ES2251441T3 - Preparacion integrada de biomasa a partir de un proceso de cultivo celular para la fabricacion de lisato celular claro, que contiene adn plasmido. - Google Patents
Preparacion integrada de biomasa a partir de un proceso de cultivo celular para la fabricacion de lisato celular claro, que contiene adn plasmido.Info
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Abstract
Método para la preparación integrada de biomasa de un proceso de cultivo celular para la fabricación de lisato celular claro que contiene ADN plásmido, caracterizado porque, en una primera etapa, se filtra cada vez en un filtro en presencia de un material filtrante inerte, en una segunda etapa, se prepara térmicamente la biomasa contenida en la torta de filtración y, en una etapa ulterior, se filtra el lisato celular.
Description
Preparación integrada de biomasa a partir de un
proceso de cultivo celular para la fabricación de lisato celular
claro, que contiene ADN plásmido.
La presente invención se refiere a un método para
la preparación integrada de biomasa a partir de un proceso de
cultivo celular para la fabricación de lisato celular claro, que
contiene ADN plásmido, así como un lisato celular de ADN plásmido,
fabricado según el método.
Se entiende por "preparación" un método de
acondicionamiento para obtener lisato celular claro que contiene
ADN plásmido. Por procedimiento integrado, se entiende un método en
el que las diversas etapas convergen de forma que la corriente de
producto es prácticamente continua. El método, de por sí de varias
etapas, puede realizarse de forma continua o por cargas.
La separación de material biológico de un proceso
de cultivo celular, la preparación del material biológico y la
fabricación de un lisato celular claro que contiene ADN plásmido es
un método usual en el sector de la biología molecular. En los
métodos conocidos, se separa material biológico, por ejemplo de
células de bacterias E. coli, del sobrante de cultivo y se
prepara después del re-espumado. Después de la
separación de los componentes sólidos, se obtiene un lisato celular
claro que además de ADN genómico, ARN, proteínas y endotoxinas,
contiene el ADN plásmido.
Se conoce la forma de separar material biológico,
mediante centrifugado continuo o por cargas, del proceso de cultivo
celular. La separación de células de levadura por filtración sobre
un lecho de material filtrante se describe en el documento
GB-A-1082862. En virtud del mismo,
se conoce también la separación de residuos celulares, mediante
material filtrante, de un autorizado de levadura.
Los métodos usuales para la preparación celular
son la conocida tisis alcalina y la tisis térmica. Para mejorar la
preparación celular, se suelen añadir enzimas, por ejemplo,
lisozima y/o detergentes a la suspensión celular. En el método de
lisis alcalina, después de la preparación celular a un pH 12,
añadiendo lejía de sosa y dodecil sulfato sódico y neutralizando
seguidamente con un tampón de acetato de elevada molaridad, se
obtiene un precipitado que contiene principalmente los residuos
celulares y partes del ADN genómico y de las proteínas. La
separación completa de este precipitado sólo se consigue
centrifugando intensamente. Una aceleración centrífuga de 12.000
gramos no resulta suficiente para ello (I. Feliciello et
al., Anal. Biochem. 212 (1993) 394-401).
Únicamente con una aceleración centrífuga de 26000 g durante 30
minutos a 4ºC se podrá separar al máximo el precipitado. La
filtración de este precipitado en cambio, incluso recurriendo a
material filtrante finísimo o en combinación con una etapa de
flotación, lleva consigo velocidades de proceso bajas y elevadas
pérdidas de ADN plásmido. La adsorción de ADN plásmido en la
superficie del material filtrante contribuye considerablemente a las
pérdidas. En particular, el ADN plásmido se une de forma muy rápida
y sólida a estas superficies de mineral cuando la concentración de
cationes bivalentes supera 0,1 mmol o la de cationes monovalentes
es superior a 20 mmol en el caso de potasio o 50 mmol en el caso de
sodio (G. Romanowski et al., Appl. Environ,. Microbiol. 57
(1991)
1057-1061).
1057-1061).
Los ácidos nucléicos de alto peso molecular son
sensibles a las fuerzas transversales / de cizallamiento. Unas
fuerzas transversales de cierta intensidad pueden causar daños
irreversibles en los ácidos nucléicos, en particular roturas de
cadena. Por este motivo, se utilizan pocas veces los métodos de
preparación mecánica para el tratamiento del ácido nucléico (A.
Carlson et al., Biotechnol. Boeing. 48 (1995)
303-315). Se sabe también que en las
centrifugadoras industriales con alimentación continua de líquidos
actúan en la entrada del rotor unas elevadas fuerzas transversales
sobre los ácidos nucléicos, que producen inevitablemente roturas de
cadenas.
En el documento WO 96/36706 se describe un método
en el que se preparan microorganismos en presencia de detergentes
(Triton®) y calentando a 70ºC-100ºC en un
intercambiador de calor de paso. Se trata de un método de
combinación de termólisis y un detergente (opcionalmente más
enzima). Sin lisozima, se describe un tratamiento térmico durante
30 segundos, y con lisozima un tratamiento de 6 segundos. En la
preparación celular por calentamiento se forman combinaciones
sólidas de residuos, ADN genómico y proteínas. Además, es de
suponer que, debido al tratamiento térmico, se produce una amplia
desnaturalización de enzimas que descomponen el ADN, las
denominadas Dnasas. Después de la centrifugación por cargas, se
obtiene un lisato celular claro. En este método sólo se realiza de
forma continua la preparación celular, y la separación de los
componentes sólidos se realiza por cargas mediante centrifugación.
Para obtener el lisato celular claro definitivo, habría que
realizar después de la centrifugación otra filtración a través de un
filtro de membrana.
Según el documento WO 92 07863, se conocen un
dispositivo y un método para el aislamiento de ácidos nucléicos a
partir de suspensiones celulares. Según dicho documento, las
células se inmovilizan en cavidades de una matriz porosa en forma
de capa. Esto se consigue mediante una filtración profunda en la
matriz, haciendo que el tamaño de las cavidades sea del mismo orden
que las células y la superficie de la matriz presente propiedades
cambiadoras de iones. El tamaño de las partículas de la matriz es
de 10 a 50 \mum. Debido a las propiedades cambiadoras de iones,
absorbe ADN en la superficie de la matriz. La absorción de ADN no
constituye el objeto de la invención. El método conocido presenta
un ADN purificado aunque no un ADN plásmido claro.
Según el documento
EP-A-0814156, se describe un método
para la limpieza de ADN. Las Kieselgur que aquí se utilizan no se
especifican con más detalle. La tisis se realiza según el método
alcalino. No describe ninguna tisis térmica. La tisis se realiza
según el procedimiento alcalino. No se describe ninguna lisis
térmica.
En el estado de la técnica, no se conocen métodos
que permitan preparar de forma integrada grandes cantidades de
biomasa ni métodos con los cuales se puedan preparar de forma
integrada grandes cantidades de lisatos celulares claros que
contienen ADN plásmido.
Existe la necesidad de un método eficaz de
acondicionamiento para preparar lisato claro que contiene ADN
plásmido a partir de un proceso de cultivo celular que permita la
purificación de ADN plásmido.
Lo que se pretende por lo tanto con la presente
invención es ofrecer un método de preparación integrada que, de
forma eficaz y controlada, evitando las desventajas del método de
tisis alcalino y de la centrifugación, permita obtener grandes
cantidades de lisatos celulares con elevado rendimiento de ADN
plásmido a partir de una biomasa.
Este problema se resuelve según la invención
filtrando, en una primera etapa, en un filtro en presencia de un
medio filtrante, preparando térmicamente, en una segunda etapa, la
biomasa contenida en la torta de filtrado y filtrando en una etapa
ulterior el lisato celular.
Se ha comprobado que según el método de la
presente invención, se puede elaborar cualquier cantidad
volumétrica, desde 50 ml hasta 10000 litros de biomasa para obtener
lisato celular claro que contiene ADN plásmido. La ventaja
particular en el método de la presente invención es que, por medio
de la sobrepresión existente al filtrar, se dispone del control de
las fuerzas transversales que actúan sobre los ácidos nucléicos. Un
lisato celular fabricado según la invención muestra, en particular,
después de la separación electroforética de gel, además de las
bandas para ADN genómico y ARN, claramente las bandas de ADN
plásmido, sin deterioro apreciable de los ácidos nucléicos como
consecuencia de roturas de cadena. Además, el lisato celular
obtenido por el tratamiento térmico carece de olores
desagradables.
Es conveniente que el material filtrante esté
presente durante la preparación. Esto tiene la ventaja de que el
material filtrante necesario para la siguiente filtración clara del
lisato celular ya está presente. La utilización continua del mismo
material filtrante en todas las etapas parciales (separación,
preparación, aclaración) resulta además eficaz desde el punto de
vista técnico y por consiguiente económica. Resulta particularmente
ventajoso que, en lugar de separar por gravedad la torta de
filtrado para la lisis, se proceda directamente en la torta de
filtrado existente a la preparación térmica y la filtración clara
combinada (por ejemplo bombeando a través de la misma un tampón de
tisis caliente) pudiéndose obtener de este modo directamente un
lisato celular muy claro. De este modo, el método, debido a la
reducción del número de etapas, resulta todavía más eficaz y por lo
tanto más económico.
La elección del material filtrante tiene una
importancia decisiva. El material filtrante debe ser inerte para
minimizar los efectos de la adsorción. Se ha comprobado que resulta
muy conveniente utilizar como material filtrante Kieselgur
calcinada con un contenido de SiO_{2} de por lo menos 90% en peso
con las siguientes propiedades:
\bullet Densidad en condiciones húmedas:
0,2-0,4 g/cm^{3}
\bullet Permeabilidad: 0,02-2
Darcy
\bullet Superficie BET: 2-20
m^{2}/g
\bullet Superficie geométrica:
0,25-0,65 m^{2}/g
\bullet Tamaño de partícula:
2,5-8,0 \mum
\bullet Retención de tamaño de partícula (99%):
0,1-2 \mum
Esto tiene la ventaja de que en una etapa de
filtración se obtiene un filtrado muy claro, con flujo de
filtración suficientemente elevado, con una presión diferencial
moderada. Además de la combinación de eficacia y efectividad, la
utilización de materiales filtrantes muy puros presenta la ventaja
de que sus superficies están normalizadas y por consiguiente se
pueden controlar sus propiedades.
Es asimismo conveniente que en todas las etapas
se utilice el mismo material filtrante. Esto presenta la ventaja de
que las distintas etapas del proceso se superponen de forma que la
corriente de producto se lleva de forma prácticamente continua.
La cantidad de material filtrante, referida al
contenido de sustancia sólida de la solución a filtrar, la
superficie de filtración y la sobrepresión de filtración máxima a
establecer solo se pueden determinar empíricamente.
Se ha comprobado que resulta particularmente
conveniente realizar la preparación térmica. Esto tiene la ventaja
de que la preparación se puede realizar de forma cuidadosa, por
ejemplo en la zona fisiológica de pH, en condiciones que se pueden
controlar y reproducir muy bien. La velocidad del proceso se puede
incrementar considerablemente si, en lugar del calentamiento por
cargas de la suspension celular, se utiliza un cambiador de calor
de paso. Hay que suponer además que al calentar se inactiva una
parte de las enzimas que descomponen el ADN. Comparado con la Tisis
alcalina, el olor resulta mucho menos molesto en tisis térmica.
La preparación se realiza a temperaturas
comprendidas entre 70ºC y 90ºC, de preferencia entre 70ºC y 85ºC,
todavía mejor a 80ºC. A una temperatura de menos de 70ºC, la
preparación térmica es incompleta, a una temperatura por encima de
90ºC el ADN plásmido se funde. La duración del tratamiento térmico
sólo se puede determinar de forma empírica. Es de 30 segundos a
algunos minutos.
La preparación debe realizarse con un pH
comprendido entre 7 y 10. En esta zona de pH las pérdidas por
adsorción de ADN plásmido son mínimas y la actividad de la lisozima
óptima. Además, ya hay ADN plásmido en el lisato celular claro
obtenido en la zona fisiológica de pH.
Es conveniente realizar la preparación en
presencia de cationes exclusivamente monovalentes. Esto tiene la
ventaja de que las pérdidas en la filtración subsiguiente para
obtener el lisato celular de ADN plásmido claro por adsorción en la
superficie del material filtrante se reducen al mínimo. Los
cationes polivalentes que se liberan durante la preparación celular
son enmascarados por agentes formadores de complejos.
La concentración máxima de cationes debe ser como
mucho de 20 mmol para K^{+}, como máximo 50 mmol para Na^{+} o
como máximo 150 mmol para NH_{4}^{+}. Si se superan estas
concentraciones máximas, se producen pérdidas de ADN plásmido como
consecuencia de la adsorción en la superficie del material
filtrante. Si existen varias especies de cationes, hay que tener en
cuenta la aditividad de los efectos al determinar la concentración
total acep-
table.
table.
El lisato celular claro que contiene ADN plásmido
se caracterizada por una claridad OD_{600} de cómo máximo
0,05 E/cm, lo que corresponde a una reducción de la turbidez de por lo menos 99%. El lisato celular claro obtenido con el ADN plásmido se puede utilizar para la clonación, la transformación, la transfección, la microinyección en células, para la terapia génica, la vacunación ADN y/o para la reacción de cadenas de polimerasas (PCR).
0,05 E/cm, lo que corresponde a una reducción de la turbidez de por lo menos 99%. El lisato celular claro obtenido con el ADN plásmido se puede utilizar para la clonación, la transformación, la transfección, la microinyección en células, para la terapia génica, la vacunación ADN y/o para la reacción de cadenas de polimerasas (PCR).
La invención se describirá con detalle tomando
como base unos ejemplos de realización.
Se reprodujo ADN plásmido pHEN1 (4618 bp) en la
cepa E. coli TG1 en el medio 2TY, en un matraz sacudidor a
37ºC durante 16 horas. A tres de las suspensiones de E. coli
de 125 ml cada una (OD_{600}=6) se le añadió CelpureP300® (marca
de la firma World Minerals Inc) con 15, 30, 60 g/l y se agitó de
forma continua a 20ºC. Seguidamente, se introdujo cada suspension en
un filtro para vacío (10 cm^{2} de filtración, 200 ml de volumen),
en el que previamente se había preparado una torta de
pre-filtro de 2 kg/m^{2} CelpureP300® por un
medio de filtración a base de monofilamento de polipropileno
(tamaño de poro 10 \mum). La filtración se realizó a 0,5 bar de
sobrepresión y una temperatura
de 20ºC.
de 20ºC.
Se obtuvo en todos los casos un filtrado claro.
El máximo flujo medio de filtración (2,8 m^{3}/m^{2}h) se
alcanzó con 30 g/l de CelpureP300®.
Los resultados se recogen en el cuadro 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| CelpureP300®(*) en g/l | Flujo medio de | OD_{600} del | Disminución de la |
| filtración (m^{3}/m^{2}h) | filtrado (E/cm) | turbidez en % | |
| 60 | 1,8 | 0,04 | 99 |
| 30 | 2,8 | 0,05 | 99 |
| 15 | 2,4 | 0,03 | 99 |
| (*) \begin{minipage}[t]{150mm}Propiedades: Proporción de dióxido de silicio: 98,65%; densidad en condiciones húmedas: 0,26 g/cm^{3}; permeabilidad: 0,15-0,30 Darcy; superficie BET: 4-6 m^{2}/g; superficie geométrica: 0,62 m^{2}/g; retención de tamaño de partícula (99%): 0,6-0,75 \mu m. \end{minipage} |
\newpage
Tampón de lisis A:
- 150 mmol Tris HCl, 25 mmol Na_{2}EDTA, 8% en peso de sacarosa (pH 9).
Tampón de tisis B:
- Como tampón de tisis A, y además 2% TritonX-100® (marca de la firma Röhm und Haas).
Se volvieron a suspender dos tortas de filtración
del ejemplo 1 con 30 g/l de CelpureP300® cada una en 190 ml de
tampón de tisis A y/o B. Se añadieron 500 U/ml de lisozima a cada
una y las suspensiones se calentaron, agitando continuamente, a
80ºC durante 30 segundos. Las suspensiones todavía calientes se
introdujeron en un filtro para vacío, en el que se había preparado
previamente una torta de pre-filtración de 2
kg/m^{2} CelpureP300® (incubado durante 15 minutos en el tampón
de Tisis correspondiente) sobre un medio de filtración de
monofilamento de polipropileno (tamaño de por 10 \mum). La
filtración se realizó a 0,5 bar de sobrepresión.
Con el tampón de tisis A se obtuvo un lisato
celular claro (OD_{600} = 0,2) con un flujo de filtración medio
de
0,4 m^{3}/m^{2}h. Mediante la adición de TritonX-100® (tampón de tisis B) se redujo en comparación un 50% el flujo medio de filtración. Se alcanzó un notable aumento de flujo de filtración medio hasta 1,5 m^{3}/m^{2}h en el tampón de Tisis A, al ajustarse la cantidad total de CelpureP300® a 100 y al utilizar como medio de filtración cadena PVDF/PTFE monofilamento Schuss (tamaño de poro 11,5 \mum).
0,4 m^{3}/m^{2}h. Mediante la adición de TritonX-100® (tampón de tisis B) se redujo en comparación un 50% el flujo medio de filtración. Se alcanzó un notable aumento de flujo de filtración medio hasta 1,5 m^{3}/m^{2}h en el tampón de Tisis A, al ajustarse la cantidad total de CelpureP300® a 100 y al utilizar como medio de filtración cadena PVDF/PTFE monofilamento Schuss (tamaño de poro 11,5 \mum).
Se introducen 3,7 ml ADN (E. coli; 48,5 kb
dsADN; 0,51 mg/ml) en 25 ml de un solución tampón constituida por
250 mmol Tris-HCl, 25 mmol Na_{2}EDTA, 8% en peso
de sacarosa (pH 9,09), se añadieron 0,75 g de CalpureP300® (30 g/l)
y la suspension se agitó durante 30 minutos a 30ºC y 200 rpm.
Las mediciones de la absorción UV a 260 nm y un
test PicoGreen® (kit de la firma Molekular Probes Inc.) no
ofrecieron como resultado ninguna diferencia entre la concentración
de ADN \lambda en el sobrante de la suspension y la concentración
en la solución de salida.
Se procedió a una suspension de células de E.
coli DH5\alpha con ADN plásmido pEGFP-N1 en
cuatro partes iguales, en un tampón constituido por Tris HCl y 10
mM EDTA. De una estas suspensiones, se prepararon las células con el
kit Nucleobond® AX (marca de la firma
Macherey-Nagel) según el método de lisis alcalino y
se aisló y limpió el ADN plásmido. En las otras tres suspensiones,
se prepararon térmicamente las células durante 5 minutos a
70ºC/pH 9, 70ºC/pH 10 y/o 60ºC/pH 10 y se aisló y limpió con el mismo kit el ADN plásmido. La cuantificación del ADN plásmido de las cuatro muestras mediante los tests PicoGreen mostraron que la preparación según el método de lisis alcalina y la lisis térmica a 70ºC y un pH de 9 y/o 10 dieron los mismos rendimientos de ADN plásmido, mientras que la preparación térmica a 60ºC y pH 10 sólo proporcionó un 30% aproximadamente de rendimiento del ADN plásmido obtenido según los otros tres métodos. Por el ejemplo 3 se sabe que en las condiciones de lisis térmica descritas no hay que esperar adsorción de ADN plásmido en la superficie del material filtrante.
70ºC/pH 9, 70ºC/pH 10 y/o 60ºC/pH 10 y se aisló y limpió con el mismo kit el ADN plásmido. La cuantificación del ADN plásmido de las cuatro muestras mediante los tests PicoGreen mostraron que la preparación según el método de lisis alcalina y la lisis térmica a 70ºC y un pH de 9 y/o 10 dieron los mismos rendimientos de ADN plásmido, mientras que la preparación térmica a 60ºC y pH 10 sólo proporcionó un 30% aproximadamente de rendimiento del ADN plásmido obtenido según los otros tres métodos. Por el ejemplo 3 se sabe que en las condiciones de lisis térmica descritas no hay que esperar adsorción de ADN plásmido en la superficie del material filtrante.
La claridad de un filtrado (densidad óptica OD)
se determinó con un espectrómetro UV/Vis Lambda 20 de la firma
Perkin-Elmer en modo de absorción a 600 nm y una
longitud de recorrido de 1 cm con respecto a agua como referencia,
a temperatura ambiente.
Claims (8)
1. Método para la preparación integrada de
biomasa de un proceso de cultivo celular para la fabricación de
lisato celular claro que contiene ADN plásmido,
caracterizado porque, en una primera etapa, se filtra cada
vez en un filtro en presencia de un material filtrante inerte, en
una segunda etapa, se prepara térmicamente la biomasa contenida en
la torta de filtración y, en una etapa ulterior, se filtra el
lisato celular.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la preparación se realiza a
70ºC-90ºC.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la preparación térmica se realiza
durante por lo menos 30 segundos.
4. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque como material filtrante inerte se
utiliza Kieselgur con las siguientes propiedades:
- \bullet
- Proporción de dióxido de silicio: \geq 90%
- \bullet
- Densidad en condiciones húmedas: 0,2-0,4 g/cm^{3}
- \bullet
- Permeabilidad: 0,02-2 Darcy
- \bullet
- Superficie BET: 2-20 m^{2}/g
- \bullet
- Superficie geométrica: 0,25-0,65 m^{2}/g
- \bullet
- Tamaño de partícula: 2,5-8,0 \mum
- \bullet
- Retención de tamaño de partícula (99%): 0,1-2 \mum
5. Método según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque en las tres etapas se utiliza el mismo
material de filtración.
6. Método según las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque la preparación se realiza con un pH
comprendido entre 7 y 10.
7. Método según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque la preparación se realiza en presencia
de cationes monovalentes solamente.
8. Método según las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado porque la concentración máxima de cationes es
como mucho de 20 mmol para K^{+}, como mucho 50 mmol para
Na^{+} o como mucho 150 mmol para NH_{4}^{+}
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH8001/01 | 2001-01-19 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01273288T Expired - Lifetime ES2251441T3 (es) | 2001-01-19 | 2001-12-24 | Preparacion integrada de biomasa a partir de un proceso de cultivo celular para la fabricacion de lisato celular claro, que contiene adn plasmido. |
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