Zentrifugieren wiedergewonnen werden. Die so gewonnenen immobilisierten Sonden werden wärmebehandelt, wonach die Nukleinsäure, die das gewünschte Nukleinsäurefragment enthält, mittels Elektrophorese gewonnen wird.
Das zuvor genannte Verfahren hat die folgenden Nachteile:
1. Bei den immobilisierten Sonden besteht die Möglichkeit der Hybridisierung mit unerwünschten Fragmenten, da sie hergestellt werden über die Verwendung eines Teiles der Sequenz des gewünschten Nukleinsäurefragmentes. Deshalb ist die Selektionseffektivität gering. Zusätzlich fehlt diesem Verfahren die Einfachheit und Anwendbarkeit, da es auf die Extraktion von Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz beschränkt ist.
2. Die Hybridisierung der gesammelten DNA's mit den immobilisierten Sonden wird nur einmal durchgeführt unter Verwendung von nur einer Zielsequenz, d.h. der Komplementärsequenz, daher ist die Genauigkeit gering.
3. Die Rückgewinnung eines Nukleinsäurefragments durch Elektrophorese erfordert einen komplizierten Vorgang und viel Zeit.
Die vorliegenden Erfinder haben eine Untersuchung durchgeführt, um die Nachteile des oben genannten konventionellen Verfahrens zu überwinden und haben die vorliegende Erfindung auf der Basis der Erkenntnis gemacht, daß ein Nukleinsäurefragment, das die gewünschte Nukleinsäuresequenz enthält, mit hoher Effektivität extrahiert werden kann durch Verdauung einer Nukleinsäure oder eines Nukleinsäuregemisches mit Restriktionsenzymen, die so ausgewählt sind, daß sie die Nukleinsäure oder -säuren in der Weise verdauen, daß ein die gewünschten verschiedenen Restriktionsenden am 5'- und 3'-Terminal tragendes Nukleinsäurefragment erhalten wird, Ligasieren von zwei verschiedenen DNA-Linkern an jedes dieser Restriktionsenden und Durchführung einer zweimaligen Hybridisierung unter Verwendung der immobilisierten Sonden, die zu den entsprechen Linkern komplementär sind.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Extraktion eines besonderen Nukleinsäurefragmentes, das eine interessierende Nukleinsäuresequenz enthält, aus einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäuregemisch, das die Stufen umfaßt:
(1) Verdauung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäuregemisches mit Restriktionsenzymen, um ein Gemisch von Nukleinsäurefragmenten zu erhalten, wobei die Restriktionsenzyme bestehen aus (A) zwei unterschiedlichen Enzymen, die zur Produktion des besonderen Nukleinsäurefragmentes in der Lage sind, das die vorbestimmten und verschiedenen Restriktionsenden an seinen 5'- und 3'-Terminals trägt, und (B) ein oder mehreren von (A) verschiedenen Restriktionsenzymen, für die das besondere Nukleinsäurefragment keine relevanten Restriktionsstellen enthält;
(2) Herstellung von zwei verschiedenen DNA-Linkern, die zur Bindung an die entsprechenden Restriktionsenden des besonderen Nukleinsäurefragmentes in der Lage sind;
(3) Reaktion der Linker mit dem Gemisch der Nukleinsäurefragmente;
(4) Unterwerfen des erhaltenen Reaktionsgemisches der ersten Hybridisierung mit einer immobilisierten Sonde, die zu einem der Linker komplementär ist;
(5) Isolieren des hybridisierten Nukleinsäurefragmentes von der Sonde;
(6) Unterwerfen des isolierten Nukleinsäurefragmentes der zweiten Hybridisierung mit einer immobilisierten Sonde, die zu dem anderen Linker komplementär ist; und
(7) Isolieren des hybridisierten Nukleinsäurefragmentes von der Sonde.
Die vorliegende Erfindung wird nun nachfolgend detaillierter beschrieben.
Der Begriff "eine Nukleinsäure oder Nukleinsäuregemische" betrifft eine einzelne DNA oder ein DNA-Gemisch, das aus Zellen gesammelt wird. Der Begriff "Nukleinsäure" bedeutet primär sowohl DNA als auch RNA, obgleich er manchmal verwendet wird, die DNA zu bezeichnen, wo es aus dem Kontext keine Möglichkeit des Mißverständnisses gibt.
Der Begriff "ein besonderes Nukleinsäurefragment, das eine interessieren Nukleinsäuresequenz enthält" oder "ein gewünschtes Nukleinsäurefragment" bezieht sich auf ein Fragment oder auf Fragmente, die aus der gewünschten Nukleinsäuresequenz bestehen, und auch auf ein Fragment oder auf Fragmente, die sowohl zusätzliche Sequenzen enthalten, die von den Linkern oder ähnlichem abgeleitet sind als auch die gewünschte Nukleinsäuresequenz, wobei zusätzliche Sequenzen gegenüber der gewünschten Nukleinsäuresequenz keine nachteilige Wirkung hervorrufen.
Der Begriff "Restriktionsende(n)" bedeutet das 5'- und/oder das 3'-Ende eines gegebenen Nukleinsäurefragmentes, das durch Verdauung der Nukleinsäure mittels Restriktionsenzym(en) gebildet wird.
Der Begriff "Extrakt" oder "Extrahieren" in dieser Beschreibung bedeutet die Abtrennung und Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragmentes aus einer Nukleinsäure oder aus einem Gemisch von Nukleinsäuren, oder die Konzentration des gewünschten Nukleinsäurefragmentes aus einem Gemisch verschiedener Nukleinsäurefragmente, die durch Verdauung der Nukleinsäure oder -säuren mit Restriktionsenzymen erhalten wurden.
Das neue Verfahren zur Extraktion eines Nukleinsäurefragmentes nach der vorliegenden Erfindung umfaßt die folgenden Stufen:
i) Ein zu extrahierendes Nukleinsäurefragment wird bestimmt.
ii) Eine oder mehrere Nukleinsäuren, in denen der gewünschte Nukleinsäurefragmentteil enthalten ist, werden mit Restriktionsenzymen behandelt, die so ausgewählt sind, daß das interessierende Nukleinsäurefragment enthalten wird, wobei die Selektion der Restriktionsenzyme wie folgt durchgeführt wird: (1) zwei unterschiedliche Restriktionsenzyme werden ausgewählt, so daß sie unterschiedliche Restriktionsenden an dem 5'- und 3'- Terminal des gewünschten Nukleinsäurefragmentes ergeben; und (2) ein anderes oder mehrere andere Restriktionsenzym(e), für die das gewünschte Nukleinsäurefragment keine Restriktionsstelle(n) enthält wird, hinzugegeben, um die Möglichkeit zu verringern, daß ungewünschte Fragmente die gleichen Restriktionsenden haben können, wie jene des gewünschten Fragmentes.
iii) Zwei unterschiedliche Linker, die zum spezifischen Binden an die Restriktonsenden des gewünschten Nukleinsäurefragmentes in der Lage sind, werden zu den oben erhaltenen Nukleinsäurefragmente hinzugesetzt.
iv) Jedem der Linker wird gestattet, an das entsprechenden Restriktionsende durch Zugabe von DNA-Ligase zu ligasieren.
v) Eine jedem der beiden Linker komplementäre Sonde wird auf einem Träger immobilisiert, um eine immobilisierte Sonde zu bilden.
vi) Die in Stufe iv) erhaltene Lösung wird einer Denaturierungsbehandlung unterworfen.
vii) Die einem der Linker komplementäre immobilisierte Sonde, die in Stufe v) hergestellt wurde, wird zu der Lösung von Stufe vi) zugegeben, und man läßt sie zur Durchführung der Hybridisierung stehen.
viii) Die immobilisierte Sondenphase wird rückgewonnen und einer Denaturierung unterworfen, und anschließend werden die hybridisierten Nukleinsäurefragmente zurückgewonnen.
ix) Die in Stufe viii) erhaltenen Nukleinsäurefragmente werden dazu verwendet, die zuvor genannten Stufen vi), vii) und viii) zu wiederholen unter Verwendung der anderen immobilisierten Sonde, die komplementär zu dem anderen Linker ist, hergestellt in Stufe v).
Die für das obige Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Linker können einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäurelinker sein, die an ihrem Ende eine spezifische Basensequenz haben, die zur Wiederverbindung mit jedem der beiden Restriktionsenden in der Lage sind, die durch die Aktion der ausgewählten Restriktionsenzyme gebildet werden. Zu derartigen Linkern gehören natürlich auftretende einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, die entsprechend geschnitten oder denaturiert sein können. Derartige Linker können auch nach einem der Verfahren synthetisiert werden, die für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel können sie unter Verwendung eines DNA-Synthetisators, hergestellt von Applied Biosystems Inc., gemäß den dazugehörigen Instruktionen hergestellt werden. Wenn die Restriktionsenzyme, die zur Bereitstellung von gleichen Restriktonsenden an den 5'- und 3'-Terminals des gewünschten Nukleinsäurefragmentes ausgewählt werden, Eco RI und Pst I sind, können die zu verwendenden Linker solche sein, die die folgenden Basensequenzen haben:

Eco RI-Linker

5' GCAACCATGCCTAAGTTTG 3'
3' CGTTGGTACGGATTCAAACTTAA 5'

Pst I-Linker

5' TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCA 3'
3' AAGGCATACCGTACGGAGGG 5'
Die in dem Verfahren vorliegenden Erfindung verwendeten Sonden können Nukleinsäurefragmente sein, die wenigstens teilweise den Linkern komplementär sind, die eine vorbestimmte Basensequenz haben. Zu solchen Nukleinsäurefragmenten gehört natürlich auftretende einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, die entsprechend geschnitten oder denaturiert ist, und künstlich synthetisierte DNA oder RNA. Zum Beispiel können die Sonden erhalten werden durch Synthetisierung eines DNA-Moleküls, das dem gesamten oder einem Teil der Linker-DNA-Sequenz komplementär ist. Die als Sonden verwendeten DNA-Fragmente können ein einzel- oder doppelsträngiges Molekül sein. Wenn als Sonde eine doppelsträngige DNA verwendet wird, kann sie nach der Immobilisierung denaturiert werden. Die Sonde enthält am 5'-Terminal eine DNA-Sequenz, die dazu geeignet ist, die Sonde an einen Träger zu binden. Zum Beispiel ist Amino-Link II (erhältlich von Applied Biosystems Inc.) im unten beschriebenen Beispiel ein typisches Beispiel für diese Sequenz.
Der für die Herstellung von immobilisierten Sonden verwendete Träger wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Teilchen und Membranen besteht. Spezielle Beispiele der Membranen sind natürliche oder synthetische organische Polymermembranen (z.B. Nylon-Membran, Nitrocellulose- Membran, Polytetrafluorethylen-Membran, Polyethylen-Membran usw.). Zu anderen Beispielen gehören anorganische Polymermembranen (z.B. Graphit, poröses Glas, Siliciumdioxid usw.), Metallmembranen (z.B. Aluminium, Apatit usw.), keramische Membranen (z.B. Aluminiumoxid, Siliciumnitrid usw.) und NaCl-Kristalle, die alle chemisch oder physikalisch an der Oberfläche modifiziert werden können.
Spezielle Beispiele der Teilchen sind organische Polymerteilchen (z.B. Nylon, Nitrocellulose, Cellulose, Polytetrafluorethylen, Polyethylen usw.), anorganische Polymerteilchen (z.B. Graphit, poröses Glas, Siliciumdioxid usw.), Metallteilchen (z.B. Aluminium, Apatit usw.) und keramische Teilchen < z.B. Aluminiumdioxid). Diese Teilchen können angewandt werden, nachdem sie dicht auf einer Oberfläche eines entsprechenden Objektes dispergiert worden sind.
Die oben genannten organischen Polymeren können nach Oxidation, Reduktion oder Hydrolyse oder nach physikalischer Behandlung wie Plasmabestrahlung verwendet werden. Die Oberfläche der anorganischen Teilchen, der Metallteilchen und der keramischen Teilchen kann chemisch oder physikalisch vor der Verwendung modifiziert werden, zum Beispiel durch Ionenplattieren.
Weiterhin können die Träger ein Gel sein, wie Agarose-Gel, Polyacrylamid-Gel und solche in getrockneter Form oder in hochviskosem Zustand.
Die bevorzugte Teilchengröße der oben genannten Teilchen kann 0,1 um bis 500 um sein, am bevorzugtesten 1 um bis 100 um, um eine leichtere Dispersion in einer Probenlösung und eine leichtere Rtickgewinnung durch Zentrifugieren zu sichern. Allerdings sind die oben genannten Größendimensionen nicht kritisch, solange die eingesetzten Teilchen keine nachteilige Wirkung auf die Reaktion zwischen der immobilisierten Sonde und der Probe sowie bei der Rückgewinnung der immobilisierten Sonde ausüben.
Ein Verfahren zum Binden einer Probe an einen Träger ist bekannt und wird unter bekannten Bedingungen durchgeführt. Somit kann das Bindungsverfahren unter denen ausgewählt werden, die unten aufgeführt sind in Abhängigkeit von der Art der chemischen Modifizierungen bei der besonderen Sonde und bei dem angewandten Trager.
1. Die Hydroxygruppe, vorzugsweise eine Diol-Gruppe, an der Nukleinsäuresonde oder am Träger wird aktiviert, und die aktivierte Hydroxygruppe wird mit der Aminogruppe am Träger oder an der Sonde umgesetzt. Die Mittel für die Aktivierung der Hydroxygruppe schließen ein: Trifluorethansu1fonylchlorid (nachfolgend als Tresylchlorid bezeichnet) (K. Nillson und K. Mosbach, Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, 449, 1981), CNBr (R. Axen et al., Nature 214 1302, 1967), Trichlortriazin (T. H. Finlay et al., Anal. Biochem., 87 77, 1978), Epichlorohydrin (I. Masumoto et al., J. Biochem., 85 1091, 1979), Bisoxiran (L. Sundberg und J. Porath, J. Chromatogr., 90 87, 1974), Divinylsulfonsäure (J. Porath, Meth. Enzymol., 34 27, 1974), Benzochinon (J. Brandt et al., Biochem. Biophys. Acta., 386 196, 1975) und Carbonyldiimidazol (G. S. Bethell et al., J. Biol. Chem., 254 2572, 1979).
2. Die Carboxygruppe an der Nukleinsäuresonde oder am Träger wird aktiviert, und die aktivierte Carboxygruppe wird mit der Aminogruppe am Träger oder an der Sonde umgesetzt. Die für die Aktivierung der Carboxygruppe verwendeten Mittel schließen Carbodiimide ein, wie wasserlösliche Carbodiimide (A. Tengblad, Biochem. J., 199 297, 1981; M. Funabashi et al., Anal. Biochem., 126 414, 1982) und 2-Ethoxy-1- ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin (EEDQ) (G. Saccomani et al., J. Biochem., 256 12405, 1981; B. Bellenau und G. Malek, J. Am. Chem. Soc., 90 1651, 1968).
3. Die gewünschte DNA-Sonde wird unter Verwendung von DNA- Ligase an eine Nukleinsäure geknüpft, die bereits an einen Träger mittels eines nicht speziellen üblichen Verfahrens gebunden ist.
4. Die Sonde wird an dem Träger durch Reaktion zwischen der Hydrazid-Gruppe und der Aldehydgruppe oder der Hydrazid- Gruppe und der Carboxy-Gruppe gebunden. Die Reaktion zwischen der Hydrazid-Gruppe und der Aldehyd-Gruppe führt zu einer Hydrazon-Gruppe, die nachfolgend reduziert wird, um eine kovalente Bindung (Jonathan N. Kremsky et al., Nucleic Acid Research 1987, Bd. 15, S. 2891) zu bilden. Die Reaktion zwischen der Hydrazid-Gruppe und der Carboxy-Gruppe kann in Gegenwart von oben beschriebenen Carbodiimiden durchgeführt werden.
5. Die Sonde wird an den Träger durch Einführung einer bestimmten Gruppe (zum Beispiel Biotin) in einen von beiden und einer anderen Gruppe (zum Beispiel Avidin), mit Affinität dazu, in den anderen gebunden, und nachfolgend läßt man diese Gruppen reagieren (Jonathan N. Kremsky et al., siehe oben).
6. Die Thiol-Gruppen an sowohl der Sonde als auch am Träger werden aktiviert, und man läßt sie miteinander reagieren (K. Bocklehurst et al., Biochem. J., 133, 573, 1993).
7. Die Amino-Gruppen an sowohl der Sonde als auch am Träger läßt man nach dem Bromacetamid-Verfahren reagieren (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245, 3059, 1970).
8. Die Sonde wird an den Träger über eine nicht spezifische Absorption oder über elektrostatische Absorption gekoppelt.
Ein detaillierteres Verfahren zur Kopplung einer Sonde an einen Träger ist unten aufgeführt.

Verwendung von einzelsträngiger DNA

Wenn eine DNA-Sonde eine oder mehrere Extranukleotidmoleküle an dem Terminal hat, oder wenn sie chemisch modifizierte Nukleotidmolekül(e) an dem Ende hat, können die Extranukleotidmolekül(e) oder die modifizierten Nukleotidmolekül(e) für die Bindung an einen Träger verwendet werden. Zu diesem Zweck kann nach dem folgenden Verfahren gearbeitet werden.
1) Eine einzelsträngige DNA, die am Terminal eine für die Immobilisierung geeignete Gruppe trägt, wie -NH&sub2; oder -COOH, wird in folgender Weise hergestellt. Wenn die DNA künstlich synthetisiert wurde, kann ein handelsüblicher DNA- Synthetisator (zum Beispiel ABI Corp., Typ 391, PCR-Mate) verwendet werden. Die Einführung der funktionellen Gruppe kann nach einem der folgenden Verfahren durchgeführt werden.
i) Die Hexylamino-Gruppe kann in das Terminalmolekül der DNA-Sonde unter Verwendung eines DNA-Synthetisators nach dem folgenden Reaktionsschema eingeführt werden (siehe User Bulletin, Nr. 49, August 1988, herausgegeben von der ABI Corp.).
ii) Der folgende Linker kann an das Terminal einer DNA- Sonde unter Verwendung eines DNA-Synthetisators (zum Beispiel ABI Corp., Typ A-391 EP PCR-MATE) eingeführt werden, und das Terminal des Linkers kann zu einer Aldehyd- oder Carboxy-Gruppe umgewandelt werden.
Die gebildete Aldehydgruppe am Terminal des Linkers kann mit einer Hydrazid-Verbindung von Biotin umgesetzt werden, um ein Biotin herzustellen, das zur speziellen Reaktion mit einem Avidin in der Lage ist, um einen Komplex zu bilden (Jonathan N. Kremsky et al., siehe oben).
iii) Eines bis einige zehn Nukleotide mit einer Aminogruppe können an das Ende der DNA-Sonde unter Verwendung eines DNA-Synthetisators angefügt werden.
iv) Eine für die Verknüpfung mit einem Träger oder dessen reaktivem Derivat geeignete Base kann in das Terminal der DNA-Sonde unter Verwendung von Terminaltransferase (Deug G. und Wu R., Methods in Enzymology, Bd. 100, S. 96-116, 1983) eingeführt werden.
2) Eine einzelsträngige DNA, die komplementär ist zu dem einzelsträngigen DNA-Sondenteil in der obigen Stufe 1, wird unter Verwendung des gleichen DNA-Synthetisators wie in Stufe 1 hergestellt, und die beiden DNA's werden wieder verbunden, um eine doppelsträngige DNA zu bilden.
3) Ein Träger wird an die doppelsträngige DNA gebunden, um eine immobilisierte doppelsträngige DNA-Sonde zu bilden.
4) Die immobilisierte doppelsträngige Sonde wird durch Wärme denaturiert (etwa 40º C oder darüber) oder durch eine Alkalizugabe in einer wäßrigen Salzlösung, wie einer wäßrigen 2,4 M Tetraethylammoniumchloridlösung, entsprechend verdünnt 10 x SSC (1,5 M NaCl und 0,15 M Natriumcitrat; pH 7,0), oder mit wäßriger 0,1 bis 2 M NaCl Lösung. Das Gemisch wird zentrifugiert, und eine immobilisierte einzelsträngige DNA wird als feste Phase zurückgewonnen.

Verwendung von doppelsträngiger DNA

Wenn eine doppelsträngige DNA eine oder mehrere der Extranukleotidmoleküle an dem Terminal von einem der Stränge enthält, kann die DNA an ihrem Ende mit einem Träger mit oder ohne chemische Modifizierung der Extranukleotidmoleküle verknüpft werden. Die resultierende immobilisierte doppelsträngige DNA-Sonde kann der oben genannten Stufe 4) unterworfen werden, um eine immobilisierte einzelsträngige DNA-Sonde zu erhalten.
Die oben genannte doppelsträngige DNA, die Extranukleotidmoleküle an dem Ende von einem der Stränge enthält, kann unter Verwendung einer der unten aufgeführten Verfahren hergestellt werden.
i) Eine für die Verknüpfung geeignete Base mit einem Träger oder dessen reaktivem Derivat kann in das Terminal von nur einer der beiden Stränge unter Verwendung von Terminaltransferase eingeführt werden.
ii) Eine doppelsträngige DNA kann mit einem Restriktionsenzym verdaut werden, so daß ein einzelsträngiger Teil an dem Ende gebildet wird.
iii) Ein DNA-Molkül mit einer funktionellen Gruppe kann an eine doppelsträngige DNA unter Verwendung von DNA-Ligase geknüpft werden. Zum Beispiel wird eine doppelsträngige DNA mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen verdaut, so daß die DNA unterschiedliche Restriktionsenden an den Terminals hat. Zu der verdauten DNA wird eine DNA hinzugegeben, die eine funktionelle Gruppe trägt und die zum speziellen Binden an eines der oben angeführten Restriktonsenden in der Lage ist. Die Zugabe von DNA-Ligase zu dem erhaltenen Gemisch führt zu einer gewünschten doppelsträngigen DNA mit einer funktionellen Gruppe an dem Terminal.
In dem obigen Verfahren kann das 5'-Terminal von einem der Stränge, der nachfolgend entfernt wird, dephosphorylisiert werden. Somit wird eine lange doppelsträngige DNA, bei der einer der Terminals einen verlängerten Einzelstrang hat, hergestellt, und anschließend wird das 5'-Terminal unter Mitwirkung eines Dephosphorylisierungsenzyms dephosphorylisiert. Die erhaltene DNA wird anschließend verdaut, um ein gewünschtes DNA-Fragment mit einem dephosphorylisierten 5'-Terminal zu haben.
iv) Eine doppelsträngige DNA wird am 3'-Terminal durch Einführung von Trichlortriazin in die OH-Gruppe am 3'- Terminal aktiviert. Wenn gewünscht wird, daß die -OH-Gruppe am 5'-Terminal aktiviert wird, wird die in der obigen Stufe iii) genannte Dephosphorylisierungsbehandlung zuerst durchgeführt, gefolgt von der Reaktion mit Trichlortriazin.
Da die -OH-Gruppe am 5'-Terminal reaktionsfähiger ist als die am 3'-Terminal, kann die zuerst genannte vorzugsweise und exklusiv aktiviert werden.
Nachdem das gewünschte Nukleinsäurefragment, das an den DNA- Linker gebunden ist, mit der immobilisierten Sonde hybridisiert wurde, kann die immobilisierte Sonde durch übliche Verfahren zurückgewonnen werden, wie 1) Zentrifugierung, 2) Filtration, 3) Sedimentierung und 4) Entfernung der überstehenden Flüssigkeit.
Die Denaturierung, die zur Abtrennung des gewünschten Nukleinsäurefragmentes von der immobilisierten Sonde durchgeführt wird, kann erreicht werden durch 1) Wärmedenaturierung (üblicherweise bei einer Temperatur von 60º C bis 95º C), 2) Alkalidenaturierung (üblicherweise durch Zugabe von NaOH zu einer Endkonzentration von etwa 1- Normal (1N)) und 3) Denaturierung durch Zugabe von Formaldehyd, Harnstoff oder ähnlichem. Eine entsprechende Kombination dieser kann ebenfalls eingesetzt werden.
Wie oben beschrieben, besteht das Wesentliche des Verfahrens der vorliegenden Erfindung darin, daß das gewünschte Nukleinsäurefragment, das die gewünschte Sequenz enthält, an beiden Terminals besondere Restriktionsenden hat, die voneinander abweichen, und daß das gewünschte Nukleinsäurefragment einer zweimaligen Hybridisierung unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Sonden unterworfen wird, wobei jede von ihnen zu einem der Linker komplementär ist, die an die Restriktionsenden des Fragmentes gebunden sind.
Somit ist nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Hybridisierungseffektivität sehr hoch, da Sonden verwendet werden, die komplementär zu den vorgewählten Linkern sind. Zusätzlich kann das gewünschte Nukleinsäurefragment mit hoher Reinheit erhalten werden, da zwei Hybridisierungen unter Verwendung einer unterschiedlichen Sonde bei jedem Mal durchgeführt werden, wobei die Sonde zu einer von zwei unterschiedlichen Linkern komplementär ist, die an das gewünschte Fragment gebunden sind. Als Ergebnis kann die Extraktion mit hoher Effektivität bei einfachem Verfahrensgang durchgeführt werden. Darüber hinaus ist das Verfahren, da die Extraktion auf der Hybridisierung von Linkern mit Sonden beruht, unabhängig von der Basensequenz des interessierenden Nukleinsäurefragmentes, und es ist auch leicht, die Reaktionsbedingungen einzuhalten. Dies zeigt, daß es mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich sein kann, ein DNA-Fragment zu extrahieren, dessen Basensequenz nicht bekannt ist.
Darüber hinaus ist es nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich, ein Nukleinsäurefragment ohne Einsatz komplizierter und zeitaufwendiger Mittel wie Elektrophorese zurückzugewinnen.
Die folgenden detaillierten Beispiele dienen der Erläuterung bestimmter spezieller Ausführungsformen der Erfindung.
In der dazugehörigen Zeichnung Fig. 1 ist eine vollständige Restriktionsmappe des Plasmids pBR322 gezeigt.

Beispiel 1 Extraktion des Eco RI-Pst I-Fragmentes vom Plasmid pBR322

Dieses Beispiel erläutert eine Extraktion des gewünschten Nukleinsäurefragmentes (nachfolgend als Fragment A bezeichnet) nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei das Fragment A ein Teil des Plasmids pBR322 ist, abgeleitet aus E. coli.

1) Bestimmung der Restriktionsstellen an beiden Enden des Fragmentes A und Verdauung von pBR322

Die Restriktionsmappe von pBR322 ist unter Fachleuten bekannt und in der dazugehörigen Zeichnung Fig. 1 gezeigt. In dieser Zeichnung zeigt die schraffierte Fläche das gewünschte Fragment A. Die für die Verdauung von pBR322 verwendeten Restriktionsenzyme sind eingekästelt. Aus der Restriktionsmappe kann entnommen werden, daß die beiden Enden des Fragmentes A mit den Restriktionsenzymen Pst I und Eco RI verdaut werden können, und daß es keine Sal I-, Bal I- und Pvu II-Stellen im Fragment A gibt. Daher kann die Behandlung von pBR322 mit den genannten fünf Restriktionsenzymen nicht irgendwelche andere Fragmente außer dem Fragment A produzieren, das an seinen beiden Enden Pst I- und Eco RI-Restriktionsenden hat.
Somit wurde pBR322 mit Eco RI, Sal I, Pst I, Pvu II und Bal I in der unten beschriebenen Weise behandelt, und man erhielt ein Gemisch von Nukleinsäurefragmenten, die das Fragment A enthielten. Die verwendeten Restriktionsenzyme sind alle von Takaru Shuzo Co. erhältlich. Die detaillierte Verfahrensweise ist unten beschrieben.
Zuerst ließ man das Reaktionsgemisch 1, das die im folgenden beschriebene Zusammensetzung hat, bei 37º C für eine Stunde reagieren, gefolgt von einer Wärmebehandlung bei 60º C für fünf Minuten, um die Reaktion abzuschließen. Eine Phenolextraktion wurde durchgeführt, und der Extrakt wurde anschließend einer Ethanol-Fällung unterworfen, gefolgt von einem Trocknen. Reaktionsaemisch 1: Zusammensetzung Gehalt pBR322 Eco RI Pst I Sal I Hochkonzentrierter Salzpuffer (Takaru Shuzo) H&sub2;O Gesamt (x10 konz.)
Als nächstes wurde zur weiteren Verdauung mit dem Restriktionsenzym Pvu II die oben erhaltene getrocknete DNA in 16 ul Wasser gelöst, und man ließ sie bei 37º C für eine Stunde in dem Reaktionsgemisch 2 reagieren, das die folgende Zusammensetzung hatte, gefolgt von einer Wärmebehandlung bei 60º C für fünf Minuten, um die Reaktion abzuschließen. Die Phenolextraktion wurde durchgeführt, und der Extrakt wurde anschließend einer Ethanol-Fällung unterworfen, gefolgt von einem Trocknen. Reaktionsgemisch 2: Zusammensetzung Gehalt DNA-Lösung Salzpuffer mittlerer Konzentration (Takaru Shuzo) Pvu II Gesamt (x 10 konz.)
Zum Zwecke der weiteren Verdauung mit Bal I wurden die erhaltene getrocknete DNA in 35 ul Wasser gelöst, und man ließ sie bei 37º C für eine Stunde in dem Reaktionsgemisch 3 reagieren, das die folgende Zusammensetzung hatte, gefolgt von einer Wärmebehandlung bei 60º C für fünf Minuten, um die Reaktion abzuschließen. Die Phenolextraktion wurde durchgeführt, und der Extrakt wurde anschließend einer Ethanol-Fällung unterworfen, gefolgt von einem Trocknen. Reaktionsaemisch 3: Zusammensetzung Gehalt DNA-Lösung Bal I-Puffer (Takaru Shuzo) Gesamt (x 10 konz.)

2) Herstellung der DNA-Linker 2a) Herstellung des Eco RI-Linkers

Ein Eco RI.Linker mit der folgenden Sequenz wurde synthetisiert.

Eco RI-Linker

5' GCAACCATGCCTAAGTTTG 3'
3' CGTTGGTACGGATTCAAACTTAA 5'
Die obigen beiden einzelsträngigen DNA-Moleküle, die einander komplementär sind, wurden unter Einsatz eines DNA- Synthetisators (391 PCR-MATE, Modell EP), der von Applied Biosystems Inc. erhältlich ist, gemäß der Beschreibung im dazugehörigen Handbuch synthetisiert. Anschließend wurden die synthetisierten DNA-Moleküle durch eine Schneide- Reinigung, die im Handbuch beschrieben ist, gereinigt.
Die gereinigten einzelsträngigen DNA-Moleküle (jeweils 1 ug/ul in Wasser, 5 ul) wurden miteinander vermischt, und man ließ sie bei 30º C für eine Stunde für die Reassoziierung stehen, wodurch man ein doppelsträngiges DNA-Molekül erhielt. Anschließend wurde das 5'-Ende des erhaltenen doppelsträngigen DNA-Moleküls phosphoryliert. Die Phosphorylierung wurden bei 37º C für eine Stunde in dem folgenden Reaktionsgemisch 4 durchgeführt, und anschließend wurde die Reaktion durch Wärmebehandlung bei 65º C für fünf Minuten beendet. Reaktionsgemisch 4: Zusammensetzung Gehalt doppelsträngige DNA T 4 Polynukleotidkinase x 10 T4-Kinasepuffer 10 mM ATP (gamma-³²P) ATP H&sub2;O Gesamt

2b) Herstellung von Pst I-Linker

Es wurde ein Pst I-Linker mit der folgenden Sequenz synthetisiert.

Pst I-Linker

5' TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCA 3'
3' AAGGCATACCGTACGGAGGG 5'
Die DNA-Synthese, Reinigung und Reassoziierung der einzelsträngigen DNA-Moleküle und die Phosphorylierung wurden in gleicher Weise wie in Stufe 2a) beschrieben durchgeführt.

3) Bindung der Linker an das Fragment A

Die in Stufe 2) hergestellten Linker wurden mit den pBR322- Verdauungsprodukten, die in Stufe 1) hergestellt worden waren, vermischt, so daß die Linker an das gewünschte DNA- Fragment ligasieren konnten. Für diesen Zweck wurde ein Takara-DNA-Ligasierungskit (hergestellt von Takaru Shuzo Co.) verwendet. Dann wurde das DNA-Fragmentgemisch in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA) gelöst, und man ließ es über Nacht bei 16º C in dem folgenden Reaktionsgemisch 5 reagieren, wonach es einer Ethanolfällung und Eindampfung bis zur Trockne unterworfen wurden. Reaktionsgemisch 5: Zusammensetzung Gehalt DNA-Fragmentgemisch Eco RI-Linker Pst I-Linker Lösung
Bemerkung: Die Lösungen A und B sind Reaktionsgemische, die in dem Takara-DNA-Ligasierungskit enthalten sind.

4) Herstellung der immobilisierten Sonden

Vier DNA-Sonden mit den unten aufgeführten Basensequenzen wurden unter Einsatz eines DNA-Synthetisators (391 PCR-MATE, Modell EP) von Applied Biosystems Inc. synthetisiert gemäß der Beschreibung in dem dazugehörigen Handbuch. An das 5'- Ende jeder Sonde wurde Amino-Link II (d.h. DNA-Linker) für das Anbinden an einen Träger angefügt.
Amino-Link II ist kommerziell erhältlich von ABT Corp. und ist in dem Applied Biosystem Inc. User Bulletin Nr. 49, August 1988 beschrieben; er wird durch die folgende Formel repräsentiert.
Sonde 1: H&sub2;N-(Amino-Link II)-GCAACCATGCCTAAGTTTG
Sonde 2: CGTTGGTACGGATTCAAACTTAA-(Amino-Link II)-NH&sub2;
Sonde 3: H&sub2;N-(Amino-Link II)-TTCCGTATGGCATGCCTCCCTGCA
Sonde 4: AAGGCATACCGTACGGAGGG-(Amino-Link II)-NH&sub2;
Die Sonden 1 und 2 sind komplementär zu dem Eco RI-Linker und die Sonden 3 und 4 zu dem Pst I-Linker. Diese Sonden 1 bis 4 wurden unabhängig an einem separaten Gel immobilisiert. Die Immobilisierung wurde wie folgt durchgeführt:

(1) Aktivierung des Gels

Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) (K&K oder Fluka), das bei dem folgenden Verfahrensablauf verwendet wurde, neigt dazu durch Wasser bei einem pH höher als oder gleich 3 zersetzt zu werden, und daher wurde die folgende Operation unter Verwendung einer Trockenbox durchgeführt, einer sterilisierten Packung gefüllt mit trockenem Stickstoffgas oder ähnlichem, um das Eindringen von Feuchtigkeit zu verhüten. Verwendetes Aceton und Pyridin wurde mit einem Molekularsieb für drei oder mehr Tage vor der Verwendung dehydratisiert.
Ein 10 ml Rundkolben, ausgestattet mit einem Stopfen und einem Magnetrührer, wurde mit 1,5 ml dehydratisiertem Aceton und 100 ul Pyridin gefüllt.
Zum anderen wurden 1 g Gel (Shimpack diol 300 (Shimazu)) schnell mit 50 ml dehydratisiertem Aceton auf einer Glasfritte # 5 unter Vakuum gewaschen und unmittelbar in den zuvor genannten Rundkolben eingebracht. Anschließend wurde der Kolben in einem Eisbad (etwa 0º C) gekühlt, und es wurde Tresylchlorid (200 ul pro Gramm des Gels) tropfenweise über etwa eine Minute zugegeben, wobei trockenes Stickstoffgas in den Kolben unter starkem Rühren eingeführt wurde.
Nach Beendigung der Zugabe wurde der Rundkolben mit einem Stopfen verschlossen, und die Reaktion wurde bei etwa 0º C für 20 Minuten durchgeführt, während bei geringer Geschwindigkeit gerührt wurde, um zu verhindern, daß das Gel stückig wurde. Nach der Reaktion wurde das Gel auf eine Glasfritte übertragen und dann nacheinander mit Aceton, einem Gemisch aus Aceton und 5 mM HCl (1 : 1) und 5 mM HCl gewaschen. Das Gel wurde weiterhin mit 30 ml trockenem Aceton gewaschen, wonach die Fritte mit einem Polyvinylchloridbeutel abgedeckt wurde, der trockenes Stickstoffgas enthielt und an der oberen Öffnung festgemacht wurde, und das Vakuum wurde für annähernd eine Stunde daran angelegt, um das Gel vollständig zu trocknen.

2) Immobilisierung der Sonden an dem Gel

Die an dem Träger synthetisierten DNA-Sonden wurden mit konzentrierten Ammoniakwasser abgespalten, und man ließ sie bei 55º C für zehn Stunden stehen, gefolgt von einem Entschützen. Die Sonden wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockne aufkonzentriert und in 200 ul 10 mM Triethylaminacetat(TEAA)-Puffer gelöst. Nach Eliminierung der Schutzgruppen durch Etherextraktion wurden die Sonden noch einmal bis zur Trockne aufkonzentriert und in 180 ul Kupplungspuffer (0,2 M NaHCO&sub3; und 0,5 M NaCl, pH 7,5) gelöst. Anschließend wurden 100 mg des in Stufe (1) hergestellten aktivierten Gels in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben und mit den zuvor genannten DNA-Sonden vermischt. Das Gemisch wurde bei 25º C für 24 Stunden unter leichtem Rühren gehalten, was zu einer Immobilisierung der Sonde an dem Gel führte. Nach der Reaktion wurde das Gel von dem Überstehenden durch Zentrifugieren bei 2000 U/Min für 5 Minuten entfernt, so daß man die immobilisierten Sonden erhielt.

5) Hybridisierung des gewünschten DNA-Fragmentes mit der immobilisierten Sonde

a) Das DNA-Fragmentgemisch, das das an die Linker gekoppelte gewünschte DNA-Fragment enthielt, das in Stufe 3) erhalten worden war, wurde in 100 ul 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid gelöst.
b) Die resultierende Lösung wurde einer Denaturierungsbehandlung bei 70º C für eine Minute unterworfen.
c) Die immobilisierte Sonde 1 (5 mg) wurde zu dieser Lösung hinzugegeben, und man ließ das Gemisch bei 20º C für zehn Minuten stehen.
d) Die so hybridisierte immobilisierte Sonde 1 wurde durch Zentrifugieren (bei 2000 U/Min für 15 Sekunden) ausgefällt, und das Überstehende wurde in anderes Eppendorf- Röhrchen gegeben.
e) Die immobilisierte Sonde wurde durch Zugabe von 50 ul 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid gewaschen, und die hybridisierte Sonde wurde noch einmal durch Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden zurückgewonnen. Das Überstehende wurde zu dem Eppendorf-Röhrchen in Stufe d) gegeben.
f) Zu der in Stufe e) abgetrennten hybridisierten Sonde wurde 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid (100 ul) gegeben, und die erhaltene Syspension wurde einer Denaturierungsbehandlung durch Erhitzen bei 70º C für zehn Minuten unterworfen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, um das hybridisierte DNA- Fragment von der immobilisierten Sonde abzutrennen. Das DNA- Fragment enthaltende Überstehende wurde gewonnen.
g) Zu dem in Stufe f) gewonnenen Überstehenden wurde die immobilisierte Sonde 3 (5 mg) hinzugesetzt, und das Gemisch ließ man bei 20º C für zehn Minuten stehen.
h) Für das Gemisch erfolgte eine Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, und das Überstehende wurde entfernt.
i) Zu der in Stufe h) abgetrennten immobilisierten Sonde wurde 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid (100 ul) hinzugegeben, und die erhaltene Suspension wurde einer Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden unterworfen, um die immobilisierte Sonde zurückzugewinnen.
j) Zu der in Stufe i) gewonnenen immobilisierten Sonde wurde 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid (100 ul) hinzugegeben, und die erhaltene Suspension wurde einer Denaturierungsbehandlung durch Erhitzen bei 70º C für zehn Minuten unterworfen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, um das Überstehende abzutrennen, das das DNA-Fragment von der immobilisierten Sonde enthielt. Das Überstehende wurde wiedergewonnen und für die nachfolgende Analyse (Probe 1) verwendet.
k) Das Überstehende aus Stufe e) wurde einer Denaturierungsbehandlung bei 70º C für eine Minute unterworfen, und die immobilisierte Sonde 2 (5 mg) wurde dazugegeben. Das Gemisch ließ man bei 20º C für zehn Minuten stehen.
l) Für das Gemisch erfolgte eine Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, und das Überstehende wurde entfernt.
m) Die immobilisierte Sonde als Niederschlag wurde zu 100 ul 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid gegeben, und für das Gemisch erfolgte nochmals eine Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden. Das Überstehende wurde entfernt.
n) Zu der so gewonnenen hybridisierten Sonde wurde 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid (100 ul) zugegeben, und die erhaltene Suspension wurde einer Denaturierungsbehandlung durch Erhitzen bei 70º C für zehn Minuten unterworfen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, um das Überstehende zu entfernen.
o) Zu dem in Stufe n) gewonnenen Überstehenden wurde die immobilisierte Sonde 4 (5 mg) gegeben, und man ließ das Gemisch bei 20º C für zehn Minuten stehen.
p) Die hybridisierte Sonde wurde durch Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden rückgewonnen und mit 100 ul 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid gewaschen. Die Sonde wurde zurückgewonnen durch Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden. Die so gewonnene Sonde wurde in 100 ul 2,4 M Tetraethylammoniumchlorid suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde einer Denaturierungsbehandlung durch Erhitzen bei 70º C für zehn Minuten unterworfen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 2000 U/Min für 15 Sekunden, um das Überstehende zu gewinnen. Das so zurückgewonnene Überstehende wurde für die nachfolgende Analyse (Probe 2) verwendet.

6) Identifizierung des gewonnenen DNA-Fragmentes und Bestimmung von dessen Reinheit

Die in Stufe 5) erhaltenen Proben 1 und 2 wurden miteinander vermischt, für zehn Minuten auf 70º C erhitzt, und anschließend ließ man sie bei 20º C für dreißig Minuten stehen (Probe 3).
Die Probe 3 (2 ul) wurde einer 2% Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen, und es wurde ein einzelnes Band bei der Position von etwa 790 bis 800 bp durch Autoradiografie beobachtet.
Andererseits wurde die Probe 3 auch einer Prüfung unterzogen hinsichtlich der Menge des zurückgewonnenen gewünschten DNA- Fragmentes. Somit wurde auf der Basis der Menge des als Ausgangsprodukt eingesetzten pBR322 (1,0 ug; siehe Reaktionsgemisch 1) die theoretische Menge des Eco RI-Pst I- Fragmentes mit 173 ng berechnet. Andererseits betrug die Menge des zurückgewonnenen gewünschten DNA-Fragmentes 145 ng. Auf der Basis dieser Daten ergab die folgende Gleichung eine 80 %ige Rückgewinnung des gewünschten DNA-Fragmentes.
* Bemerkung: "752" steht für die Anzahl der Nukleotide, die in dem Eco RI-Pst I-Fragment enthalten sind, wohingegen "795" für die Anzahl der Nukleotide steht, die in dem Eco RI-Pst I-Fragment enthalten sind, begleitet von dem Linker.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das interessierende Fragment A erfolgreich zurückgewonnen werden konnte unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die in der obigen Stufe 1) verwendeten Restriktionsenzyme Sal I, Pvu II und Bal I, andere Fragmente ähnlicher Größe gegenüber dem gewünschten Fragment A erbrachten.

Claims

1. Verfahren zur Extraktion eines besonderen Nukleinsäurefragmentes, das eine interessierende Nukleinsäuresequenz enthält, aus einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäuregemisch, das die Stufen umfaßt:

(1) Verdauung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäuregemisches mit Restriktionsenzymen, um ein Gemisch von Nukleinsäurefragmenten zu erhalten, wobei die Restriktionsenzyme aus (A) zwei unterschiedlichen Enzymen, die zur Produktion des besonderen Nukleinsäurefragmentes in der Lage sind, das die vorbestimmten und verschiedenen Restriktionsenden an seinen 5'- und 3'-Terminals trägt, und (B) ein oder mehreren von (A) verschiedenen Restriktionsenzymen, für die das besondere Nukleinsäurefragment keine relevanten Restriktionsstellen enthält, bestehen;

(2) Herstellung von zwei verschiedenen DNA-Linkern, die zur Bindung an die entsprechenden Restriktionsenden des besonderen Nukleinsäurefragments in der Lage sind;

(3) Reaktion der Linker mit dem Gemisch der Nukleinsäurefragmente;

(4) Unterwerfen des erhaltenen Reaktionsgemisches der ersten Hybridisierung mit einer immobilisierten Sonde, die zu einem der Linker komplementär ist;

(5) Isolieren des hybridisierten Nukleinsäurefragmentes von der Sonde;

(6) Unterwerfen des isolierten Nukleinsäurefragmentes der zweiten Hybridisierung mit einer immobilisierten Sonde, die zu dem anderen Linker komplementär ist; und

(7) Isolieren des hybridisierten Nukleinsäurefragmentes von der Sonde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure DNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Linker DNA sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die immobilisierte Sonde eine auf einem unlöslichen Träger immobilisierte Nukleinsäure ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Nukleinsäure an ihren Terminal immobilisiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Nukleinsäure DNA ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin der unlösliche Träger eine natürliche oder synthetische organische oder anorganische Polymermembran ist.

8. Verfahren nach Anspruch 4, worin der unlösliche Träger ein natürliches oder synthetisches organisches oder anorganisches Polymerteilchen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Größe des Teilchens 0,1 um bis 500 um beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Größe 1 um bis 100 um beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, worin der unlösliche Träger Silicagel ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8, worin der unlösliche Träger Polystyren ist.