DE69421885T2 - Oberflächenmaterial für Festphase-Extraktionsreinigung von DNA - Google Patents

Oberflächenmaterial für Festphase-Extraktionsreinigung von DNA

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Reinigung von DNA durch Festphasenextraktion und insbesondere auf siliciumhaltige Materialien, die DNA binden können und von denen DNA unter geeigneten Bedingungen eluiert werden kann.
  • Die Herstellung hochreiner doppelsträngiger (ds) Plasmid-DNA, einzelsträngiger (ss) Phagen-DNA, chromosomaler DNA und Agarose-Gel-gereinigter DNA-Fragmente ist in der Molekularbiologie von entscheidender Bedeutung. Idealerweise sollte ein Verfahren zur Reinigung von DNA einfach und schnell sein und, wenn überhaupt, nur eine geringe zusätzliche Manipulation der Probe erfordern. Durch ein solches Verfahren gewonnene DNA sollte unmittelbar einer Transformation, Restriktionsanalyse, Ligasierung oder Sequenzierung zugänglich sein. Ein Verfahren mit allen diesen Merkmalen wäre für die Automatisierung der DNA- Proben-Präparation, einem Ziel von Forschungs- und diagnostischen Laboratorien, äußerst attraktiv. Typischerweise ist die Präparation von Plasmid-DNA aus rohen Alkoholpräzipitaten aufwendig, wobei am häufigsten CsCl-Gradienten, Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie oder RNase, Proteinase K und wiederholte Alkoholfällungsschritte verwendet werden. Diese Verfahren erfordern außerdem eine beträchtliche Probennachbearbeitung, um CsCl und andere Salze, Ethidiumbromid und Alkohol zu entfernen. Ähnliche Argumente gelten bei der Verwendung eines dieser Verfahren zur Reinigung von DNA-Fragmenten. Ein weiteres Problem mit diesen Verfahren besteht darin, daß kleine negativ geladene Zellkomponenten mit der DNA zusammengereinigt werden können. Die DNA kann also ein unerwünschtes Ausmaß an Kontamination aufweisen.
  • DNA kann auch unter Verwendung fester Phasen gereinigt werden. Herkömmliche Festphasenextraktionstechniken verwendeten Oberflächen, die entweder (1) wegen der Oberflächengestaltung keine ausreichenden Mengen von DNA-Molekülen anziehen und halten können, um eine leichte Gewinnung der DNA-Moleküle während der Elution zu ermöglichen, oder (2) DNA-Moleküle übermäßig stark an die Oberfläche binden und dadurch die Gewinnung der DNA-Moleküle während der Elution behindern. Zu den herkömmlichen Oberflächenmaterialien, die diese Probleme verursachen, wenn die bei der Festphasenextraktion verwendet werden, gehören Siliciumoxidoberflächen, wie Glas und Celite. Eine ausreichende Bindung von DNA an diese Typen von Oberflächen kann nur dadurch erreicht werden, daß man hohe Konzentrationen an chaotropen Stoffen oder Alkoholen verwendet, die im allgemeinen toxisch, ätzend und/oder teuer sind. Es ist zum Beispiel bekannt, daß DNA in Gegenwart von chaotropen Stoffen an zerstoßene Glaspulver und Glasfaserfilter bindet. Die chaotropen Ionen werden typischerweise mit Alkohol weggewaschen, und die DNAs werden mit Niedersalzlösungen oder Wasser eluiert. Dabei ist wichtig, daß RNA und Proteine nicht binden. Ein schwerwiegender Nachteil bei der Verwendung von zerstoßenem Glaspulver besteht jedoch darin, daß seine Bindungskapazität gering ist. Außerdem leiden Glaspulver häufig an einer schwankenden Ausbeute, Unverträglichkeit mit Boratpuffern und einer Neigung, Einzelstrangbrüche in großen DNAs zu verursachen. In ähnlicher Weise liefern Glasfaserfilter eine nichtporöse Oberfläche mit geringer DNA-Bindungskapazität. Andere Siliciumoxide, wie Silicagel und Glaskügelchen, sind für die Bindung und Gewinnung von DNA nicht geeignet. Zur Zeit ist Celite, wie man es in Prep-A-GeneTM von den Bio-Rad Laboratories findet, die Festphase der Wahl für die Festphasenextraktion von DNA. Wie bei den zerstoßenen Glaspulvern sind für eine ausreichende Bindung der DNA an das Celite hohe Konzentrationen an chaotropen Stoffen erforderlich.
  • EP-A-0 600 253, das für die benannten Vertragsstaaten DE, FR, IT und GB unter Art. 54(3) und (4) EPÜ zum Stand der Technik gehört, offenbart Borsilicate, Aluminiumsilicate und Phosphosilicate für die Reinigung von DNA.
  • EP-A-0 442 026, das unter Art. 54(2) EPÜ zum Stand der Technik gehört, offenbart Borsilicatglas für die DNA-Reinigung.
  • EP-A-0 512 767, das unter Art. 54(2) EPÜ zum Stand der Technik gehört, offenbart Aluminiumsilicat für die DNA-Reinigung.
    • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Diese Probleme bei herkömmlichen DNA-Reinigungsverfahren werden von der vorliegenden Erfindung angegangen, die sich auf ein siliciumhaltiges Material bezieht, das eine ausreichende Hydrophilie und ausreichende Elektropositivität aufweist, um DNA aus einer DNA-haltigen Suspension zu binden und die Elution der DNA von dem Material zu erlauben. Im allgemeinen manifestieren sich die hydrophilen und elektropositiven Eigenschaften an der Oberfläche des siliciumhaltigen Materials und werden anhand der durch FTIR-Spektroskopie (Fourier-Transform- Infrarot-Spektroskopie) gemessenen Anwesenheit von Sauerstoff und der durch ESCA (electron surface composition analysis) nachgewiesenen Anwesenheit des Substituentenatoms quantifiziert. Zu den siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung gehören Siliciumoxidcarbonyl, Siliciumoxidsulfonyl und Siliciumoxidphosphonyl.
  • Die siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für Verfahren zur Reinigung von DNA aus anderen Zellkomponenten geeignet. Bei diesen Verfahren wird eine Suspension von Zellkomponenten mit dem siliciumhaltigen Material in Kontakt gebracht, das siliciumhaltige Material wird gewaschen, um alle anderen Zellkomponenten als DNA, die an das Material gebunden sind, zu entfernen, und die gebundene DNA wird von dem Material eluiert. Mehrere der siliciumhaltigen Materialien können DNA unter Verwendung nur von, reinem Wasser, d. h. ohne die Verwendung chaotroper Stoffe, binden und wieder abgeben.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein siliciumhaltiges Material, das ausreichend Hydrophilie und ausreichend Elektropositivität aufweist, um DNA aus einer Suspension von Zellkomponenten zu binden und die Elution der DNA von dem Material zu erlauben. Es hat sich gezeigt, daß viel niedrigere Konzentrationen an chaotropen Stoffen oder Alkoholen verwendet werden können, um eine Reinigung von DNA zu erreichen, wenn man die siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • DNA tritt mit einer Festphasenoberfläche auf zweierlei Weise in Wechselwirkung. Erstens tritt DNA durch Wasserstoffbrücken zwischen Hydroxygruppen der DNA und Oberflächenkomponenten der festen Phase, wie Oberflächen-Hydroxygruppen, in Wechselwirkung. Die zweite Art von Wechselwirkung erfolgt zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA und positiv geladenen Elementen der Festphasenoberfläche. Die hydrophilen und elektropositiven Eigenschaften der Festphasenoberfläche müssen so gestaltet sein, daß sie eine Bindung der DNA aus einer Suspension von Zellkomponenten, einer Suspension von Nucleinsäure und anderen Komponenten und/oder einer Suspension von Nucleinsäure ermöglichen und die Elution der DNA von dem Festphasenmaterial erlauben. Die elektropositiven Eigenschaften des Festphasenmaterials dürfen also keine zu hohe positive Ladung beinhalten, sonst klebt die DNA an der Oberfläche und kann nicht eluiert werden. Diese Eigenschaft gilt auch für viele Oberflächen auf Metallbasis, was dazu führt, daß sie für die Reinigung von DNA nicht verwendet werden können.
  • Siliciumhaltige Materialien, z. B. Siliciumoxid, Celite, Glaspulver und dergleichen, werden mit gemischten Ergebnissen für die DNA-Reinigung verwendet. Einige dieser Oberflächen haben geringe Bindungskapazitäten und/oder erfordern die Verwendung hochkonzentrierter Lösungen von chaotropen Stoffen oder Alkoholen für die Bindung der DNA. Es ist also wünschenswert, Festphasenoberflächen, insbesondere Festphasen von siliciumhaltigen Materialien, herzustellen, die hydrophile und elektropositive Eigenschaften aufweisen, die für die DNA-Reinigung und/oder die DNA-Reinigung mit viel niedrigeren Konzentrationen an chaotropen Stoffen oder Alkoholen geeignet sind. Auf der Oberfläche der festen Phase werden hydrophile Eigenschaften durch die Anwesenheit von Gruppen erreicht, die Wassermoleküle anziehen. Zu den geeigneten Gruppen gehören -OH, -NH, -F, -H oder Gruppen mit doppeltgebundenem Sauerstoff, wie Carbonyl, Sulfonyl oder Phosphonyl. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden siliciumhaltige Materialien hergestellt, bei denen die hydrophilen Eigenschaften durch Einbau der geeigneten hydrophilen Gruppen erreicht werden und die elektropositiven Eigenschaften durch Einbau von Si und anderer geeigneter positiv geladener Atome erreicht werden. Zu den siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung gehören Siliciumoxidcarbonyl, Siliciumoxidsulfonyl und Siliciumoxidphosphonyl.
  • Im allgemeinen werden die siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man SiCl&sub4; bei etwa 0 bis 10ºC, vorzugsweise 0 bis 5ºC, am meisten bevorzugt 0ºC, mit RCln und H&sub2;O umsetzt, wobei R CO, PO oder SO sein kann und n 2 oder 3 sein kann, so daß die Wertigkeit von R abgesättigt wird. Zum Beispiel beträgt n 2 für R=CO oder SO und 3 für PO. Siliciumhaltige Materialien werden mit verschiedenen Verhältnissen von R : Si hergestellt, indem man unterschiedliche Anteile von SiCl&sub4; und RCln miteinander umsetzt. Im allgemeinen werden RCln und SiCl&sub4; miteinander gemischt und dann abgekühlt. Wasser wird langsam hinzugefügt, bis sich kein Gas mehr entwickelt. Zusätzliches Wasser wird hinzugefügt, um eine voll ständige Reaktion zu gewährleisten. Das siliciumhaltige Material wird filtriert, gewaschen, kurz getrocknet und in einem Exsiccator aufbewahrt.
  • Siliciumoxidcarbonyle werden so hergestellt, wie es oben allgemein beschrieben ist. Das Kohlenstoffatom ist weniger elektropositiv als das Bor- oder Phosphoratom. Die Siliciumoxidcarbonyle haben ähnliche DNA-Bindungskapazitäten wie die Borsilicate, wenn auch bei einem höheren Verhältnis von Carbonyl zu Silicium. Siliciumoxidcarbonyle werden hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten COCl&sub2; umsetzt. Im allgemeinen nimmt mit zunehmendem Prozentsatz an Carbonyl in der Oberfläche der Siliciumoxidcarbonyle auch die Ausbeute der von der Oberfläche eluierten DNA zu. Für Siliciumoxidcarbonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten COCl&sub2; hergestellt wurden, zeigte sich selbst bei niedrigen Konzentrationen an Bindungsmittel (z. B. chaotroper Stoff) eine gute Ausbeute an DNA. Vorzugsweise werden die Siliciumoxidcarbonyle hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,1 bis 0,4 Äquivalenten COCl&sub2; umsetzt, und am meisten bevorzugt ist ihre Herstellung, indem man SiCl&sub4; mit 0,25 bis 0,35 Äquivalenten COCl&sub2; umsetzt. Bei der DNA-Gewinnung übertreffen viele dieser Siliciumoxidcarbonyle das Super Fine Super Floss Celite.
  • Siliciumoxidsulfonyle werden so hergestellt, wie es oben allgemein beschrieben ist. Das Schwefelatom hat ähnliche elektropositive Eigenschaften wie das Kohlenstoffatom. Die Siliciumoxidsulfonyle haben ähnliche, aber bessere Bindungskapazitäten als die Siliciumoxidcarbonyle. Siliciumoxidsulfonyle werden hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; umsetzt. Im allgemeinen nimmt mit zunehmendem Prozentsatz an Sulfonyl in der Oberfläche der Siliciumoxidsulfonyle auch die Ausbeute der von der Oberfläche eluierten DNA zu. Für Siliciumoxidsulfonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; hergestellt wurden, zeigte sich selbst bei niedrigen Konzentrationen an Bindungsmittel (z. B. chaotroper Stoff) eine gute Ausbeute an DNA. Vorzugsweise werden die Siliciumoxidsulfonyle hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,3 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; umsetzt, und am meisten bevorzugt ist ihre Herstellung, indem man SiCl&sub4; mit 0,7 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; umsetzt. Bei der DNA-Gewinnung übertreffen viele dieser Siliciumoxidsulfonyle das Super Fine Super Floss Celite. In bezug auf die DNA-Ausbeute sind die Siliciumoxidsulfonyle den anderen siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung im allgemeinen überlegen.
  • Siliciumoxidphosphonyle werden so hergestellt, wie es oben allgemein beschrieben ist. Das Phosphoratom ist weniger elektropositiv als das Boratom, aber elektropositiver als das Kohlenstoff- oder Schwefelatom. Die hydrophilen Eigenschaften erhält die Oberfläche durch den Sauerstoff des Phosphonyls. Die Siliciumoxidphosphonyle haben ähnliche Bindungseigenschaften wie die Siliciumoxidcarbonyle. Die Gegenwart von Phosphor bewirkt, daß DNA unter Bindungsbedingungen fester bindet als bei Siliciumoxidcarbonylen oder Siliciumoxidsulfonylen. Siliciumoxidphosphonyle werden hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,1 bis 2,0 Äquivalenten POCl&sub3; umsetzt. Im allgemeinen nimmt mit zunehmendem Prozentsatz an Phosphonyl in der Oberfläche der Siliciumoxidphosphonyle auch die Ausbeute der von der Oberfläche eluierten DNA zu. Für Siliciumoxidphosphonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 2 Äquivalenten POCl&sub3; hergestellt wurden, zeigte sich selbst bei niedrigen Konzentrationen an Bindungsmittel (z. B. chaotroper Stoff) eine gute Ausbeute an DNA. Vorzugsweise werden die Siliciumoxidphosphonyle hergestellt, indem man SiCl&sub4; mit 0,3 bis 2 Äquivalenten POCl&sub3; umsetzt, und am meisten bevorzugt ist ihre Herstellung, indem man SiCl&sub4; mit 0,5 bis 1 Äquivalent POCl&sub3; umsetzt.
  • Die siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung werden für die Reinigung von DNA aus anderen Zellkomponenten oder potentiellen Kontaminanten verwendet. In beiden Fällen kann die DNA aus jeder beliebigen Quelle erhalten werden; dazu gehören unter anderem Rohzellextrakte, biologische Flüssigkeiten, Phagenüberstände, Agarose-Gele und Reaktionsgemische der radioaktiven Markierung. Alternativ dazu können auch die Aluminiumsilicate, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit mehr als 0,5 Äquivalenten AlCl&sub3; hergestellt werden, verwendet werden, um DNA zu immobilisieren. Die DNA kann doppelsträngig, einzelsträngig, zirkulär oder linear und von unterschiedlicher Größe sein. Herkömmliche Techniken zur Gewinnung von DNA aus irgendeiner Quelle, die in der Technik wohlbekannt sind, werden verwendet, um die DNA für die Reinigung zu präparieren. Typische Verfahren zur Gewinnung von DNA ergeben eine Suspension der DNA in einer Lösung. Wegen der Isolierung von DNA aus biologischen Proben, siehe z. B. J. D. Harding et al., Nucleic Acids Research 17: 6947 (1989), und M. A. Marko et al., Analytical Biochemistry 121: 382 (1982). Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA findet man in L. H. Lutze et al., Nucleic Acids Research 20: 6150 (1990). Die Extraktion von doppelsträngiger DNA aus biologischen Proben findet man in O. Yamada et al., Journal of Virological Methods 27: 203 (1990). Die meisten DNA-Lösungen umfassen die DNA in einem geeigneten Puffer, wie TE-Puffer (Tris-EDTA) oder TEA-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA), oder in einem Lysat. Siehe auch J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).
  • Sobald die DNA in einer geeigneten Lösung oder Suspension erhalten wurde, wird das siliciumhaltige Material der vorliegenden Erfindung zu der Lösung oder Suspension gegeben. Alternativ dazu könnte die DNA-Lösung oder Suspension auch zu dem siliciumhaltigen Material der vorliegenden Erfindung gegeben werden. Nachdem die DNA-Lösung oder -Suspension mit dem siliciumhaltigen Material der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht wurde, wird typischerweise ein Bindungspuffer hinzugefügt, um die Bindung der DNA an das siliciumhaltige Material zu unterstützen. Zu den geeigneten Bindungspuffern gehören wohlbekannte chaotrope Stoffe, wie NaClO&sub4; und NaI, sowie andere Agentien, wie Isopropanol, NaCl oder Guanidin·HCl. Nachdem die DNA an das siliciumhaltige Material gebunden wurde, wird die reine DNA von dem siliciumhaltigen Material eluiert. Zu den geeigneten Elutionsmitteln gehören 10 mM Tris, pH 7,0, oder Wasser. Im allgemeinen wird das siliciumhaltige Material mit gebundener DNA abgetrennt, z. B. durch Zentrifigation oder Filtration, und gewaschen, bevor man die DNA eluiert. Zu den geeigneten Waschreagentien gehören 80/20 Ethanol/ 50 mM Tris, pH 7,0, und andere niedermolekulare Alkohole.
  • Es wurde weiterhin gefunden, daß viele der oben beschriebenen siliciumhaltigen Materialien in der Lage sind, DNA in reinem Wasser bei Raumtemperatur zu binden, so daß die Verwendung chaotroper Bindungspuffer entfällt. Die gebundene DNA wird bei 37ºC in reinem Wasser eluiert. Das Wegfallen der chaotropen Bindungspuffer ist ein erheblicher Fortschritt bei dieser Technik.
  • Die durch Reinigung mit den siliciumhaltigen Materialien der vorliegenden Erfindung erhaltene DNA kann ohne weitere Manipulation für die Spaltung mit Restriktionsenzymen, Klonierung, Sequenzierung, Diagnose und dergleichen verwendet werden. Die hohe Qualität der mit der vorliegenden Erfindung hergestellten DNA und die Geschwindigkeit, mit der DNA mit minimaler Nachbearbeitung gereinigt wird, bedeuten, daß diese siliciumhaltigen Materialien für die Automatisierung der DNA-Proben-Präparation geeignet sein können.
  • Die irreversible Bindung von DNA an einige der Aluminiumsilicate ist geeignet, um DNA-Kontaminanten für die in-vitro- Diagnose aus biologischen Proben zu entfernen oder um DNA aus Nachweisgründen zu immobilisieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die zur Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. Es wurden in dem Fachgebiet wohlbekannte Standardtechniken oder die unten besonders beschriebenen Techniken verwendet.
    • Beispiel 1 Synthese siliciumhaltiger Materialien A. Borsilicate (nicht beansprucht)
  • Borsilicate, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 5 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt wurden, wurden unter Verwendung der folgenden Verhältnisse von BCl&sub3; (1 M in CH&sub2;Cl&sub2;; Aldrich Chemical Co.) zu SiCl&sub4; (Petrarch Systems) hergestellt:
  • Das SiCl&sub4; und das BCl&sub3; wurden unter Rühren miteinander gemischt und in Eis auf 0ºC abgekühlt. Wasser wurde langsam hinzugefügt, bis kein HCl-Gas mehr in dem Reaktionsgefäß entwickelt wurde. Dann wurden etwa 5 ml Wasser hinzugefügt, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang gerührt und filtriert, dreimal mit 10 ml H&sub2;O und dreimal mit 10 ml Aceton gewaschen. Das Borsilicat wurde 25 Minuten an der Luft getrocknet und dann eine Stunde bei 100ºC getrocknet. Das Borsilicat wurde bis zur Verwendung in einem Exsiccator aufbewahrt.
    • D. Siliciumoxidcarbonyle
  • Siliciumoxidcarbonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten COCl&sub2; hergestellt wurden, wurden unter Verwendung der folgenden Verhältnisse von Phosgen (Fluka) zu SiCl&sub4; (Petrarch Systems) hergestellt:
  • Das Phosgen und das SiCl&sub4; wurden miteinander gemischt und in einem Eisbad 10 Minuten lang auf 0ºC abgekühlt. Wasser wurde portionsweise hinzugefügt (10 Tropfen/2 min), um zu verhindern, daß das Reaktionsgemisch zu heiß wurde. Nachdem insgesamt 3 ml Wasser hinzugefügt worden waren, wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten lang bei 0ºC und dann eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um nicht umgesetztes Phosgen zu vertreiben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Büchner-Trichter filtriert. Das Siliciumoxidcarbonyl wurde dreimal mit 10 ml Wasser und dreimal mit 10 ml Aceton gewaschen, eine Stunde an der Luft getrocknet, eine Stunde bei 100ºC im Ofen getrocknet und in einem Exsiccator aufbewahrt.
    • E. Siliciumoxidsulfonyle
  • Siliciumoxidsulfonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; hergestellt wurden, wurden unter Verwendung der folgenden Verhältnisse von Thionylchlorid (Aldrich Chemical Co.) zu SiCl&sub4; (Petrarch Systems) hergestellt:
  • Das SiCl&sub4; und das Thionylchlorid wurden in einen 25-ml- Erlenmeyer-Kolben gegeben und unter Rühren in einem Eis/Wasser-Bad auf 0ºC abgekühlt. Zehn Tropfen Wasser wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde zwei Minuten lang gerührt. Dann wurden alle zwei Minuten fünf Tropfen Wasser hinzugefügt, wobei ständig gerührt wurde, bis kein Gas mehr entwickelt wurde. Dann wurden 2 ml Wasser hinzugefügt, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und dreimal mit 10 ml Wasser und dreimal mit 10 ml Aceton gewaschen. Das Siliciumoxidsulfonyl wurde eine Stunde an der Luft getrocknet, eine Stunde bei 100ºC im Ofen getrocknet und in einem Exsiccator aufbewahrt.
    • F. Siliciumoxidphosphonyle
  • Siliciumoxidphosphonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 2,0 Äquivalenten POCl&sub3; hergestellt wurden, wurden unter Verwendung der folgenden Verhältnisse von POCl&sub2; (Aldrich Chemical Co.) zu SiCl&sub4; (Petrarch Systems) hergestellt:
  • Das SiCl&sub4; wurde in einen 25-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und etwa 10 Minuten in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Dann wurde das POCl&sub3; mit einer Spritze hinzugefügt, und das Gemisch wurde fünf Minuten lang gekühlt. Wasser wurde sehr langsam (etwa 2 Tropfen/min) unter kräftigem Rühren hinzugetropft, bis die sichtbaren Anzeichen der Reaktion aufhörten (kein weißes Gas entwickelte sich, und keine Blasenbildung). Das Reaktionsgemisch wurde 5-10 Minuten lang bei 0ºC gerührt. Etwa 5 ml Wasser wurden in 1-ml-Portionen hinzugefügt, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Das Siliciumoxidphosphonyl wurde dreimal mit 10 ml Wasser und dreimal mit 10 ml Aceton gewaschen. Das gewaschene Siliciumoxidphosphonyl wurde dann 15 Minuten an der Luft getrocknet, eine Stunde bei 100ºC im Ofen getrocknet und bis zur Verwendung in einem Exsiccator aufbewahrt.
    • Beispiel 2 Analyse der DNA-Ausbeute unter Verwendung von Super Fine Super Floss Celite als Standard
  • Die folgenden Materialien wurden für die Analyse der DNA- Ausbeute mit Super Fine Super Floss Celite als Standard für die Analyse der DNA-Rückgewinnungsfähigkeiten der siliciumhaltigen Materialien verwendet:
  • Super Fine Super Floss Celite (Manville; 1 : 5 w/w in H&sub2;O) [SFSF]
  • λ-DNA (BRL Kat.-Nr. 56125A)
  • 50 mM Tris, pH 7,0 (durch Verdünnen aus 1 M Stammlösung)
  • Bindungspuffer (H&sub2;O oder NaClO&sub4;, durch Verdünnen aus 6 M Stammlösung)
  • 80% Ethanol in 50 mM Tris, pH 7,0
  • MilliQ H&sub2;O
  • Ethidiumbromid (10 mg/ml)
  • 1% Agarose
  • 1 · TAE (durch Verdünnen aus 50 · Stammlösung)
  • Type II Loading Dye (25% Ficoll 400, 25% Bromphenolblau, 25% Xylolcyanol)
  • Polaroidfilm Typ 57 und 55
  • 50 ul λ-DNA-Lösung (0,5 ul λ-DNA in 50 ul 50 mM Tris, pH 7,0, für 31 ug DNA/Reaktion) wurden in acht Röhrchen gegeben. 20 ul SFSF (ca. 30 ug) wurden zu der DNA gegeben. 400 ul Bindungspuffer wurden wie folgt zu der DNA gegeben: H&sub2;O zu Röhrchen 1; 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 bzw. 4 M NaClO&sub4; in Röhrchen 2-8. Das Gemisch wurde unter Schaukeln 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die resultierenden Sedimente wurden zweimal mit 80/20 Ethanol/50 mM Tris, pH 7,0, gewaschen. Die DNA wurde 10 Minuten bei 37ºC mit 20 ul Wasser aus dem Sediment eluiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und die Überstände jeweils in getrennten Röhrchen aufbewahrt. Die Sedimente wurden wiederum wie zuvor eluiert, die Röhrchen zentrifugiert, und die Überstände vereinigt. 2 ul Type II Loading Dye wurden in jedes Röhrchen der Überstände gegeben, und das Gemisch wurde auf ein Gel mit 1% Agarose, 1 · TAE, aufgebracht. Das Gel wurde etwa 25 Minuten lang einer Elektrophorese bei 100-130 Volt in 1 · TAE-Puffer unterzogen. Die Gele wurden ca. 20 bis 30 Minuten lang mit Ethidiumbromid in H&sub2;O (ca 1 : 1000) angefärbt. Photographien über UV-Licht wurden mit Film des Typs 57 aufgenommen, und Negative wurden (wenn möglich) mit Film des Typs 55 aufgenommen.
  • Die Gele zeigten, daß eine kleine Menge DNA aus dem SFSF eluiert wurde, wenn Wasser als Bindungspuffer verwendet wurde. Eine kleine Menge DNA wurde auch eluiert, wenn 1, 1,5 und 2,0 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer verwendet wurde. Ein dramatischer Anstieg der Menge der eluierten DNA wurde beobachtet, wenn 2,5, 3,0, 3,5 und 4,0 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer verwendet wurden. Beim Vergleich von SFSF mit Prep-A-GeneTM wurde festgestellt, daß von dem Celite von Prep-A-GeneTM keine DNA eluiert wurde, bis 3,0 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer verwendet wurde, während SFSF etwas DNA in nativem Zustand band und mit 2,5 M NaClO&sub4; stärker band. SFSF war also besser als Prep-A- GeneTM. In den folgenden Beispielen wurde SFSF als Standard verwendet, und 3 M NaClO&sub4; wurde als Bindungspuffer verwendet.
    • Beispiel 3 (nicht beansprucht) Analyse der DNA-Ausbeute unter Verwendung von Borsilicaten
  • Die Ausbeute an DNA bei Verwendung der in Beispiel 1 hergestellten Borsilicate wurde analysiert, indem man das in Beispiel 2 dargelegte Verfahren befolgte, außer daß sieben Röhrchen das Borsilicat (ca 30 ug) enthielten, und 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 bzw. 4 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer verwendet wurden. Das achte Röhrchen (Kontrolle) enthielt SFSF (ca. 30 ug), und es wurde 3,0 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer verwendet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Ein Borsilicat, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,09 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war, zeigte eine gute DNA-Ausbeute. Ein Borsilicat, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,16 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war, band unter den verwendeten Bedingungen keine DNA oder gab sie wieder ab. Da das mit 0,09 Äquivalenten hergestellte Produkt eine gute Ausbeute ergab, so wie auch eines, das mit 0,33 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war (siehe unten), ist dieses letztere Produkt ein Beispiel für einen sporadischen Fehler. Ein Borsilicat, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,55 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war, hielt praktisch die gesamte vorhandene DNA zurück und gab sie wieder ab. Dieses Borsilicat zeigte eine gute DNA-Ausbeute bis herunter zu 1 M NaClO&sub4; (d. h. 1 M NaClO&sub4; wurde als Bindungspuffer verwendet) und hielt bei dieser Konzentration die gesamte DNA zurück und gab sie wieder ab. Ein Borsilicat, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,33 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 1,5 M NaClO&sub4; eine ausgezeichnete DNA-Ausbeute (d. h. Bindung und Elution von DNA). Ein Borsilicat, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,42 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 2,0 M NaClO&sub4; eine ausgezeichnete DNA-Ausbeute.
    • Beispiel 4 Analyse der DNA-Ausbeute unter Verwendung von Siliciumoxidcarbonylen
  • Die Ausbeute an DNA bei Verwendung der in Beispiel 1 hergestellten Siliciumoxidcarbonyle wurde analysiert, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Ein Siliciumoxidcarbonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 oder 0,5 Äquivalenten COCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 1 M NaClO&sub4; eine gute DNA-Ausbeute. Ein Siliciumoxidcarbonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 1,0 Äquivalenten COCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 1 M NaClO&sub4; eine sehr gute DNA-Ausbeute. Ein Siliciumoxidcarbonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,3 Äquivalenten COCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 2 M NaClO&sub4; eine ausgezeichnete DNA-Ausbeute.
    • Beispiel 5 Analyse der DNA-Ausbeute unter Verwendung von Siliciumoxidsulfonylen
  • Die Ausbeute an DNA bei Verwendung der in Beispiel 1 hergestellten Siliciumoxidsulfonyle wurde analysiert, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Ein Siliciumoxidsulfonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 Äquivalent SOCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 2 M NaClO&sub4; eine gute DNA-Ausbeute. Ein Siliciumoxidsulfonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,7,1,0 oder 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 1 M,1,5 M bzw. 1 M NaClO&sub4; eine sehr gute DNA- Ausbeute. Ein Siliciumoxidsulfonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,333 oder 0,500 Äquivalenten SOCl&sub2; hergestellt worden war, ergab bis herunter zu 1,5 M oder 2 M NaClO&sub4; eine ausgezeichnete DNA-Ausbeute.
    • Beispiel 6 Analyse der DNA-Ausbeute unter Verwendung von Siliciumoxidphosphonylen
  • Die Ausbeute an DNA bei Verwendung der in Beispiel 1 hergestellten Siliciumoxidphosphonyle wurde analysiert, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Siliciumoxidphosphonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1, 0,3, 1,5 oder 2,0 Äquivalenten POCl&sub3; hergestellt worden waren, ergaben eine gute DNA-Ausbeute. Siliciumoxidphosphonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,5, 0,7 oder 1 Äquivalent POCl&sub3; hergestellt worden waren, ergaben eine ausgezeichnete DNA-Ausbeute.
    • Beispiel 7 Analyse der DNA-Ausbeute ohne die Verwendung chaotroper Stoffe
  • Die Verbindungen, die bis herunter zu 1 M NaClO&sub4; eine vollständige Rückgewinnung der DNA ergeben hatten, wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, DNA in Abwesenheit jedes Bindungspuffers zu gewinnen. DNA wurde an das siliciumhaltige Material gebunden, wobei reines Wasser von Raumtemperatur verwendet wurde. Die gebundene DNA wurde bei 37ºC in reinem Wasser eluiert. Es wurde gefunden, daß die folgenden siliciumhaltigen Materialien unter diesen Bedingungen DNA binden und wieder abgeben:
  • Borsilicate, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,3 oder 0,8 Äquivalenten BCl&sub3; hergestellt worden waren;
  • Siliciumoxidphosphonyle, die durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,5, 0,7 oder 1,0 Äquivalenten POCl&sub3; hergestellt worden waren.

Claims (2)

1. Siliciumhaltiges Material, und zwar ein Siliciumoxidcarbonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten COCl&sub2; erhältlich ist, ein Siliciumoxidsulfonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 1,5 Äquivalenten SOCl&sub2; erhältlich ist, oder ein Siliciumoxidphosphonyl, das durch Umsetzen von SiCl&sub4; mit 0,1 bis 2 Äquivalenten POCl&sub3; erhältlich ist, wobei das Material ausreichend Hydrophilie und ausreichend Elektropositivität aufweist, um DNA aus einer DNA-haltigen Suspension zu binden, und die Elution der DNA von dem Material erlaubt.
2. Verfahren zur Reinigung von DNA, umfassend die Schritte:
(a) In-Kontakt-Bringen einer DNA-haltigen Suspension mit dem siliciumhaltigen Material gemäß Anspruch 1 unter Bedingungen, die für die Bindung von DNA an das Material geeignet sind;
(b) Waschen des Materials, an das die DNA gebunden ist; und
(c) Eluieren der gebundenen DNA von dem Material.
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