JP4065405B2 - プラスミドｄｎａを含有する細胞溶解物を製造するためのバイオマスの処理法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明はプラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物を製造するための細胞培養法からのバイオマスの統合処理法、並びにこの方法により製造されたプラスミドＤＮＡ細胞溶解物に関する。
【０００２】
処理とは透明な、プラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物を製造するためのコンディショニング法であると理解する。統合処理法とは個々の工程が一体になって移行し、こうして生成物流が実質的に連続的に移動する方法であると理解するべきである。多工程の方法を連続的にまたはバッチ式に実施することができる。
【０００３】
細胞培養工程からの生物学的材料の分離、生物学的材料の砕解および透明な、プラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物の製造は分子生物学の分野においては、汎用される方法である。公知の方法においては、生物学的材料を、例えばＥ.コリバクテリア細胞からの生物学的材料を、培養上澄みから分離し、再懸濁後に砕解する。固体成分の分離後に、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質およびエンドトキシンと共にプラスミドＤＮＡを含有するいわゆる透明な細胞溶解物を製造する。
【０００４】
生物学的材料を細胞培養工程からバッチ式にまたは連続的に遠心により分離することは公知である。フィルター助剤のベッドを介して濾過することによるベーキング酵母細胞の分離がＧＢ−Ａ−１０８２８６２中に記載されている。これによれば、フィルター助剤を用いる、酵母自己溶解物からの細胞残分の分離も公知である。
【０００５】
細胞砕解のための通常の方法は公知のアルカリ性溶解および熱的溶解である。細胞砕解を改善するために、しばしば酵素、例えばリソチーム、および／または細胞懸濁のための界面活性剤を添加する。アルカリ性溶解法においては、水酸化ナトリウム溶液およびナトリウムドデシルスルフェートの添加によるｐＨ１２での細胞砕解、および高いモル濃度の酢酸塩緩衝液での中和により沈殿物が得られ、これは実質的に細胞破壊屑およびゲノムＤＮＡおよび蛋白質の一部を含有する。この沈殿物の完全な分離は強力な遠心分離によってのみ達成することができる。このためには、１２０００ｇの遠心加速度では十分ではない（l. Feliciello et al., Anal. Biochem. 212 (1993) 394-401）。４℃で３０分間、遠心加速度２６０００ｇで初めて、この沈殿物は十分に分離される。これに対してこの沈殿物の濾過は、微細な濾過助剤を用いて、またはフロテーション工程と組み合わせて、低い工程速度とプラスミドＤＮＡの高い損失と結びついている。プラスミドＤＮＡのフィルター助剤表面への吸着は著しい損失を伴う。特にプラスミドＤＮＡは、二価のカチオンの濃度が０.１ミリモルまたは一価のカチオンの濃度がカリウムの場合には２０ミリモルまたはナトリウムの場合には５０ミリモルに上昇する場合には、そのようなミネラル表面に非常に迅速にかつ強固に結合する（G. Romanowski et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 1057-1061）。
【０００６】
高分子量の核酸は剪断力に対して敏感である。強い剪断力は核酸の非可逆的な損傷、特に鎖切断に導く。このような理由から核酸処理のために機械的な砕解法はほとんど使用されない（A. Carlson et. al., Biothechnol. Bioeng. 48(1995) 303-315）。連続的な液体供給の工業的な遠心においては、高い剪断力がローター入口で核酸に作用し、必然的に鎖切断に導く。
【０００７】
ＷＯ９６／３６７０６中には、微生物を界面活性剤（Triton（Ｒ））の存在で、かつ貫流熱交換装置中で７０℃〜１００℃に加熱することにより砕解する方法が記載されている。これは熱的溶解と界面活性剤（場合によりリソチームをプラス）との組合せ法である。リソチームなしの場合には熱処理は３０秒であると記載されており、リソチームを用いる場合には６秒間である。加熱による細胞砕解は、細胞屑、ゲノムＤＮＡおよび蛋白質からなる固体化合物を形成する。更に、熱処理によりＤＮＡを分解する酵素、いわゆるＤＮアーゼの著しい変性が生じる。透明な細胞溶解物はバッチ式の遠心分離により得られる。この方法では、細胞砕解のみが連続的に実施され、固体成分の分離は遠心分離によるバッチ式により行われる。最終的な透明な細胞溶解物を獲得するためには、遠心分離に続けて、更にメンブランフィルターを介して濾過を実施しなければならない。
【０００８】
ＷＯ９２０７８６３によれば細胞懸濁液から核酸を単離するための装置および方法が公知である。この文献によれば、細胞を予め装入した多孔性のマトリックスの中空室中に層の形で固定化する。このことはマトリックス中への深部濾過により達せられ、その際に中空室の大きさはほぼ細胞の大きさであり、マトリックス表面はイオン交換体特性を示す。マトリックスの粒度は１０〜５０μｍである。イオン交換体特性により、ＤＮＡはマトリックスの表面に吸収される。ＤＮＡの吸収は本発明の課題ではない。公知の方法は精製したＤＮＡを提供するが、透明なプラスミドＤＮＡではない。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０８１４１５６によれば、ＤＮＡの清浄化法が記載されている。この中に使用した珪藻土は詳細には特定されていない。溶解はアルカリ法により行われる。熱溶解は記載されていない。
【００１０】
こうして、公知技術からは多量のバイオマスを総合して加工することを可能にする方法も、統合的に多量のプラスミドＤＮＡ含有透明細胞溶解物を製造することができる方法も公知ではない。
【００１１】
プラスミドＤＮＡ精製を可能にする、細胞培養工程から透明なプラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物を製造するための効果的なコンディショニング法に対する要求がある。
【００１２】
従って、本発明方法の基礎となる課題は、アルカリ性溶解法および遠心分離の欠点を回避して効果的で制御された方法で多量の透明な細胞溶解物をバイオマスから高いプラスミドＤＮＡ収率で製造する、統合処理法を提供することである。
【００１３】
この課題は、第１の工程でそれぞれ濾過助剤の存在下にフィルター中で濾過し、第２の工程でフィルターケーキ中に含有されるバイオマスを熱的に砕解し、次の工程で細胞溶解物を濾過することにより解決する。
【００１４】
本発明方法により５０ｍｌ〜１００００ｌの全ての体積量のバイオマスを迅速に、プラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物に処理することができることが確認された。本発明の方法を用いて、濾過においてかけられる過圧に関して、核酸に作用する剪断力に関してのコントロールが加えられるということが、特に有利である。本発明により製造した細胞溶解物はゲル電気泳動による分離の後に、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡのためのバンドの他に、鎖切断による核酸の認識できる損傷を有さないプラスミドＤＮＡのためのバンドを明らかに示す。更に得られた細胞溶解物は熱処理による不快な臭気を有さない。
【００１５】
砕解の際にフィルター助剤が存在しているということは有利である。このことは引き続く細胞溶解物の透明濾過のために必要な濾過助剤がすでに存在しているという利点を有する。全ての部分工程（分離、砕解、透明化）にわたって、同じ濾過助剤を連続的に使用するということは、更に技術的に効果的であり、こうして経済的である。溶解のためにフィルターケーキを懸濁する代わりに、存在するフィルターケーキ中で直接熱的砕解および透明濾過を組み合わせ実施し（例えば熱溶解緩衝液のポンプによる通過）、こうして直接非常に透明な細胞溶解物を獲得することができる場合、特に有利である。こうして、全方法を個々の工程の数を減らすことにより更に効果的に、こうして経済的に、より有利になる。
【００１６】
フィルター助剤の選択は決定的な意味を有する。フィルター助剤は、吸着効果を最少にするために不活性でなければならない。フィルター助剤としては、ＳｉＯ２含量が少なくとも９０質量％であり、かつ更に以下の特性：
・湿潤密度：０.２〜０.４ｇ／ｃｍ３
・透過性：０.０２〜２ダーシー
・ＢＥＴ表面積：２〜２０ｍ２／ｇ
・幾何学的表面積：０.２５〜０.６５ｍ２／ｇ
・粒度：２.５〜８.０μｍ
・保持（９９％）粒度（Partikelgroessenretention(99%)）：０.１〜２μｍ
を有するか焼した珪藻土を使用するのが有利であることが示された。
【００１７】
このことは濾過工程において非常に透明な濾液が、中程度の圧力差で十分に高い濾過流で得られるという利点を有する。
【００１８】
この高純度濾過助剤の使用は、この効率性および有効性とからなる組合せのほかに、その表面が規格化されており、こうしてその特性をコントロールすることができるという利点を提供する。
【００１９】
全ての工程で同じ濾過助剤を使用するということも、同様に有利である。このことは個々の工程が一体になって移行し、こうして生成物流が実質的に連続的に移動する利点を有する。
【００２０】
濾過すべき溶液の固体含量に対する濾過助剤の量、濾過面積および負荷する最大濾過過圧の高さは経験的にのみ決定することができる。
【００２１】
砕解を熱的に実施することは、特に有利であるとして示されている。この方法はこの砕解を緩和な例えば、生理学的なｐＨ範囲で、非常に良好に制御可能に、かつ再現性の条件下に実施することができるという利点を有する。細胞懸濁液のバッチ式の加熱の代わりに、貫流熱交換器を使用する場合、この方法の速度を著しく上昇させることができる。更に、ＤＮＡ分解酵素の一部が加熱の際に不活性化すると思われる。臭気による負荷は、アルカリ性溶解に比較して、熱溶解において明らかに僅かである。
【００２２】
砕解は、７０〜９０℃、有利に７０〜８５℃、特に有利には８０℃の温度で実施する。７０℃より低い温度では熱的砕解は不完全である；９０℃を越える温度ではプラスミドＤＮＡは溶融する。熱負荷の時間は経験的にのみ決定することができる。これは３０秒〜数分間である。
【００２３】
砕解は７〜１０のｐＨ値で実施しなければならない。このｐＨ−範囲においてはプラスミドＤＮＡの吸着損失は最少であり、リソチームの活性は最適である。更に、得られた透明な細胞溶解物中のプラスミドＤＮＡはすでに生理学的なｐＨ−範囲に存在する。
【００２４】
砕解を一価のカチオンの存在で実施するのが有利である。このことは引き続く透明なプラスミドＤＮＡ−細胞溶解物への濾過の際の、濾過助剤表面への吸着による損失が最少である、という利点を有する。細胞砕解の際に遊離される多価のカチオン、は錯形成剤によりマスクされる。
【００２５】
カチオンの最高濃度はＫ＋に関しては最高で２０ミリモル、Ｎａ＋に関しては最高で５０ミリモルまたはＮＨ４＋に関しては最高で１５０ミリモルである。この最高濃度を越える際にはフィルター助剤表面への吸収によるプラスミドＤＮＡの損失が生じる。多くのカチオンの種類が存在する場合には、許容される全濃度を特定する際に、効果の相加性も考慮に入れなければならない。
【００２６】
透明なプラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物は少なくとも９９％の混濁の減少に相当する、０.０５Ｕ／ｃｍ以下の透明度ＯＤ６００を特徴とする。得られたプラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物をクローン化のために、形質転換のために、トランスフェクションのために、細胞中へのマイクロインジョクションのために、遺伝子治療のために、ＤＮＡワクチン化のために、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために使用することができる。
【００２７】
実施例により、本発明をより詳細に説明する。
【００２８】
例１
Ｅ.コリ株ＴＧ１中のプラスミドＤＮＡｐＨＥＮ１（４６１８ｂｐ）を２ＴＹ媒体中で、振盪フラスコ中で３７℃で１６時間増殖させた。それぞれ１２５ｍｌの３つのＥ.コリ懸濁液（ＯＤ６００＝６）にCelpureP300（Ｒ）（World Minerals Inc. 社の商標）を１５、３０もしくは６０ｇ／ｌ添加し、２０℃で連続的に攪拌する。次いで、それぞれの懸濁液を吸引フィルター（フィルター面積１０ｃｍ２、充填体積２００ｍｌ）中に入れ、その際予めCelpureP300（Ｒ）２ｋｇ／ｍ２の前フィルターケーキをポリプロピレンモノフィラメントからなるフィルター媒体（孔径１０μｍ）上に設けた。濾過を０.５バールの過圧および２０℃で実施した。
【００２９】
全ての場合に透明な濾液が得られた。最も高い平均濾過流（２.８ｍ３／ｍ２ｈ）はCelpureP300(R)３０ｇ／ｌで達せられた。
【００３０】
結果を第１表中にまとめた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
例２
溶解緩衝液Ａ：
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ １５０ミリモル、Ｎａ２ＥＤＴＡ ２５ミリモル、サッカロース８質量％（ｐＨ９）
溶解緩衝液Ｂ：
溶解緩衝液Ａと同様であるが、付加的にＴｒｉｔｏｎＸ-１００（Ｒ）（Roehm und Haas社の商標）２％
CelpureP300（Ｒ）３０ｇ／ｌを有する、例１からの２つのフィルターケーキをそれぞれ溶解緩衝液ＡまたはＢ１９０ｍｌ中で再懸濁させる。リソチーム５００Ｕ／ｍｌをそれぞれ添加し、この懸濁液を連続的な撹拌下に、８０℃に３０秒間加熱する。まだ熱い懸濁液を、予めCelpureP300（Ｒ）２ｋｇ／ｍ２の前フィルターケーキ（相応する溶解緩衝液中で１５分間インキュベートした）がポリプロピレンモノフィラメントからなるフィルター媒体（孔径１０μｍ）上に設けられた吸引フィルターに供給する。濾液を０.５バールの過圧で実施した。
【００３３】
溶解緩衝液Ａにより平均濾過流０.４ｍ３／ｍ２ｈで透明な細胞溶解物（ＯＤ６００＝０.０２）が得られた。これに対して、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（Ｒ）の添加により（溶解緩衝液Ｂ）、平均濾過流は５０％だけ減少した。溶解緩衝液Ａ中での平均濾過流の１.５ｍ３／ｍ２ｈへの明らかな上昇は、CelpureP300（Ｒ）の全量が１００ｇ／ｌに調節してあり、かつＰＶＤＦたて糸／ＰＴＦＥ緯糸モノフィラメント（孔径１１.５μｍ）をフィルター媒体として使用している場合に達成された。
【００３４】
例３
λＤＮＡ（Ｅ.コリ；ｄｓＤＮＡ４８.５ｋｂ；０.５１ｍｇ／ｍｌ）３.７ｍｌを、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ２５０ミリモル、Ｎａ２ＥＤＴＡ ２５ミリモル、サッカロース８質量％（ｐＨ９.０９）からなる緩衝溶液２５ｍｌ中に添加した。CelpureP300（Ｒ）（３０ｇ／ｌ）を添加し、この懸濁液を２０℃で、３０分間２００ｒｐｍで振盪する。
【００３５】
２６０ｎｍでのＵＶ吸収測定およびPicoGreen（Ｒ）テスト（Molekular Probes Inc.社のキット）は懸濁液の上澄み中のλＤＮＡ濃度と出発溶液中の濃度との間に差を示さない。
【００３６】
例４
プラスミドＤＮＡｐＥＧＦＰ−Ｎ１を有するＥ.コリ細胞ＤＨ５αをＴｒｉｓ・ＨＣｌおよびＥＤＴＡ１０ミリモルからなる緩衝液中に４等分して懸濁する。これらの懸濁液の１つから細胞をNucleobond（Ｒ） AXキット（Macherey-Nagelの商標）を用いて、アルカリ性溶解法により砕解し、プラスミドＤＮＡを単離し、精製した。他の３つの懸濁液においては細胞を熱的に７０℃／ｐＨ９、７０℃／ｐＨ１０もしくは６０℃／ｐＨ１０で５分間砕解し、かつプラスミドＤＮＡをそれぞれ同じキットで単離し、精製した。この４つの試料のPicoGreen（Ｒ）テストによるプラスミドＤＮＡ定量は、アルカリ性溶解法による砕解および７０℃およびｐＨ９もしくはｐＨ１０での熱的溶解は同じ収率のプラスミドＤＮＡに導き、一方６０℃でｐＨ１０の熱的砕解は、他の３つの方法により得られたプラスミドＤＮＡの収率の約３０％に導く。例３からは記載した熱的溶解条件下に、フィルター助剤表面にプラスミドＤＮＡの吸着が期待されないことを知ることができる。
【００３７】
測定法：
透明性の測定
濾液の透明性（光学密度、ＯＤ）はPerkin-Elmer社のUV/Vis Spektrometer Lamda 20 を用いて、参照としての水に対して、吸収モード６００ｎｍで、１ｃｍの行程で、室温で測定する。
本発明はプラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物を製造するための細胞培養法からのバイオマスの統合処理法、並びにこの方法により製造されたプラスミドＤＮＡ細胞溶解物に関する。
【０００２】
処理とは透明な、プラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物を製造するためのコンディショニング法であると理解する。統合処理法とは個々の工程が一体になって移行し、こうして生成物流が実質的に連続的に移動する方法であると理解するべきである。多工程の方法を連続的にまたはバッチ式に実施することができる。
【０００３】
細胞培養工程からの生物学的材料の分離、生物学的材料の砕解および透明な、プラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物の製造は分子生物学の分野においては、汎用される方法である。公知の方法においては、生物学的材料を、例えばＥ.コリバクテリア細胞からの生物学的材料を、培養上澄みから分離し、再懸濁後に砕解する。固体成分の分離後に、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質およびエンドトキシンと共にプラスミドＤＮＡを含有するいわゆる透明な細胞溶解物を製造する。
【０００４】
生物学的材料を細胞培養工程からバッチ式にまたは連続的に遠心により分離することは公知である。フィルター助剤のベッドを介して濾過することによるベーキング酵母細胞の分離がＧＢ−Ａ−１０８２８６２中に記載されている。これによれば、フィルター助剤を用いる、酵母自己溶解物からの細胞残分の分離も公知である。
【０００５】
細胞砕解のための通常の方法は公知のアルカリ性溶解および熱的溶解である。細胞砕解を改善するために、しばしば酵素、例えばリソチーム、および／または細胞懸濁のための界面活性剤を添加する。アルカリ性溶解法においては、水酸化ナトリウム溶液およびナトリウムドデシルスルフェートの添加によるｐＨ１２での細胞砕解、および高いモル濃度の酢酸塩緩衝液での中和により沈殿物が得られ、これは実質的に細胞破壊屑およびゲノムＤＮＡおよび蛋白質の一部を含有する。この沈殿物の完全な分離は強力な遠心分離によってのみ達成することができる。このためには、１２０００ｇの遠心加速度では十分ではない（l. Feliciello et al., Anal. Biochem. 212 (1993) 394-401）。４℃で３０分間、遠心加速度２６０００ｇで初めて、この沈殿物は十分に分離される。これに対してこの沈殿物の濾過は、微細な濾過助剤を用いて、またはフロテーション工程と組み合わせて、低い工程速度とプラスミドＤＮＡの高い損失と結びついている。プラスミドＤＮＡのフィルター助剤表面への吸着は著しい損失を伴う。特にプラスミドＤＮＡは、二価のカチオンの濃度が０.１ミリモルまたは一価のカチオンの濃度がカリウムの場合には２０ミリモルまたはナトリウムの場合には５０ミリモルに上昇する場合には、そのようなミネラル表面に非常に迅速にかつ強固に結合する（G. Romanowski et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 1057-1061）。
【０００６】
高分子量の核酸は剪断力に対して敏感である。強い剪断力は核酸の非可逆的な損傷、特に鎖切断に導く。このような理由から核酸処理のために機械的な砕解法はほとんど使用されない（A. Carlson et. al., Biothechnol. Bioeng. 48(1995) 303-315）。連続的な液体供給の工業的な遠心においては、高い剪断力がローター入口で核酸に作用し、必然的に鎖切断に導く。
【０００７】
ＷＯ９６／３６７０６中には、微生物を界面活性剤（Triton（Ｒ））の存在で、かつ貫流熱交換装置中で７０℃〜１００℃に加熱することにより砕解する方法が記載されている。これは熱的溶解と界面活性剤（場合によりリソチームをプラス）との組合せ法である。リソチームなしの場合には熱処理は３０秒であると記載されており、リソチームを用いる場合には６秒間である。加熱による細胞砕解は、細胞屑、ゲノムＤＮＡおよび蛋白質からなる固体化合物を形成する。更に、熱処理によりＤＮＡを分解する酵素、いわゆるＤＮアーゼの著しい変性が生じる。透明な細胞溶解物はバッチ式の遠心分離により得られる。この方法では、細胞砕解のみが連続的に実施され、固体成分の分離は遠心分離によるバッチ式により行われる。最終的な透明な細胞溶解物を獲得するためには、遠心分離に続けて、更にメンブランフィルターを介して濾過を実施しなければならない。
【０００８】
ＷＯ９２０７８６３によれば細胞懸濁液から核酸を単離するための装置および方法が公知である。この文献によれば、細胞を予め装入した多孔性のマトリックスの中空室中に層の形で固定化する。このことはマトリックス中への深部濾過により達せられ、その際に中空室の大きさはほぼ細胞の大きさであり、マトリックス表面はイオン交換体特性を示す。マトリックスの粒度は１０〜５０μｍである。イオン交換体特性により、ＤＮＡはマトリックスの表面に吸収される。ＤＮＡの吸収は本発明の課題ではない。公知の方法は精製したＤＮＡを提供するが、透明なプラスミドＤＮＡではない。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０８１４１５６によれば、ＤＮＡの清浄化法が記載されている。この中に使用した珪藻土は詳細には特定されていない。溶解はアルカリ法により行われる。熱溶解は記載されていない。
【００１０】
こうして、公知技術からは多量のバイオマスを総合して加工することを可能にする方法も、統合的に多量のプラスミドＤＮＡ含有透明細胞溶解物を製造することができる方法も公知ではない。
【００１１】
プラスミドＤＮＡ精製を可能にする、細胞培養工程から透明なプラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物を製造するための効果的なコンディショニング法に対する要求がある。
【００１２】
従って、本発明方法の基礎となる課題は、アルカリ性溶解法および遠心分離の欠点を回避して効果的で制御された方法で多量の透明な細胞溶解物をバイオマスから高いプラスミドＤＮＡ収率で製造する、統合処理法を提供することである。
【００１３】
この課題は、第１の工程でそれぞれ濾過助剤の存在下にフィルター中で濾過し、第２の工程でフィルターケーキ中に含有されるバイオマスを熱的に砕解し、次の工程で細胞溶解物を濾過することにより解決する。
【００１４】
本発明方法により５０ｍｌ〜１００００ｌの全ての体積量のバイオマスを迅速に、プラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物に処理することができることが確認された。本発明の方法を用いて、濾過においてかけられる過圧に関して、核酸に作用する剪断力に関してのコントロールが加えられるということが、特に有利である。本発明により製造した細胞溶解物はゲル電気泳動による分離の後に、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡのためのバンドの他に、鎖切断による核酸の認識できる損傷を有さないプラスミドＤＮＡのためのバンドを明らかに示す。更に得られた細胞溶解物は熱処理による不快な臭気を有さない。
【００１５】
砕解の際にフィルター助剤が存在しているということは有利である。このことは引き続く細胞溶解物の透明濾過のために必要な濾過助剤がすでに存在しているという利点を有する。全ての部分工程（分離、砕解、透明化）にわたって、同じ濾過助剤を連続的に使用するということは、更に技術的に効果的であり、こうして経済的である。溶解のためにフィルターケーキを懸濁する代わりに、存在するフィルターケーキ中で直接熱的砕解および透明濾過を組み合わせ実施し（例えば熱溶解緩衝液のポンプによる通過）、こうして直接非常に透明な細胞溶解物を獲得することができる場合、特に有利である。こうして、全方法を個々の工程の数を減らすことにより更に効果的に、こうして経済的に、より有利になる。
【００１６】
フィルター助剤の選択は決定的な意味を有する。フィルター助剤は、吸着効果を最少にするために不活性でなければならない。フィルター助剤としては、ＳｉＯ２含量が少なくとも９０質量％であり、かつ更に以下の特性：
・湿潤密度：０.２〜０.４ｇ／ｃｍ３
・透過性：０.０２〜２ダーシー
・ＢＥＴ表面積：２〜２０ｍ２／ｇ
・幾何学的表面積：０.２５〜０.６５ｍ２／ｇ
・粒度：２.５〜８.０μｍ
・保持（９９％）粒度（Partikelgroessenretention(99%)）：０.１〜２μｍ
を有するか焼した珪藻土を使用するのが有利であることが示された。
【００１７】
このことは濾過工程において非常に透明な濾液が、中程度の圧力差で十分に高い濾過流で得られるという利点を有する。
【００１８】
この高純度濾過助剤の使用は、この効率性および有効性とからなる組合せのほかに、その表面が規格化されており、こうしてその特性をコントロールすることができるという利点を提供する。
【００１９】
全ての工程で同じ濾過助剤を使用するということも、同様に有利である。このことは個々の工程が一体になって移行し、こうして生成物流が実質的に連続的に移動する利点を有する。
【００２０】
濾過すべき溶液の固体含量に対する濾過助剤の量、濾過面積および負荷する最大濾過過圧の高さは経験的にのみ決定することができる。
【００２１】
砕解を熱的に実施することは、特に有利であるとして示されている。この方法はこの砕解を緩和な例えば、生理学的なｐＨ範囲で、非常に良好に制御可能に、かつ再現性の条件下に実施することができるという利点を有する。細胞懸濁液のバッチ式の加熱の代わりに、貫流熱交換器を使用する場合、この方法の速度を著しく上昇させることができる。更に、ＤＮＡ分解酵素の一部が加熱の際に不活性化すると思われる。臭気による負荷は、アルカリ性溶解に比較して、熱溶解において明らかに僅かである。
【００２２】
砕解は、７０〜９０℃、有利に７０〜８５℃、特に有利には８０℃の温度で実施する。７０℃より低い温度では熱的砕解は不完全である；９０℃を越える温度ではプラスミドＤＮＡは溶融する。熱負荷の時間は経験的にのみ決定することができる。これは３０秒〜数分間である。
【００２３】
砕解は７〜１０のｐＨ値で実施しなければならない。このｐＨ−範囲においてはプラスミドＤＮＡの吸着損失は最少であり、リソチームの活性は最適である。更に、得られた透明な細胞溶解物中のプラスミドＤＮＡはすでに生理学的なｐＨ−範囲に存在する。
【００２４】
砕解を一価のカチオンの存在で実施するのが有利である。このことは引き続く透明なプラスミドＤＮＡ−細胞溶解物への濾過の際の、濾過助剤表面への吸着による損失が最少である、という利点を有する。細胞砕解の際に遊離される多価のカチオン、は錯形成剤によりマスクされる。
【００２５】
カチオンの最高濃度はＫ＋に関しては最高で２０ミリモル、Ｎａ＋に関しては最高で５０ミリモルまたはＮＨ４＋に関しては最高で１５０ミリモルである。この最高濃度を越える際にはフィルター助剤表面への吸収によるプラスミドＤＮＡの損失が生じる。多くのカチオンの種類が存在する場合には、許容される全濃度を特定する際に、効果の相加性も考慮に入れなければならない。
【００２６】
透明なプラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物は少なくとも９９％の混濁の減少に相当する、０.０５Ｕ／ｃｍ以下の透明度ＯＤ６００を特徴とする。得られたプラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物をクローン化のために、形質転換のために、トランスフェクションのために、細胞中へのマイクロインジョクションのために、遺伝子治療のために、ＤＮＡワクチン化のために、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために使用することができる。
【００２７】
実施例により、本発明をより詳細に説明する。
【００２８】
例１
Ｅ.コリ株ＴＧ１中のプラスミドＤＮＡｐＨＥＮ１（４６１８ｂｐ）を２ＴＹ媒体中で、振盪フラスコ中で３７℃で１６時間増殖させた。それぞれ１２５ｍｌの３つのＥ.コリ懸濁液（ＯＤ６００＝６）にCelpureP300（Ｒ）（World Minerals Inc. 社の商標）を１５、３０もしくは６０ｇ／ｌ添加し、２０℃で連続的に攪拌する。次いで、それぞれの懸濁液を吸引フィルター（フィルター面積１０ｃｍ２、充填体積２００ｍｌ）中に入れ、その際予めCelpureP300（Ｒ）２ｋｇ／ｍ２の前フィルターケーキをポリプロピレンモノフィラメントからなるフィルター媒体（孔径１０μｍ）上に設けた。濾過を０.５バールの過圧および２０℃で実施した。
【００２９】
全ての場合に透明な濾液が得られた。最も高い平均濾過流（２.８ｍ３／ｍ２ｈ）はCelpureP300(R)３０ｇ／ｌで達せられた。
【００３０】
結果を第１表中にまとめた。
【００３１】
【表１】
例２
溶解緩衝液Ａ：
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ １５０ミリモル、Ｎａ２ＥＤＴＡ ２５ミリモル、サッカロース８質量％（ｐＨ９）
溶解緩衝液Ｂ：
溶解緩衝液Ａと同様であるが、付加的にＴｒｉｔｏｎＸ-１００（Ｒ）（Roehm und Haas社の商標）２％
CelpureP300（Ｒ）３０ｇ／ｌを有する、例１からの２つのフィルターケーキをそれぞれ溶解緩衝液ＡまたはＢ１９０ｍｌ中で再懸濁させる。リソチーム５００Ｕ／ｍｌをそれぞれ添加し、この懸濁液を連続的な撹拌下に、８０℃に３０秒間加熱する。まだ熱い懸濁液を、予めCelpureP300（Ｒ）２ｋｇ／ｍ２の前フィルターケーキ（相応する溶解緩衝液中で１５分間インキュベートした）がポリプロピレンモノフィラメントからなるフィルター媒体（孔径１０μｍ）上に設けられた吸引フィルターに供給する。濾液を０.５バールの過圧で実施した。
【００３３】
溶解緩衝液Ａにより平均濾過流０.４ｍ３／ｍ２ｈで透明な細胞溶解物（ＯＤ６００＝０.０２）が得られた。これに対して、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００（Ｒ）の添加により（溶解緩衝液Ｂ）、平均濾過流は５０％だけ減少した。溶解緩衝液Ａ中での平均濾過流の１.５ｍ３／ｍ２ｈへの明らかな上昇は、CelpureP300（Ｒ）の全量が１００ｇ／ｌに調節してあり、かつＰＶＤＦたて糸／ＰＴＦＥ緯糸モノフィラメント（孔径１１.５μｍ）をフィルター媒体として使用している場合に達成された。
【００３４】
例３
λＤＮＡ（Ｅ.コリ；ｄｓＤＮＡ４８.５ｋｂ；０.５１ｍｇ／ｍｌ）３.７ｍｌを、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ２５０ミリモル、Ｎａ２ＥＤＴＡ ２５ミリモル、サッカロース８質量％（ｐＨ９.０９）からなる緩衝溶液２５ｍｌ中に添加した。CelpureP300（Ｒ）（３０ｇ／ｌ）を添加し、この懸濁液を２０℃で、３０分間２００ｒｐｍで振盪する。
【００３５】
２６０ｎｍでのＵＶ吸収測定およびPicoGreen（Ｒ）テスト（Molekular Probes Inc.社のキット）は懸濁液の上澄み中のλＤＮＡ濃度と出発溶液中の濃度との間に差を示さない。
【００３６】
例４
プラスミドＤＮＡｐＥＧＦＰ−Ｎ１を有するＥ.コリ細胞ＤＨ５αをＴｒｉｓ・ＨＣｌおよびＥＤＴＡ１０ミリモルからなる緩衝液中に４等分して懸濁する。これらの懸濁液の１つから細胞をNucleobond（Ｒ） AXキット（Macherey-Nagelの商標）を用いて、アルカリ性溶解法により砕解し、プラスミドＤＮＡを単離し、精製した。他の３つの懸濁液においては細胞を熱的に７０℃／ｐＨ９、７０℃／ｐＨ１０もしくは６０℃／ｐＨ１０で５分間砕解し、かつプラスミドＤＮＡをそれぞれ同じキットで単離し、精製した。この４つの試料のPicoGreen（Ｒ）テストによるプラスミドＤＮＡ定量は、アルカリ性溶解法による砕解および７０℃およびｐＨ９もしくはｐＨ１０での熱的溶解は同じ収率のプラスミドＤＮＡに導き、一方６０℃でｐＨ１０の熱的砕解は、他の３つの方法により得られたプラスミドＤＮＡの収率の約３０％に導く。例３からは記載した熱的溶解条件下に、フィルター助剤表面にプラスミドＤＮＡの吸着が期待されないことを知ることができる。
【００３７】
測定法：
透明性の測定
濾液の透明性（光学密度、ＯＤ）はPerkin-Elmer社のUV/Vis Spektrometer Lamda 20 を用いて、参照としての水に対して、吸収モード６００ｎｍで、１ｃｍの行程で、室温で測定する。
Claims (7)
- プラスミドＤＮＡを含有する透明な細胞溶解物を製造するために、細胞培養法からのバイオマスを統合処理する方法において、それぞれ不活性なフィルター助剤の存在下に、第１の工程でフィルター中で濾過し、第２の工程でフィルターケーキ中に含有されるバイオマスを熱的に砕解し、次の工程で細胞溶解物を濾過し、その際不活性なフィルター助剤として、次の特性：
・二酸化ケイ素の割合≧９０％
・湿潤密度：０ . ２〜０ . ４ｇ／ｃｍ ３
・透過性：０ . ０２〜２ダーシー
・ＢＥＴ表面積：２〜２０ｍ ２ ／ｇ
・幾何学的表面積：０ . ２５〜０ . ６５ｍ ２ ／ｇ
・粒度：２ . ５〜８ . ０μｍ
・保持（９９％）粒度：０ . １〜２μｍ
を有する珪藻土を使用することを特徴とする、バイオマスの統合処理法。 - 砕解を７０〜９０℃で実施する、請求項１記載の方法。
- 熱的な砕解を少なくとも３０秒間実施する、請求項１記載の方法。
- ３工程全てにおいて同じフィルター助剤を使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
- 砕解を７〜９のｐＨ値で実施する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
- 砕解を一価のカチオンのみの存在で実施する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
- カチオンの最高濃度がＫ＋に関しては最高で２０ミリモル、Ｎａ＋に関しては最高で５０ミリモルまたはＮＨ４ ＋に関しては最高で１５０ミリモルである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
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