ES2328008T5 - Procedimientos de purificación de ADN - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar ADN plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de la célula huésped que comprende las siguientes etapas: <br /><br />(a) formar una solución mediante la adición de suficiente sal a dicha mezcla en donde dicha solución tiene una concentración de sal en el rango de aproximadamente 2M a 4M para permitir la unión selectiva de dicha al menos una impureza de célula huésped a un medio de interacción hidrofóbica; <br /><br />(b) contactar dicha solución que contiene ADN plásmido con dicho medio de interacción hidrofóbica bajo condiciones en que dicha al menos una impureza se une al medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo; y <br /><br />(c) recoger ADN plásmido no unido a partir de dicho complejo; en donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de solventes orgánicos, detergentes, glicoles, cobalto hexamina, espermidina, y polivinilpirolidona.
Description
Procedimientos de purificación de ADN
5 La presente invención proporciona procedimientos para la purificación de ADN plasmídico que incluye la extracción de impurezas de la célula huésped, tales como endotoxinas, ARN, proteínas y ADN de la célula huésped, a partir de una solución acuosa que contiene ADN plasmídico y procedimientos para la separación y purificación de ADN plasmídico superenrollado de una solución acuosa que contiene una mezcla de ADN plasmídico superenrollado y fragmentado o relajado utilizando medio de interacción hidrofóbico. También se proporcionan procedimientos mejorados para pequeña
10 escala, tales como laboratorio o escala de unidad de banco, purificación de ADN y equipamiento utilizado en tales procedimientos. La presente invención proporciona ADN plasmídico purificado y/o separado, tal como ADN plasmídico superenrollado.
La terapia génica ofrece un paradigma de nuevo tratamiento para curar enfermedades humanas. El uso de ADN para el
15 tratamiento de enfermedades genéticamente causadas, incluyendo fibrosis quística, varios tipos de cáncer, etc., e inmunización contra enfermedades, es un prometedor modo de terapia que en la actualidad es ampliamente perseguido. Más que alterar el fenotipo de la enfermedad mediante el uso de agentes que interactúan con productos génicos, o son en sí mismos productos génicos, la terapia génica puede teóricamente modificar genes específicos resultando en la cura
o tratamiento de la enfermedad. La terapia génica también puede utilizarse como un sistema de suministro de fármacos.
20 Para lograr esto, un gen que produce un producto útil (ARN, péptido, proteína, etc.) o es en sí mismo un producto útil (tales como en el uso de ADN antisentido) sería insertado en el ADN o célula de una célula homóloga, heteróloga o autóloga de un individuo o célula huésped para ser administrada luego a un individuo, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Por ejemplo, durante la cirugía de vasos sanguíneos, un gen que produce un factor anti coagulación sería insertado en el ADN de células que revisten los vasos sanguíneos para ayudar a prevenir la formación de coágulos de sangre
25 peligrosos. Muchas otras condiciones también pueden conducir al tratamiento utilizando esta aproximación general.
La terapia génica espera que sea una herramienta poderosa para tratar muchos de los más de 4.000 desórdenes genéticos conocidos, incluyendo fibrosis quística, enfermedad coronaria, cáncer, artritis, y otras enfermedades. La terapia génica generalmente requiere la transferencia de material genético (ADN) en un individuo. La entrega genética o 30 la entrega de material genético can puede lograrse tanto mediante administración directa del 100 que contiene el virus o ADN plasmídico a la sangre tejidos, indirectamente a través de la introducción de células manipuladas en el laboratorio para abrigar ADN extraño o a través de diferentes técnicas de encapsulado o de portador conocidas en la técnica. Informes recientes sugieren que la entrega directa de ADN también puede ser posible. Varios sistemas distintos están en uso o bajo consideración para la transferencia somática de genes. Estas incluyen, por ejemplo, ADN (tanto desnudo
35 o acomplejado), virus ARN (retrovirus), y virus ADN (adenovirus, virus adenoasociado [AAV], virus del herpes, y virus de la viruela).
Las ventajas claves del modo de terapia génica no viral, tales como el uso de ADN plasmídico, es la facilidad de preparación en grandes cantidades, un alto grado de seguridad, una falta general de integración del ADN heterólogo en
40 el ADN del astro la huésped, y la posibilidad de utilizar gen(es) o fragmentos de gen (es) virtualmente de tamaño y número ilimitado. Además, el uso de ADN plasmídico en la terapia génica generalmente no implican el uso de gen(es) o proteínas extraños que pueden inducir una respuesta inmune no deseada en el receptor. Además, las alternativas al uso del ADN plasmídico, tales como vectores virales, son relativamente más caras de producir.
45 Los procedimientos actualmente utilizados para producir ADN plasmídico generalmente proporcionan una mezcla de ADN plasmídico superenrollado y un artefacto ADN fragmentado (o relajado), que generalmente no es útil en la aplicación final del ADN plasmídico. Los procedimientos de la presente invención proporcionan una separación no destructiva de ADN plasmídico superenrollado y fragmentado de forma tal que mientas los presentes procedimientos se ejemplifican mediante la recuperación y uso del ADN plasmídico superenrollado, una persona de habilidad ordinaria
50 apreciará que cualquier forma separada del ADN plasmídico puede ser considerada un producto útil de los procedimientos aquí divulgados. Además, mientras la presente divulgación enfatiza la necesidad de una mayor pureza del ADN plasmídico superenrollado en el contexto de la terapia génica, una persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que el ADN plasmídico es ampliamente utilizado en biología recombinante molecular más allá del uso en preparaciones de terapia génica y la invención aquí divulgada encuentra una amplia aplicabilidad como un
55 procedimiento preparatorio para ADN plasmídico superenrollado aislado y purificado.
Los procedimientos actualmente disponibles para la separación de las dos formas de ADN plasmídico utilizan cromatografía de intercambio de iones (A novel, rapid process for purification of plasmids for gene therapy (Bhikhabhai
R. Ollivier M. and Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R & D, 75184 Uppsala, Sweeden and RPR Gencell, 60 Rhone-Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France.
Publication number: 18-1129-51; Preparative purification of supercoiled plasmid DNA utilizando anion exchange chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) o cromatografía de exclusión (Prazeres, D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid Purification, Biotechnology Techniques Vol. 11, No. 6, June 1997, p 417-420), acopladas con el uso de aditivos 5 tales como polietilen glicol (PEG), detergentes, y otros componentes tales como hexamin cobalto, espermidina, y polivinilpirolidona (PVP). Recientemente se concedió una patente (Horn, et al (Patente U.S. No. 5.707.812)) para la purificación de ADN plasmídico superenrollado usando PEG como un aditivo. Sin embargo, procedimientos actualmente conocidos son incapaces de proporcionar una separación eficiente y de coste efectivo de ADN superenrollado y fragmentado (o relajado). Además, muchos de los procedimientos conocidos sufren de la desventaja de utilizar PEG u
10 otros aditivos, que pueden no ser deseados en la fabricación de ADN plasmídico, al requerir procedimientos de separación, eliminación y control de calidad adicionales, que pueden ser difíciles, consumir más tiempo y más caros.
Formas alternativas de procedimientos conocidos para la separación de formas superenrolladas y relajadas de ADN plasmídico utilizan resinas muy caras, propietarias, que también utilizan disolventes, tales como acetonitrilo, etanol y
15 otros componentes, como trietilamina y tetrabutil fosfato de amonio, durante el proceso. Estos procedimientos generalmente no son adecuados para producción en gran escala debido al uso de disolventes. Además, no pueden aplicarse a materiales iniciales que tienen cantidad significativas de ADN plasmídico relajado ya que la cantidad abundante de ADN plasmídico relajado contaminante en los materiales iniciales tiende a reducir las capacidades de resolución de estas resinas. (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, páginas 52-62, Mayo 1997.)
20 Procedimientos adicionales de separación de ADN superenrollado y relajado se basan en la cromatografía de exclusión, que implica la separación de las dos formas de ADN plasmídico basada en la pequeña diferencia de tamaño. Estas columnas tienden a ser relativamente largas, presentando significativos problemas de escala, haciendo no factible implementar en la producción en gran escala. Además los procedimientos de exclusión necesitan muestras
25 concentradas de soluciones, que no es factible obtener con soluciones de ADN plasmídico, debido a la naturaleza altamente viscosa del ADN. Ver, A comparison of gel filtration chromatographic supports for plasmid purification G.N.M. Ferreira, J.M.S. Cabral and D.M.F. Prazeres, Biotechnology Techniques, Volume 11, No. 6, June 1997, pp 417-420.
Las preparaciones de ADN plasmídico, que son producidas a partir de preparaciones bacterianas y con frecuencia
30 contienen una mezcla de ADN plasmídico relajado y superenrollado, con frecuencia requieren la extracción de endotoxina, tal como requiere la FDA, ya que las endotoxinas producidas en muchos huéspedes bacterianos son conocidos por causar reacciones inflamatorias, tales como fiebre o sepsis en el huésped que recibe el ADN plasmídico. Estas endotoxinas son generalmente lipopolisacáridos, o fragmentos de los mismos, que son componentes de la membrana exterior de una bacteria Gram-negativa, y están presentes en la preparación de ADN como artefactos de las
35 células huésped o como una parte de artefactos mayores, tales como membranas de células huésped o macromoléculas, utilizadas en la expresión y fabricación del ADN plasmídico para la terapia génica, por ejemplo. Por lo tanto la extracción de endotoxinas es una etapa crucial y necesaria en la purificación del ADN plasmídico para uso terapéutico o profiláctico.
40 La extracción de endotoxina a partir de soluciones de ADN plasmídico primariamente ha utilizado la estructura negativamente cargada de las endotoxinas; sin embargo el ADN plasmídico también está cargado negativamente y por lo tanto la separación usualmente se logra con resinas de intercambio de iones que unen ambas de estas moléculas y, bajo ciertas condiciones, preferencialmente eluyen el ADN plasmídico mientras enlazan las endotoxinas. Dicha separación resulta en sólo la extracción parcial como cantidades significativas de endotoxinas eluídas con el ADN
45 plasmídico y/o se logra una recuperación muy pobre de ADN plasmídico. Otros procedimientos patentados usan detergentes, que pueden presentar problemas. (Process for the depletion or removal of endotoxins. Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, U.S. Patent Number: 5,747,663.) Además, la capacidad de enlace de estas resinas está sólo en el orden de 103 a 104 EU (unidades endotoxina) /ml de resina ya que la resina está ocupada tanto por endotoxina y ADN plasmídico, por ejemplo, requiriendo típicamente de 3 a 80 litros de resina, basado en capacidades
50 informadas de 50.000 EU/ml a 2000 EU/ml (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, pages 52-62, May 1997. Sterogene technical profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Famsworth Cr., Carlsbad, CA 92008).
Prazeres et al., Trends in Biotech. 17(4):169-174 (1999) discute los problemas asociados con la producción a gran escala de ADN plasmídico de grado farmacéutico para terapia génica y observa que la baja capacidad de absorbentes
55 cromatográficos de intercambio de aniones es un problema pertinente en la purificación del plásmido.
McLaughlin et al., J. Chromatog. 418:51-72 (1987) describe procedimientos para la resolución de ARN utilizando HPLC. En particular cromatografía de intercambio de aniones y de fase reversa.
60 El documento WO 99/29832 describe un procedimiento cromatográfico HPLC para purificar ADN plasmídico a partir de una mezcla que contiene tanto ADN plasmídico como genómico. Se utiliza etanol como un disolvente para eluir ADN plasmídico.
Colote et al., Analytical Biochem. 154:15-20 (1986) describe un procedimiento para el análisis y purificación de ADN 5 plasmídico mediante la cromatografía líquida de fase reversa de alto rendimiento. El proceso descrito se lleva a cabo en presencia de disolventes orgánicos tales como acetonitrilo y DMSO.
La presente invención proporciona procedimientos de separación, aislamiento y/o purificación de ADN plasmídico que pueden ser utilizados en combinación o independientemente. Específicamente, la presente invención proporciona
10 procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN plasmídico superenrollado y relajado, así como procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN plasmídico de impurezas de la célula huésped, tales como componentes o fragmentos que contienen endotoxina. La presente invención también proporciona procedimientos para la separación, aislamiento y/o purificación de ADN plasmídico a escala de laboratorio o pequeña escala.
15 La presente invención proporciona procedimientos para aislar ADN plasmídico de otros componentes presentes en mezclas que contienen ADN plasmídico, produciendo composiciones enriquecidas en el ADN plasmídico deseado. Los procedimientos incluyen la separación de los ADN plasmídicos de los componentes no deseados contactando mezclas que contienen el ADN plasmídico con medio interactivo hidrofóbico. La separación del ADN plasmídico de otros componentes resulta de las diferentes afinidades del ADN plasmídico y otros componentes no deseados por el medio
20 interactivo hidrofóbico bajo diferentes condiciones iónicas. Así, en los procedimientos de la invención se utiliza un medio interactivo hidrofóbico que tiene un enlace altamente preferencial para los lipopolisacáridos y lipoproteínas en relación al ADN plasmídico; este enlace preferencial se produce en el rango de condiciones iónicas utilizadas en el proceso de separación. También se incluyen en la invención procedimientos que separan ADN plasmídico superenrollado y ADN plasmídico relajado. Los procedimientos utilizan condiciones iónicas donde el ADN plasmídico superenrollado se enlaza
25 preferencialmente al medio interactivo hidrofóbico en relación al ADN plasmídico relajado.
Se entiende que, cuando se describe una concentración de sal utilizada en los procedimientos de esta invención, puede utilizarse una fuerza iónica equivalente de una sal diferente.
30 Es un objeto de la presente invención proporcionar procedimientos de separación, aislamiento y/o purificación ADN plasmídico de impurezas contaminantes de la célula huésped.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN plasmídico y componentes o fragmentos que contienen endotoxina.
35 Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN plasmídico superenrollado y relajado.
En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de separación de endotoxina y otras impurezas
40 de la célula huésped (por ejemplo, ARN, ADN cromosómico, proteína) del ADN plasmídico implicando contactar un lisado celular con un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones donde la endotoxina y otras substancias contaminantes se unen al medio de interacción hidrofóbico para formar un complejo y separar el ADN plasmídico y el complejo. La endotoxina separada en el procedimiento de esta realización incluye endotoxina de microorganismos Gram-negativos así como fragmentos y componentes celulares y subcelulares unidos a las endotoxinas y fragmentos de
45 endotoxina. El medio de interacción hidrofóbica enlaza ARN, incluyendo t-ARN, r-ARN y m-ARN, proteínas de la célula huésped y ADN cromosómico. El medio de interacción hidrofóbico útil en la presente invención puede estar en forma de resinas, membranas u otro medio de soporte.
Una forma preferida de esta realización incluye cargar la mezcla de ADN plasmídico, con otros componentes opcionales
50 contaminantes de la célula huésped, incluyendo endotoxinas, estando presentes, en una matriz de columna o lecho que contiene el medio de interacción hidrofóbico, en una forma donde la endotoxina y las impurezas de la célula huésped preferencialmente se unen o son retenidas por el medio de interacción hidrofóbico, y el ADN plasmídico se recoge como un efluente (flujo continuo) desde el proceso de carga o en lavado(s) opcionales subsiguientes del medio de interacción hidrofóbico que no disturben o interrumpan la retención de las impurezas y endotoxinas de la célula huésped sobre y/o
55 en el medio de interacción hidrofóbico. Después de la recolección del ADN plasmídico, la columna o matriz de lecho puede ser regenerada mediante la elución de las impurezas de la célula huésped y endotoxinas unidas o retenidas mediante la alteración, cambio o modificación de las condiciones hidrofóbicas de interacción de la columna o lecho mediante, por ejemplo, la alteración de la concentración de sal que rodea la matriz de columna o lecho.
60 Realizaciones alternativas de la presente invención proporcionan procedimientos de separación en ausencia de una o
ambas cromatografía de intercambio de iones o cromatografía de exclusión.
En una forma preferida de esta realización, el volumen de la columna o lecho es inicialmente equilibrado con una solución de reacción de sulfato de amonio a una concentración que permite la unión selectiva de las impurezas 5 contaminantes a la columna de interacción hidrofóbica, preferentemente, una concentración de aproximadamente 2M. Las sales que pueden ser utilizadas en el procedimiento de la presente invención incluyen mezclas de aniones y
- -
cationes seleccionadas del grupo consistente en, pero no limitado a, acetato, fosfato, carbonato, SO42-, Cl-, Br-, NO3 , Mg2+, Li+, Na+, K+, NH4+. Pueden emplearse mezclas de sales. Además, la mezcla de ADN plasmídico y otras impurezas contaminantes, tales como endotoxinas, son preferentemente dializadas con un tampón de diálisis antes de contactar 10 con la matriz de columna o lecho para extraer las sales y otros contaminantes que pueden alterar la hidrofobicidad de la endotoxina y del ADN plasmídico y otras impurezas contaminantes, tales como endotoxina, en la solución de reacción de sulfato de amonio. La solución de reacción es preferentemente tamponada con, por ejemplo, Tris-HCl a un pH en el rango de, pero no limitado a, 6,8 a 8,5, preferentemente 7,4. Pueden utilizarse otros tampones, que son conocidos para aquellos entendidos en la técnica, tales como, pero no limitados a, Tris, TES (ácido N-tris(hidroximetil)metil-2
15 aminoetano-sulfónico), Tricina (N-tris(hidroximetil) metilglicina), fosfato, PIPES (Piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etano sulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)-etanesulfónico), MEPES (ácido 3-N(N-Morfolino)etilpiperazina-N'-2-etanesulfónico), y Bicina (N,N-bis(2-hiroxietil) glicina).
Los procedimientos de la presente invención proporcionan ADN plasmídico aislado y/o purificado, y una composición
20 que contiene el ADN plasmídico, que tiene un contenido de endotoxina sustancialmente reducido, o está libre de endotoxina, de forma tal que la carga de endotoxina del ADN plasmídico se ha reducido en tanto como más del 95%, preferentemente, más del 98%, más preferentemente más del 99%, alternativamente más del 99,9% y más preferentemente más del 99,99% al 99,999%. El procedimiento de la presente invención puede utilizarse para separar grandes cargas iniciales de endotoxina, tales como al menos 200.000 a 400.000 unidades endotoxina (EU)/mililitro de
25 solución, proporcionando una capacidad de al menos 600.000 a 3 millones EU/ml matriz hidrofóbica. Además, el proceso de la presente invención proporciona un producto de composición ADN plasmídico que contiene un rango de menos de 10 a menos de 2500 EU o un rango de menos de 1 a menos de 300 EU/mg ADN. Alternativamente, el proceso de la presente invención proporciona un producto de composición ADN plasmídico que contiene un rango de menos de 50 a menos de 1000 unidades endotoxina (EU) o un rango de menos de 10 a menos de 50 EU/mg ADN. El
30 procedimiento de la presente invención también reduce el contenido de proteína a menos de 0,1% (w/w) ARN a menos de 1% (w/w) y de ADN cromosómico de menos de 1% (w/w).
En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de separación de ADN plasmídico superenrollado de ADN plasmídico relajado que incluye las etapas de contactar una mezcla de ADN plasmídico 35 superenrollado y ADN plasmídico relajado con un medio de interacción hidrofóbico bajo una primera condición donde tanto el ADN plasmídico superenrollado como el ADN plasmídico relajado se unen al medio de interacción hidrofóbico para formar una primera mezcla de unión, alterando las primeras condiciones que rodean la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer el ADN plasmídico relajado de la primera mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla de unión y el ADN plasmídico relajado, y modificar las
40 segundas condiciones que rodean la segunda mezcla de unión a una tercera condición para extraer el ADN plasmídico superenrollado de la segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contienen el medio de interacción hidrofóbico y el ADN plasmídico superenrollado.
En otra forma de esta realización, la alteración y modificación pueden realizarse mediante el cambio de las condiciones
45 de pH del tampón de elución o solución, en una forma tal que las formas relajada y superenrollada pueden ser eluídas a diferentes condiciones de pH, con o sin cambios en las condiciones de la sal.
En otra forma de esta realización, la alteración y modificación pueden realizarse a través de elución isocrática, donde una solución de la misma composición, preferentemente a una concentración de sal que pueda eluir ambas formas del
50 ADN plasmídico, cuando pasan a través de la columna que contiene el plásmido ligado, eluirían secuencialmente las dos formas distintamente, en fracciones separadas.
En otra realización, las condiciones de la sal y/u otras condiciones pueden ser modificadas en una forma tal que la forma relajada del plásmido puede ser recogida como la fracción no unida, mientras que la forma superenrollada se une
55 a la resina. La forma superenrollada puede ser subsiguientemente eluída utilizando condiciones indicadas anteriormente.
En otra forma de esta realización, la alteración y modificación pueden realizarse mediante el uso de moléculas o una mezcla de moléculas que se unen a los ligandos competitivamente ("desplazadores") y extraer las formas ligadas de
60 ADN plasmídico de la matriz como componentes separados.
En otra forma de esta realización, moléculas o mezcla de moléculas que pueden unirse a través de interacción hidrofóbica o por el contrario, pueden mezclarse con soluciones de ADN plasmídico, que, al cargarse en la columna pueden ser secuencialmente desplazadas, resultando en la separación de las diferentes formas de ADN.
5 En las dos formas alternativas anteriores de la realización, comúnmente referidas como modos de cromatografía de "desplazamiento" y "frontal", la molécula añadida puede co-eluir con el producto que, en la mayoría de los casos puede ser efectivamente separado utilizando procedimientos conocidos para aquellos en la técnica.
10 La cromatografía de desplazamiento es un modo de cromatografía en el cual dos o más moléculas unidas a una resina son desplazadas utilizando una molécula desplazadora que tiene una afinidad más alta por la resina resultando en un desplazamiento secuencial y por lo tanto elución de las dos o más moléculas unidas. Recientemente, se han identificado desplazadores para resinas hidrofóbicas de interacción, que consisten en copolímeros tribloque incluyendo polimetil metacrilato, ácido acrílico, y polidimetilaminoetil metacrilato (ver Ruaan et al "Hydrophobic displacement chromatography
15 of proteins using triblock copolymers as displacers, 1998 AIChE meeting). Otros desplazadores han sido exitosamente desarrollados para la cromatografía de desplazamiento con resinas hidrofóbicas de interacción (ver Shukla et. al. Hydrophobic displacement chromatography of proteins in 1998 Annual AIChE meeting). Desplazadores tales como 2-(2butoxietoxi) etanol se han utilizado como desplazadores en cromatografía de fase reversa, que podrían ser útiles.
20 Después de unir las dos formas del plásmido, puede utilizarse un desplazador, tales como los listados anteriormente para desplazar ADN superenrollado y relajado secuencialmente de las resinas HIC (columna de interacción hidrofóbica) aquí descritas.
En cromatografía de modo "frontal", la columna se carga con una mezcla binaria, que difiere en su afinidad por la
25 resina, y al sobrecargar continuamente la columna, un componente desplaza al otro y resulta en elución secuencial de los dos componentes. En la aplicación de este procedimiento de la presente invención, las dos formas de ADN, por ejemplo, pueden cargarse sobre una columna HIC y la sobrecarga de la muestra puede resultar en un efecto de desplazamiento que lleve al desplazamiento de la forma relajada, que puede ser recogida separadamente de la forma superenrollada.
30 En una forma de esta realización, la alteración y modificación son combinadas en un proceso continuo de un gradiente de elución del ADN plasmídico relajado y ADN plasmídico superenrollado mezclando primera mezcla de unión son una solución de sal, tales como solución de sulfato de amonio, con una concentración continuamente variable de sal, tales como sulfato de amonio, la concentración preferentemente variando de 3M a 1M de sal, tales como sulfato de amonio.
35 El ADN plasmídico relajado se recoge en esta forma de esta realización de la invención en un primer volumen eluído y el ADN plasmídico superenrollado se recoge en un segundo volumen eluído.
En otra forma preferida de esta realización, las formas superenrollada y relajada del ADN plasmídico son separadas uniendo primero las dos formas del ADN a un medio de interacción hidrofóbico en un lecho o columna a altas
40 concentraciones de sal, o fuerzas iónicas equivalentes, tales como 2,5 M a 4 M, preferentemente 3 M, sulfato de amonio, y luego eluyendo, tanto en forma de gradiente por etapas o gradiente continuo, las dos formas separadas del ADN plasmídico de la columna, cambiando la concentración de sal, o fuerzas iónicas equivalentes, a un primer rango de 2,45M a 2,35M sulfato de amonio y luego a un segundo rango de 0M (posiblemente 1M) a 2,3M sulfato de amonio (en la etapa de realización de la elución) o cambiando continuamente la concentración de sulfato de amonio del rango de 2,5
45 M a 4M a un segundo rango de 0M (posiblemente 1M) a 2,3M sobre un volumen de 1 a 30 volúmenes de columna o lecho, preferentemente al menos 6 volúmenes columna o lecho (en la realización de gradiente continuo). En cada una de estas formas, el ADN plasmídico relajado eluye desde el medio de la columna o lecho a la concentración de sal (sulfato de amonio) en el rango de 2,35M a 2,45M mientras que el ADN plasmídico superenrollado eluye desde el medio de la columna o lecho a la concentración de sal (sulfato de amonio) en el rango de 0M a 2,3M.
50 En otra realización, la invención proporciona procedimientos de aislamiento de ADN plasmídico superenrollado que incluyen:
aplicar una muestra que contiene plásmido superenrollado a un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones iónicas donde el plásmido superenrollado preferencialmente se une al medio respecto al no-plásmido 55 superenrollado; y ajustar las condiciones iónicas de forma tal que el plásmido superenrollado unido se extrae del medio.
En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para enriquecer la cantidad de ADN plasmídico superenrollado en relación al ADN plasmídico relajado en una mezcla de los mismos, incluyendo el
60 procedimiento (1) interaccionar la mezcla que contiene ADN plasmídico superenrollado y ADN plasmídico relajado con un medio interactivo hidrofóbico que contiene un grupo alquilo bajo condiciones iónicas donde el ADN plasmídico superenrollado preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico; (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN plasmídico relajado y superenrollado bajo condiciones iónicas que permitan la extracción preferencial del ADN plasmídico relajado; y (3) eluir el ADN plasmídico superenrollado del medio interactivo hidrofóbico.
5 En una realización preferida adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para extraer lipopolisacárido (LPS) de una composición que contiene ADN plasmídico, incluyendo el procedimiento las etapas de (1) interaccionar la mezcla que contiene el ADN plasmídico y LPS con un medio interactivo hidrofóbico que contiene un grupo alquilo, donde la interacción es bajo condiciones iónicas donde el LPS preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico
10 en relación al ADN plasmídico; y (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN plasmídico y LPS con condiciones iónicas que permiten la extracción selectiva del ADN plasmídico.
Los procedimientos de la presente invención proporciona ADN plasmídico superenrollado aislado y/o purificado, y una composición que contiene el ADN plasmídico superenrollado, que preferentemente está libre de endotoxina free, de
15 forma tal que la cantidad de ADN plasmídico superenrollado presente en la composición producida mediante los procedimientos aquí descritos es al menos 50% en peso de la cantidad total de plásmido a al menos 99% en peso, preferentemente al menos 60% en peso a al menos 95% en peso, más preferentemente al menos 70% en peso a al menos 90% en peso, más preferentemente al menos 75% en peso a al menos 85% en peso, ADN plasmídico superenrollado.
20 El porcentaje en peso puede medirse, como aquí se ejemplifica, mediante resolución HPLC sobre una columna ADN-NPR HPLC, a través de un gradiente, resultando en picos con áreas correspondientes a la cantidad de cada componente. El porcentaje de forma superenrollada se calculó como la fracción del área del pico correspondiente al ADN plasmídico superenrollado al área total de los picos de ADN plasmídico superenrollado y relajado.
25 El medio de interacción hidrofóbico preferido que puede ser utilizado en los procedimientos de la presente invención incluye resinas de cromatografía hidrofóbicas de interacción que, por ejemplo, contienen polímero metacrilato o esqueleto copolímero, tales como copolímeros metacrilato /etilen glicol y/o metacrilato /propilen glicol (TosoHaas, Montgomeryville. PA), y/o una agarosa o sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech. Piscataway, NJ), tales como
30 reticulada o no-reticulada, agarosa, sefarosa, dextrano, silica que contiene polímero, polímeros orgánicos (naturales o sintéticos), una cerámica que contenga, o una matriz de gel, esqueleto, o una combinación de cualquiera de éstos, con C3 a C10 alquilo, ramificado o recto, ligandos pendientes de cadenas laterales. Los grupos pendientes hidrofóbicos preferidos incluyen ligandos propilo, butilo, hexilo y/o octilo. Estos ligandos proporcionan la interacción preferencial de enlace que se aprovecha en los procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de la presente invención.
35 Una persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que las resinas hidrofóbicas de interacción pueden incluir ligandos además a o en lugar de esos ligandos alquilo, que también serán útiles en el procedimiento de la presente invención. Ejemplos de tales ligandos incluyen, pero no están limitados a, fenilo, octilo, butilo, propilo, neopentilo, hidroxipropilo, bencilo, octadecilo, difenilo, y metilo así como derivados sustituidos y no sustituidos del mismo, y combinaciones de los mismos. Resina o materiales de medio adecuados útiles en la presente invención incluyen
40 aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente EP No. 964057, Solicitud EP No. 99109441, JP 2000035423, JP 99127700 y JP 98127665 (Kitamura et al.),
El medio de interacción hidrofóbico puede estar en forma de granos, que pueden ser empaquetados o cargados en una columna o lecho reactor, o un medio reticulado poroso. El tamaño de grano del medio puede oscilar de 2,5 µm a más o
45 igual a 100 µm. El tamaño de grano del medio está preferentemente en el rango de 30 a 110 µm de diámetro, tales como 35 a 100 µm de diámetro, o, alternativamente en el rango de 35 a 90 µm de diámetro. El medio de interacción hidrofóbico puede estar presente en forma de membranas, tales como esqueletos de celulosa o de derivados de celulosa, poliéter sulfonas, polisulfonas, y derivados de la misma y/u otros materiales conocidos en las técnicas de filtración y separación, incluyendo plásticos, tales como e incluyendo placas de microtítulo y de Petri o placas y
50 contenedores de cultivo de células.
Los granos utilizados en columnas "Streamline" (Amersham Pharmacia biotech) típicamente son de mayor tamaño con diferentes densidades, y son hechos por varios fabricantes, incluyendo (Amersham Pharmacia Biotech, Biosepra Inc, pero no limitado a éstos, donde el lisado clarificado puede fluir a través de estas columnas de "lecho expandido",
55 resultando en la extracción de contaminantes a través de la unión a los granos que contienen los ligandos interactivos hidrofóbicos.
Tamaños de granos menores, son típicamente utilizados en separaciones de alto rendimiento, incluyendo HPLC, donde esta invención puede utilizarse para proporcionar un procedimiento analítico cuantitativo para ADN plasmídico.
60 Los granos para los propósitos de uso en esta invención, particularmente la separación de dos formas de ADN plasmídico no necesitan ser porosos ya que el ADN plasmídico es generalmente demasiado grande para ser capaz de ocupar los poros, y por lo tanto proporcionar cualquier capacidad adicional. Sin embargo, para los propósitos de enlace de contaminantes, los poros pueden incrementar efectivamente la capacidad ya que las moléculas contaminantes tales
5 como ARN, proteínas, endotoxinas y fragmentos de ADN son entonces comparables o menores que el tamaño de los poros. En este caso la porosidad jugará un papel y por lo tanto las resinas porosas pueden ser útiles.
En los procedimientos de la presente invención:
(i) purificar ADN plasmídico a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impureza de 10 célula huésped;
(ii) separar ADN plasmídico superenrollado de ADN plasmídico relajado; y
(iii) enriquecer la cantidad de ADN plasmídico superenrollado en relación al ADN plasmídico relajado en una mezcla de los mismos; el procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin
15 cobalto, espermidina y polivinilpirrolidona, que más tarde requerirán separación del producto ADN plasmídico superenrollado antes de utilizarlo en, por ejemplo, terapia génica.
Breve Descripción de los Dibujos
20 La figura 1 muestra un diagrama de flujo de las distintas etapas implicadas en realizar el procedimiento ejemplificado de separar ADN plasmídico superenrollado y relajado. La figura 2 muestra una representación conceptual de los distintos soportes hidrofóbicos de interacción con las químicas del ligando unidas a las mismas que fueron utilizados en el procedimiento ejemplificado. La figura 3 muestra un diagrama de flujo de las distintas etapas implicadas en la realización del 25 procedimiento ejemplificado de separar la endotoxina del ADN plasmídico.
La figura 4 (inserción) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 5 (butil HIC) teñido con SYBR GOLD donde el carril 1 contiene un ADN superenrollado Ladder; los carriles 2 y 3, contienen muestras del pico 1 (relajado) y los carriles 3-5 contienen muestras del pico 2 (superenrollado). (Estando los carriles numerados de izquierda a derecha.) El cromatograma del Ejemplo 5 de absorbancia versus volumen muestra la
30 separación del ADN relajado (pico 1) y superenrollado (pico 2). La figura 5 (inserción) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 6 (butil HIC) teñida con SYBR GOLD donde el carril 1 contiene un marcador; los carriles 2 y 3 contienen muestras del pico 1 (relajado) y los carriles 4-6 contienen fracciones del pico 2 (forma superenrollada). (Estando los carriles numerados de izquierda a derecha.) El cromatograma del Ejemplo 6 muestra la separación de formas de ADN relajado (pico 1) y
35 superenrollado (pico 2). La figura 6 (inserción) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 7 donde el carril 1 contiene un marcador, los carriles 2 y 3 contienen material cargado sobre la columna; el carril 4 contiene material del pico del artefacto; el carril 5 contiene material de la Elución 2,4M AS; y el carril 6 contiene material de la Elución 1M AS. (Estando los carriles numerados de izquierda a derecha.) El cromatograma muestra la separación de formas de
40 ADN plasmídico relajado y superenrollado donde el pico del artefacto es un pico iniciador ancho (izquierda), seguido hacia la derecha por picos relajado y superenrollado, respectivamente. La figura 7 (inserción) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa del Ejemplo 8 (hexyl HIC) donde el carril 1 contiene un marcador; los carriles 2-4 contienen material del pico 1 (forma relajada); y los carriles 5 y 6 contienen fracciones del pico 2 (forma superenrollada). (Carriles y picos numerados de izquierda a derecha.) El
45 cromatograma demuestra la separación de las formas relajada de la superenrollada. La figura 8 muestra una imagen escaneada de una electroforesis de un gel de agarosa de muestras teñidas SYBR GOLD, del Ejemplo 9, donde el carril 1 es un marcador; el carril 2 contiene el material cargado sobre la columna; los carriles 3, 4 y 5 contienen los lavados 1, 2 y 3, respectivamente; el carril 6 contiene la elución 1M; y el carril 7 contiene la elución de agua.
50 Los procedimientos de la presente invención aprovechan las diferencias en las hidrofobicidades del ADN plasmídico superenrollado, ADN plasmídico relajado y contaminantes celulares, tales como endotoxina.
Los procedimientos aquí descritos son útiles para purificar y aislar ADN plasmídico superenrollado que incluyen
55 cósmidos y vectores fagémidos. Estos vectores y el ADN plasmídico pueden ser purificados a partir de cualquier fuente. Además, el ADN plasmídico y cósmidos presentes en levadura y células de mamífero también pueden ser purificados, ya que mezclas similares de contaminantes, incluyendo endotoxinas, ARN, proteínas y ADN cromosómico, pueden estar presentes en estas preparaciones. También existe la necesidad de obtener la forma superenrollada del ADN plasmídico y cósmido a partir de estas fuentes y por lo tanto, los procedimientos aquí descritos pueden ser utilizados para purificar
60 ADN en muchas de estas aplicaciones.
"Medio de interacción hidrofóbico" es un material que comprende (a) una mitad soporte y (b) una mitad hidrofóbica unida ya sea directa o indirectamente a la mitad soporte, ejemplos de los cuales son aquí descritos y son conocidos en la técnica. La mitad hidrofóbica proporciona las bases para la unión preferencial utilizada en los procedimientos de
5 separación aquí descritos. Varios ejemplos de "medio de interacción hidrofóbico" son conocidos en la técnica y están aquí descritos. Otros términos aquí utilizados también indican un medio de interacción hidrofóbico y ejemplos del mismo, tales como "resina", "matriz", "columna", "medio", "granos" y "ligando de interacción hidrofóbica".
"ADN" significa cualquier forma de ácido desoxiribonucleico, incluido, pero no limitado a, plásmido (tanto superenrollado 10 y/o relajado o fragmentado), cósmido, o cromosoma artificial.
ADN "fragmentado" o "relajado" significa ADN que no está superenrollado. ADN "superenrollado" es un término bien entendido en la técnica.
15 Una "impureza contaminante" es cualquier sustancia de la cual se desea separar, o aislar, ADN. Las impurezas contaminantes incluyen, pero no están limitadas a, proteínas de la célula huésped, endotoxina, ADN y/o ARN de la célula huésped. Se entiende que, lo que es considerado una impureza contaminante puede depender del contexto en el cual se practican los procedimientos de la invención. Una "impureza contaminante" puede ser o no una célula huésped derivada, por ejemplo, puede ser o no una impureza de la célula huésped.
20 "Aislar " o "purificar" un primer componente (tales como ADN) significa el enriquecimiento del primer componente a partir de otros componentes con los cuales el primer componente se halla inicialmente. Se proporcionan aquí grados de purificación deseable y/o obtenible. Preferentemente, los procedimientos de la invención resultan en un enriquecimiento aproximado de cinco veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de diez veces, preferentemente en un
25 enriquecimiento aproximado de 20 veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de 50 veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de 100 veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de 200 veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de 500 veces, preferentemente en un enriquecimiento aproximado de 1000 veces. Alternativamente, el grado de purificación puede expresarse como un porcentaje del primer componente respecto a otro componente, o respecto a la preparación resultante. Ejemplos de
30 dichos porcentajes se proporcionan aquí.
Unión o extracción "preferencial" o "selectiva" de un componente significa que, para una condición dada, el primer componente se une o se extrae en un mayor grado respecto a otro componente.
35 Como será entendido por aquellos entendidos en la técnica, "extracción" o "unión" no necesariamente, o aún de forma deseada, significa completa, o 100%, extracción o unión.
Una solución "acuosa" generalmente indica una solución de base agua (por ejemplo, el disolvente principal es agua), que puede o no ser 100% de agua como disolvente.
40 El aislamiento del ADN plasmídico producido en células bacterianas recombinantes implica la lisis de las células y la extracción de restos celulares, que puede lograrse a través de varios procedimientos. La solución final contiene ADN plasmídico, que contiene típicamente cantidades extremadamente altas de endotoxinas entre otros contaminantes. Los procedimientos de la presente invención prevén la extracción de cantidades significativas de los contaminantes claves,
45 tales como ARN, ADN genómico, proteína y endotoxina utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica como una primera etapa, donde el ADN plasmídico fluye sin unir. Un procedimiento de la presente invención implica, opcionalmente dializar la solución mezclada obtenida a partir de la lisis bacteriana en un tampón en el rango de pH de 6,8 a 8,5, preferentemente un pH de 6,8 a 7,4, que contiene, preferentemente, 2M sulfato de amonio, con o sin 10mM ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), y fluir opcionalmente la solución dializada a través de una columna de
50 cromatografía empaquetada que contiene un soporte cromatográfico con un ligando(s) de interacción hidrofóbica, tales como cualquiera de, o una mezcla de, un ligando propilo, butilo, octilo o hexilo, que preferentemente había sido, previamente equilibrado con un tampón en el rango de pH de 6,8 a 8,5 (preferentemente 6,8 a 7,4), que también contiene 2M sulfato de amonio, con o sin 10mM EDTA. La solución de flujo continuo está típicamente a una concentración de sales aproximadamente de 2M, tales como sulfato de amonio, y predominantemente contiene ADN
55 plasmídico (mezcla de superenrollado y relajado) con menos de 2% de contaminantes. Dependiendo de las variaciones en las etapas anteriores, el porcentaje de ADN superenrollado puede oscilar en cualquier parte entre 50 y 95% en peso, típicamente aproximadamente 75 a 85%, alternativamente, 80 a 85%, requiriendo purificación adicional, implicando la extracción de la forma relajada de ADN plasmídico de la mezcla.
60 Procedimientos de la presente invención también hacen posible producir ADN plasmídico purificado que tiene niveles de endotoxina por debajo de niveles especificados, por ejemplo, típicamente <10 EU/mg ADN plasmídico. Los procedimientos de extracción de endotoxina de la presente invención son adaptables tanto a producción a gran escala como a pequeña escala, permitiendo la producción económica de material de grado terapéutico y de laboratorio. Estos procedimientos aprovechan la unión selectiva de la endotoxina a las resinas hidrofóbicas aquí descrito que, para
5 producción a gran escala, puede contener capacidades que excedan un millón de unidades por mililitro de resina utilizada.
Los procedimientos convencionalmente disponibles de extracción de endotoxina tienen bajas capacidades (1.000 a
10 componentes químicos y/o procedimientos que no pueden ser fácilmente utilizados en la preparación de material de grado terapéutico. (Patente U.S. No. 5.747.663). El procedimiento de extracción de endotoxina de la presente invención implica suspender la solución que contiene endotoxina y ADN plasmídico en una sal, tales como sulfato de amonio o cloruro de sodio a una concentración de 2M que hace a la endotoxina significativamente más hidrofóbica que el ADN plasmídico y asegura la unión o interacción preferencial y separación de la endotoxina sobre la resina que contiene
15 ligandos hidrofóbicos de interacción, tales como grupos butilo, octilo, y/o hexilo, en comparación con el ADN plasmídico. La concentración de sal utilizada puede preferentemente ser optimizada para unir ARN, proteína y endotoxina. Una baja concentración de sal puede ser suficiente para proporcionar la unión de la endotoxina sola ya que la endotoxina tiene una mayor afinidad para los ligandos hidrofóbicos de interacción aquí descritos.
20 Una característica atractiva de este procedimiento de extracción de endotoxina es la inmensa capacidad de la resina por la endotoxina, de aproximadamente 1.000.000 EU/ml de resina, además de la simplicidad y >95% de recuperación de ADN plasmídico. Por ejemplo, una solución de ADN plasmídico que contiene 500 mg de plásmido y 10 millones EU de endotoxina puede ser purificada utilizando 10 ml de resina, mientras que, se requerirían al menos 1.000 a 4.000 ml de una resina de intercambio de aniones para unir el ADN plasmídico y la endotoxina, con la desventaja añadida de
25 recuperaciones pobres de resina de intercambio de aniones. El procedimiento de la presente invención por lo tanto resulta en ahorros de 100 a 400 veces en el coste de la resina, y ahorros adicionales de coste de columna y recuperación incrementada de producto. La resina comercialmente disponible ADN Etox es actualmente al menos 8 veces más cara que las resinas utilizadas en el procedimiento de la presente invención. Otra resina comercial (PolyFlo -PureSyn Inc., 87 Great Valley Pkwy Malvem, PA 19355) con propiedad química que es útil en la extracción de
30 endotoxina es 5 a 10 veces más cara y requiere el uso de disolventes y químicos de apareamiento de iones.
Los procedimientos de la presente invención proporciona ADN plasmídico de alta calidad que comprenden más de 90% de ADN plasmídico superenrollado a partir del material inicial de menor calidad (por ejemplo, un material inicial compuesto de una mezcla de ADN relajado y superenrollado). Adicionalmente, los procedimientos de la presente
35 invención son aplicables para procesos a gran escala típicamente usados para la producción de ADN plasmídico para terapia génica. Los procedimientos de la presente invención permiten una producción confiable de ADN plasmídico de alta calidad, independiente de variaciones que típicamente conducen a la reducción en calidad por ejemplo generación de forma de ADN plasmídico relajado/fragmentado. Estas variaciones pueden producirse durante el crecimiento de las bacterias que producen el ADN plasmídico y las subsiguientes etapas de aislamiento y purificación.
40 Los procedimientos de separación de ADN plasmídico superenrollado y relajado, y procedimientos de separación de ADN plasmídico y endotoxina, de la presente invención se basan en un descubrimiento de que las formas de ADN plasmídico y endotoxina exhiben diferentes especificidades de unión sobre resinas de cromatografía hidrofóbicas de interacción que, por ejemplo, contienen C4 a C10 alquilo, ramificados o rectos, ligandos, y preferentemente contienen
45 tanto un ligando butil o un hexil. Estos ligandos proporcionan la interacción preferencial de unión que es aprovechada en los procedimientos de separación, purificación y/o aislamiento de la presente invención. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que las resinas hidrofóbicas pueden incluir ligandos además de o en lugar de estos ligandos alquilo, que también serán útiles en el procedimiento de la presente invención. Ejemplos de dichos ligandos también se describen con anterioridad. Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran los procedimientos de la presente
50 invención descrita. Los siguientes procedimientos generales fueron o pueden ser utilizados.
Se extrajeron plásmidos para aplicaciones de terapia génica a partir de una bacteria huésped adecuada, por ejemplo Escherchia coli, a continuación de una fermentación. En la siguiente ejemplificación de la invención descrita, se utilizó
E. coli STBL-2, que contiene plásmido pEIA-K2. El plásmido pEI-A-K2 es un derivado plásmido pUC que contiene un
55 gen supresor de adenovirus Tipo 5, y contiene un gen kanamicina como un marcador seleccionable. La fermentación se llevó a cabo anaeróbicamente en un medio adecuado de extracto de levadura/glucosa que contiene sales inorgánicas, tales como fosfato de potasio mono básico, fosfato de sodio dibásico, sulfato de amonio y sulfato de magnesio a un pH de entre 6,5 a 7,8, preferentemente 7,0, y a una temperatura de 37°C. La aireación se ajustó a un volu men de aire por volumen de medio y la agitación se ajustó a 800 rpm. Las células se cultivaron en esta forma hasta que se agotó la
60 glucosa del medio, luego se controló la DO del caldo de fermentación mediante la alimentación de glucosa y agitación.
La alimentación contenía una solución concentrada de glucosa (160 g/L) y extracto de levadura (80 g/L) y sales (1,5 g/L sulfato de amonio, MgSO4, 1,5 g/L en tampón fosfato). Después de completar la fermentación, las células fueron recogidas mediante centrifugación o mediante filtración a través de membranas de ultra o microfiltración, y lavadas con TE tampón (ver a continuación), pH 7,4. Las células fueron lisadas contactando la suspensión con un volumen igual de
5 una solución de 0,15N a 0,2N NaOH y 1% sulfato de sodio dodecil (pH 11,5 a 13) con mezclado suave. La solución alcalina fue neutralizada con una solución de acetato de potasio. El material fue luego clarificado tanto mediante centrifugación como mediante el pasaje de la suspensión a través de una serie de filtros intensos. Las soluciones de plásmido son concentradas mediante membranas de ultrafiltración y diafiltración contra TE tampón, pH 7. El concentrado diafilter puede aplicarse directamente al medio aquí descrito.
10 El contenido de ADN plasmídico del lisado es generalmente menos del 2% del ácido nucléico total siendo la mayor parte de los contenidos ARN o ADN cromosómico. Además, el lisado está contaminado con endotoxina y proteínas celulares.
La presente invención también proporciona procedimientos de producción a escala pequeña, de laboratorio o pequeña
15 escala de ADN aislado o purificado, y equipos de columnas y separadores útiles aquí. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que la producción a pequeña escala de ADN plasmídico introduce desafíos diferentes, en comparación con la producción gran escala. Específicamente, la separación a pequeña escala comporta la separación de una mayor proporción de ARN contaminante en el material inicial, de forma tal que mientras la relación de plásmido respecto al ARN en un material inicial a gran escala puede ser aproximadamente 2% (wt/wt), como se indicó
20 anteriormente, la relación de pequeña escala es aproximadamente 0,1% (wt/wt). Además, el volumen de cultivo de las muestras a pequeña escala es generalmente de aproximadamente 2 mL hasta aproximadamente 2L, en oposición a los de aproximadamente 5L hasta aproximadamente 1000L en la separación a gran escala. Las separaciones a pequeña escala de la presente invención implican aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 1mg de plásmido con un volumen reactor o columna lecho de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 ml; usualmente en el rango de
25 aproximadamente 10 ml hasta aproximadamente 15 ml. La presente invención proporciona por lo tanto, producción eficiente a pequeña escala de ADN aislado y/o purificado, preferentemente ADN superenrollado, a partir de impurezas, tales como endotoxina, ARN y ADN relajado.
Mientras que distintos procedimientos son utilizados en la presente ejemplificación, una persona de habilidad ordinaria
30 apreciará que otros procedimientos preparatorios y materiales iniciales pueden ser utilizados en la invención aquí descrita.
Ejemplo 1: Extracción de endotoxina utilizando Cromatografía Butil De Interacción Hidrofóbica (Pequeña escala)
35 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de filtración. Todos los tampones utilizados fueron filtrados a través de un filtro de 0.2 µm, y se almacenaron muestras para endotoxina en tubos de muestra de poliestireno.
Un concentrado de diafiltración (0 400ml) se dializó en TE pH 7,4 (50ml Tris, 10mM EDTA ajustado a pH 7,4 con HCI)
40 se utilizó para el experimento. Se añadió sulfato de amonio (AS) según se requirió para llevar la muestra 2M a 100 ml de TE más 2M AS, tampón pH 7,4 y parcialmente disuelta. Esta solución se añadió a la muestra dializada para hacer un volumen final de 575 ml, del cual 475 ml se utilizaron para el experimento.
Una columna Butil 650S (resina Butil 650S de TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936) de 2,6
45 cm de diámetro y 15 cm de altura de lecho, de aproximadamente 75 ml volumen de lecho se empaquetó y se equilibró con TE tampón, pH 7,4, que contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min. El flujo continuo se recolectó, y se tomaron muestras para análisis (concentración ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina. El ensayo de endotoxina se realizó con jeringuillas y las muestras fueron diluidas apropiadamente para obtener recuperaciones PPC (Positive Product Control) en el rango considerado aceptable. Las concentraciones de endotoxina se determinaron
50 utilizando el ensayo BioWhittaker Kinetic-QCL Chromogenic LAL como se describió en la BW publicación No. P50650U-5, Kinetic-QCL Test Kit Manual. A continuación de la carga de la muestra, se hizo fluir TE que contiene 2M sulfato de amonio a través de la columna, y se recogió y se muestreó. La columna fue subsiguientemente lavada con TE tampón - pH 7,4, USP agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con >15 volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina estuvo presente en cada uno de estos lavados como se muestra a continuación en la
55 Tabla 1. Además para esta excepcional eficiencia de extracción de endotoxina, se extrajeron cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, dejando la muestra significativamente purificada.
Tabla 1
- Muestra
- ADN conc. (mg/ml) Endotoxina EU/ml Total unidades EU % Endotoxina EU por Mg de ADN
- Muestra
- ADN conc. (mg/ml) Endotoxina EU/ml Total unidades EU % Endotoxina EU por Mg de ADN
- Carga
- 0,70 472,200 22.400.000 100 674.571
- Flujo continuo
- 0,38 1,64 771 0,003 4,31
- Lavado
- 0,56 7,48 1.196 0,005 13,42
- capacidad de endotoxina por ml de resina:
- 3 millones
- EU/ml
- Reducción de endotoxina en muestra:
- 99,992%
Ejemplo 2: Extracción de endotoxina utilizando Cromatografía Butil De Interacción Hidrofóbica (gran escala)
Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se 5 clarificaron a través de procedimientos de filtración.
La diafiltración del concentrado (- 650ml) se dializó en TE pH 7,4 (50mM Tris, 10mM EDTA ajustado a pH 7,4 con HCl) y el sulfato de amonio requerido para volver la muestra 2M se añadió a 1200 ml de TE que contiene 2M AS, pH 7,4 tampón y se disolvió. El volumen de esta solución se llevó hasta 1300 ml. Esta solución se añadió a la muestra dializada
10 para hacer un volumen final de 1950 ml, y el pH se ajustó a 7,4 utilizando HCI.
Una columna Butil 650S de 5 cm diámetro y 15 cm de altura de lecho, de aproximadamente 275 ml de volumen de lecho se empaquetó y equilibró con TE tampón, pH 7,4, que contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 20 ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis (concentración ADN, gel de agarosa, y 15 ensayo de endotoxina, como se describió anteriormente). A continuación de la carga de la muestra, TE que contenía 2M sulfato de amonio se hizo fluir a través de la columna, y se recogió y se muestreó. La columna fue subsiguientemente lavada con TE tampón -pH 7,4, USP agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con >15 volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina estaba presente en cada uno de estos lavados como se muestra a continuación en la Tabla 2. Además de esta extremadamente excepcional eficiencia de extracción de endotoxina, se
20 extrajeron cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, dejando la muestra significativamente purificada.
Tabla 2
- Muestra
- ADN conc. (mg/ml) Endotoxina EU/ml Total EU % Endotoxina EU por mg de ADN
- Carga
- 1,59 271500 176.475. 000 100 170.754
- Flujo continuo + Lavado
- 0,34 <0,5 1325 0,007 1,45
- Capacidad de endotoxina por ml de resina:
- 0,64
- millón EU/ml
- Reducción de endotoxina en muestra:
- 99,993%
25 Ejemplo 3: Extracción de endotoxina utilizando Cromatografía Hexil De Interacción Hidrofóbica (Pequeña escala)
Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de centrifugación. El sobrenadante se dializó en un tampón 20mM fosfato de
30 potasio (solución 20mM fosfato de potasio monobásico combinada con 20mM fosfato de potasio dibásico en una proporción para obtener un pH de 6,8), pH 6,8 y el sulfato de amonio requerido para hacer la muestra 2M se añadió a 20 ml de KPB (20mM fosfato de potasio tampón) que contiene 2M AS, pH 6,8 tampón y se disolvió. Esta solución se añadió a 5 ml de muestra dializada para hacer un volumen final de 25 ml y el pH se ajustó a 6,8.
35 Una columna Hexyl 650C (TosoHaas) de 1,6 cm diámetro y 4 cm de altura de lecho, de aproximadamente 8 ml de volumen de lecho se empaquetó y equilibró con KPB, pH 6,8, que contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis (concentración ADN, gel de agarosa, y ensayo endotoxina, ver anterior). A continuación de la carga de la muestra, se permitió el flujo continuo de KPB que contiene 2M sulfato de amonio en la columna, se recogió y se muestreó. La columna fue subsiguientemente lavada
40 con KPB pH 6,8, USP agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con >15 volúmenes de USP
agua purificada. La endotoxina estaba presente en cada uno de estos lavados como se muestra a continuación en la Tabla 3. Además de esta eficiencia extremadamente excepcional de extracción de endotoxina, se extrajeron cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, dejando la muestra significativamente purificada.
Tabla 3
- Muestra
- ADN (mg/ml) conc. Endotoxina EU/ml Total unidades EU % Endotoxina EU por Mg de ADN
- Carga
- 2,43 593500 29.675.000 100 244.238
- Flujo continuo + Lavado
- 0,037 0,5 35 0,0001 14
- Capacidad de endotoxina por ml de resina:
- 3,7 millones
- EU/ml
- Reducción de endotoxina en muestra:
- 99,999%
Ejemplo 4: Extracción de Endotoxina utilizando Cromatografía Octil De Interacción Hidrofóbica (Pequeña escala)
10 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y lisado utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de centrifugación como se describió anteriormente. El sobrenadante se utilizó para el experimento. Se añadió sulfato de amonio requerido para hacer la muestra 2M a 20 ml de TE más 2M AS, pH 7,4 tampón y se disolvió. Esta solución se añadió a 10 ml de muestra dializada para hacer un volumen final de 25 ml y el pH se ajustó a 7,4.
15 Una columna Octil Sefarosa 4 de Flujo Rápido (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de 1,0 cm diámetro y 10 cm de altura de lecho, de aproximadamente 8 ml de volumen de lecho se empaquetó y equilibró con TE, pH 7,4, que contiene 2M AS. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina). A continuación de la carga de
20 la muestra, TE que contiene 2M sulfato de amonio se hizo fluir a través de la columna, se recogió y se muestreó. La columna fue subsiguientemente lavada con TE pH 7,4, USP agua purificada, y limpiada con 0,5N hidróxido de sodio, y enjuagada con >15 volúmenes de USP agua purificada. La endotoxina estaba presente en cada uno de estos lavados como se muestra a continuación en la Tabla 4.
25 Tabla 4
- Muestra
- ADN conc. (mg/ml) Endotoxina EU/ml Total unidades EU % Endotoxina EU por mg de ADN
- Carga
- 2,43 593500 59.350.000 100 244.238
- Flujo contínuo + Lavado
- 0,037 32 2240 0,004 280
- Capacidad de endotoxina por ml de resina:
- 7,41
- millón EU/ml
- Reducción de endotoxina en muestra:
- 99,996%
Ejemplo 5: Separación de formas superenrollada y relajada del ADN plasmídico utilizando Cromatografía Butil De Interacción Hidrofóbica - Gradiente de Elución
30 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de filtración, como se describió anteriormente. La purificación gruesa del ADN plasmídico para eliminar los contaminantes principales tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosómico, etc. se realizó utilizando cromatografía butil de interacción hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de
35 amonio, el ADN plasmídico fluye a través de la columna mientras los contaminantes se unen a la columna (ver anterior).
El flujo continuo que contiene el ADN plasmídico se dializó y procesó sobre una columna de intercambio de iones (Bio Sepra) que no proporcionaba ninguna purificación adicional. El procesado a través de la columna Q de intercambio de iones y diafiltraciones no son necesarias para lograr la separación sobre la columna butil. La elución de la columna Q de intercambio de iones fue diafiltrada utilizando una membrana 30kD regenerada de celulosa (0,1m2, Millipore Corporation). El material dializado se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de amonio sólido.
5 Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S - TosoHaas) de 2,6 cm diámetro y aproximadamente 15 cm de altura se empaquetó a una tasa de flujo de 15-20mUmin. La columna fue equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris - EDTA tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min. El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna fue entonces lavada con 2-3 volúmenes de columna de una solución 3M de sulfato de amonio en tampón. La columna se eluyó entonces con un gradiente de sulfato de amonio de concentración desde 3M a 1M sobre 6
10 volúmenes de lecho. Durante el gradiente de elución, resultaron dos picos, el primer pico que contiene la forma relajada del ADN plasmídico, y el segundo pico que contiene la forma superenrollada de ADN plasmídico como se evidencia en fracciones del gel de agarosa (la figura 4A). El cromatograma se muestra en la figura 4B. Los resultados fueron confirmados adicionalmente mediante un ensayo HPLC utilizado para determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 5).
15 Dentro de los limites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 85% de forma superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía un 50-60% de forma superenrollada. Al menos un 90% del ADN plasmídico superenrollado inicial fue recuperado. La resolución de los picos fue adecuada para realizar la separación, aún con una altura de columna de 15 cm. Esto demuestra la separación efectiva de formas superenrollada y
20 relajada del plásmido utilizando cromatografía Butil de interacción hidrofóbica. Además de esta excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y endotoxina pueden ser extraídas resultando en un producto que reúne las especificaciones para la terapia génica.
Tabla 5 25
- Muestra
- % Superenrollado
- Material inicial
- 63
- Fracción Pico 1
- 8
- Fracción Pico 2
- 83
Ejemplo 6: Separación de formas superenrollada y relajada del ADN plasmídico utilizando Cromatografía Butil De Interacción Hidrofóbica -Gradiente Elución Long columna
30 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de filtración, como descrito anteriormente. Se realizó una purificación gruesa del ADN plasmídico para eliminar los principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio, el ADN plasmídico fluye a través de la columna mientras los contaminantes se unen a la columna (ver anterior). El flujo
35 continuo que contiene el ADN plasmídico se dializó y procesó sobre una columna de intercambio de iones que no proporciona ninguna purificación adicional. La elución de la columna Q fue diafiltrada utilizando una membrana de celulosa 30kD regenerada. El material dializado se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de amonio solido, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5.
40 Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S - TosoHaas) de 2,6 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se empaquetó a una tasa de flujo de 15-20ml/min. La columna fue equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris - EDTA tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 5 ml/min. El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna se lavó entonces lavada con 2-3 volúmenes de lecho con una solución tampón 3M sulfato de amonio. La columna se eluyó con un gradiente de concentración de sulfato de amonio de 3M a 1M sobre 6 volúmenes
45 de lecho. Durante el gradiente de elución, resultan dos picos, el primer pico que contiene la forma relajada del ADN plasmídico, y el segundo pico que contiene la forma superenrollada de ADN plasmídico como se evidenció en el gel de agarosa de fracciones (la figura 5A). El cromatograma se muestra en La figura 5B. Los resultados fueron adicionalmente confirmados mediante un ensayo HPLC utilizado para determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 6).
50 Dentro de los límites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 90% de forma superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía 50% de forma superenrollada. La resolución de punto de partida de los picos se obtuvo con la columna más larga. Este ejemplo demuestra claramente la separación efectiva de las formas superenrollada y relajada del plásmido utilizando cromatografía butil de interacción hidrofóbica. Además de esta excelente separación, cantidades residuales de ARN, proteína, y endotoxina pueden extraerse resultando en un
producto que reúne las especificaciones para terapia génica. Tabla 6
- Muestra
- % Superenrollado
- Material inicial
- 53
- Pico 1 Fracción 36
- 15
- Pico 2 Fracción 47
- 83
- Pico 2 Fracción 49
- 95
- Pico 2 Fracción 52
- 91
5 Ejemplo 7: Separación de formas superenrollada y relajada del ADN plasmídico utilizando Cromatografía Butil Interacción de Hidrofóbica – columna larga de elución por etapas
Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2, y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se
10 clarificaron a través de procedimientos de filtración, como se ha descrito anteriormente. Se realizó una purificación gruesa del ADN plasmídico para eliminar los principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio, el ADN plasmídico fluye a través de la columna mientras que los contaminantes se unen a la columna (ver Ejemplo 1 anterior). El flujo continuo y el lavado se reunieron y concentraron utilizando una membrana 30kD de
15 ultrafiltración utilizando filtración de flujo tangencial. El ADN plasmídico concentrado se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de amonio sólido.
Una columna Butil (Toyopearl Butil 650S - TosoHaas) de 1 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se empaquetó a una tasa de flujo de 6 ml/min. La columna fue equilibrada con 3M de sulfato de amonio en Tris - EDTA 20 tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna se lavó entonces con 2-3 volúmenes de lecho con una solución tampón 3M de sulfato de amonio. La columna se eluyó entonces con varias concentraciones de sulfato de amonio - 2,8M, 2,7M, 2,6M, 2,55M, 2,5M, 2,4M, 1M - utilizando 2-3 volúmenes de columna. Se observaron picos en las eluciones 2,4M y 1M. La electroforesis de gel de agarosa de los picos se muestra en la figura 6A. El gel indica separación clara de las formas superenrollada y
25 relajada. La elución 2,4M contiene la forma relajada, mientras que la elución 1M contiene el ADN superenrollado. El cromatograma se muestra en la figura 6B. Los resultados fueron adicionalmente confirmados mediante un ensayo HPLC usado para determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 7).
Dentro de los límites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía un 93% de forma
30 superenrollada, mientras que el material inicial sólo contenía 62% de forma superenrollada. Estos resultados fueron confirmados mediante subsiguientes experimentos donde las eluciones 2,3M y 2,2M no proporcionan la resolución, y la elución 2,4M repetidamente proporcionó una significativa extracción de la forma relajada, enriqueciendo así la forma superenrollada en la elución 1M. La separación lograda utilizando la elución por etapas es significativa en separaciones a gran escala, que son realizadas de forma más confiable utilizando eluciones en etapas. Este ejemplo demuestra
35 claramente la efectiva separación de las formas superenrollada y relajada del plásmido utilizando elución por etapas de cromatografía butil de interacción hidrofóbica. Además de esta excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y endotoxina puede ser extraída resultando en un producto que reúne las especificaciones para terapia génica.
Tabla 7 40
- Muestra
- % Superenrollado
- Material inicial
- 62
- 2,4M Elución
- 8
- 1M Elución
- 93
Ejemplo 8: Separación de las formas superenrollada y relajada del ADN plasmídico utilizando Cromatografía Hexyl de Interacción Hidrofóbica – Columna Larga de Gradiente de Elución
45 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2 y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se 15
clarificaron a través de procedimientos de filtración, como se ha descrito anteriormente. Se realizó una purificación gruesa del ADN plasmídico para eliminar los principales contaminantes tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosómico, etc. utilizando cromatografía butil de interacción hidrofóbica, donde, a una concentración de 2M Sulfato de amonio, el ADN plasmídico fluye a través de la columna mientras que los contaminantes se unen a la columna (ver,
5 por ejemplo, Ejemplo 1 anterior). El flujo continuo que contiene el ADN plasmídico se dializó y procesó en una columna de intercambio de iones que no proporciona ninguna purificación adicional. La elución de la columna Q fue diafiltrada utilizando una membrana de celulosa 30kD regenerada. El material dializado se ajustó a 3M sulfato de amonio utilizando sulfato de amonio sólido (ver anterior).
10 Una columna Hexyl (Toyopearl Hexyl 650C -TosoHaas) de 1 cm diámetro y aproximadamente 30 cm de altura se empaquetó a una tasa de flujo de 5 ml/min. La columna fue equilibrada con 3M sulfato de amonio en Tris-EDTA tampón pH 7,4. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El plásmido se unió a la columna a 3M sulfato de amonio. La columna se lavó entonces con 2-3 volúmenes de lecho con una solución 3M sulfato de amonio tampón. La columna se eluyó entonces con un gradiente de sulfato de amonio de concentración de 3M a 1M durante 6 volúmenes de lecho.
15 Durante el gradiente de elución, resultaron dos picos, el primer pico que contiene predominantemente la forma relajada del ADN plasmídico, y el segundo pico que contiene predominantemente la forma superenrollada de ADN plasmídico cono se evidencia en el gel de agarosas de fracciones (La figura 7A).
El cromatograma se muestra in la figura 7B. Cualitativamente, el segundo pico contenía significativamente una mayor
20 proporción de plásmido superenrollado que el material inicial basado en la electroforesis de gel de agarosa. Se obtuvo una excelente resolución de los picos, considerando el hecho de que el tamaño de grano fue de 100 :m para el Hexyl, comparado con 35 :m para el Butil.
Ejemplo 9: Endotoxina extracción utilizando Cromatografía de Butil Interacción Hidrofóbica (utilizando cloruro de sodio)
25 Se cultivaron células de E. coli que abrigan el plásmido pEIA-K2 y se lisaron utilizando procedimientos químicos, y se clarificaron a través de procedimientos de centrifugación. El sobrenadante se utilizó para el experimento. La muestra fue purificada a través de una columna de intercambio de iones (Q Hyper D - BIOSEPRA Inc.). Una elución 2M de cloruro de sodio de la columna se utilizó para este experimento. La muestra estuvo presente en 50mM Tris 10mM EDTA pH
30 7,4 tampón con 2M NaCl. Una columna Butil HIC (utilizando Butil 650S resina - TosoHaas) de 1 cm de diámetro y de altura 20 cm de aproximadamente 10ml de volumen se empaquetó y equilibró con TE que contiene 2M cloruro de sodio. La muestra se cargó a una tasa de flujo de 2 ml/min. El flujo continuo se recogió, y se tomaron muestras para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina). A continuación de la carga de la muestra, TE que contiene 2M sulfato de amonio se hizo fluir a través de la columna, se recogió y se muestreó. La columna fue
35 subsiguientemente lavada con TE pH 7,4.
Tabla 8
- Muestra
- ADN conc. (mg/ml) Endotoxina EU/ml Total unidades EU % Endotoxina EU por mg de ADN
- Carga
- 0,27 642 16.050 100 2377
- Lavado
- 0,13 5 350 2 38
- Capacidad de endotoxina por ml de resina:
- 1570 EU/ml
- Reducción de endotoxina en muestra:
- 98 %
40 Ejemplo 10: Purificación de Plásmido a Pequeña escala con Cromatografía Butil de Interacción Hidrofóbica
La purificación de ADN plasmídico a pequeña escala se realiza utilizando equipos comercialmente disponibles, el más comúnmente conocidos de los cuales es el equipo Qiagen's Miniprep. Los procedimientos aquí descritos pueden utilizarse para la purificación de ADN plasmídico proporcionan varias ventajas sobre los equipos comerciales. El
45 siguiente ejemplo demuestra el uso de la cromatografía de interacción hidrofóbica en un procedimiento de la presente invención para purificación de ADN plasmídico en una pequeña escala.
El material inicial para la purificación se obtuvo a través de procedimientos estándar. Específicamente, células de E. coli que abrigan plásmido de aproximadamente 4,65 Kb de tamaño se cultivaron en Caldo de Luria que contiene 100µg/ml 50 de ampicilina a 37°C. Las células se recogieron a un OD de 2,7. Las células se extrajeron del medio a través de centrifugación. Subsiguientemente, el gránulo de células se resuspendió en 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA pH 8,0. Se añadió un volumen igual de 200mM NaOH, 1% SDS solución, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutes. Esta etapa resulta en la lisis de las células, liberando los contenidos de la célula, incluyendo el ADN
plasmídico. Se añadió solución de neutralización consistente en 3,1M de acetato de potasio (pH 5,5) en volumen igual (original) y se mezcló bien. El lisado neutralizado se filtró entonces a través de tela para queso y filtros para extraer el precipitado. El lisado clarificado se precipitó con 70% isopropanol (añadiendo 2,1ml isopropanol por 3 ml de lisado clarificado). El precipitado se separó a través de centrifugación y el gránulo fue lavado con 70% etanol, secado y
5 disuelto en 10mM Tris-HCl, 0,1mm EDTA tampón, pH 8,0. Esta preparación se congeló a -20°C hasta su uso y fue el material inicial para los experimentos de purificación.
Una columna Butil 650S con un volumen de lecho de 20 ml y altura de lecho de 10 cm se empaquetó en una columna de 1,6cm de diámetro (Pharmacia XK16/20) y se equilibró con 2,2M sulfato de amonio (AS) en 50mM Tris-HCl, 10mM 10 EDTA (TE) tampón, pH 7,4. La muestra para cargar se preparó mediante el añadido de sulfato de amonio solido a la concentración final de 2,2M. La muestra se diluyó con 2,2M AS en Tris - EDTA, pH 7,4 a 10 ml.
Las condiciones de purificación se diseñaron para permitir que el ADN plasmídico sea recogido en el flujo continuo y que los contaminantes se unieran a la resina.
15 La muestra se cargó a 2 ml/min y se recogió el flujo continuo. La columna fue lavada con 35 ml de 2,2M AS en TE tampón y se recogió como fracciones Lavado 1(10 ml), Lavado 2 (14,5 ml), y Lavado 3 (10ml). Un pico resultó durante el lavado. La columna se eluyó con 55 ml de 1M AS en TE tampón, pH 7,4 y se recogió como 1M Lavado 1 (10ml) y 1M Lavado 2 (45ml). Un pico resultó durante la elución 1M AS. La columna se eluyó con 50 ml de USP - Agua purificada.
20 Resultó un pico. La tabla siguiente muestra el ácido nucléico total presente en cada una de las fracciones anteriores. Las concentraciones fueron calculadas en base a la absorbancia a 260nm (Conc. (µg/ml) = A260 * 50)
Tabla 9
- Fracciones de columna
- Conc. Masa
- (µg/ml)
- (µg)
- Carga
- 550,0 5503
- Lavado 1
- 7,6 76
- Lavado 2
- 40,4 607
- Lavado 3
- 5,0 50
- Lavado reunido (ADN plasmídico)
- 20,9 733
- 1M elución
- 35,8 1611
- Agua elución
- 30,5 1523
25 Se realizó la electroforesis de un gel de agarosa de la muestras. La figura 8 muestra una fotocopia del gel. La fotografía del gel muestra el ADN plasmídico en las fracciones de Lavado (carriles 3, 4, 5). En comparación con la muestra de carga (carril 2) se ve ARN no visible en las fracciones de Lavado. Las fracciones de elución contienen ARN como se ve en los Carriles 6 y 7. La endotoxina en el Lavado reunido se midió utilizando un ensayo Kinetic QCL de endotoxina. No
30 se detectó endotoxina en la muestra en el nivel de sensibilidad del ensayo, que fue de 0.005 EU/ml. El rendimiento de plásmido fue 733 µg a partir de 100 ml de cultivo que es similar al obtenible con equipos comerciales.
Producción de ADN plasmídico de grado farmacéutico, Magda Marquet, Nancy Horn, Jennifer Meek, Gregg Budahazi, Patente U.S. Número. 5.561.064. 35 Concentración y fraccionamiento por tamaño de ácidos nucléicos y virus en medio poroso, Cole, Kenneth D., Patente
U.S. Número: 5.707.850.
Purificación de ADN plasmídico durante cromatografía de columna, Nancy Horn, Greg Budahazi, Magda Marquet, 40 Patente U.S. Número: 5.707.812
Claims (30)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para purificar ADN plasmídico a partir de una mezcla del mismo que contiene al menos una impurezade la célula huésped que comprende las siguientes etapas: 5(a) formar una solución mediante la adición de suficiente sal a dicha mezcla para permitir la unión selectiva de dicha al menos una impureza de célula huésped a un medio de interacción hidrofóbico, donde dicha sal es sulfato de amonio o sales de sodio en un intervalo de concentraciones de 2M a 4M;(b) contactar dicha solución que contiene ADN plasmídico con dicho medio de interacción hidrofóbico10 bajo condiciones en que dicha al menos una impureza se une al medio de interacción hidrofóbico para formar un complejo; y(c) recoger ADN plasmídico no unido a partir de dicho complejo como el flujo pasante del proceso de carga;15 donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, espermidina, y polivinilpirolidona.
- 2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la al menos una impureza es seleccionada del grupo consistente enARN, endotoxina, ADN cromosómico y proteína. 20
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1, donde la al menos una impureza es una endotoxina.
-
- 4.
- Procedimiento según la reivindicación 1, donde el sulfato de amonio está presente en una concentración de 2M.
25 5. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la sal de sodio es cloruro de sodio. - 6. Procedimiento según la reivindicación 5, donde la sal de sodio es cloruro de sodio en una concentración de 2M.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la solución tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4. 30
-
- 8.
- Procedimiento según la reivindicación 1, donde la solución tiene un pH de 7,4.
-
- 9.
- Procedimiento de separación de ADN plasmídico superenrollado de una mezcla de ADN plasmídico superenrollado y
ADN plasmídico relajado y, opcionalmente, al menos una impureza de célula huésped que comprende las siguientes 35 etapas:(a) formar una solución mediante la adición de una sal a la mezcla de ADN plasmídico superenrollado y ADN plasmídico relajado y, cuando esté presente, dicha al menos una impureza de célula huésped;(b) contactar la solución con un medio de interacción hidrofóbico bajo una primera condición donde40 tanto el ADN plasmídico superenrollado como el ADN plasmídico relajado se unen al medio de interacción hidrofóbico para formar una primera mezcla de unión;(c) alterar la primera condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer ADN plasmídico relajado de la primera mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla de unión y ADN plasmídico relajado; y45 (d) modificar la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión a una tercera condición para extraer ADN plasmídico superenrollado de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contienen medio de interacción hidrofóbico y ADN plasmídico superenrollado,donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, 50 espermidina, y polivinilpirolidona. - 10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la al menos una impureza de célula huésped es seleccionada del grupo consistente en ARN, endotoxina, ADN cromosómico y proteína.55 11. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la al menos una impureza de célula huésped es una endotoxina.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo consistente en SO42-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ y NH4+.60 13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde la sal es sulfato de amonio en un intervalo de concentraciones de 2,5M a 4M.
- 14. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la primera condición comprende equilibrar dicho medio con unasolución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en un intervalo de concentraciones de 2,5M a 4M. 5
- 15. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la segunda condición comprende lavar el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35M a 2,45M.
- 16. Procedimiento según la reivindicación 9, donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla de 10 unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 1 M a 2,3M.
- 17. Procedimiento de separación de endotoxina de ADN plasmídico que comprende contactar una mezcla de endotoxina y ADN plasmídico con un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones donde dicha endotoxina se une a dicho medio de interacción hidrofóbico para formar un complejo y separar dicho ADN plasmídico y dicho complejo15 mediante la recogida de dicho ADN plasmídico como el flujo pasante del proceso de carga,donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, espermidina, y polivinilpirolidona.20 18. Procedimiento según la reivindicación 17, donde dicha mezcla comprende además una sal de amonio en un intervalo de concentraciones de 1,5 a 4M.
- 19. Procedimiento según la reivindicación 18, donde dicha sal de amonio es sulfato de amonio que está presente en unaconcentración de 2M. 25
-
- 20.
- Procedimiento según la reivindicación 17, donde dicha mezcla tiene un pH en el rango de 6,8 a 7,4.
-
- 21.
- Procedimiento según la reivindicación 20, donde el pH es 7,4.
30 22. Procedimiento de separación de ADN plasmídico superenrollado de ADN plasmídico relajado que comprende contactar una mezcla de ADN plasmídico superenrollado y ADN plasmídico relajado con un medio de interacción hidrofóbico bajo una primera condición donde tanto el ADN plasmídico superenrollado como el ADN plasmídico relajado se unen a dicho medio de interacción hidrofóbico para formar una primera mezcla de unión, alterar dicha primera condición que rodea la primera mezcla de unión a una segunda condición para extraer dicho ADN plasmídico relajado35 de dicha primera mezcla de unión para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla de unión y dicho ADN plasmídico relajado, y modificar la segunda condición que rodea dicha segunda mezcla de unión a una tercera condición para extraer dicho ADN plasmídico superenrollado de dicha segunda mezcla de unión para formar componentes separados que contienen dicho medio de interacción hidrofóbico y dicho ADN plasmídico superenrollado;40 donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, espermidina, y polivinilpirolidona. - 23. Procedimiento según la reivindicación 22, donde dicha primera condición comprende equilibrar dicho medio con unasolución de sal que contiene sulfato de amonio en un intervalo de concentraciones de 2,5 M a 4 M. 45
- 24. Procedimiento según la reivindicación 23, donde dicha segunda condición comprende lavar dicha primera mezcla de unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 2,35 M a 2,45 M.
- 25. Procedimiento según la reivindicación 24, donde dicha tercera condición comprende lavar dicha segunda mezcla de 50 unión con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de 1 M a 2,3M.
- 26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 22, donde dicha alteración y dicha modificación son combinados en un proceso continuo que comprende una elusión en gradiente de dicho ADN plasmídico relajado y ADN plasmídico superenrollado mediante la mezcla de dicha primera mezcla de unión con una solución de sal que contiene55 sulfato de amonio con una concentración variable continuamente de sulfato de amonio, variando dicha concentración de 3M a 1 M de sulfato de amonio, y dicho ADN plasmídico relajado se recoge en un primer volumen eluido y dicho ADN plasmídico superenrollado se recoge en un segundo volumen eluido.
- 27. Procedimiento según la reivindicación 22, donde dicho componente de ADN plasmídico relajado separado y dicho 60 ADN plasmídico superenrollado separado se recogen y se aíslan.
- 28. Procedimiento para el enriquecimiento de la cantidad de ADN plasmídico superenrollado en relación al ADN plasmídico relajado en una mezcla de los mismos, comprendiendo el procedimiento:5 (1) interaccionar la mezcla que contiene ADN plasmídico superenrollado y ADN plasmídico relajado con un medio interactivo hidrofóbico que comprende un grupo alquilo bajo condiciones iónicas en donde el ADN plasmídico superenrollado preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico;(2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN plasmídico relajado y superenrolladobajo condiciones iónicas que permiten la extracción preferencial del ADN plasmídico relajado; y 10 (3) eluir el ADN plasmídico superenrollado del medio interactivo hidrofóbico;donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, espermidina, y polivinilpirolidona.15 29. Procedimiento para extraer lipopolisacárido (LPS) de una composición que contiene ADN plasmídico, comprendiendo el procedimiento:(1) interaccionar la mezcla que comprende el ADN plasmídico y LPS con un medio de interacciónhidrofóbico que comprende un grupo alquilo, en donde la interacción es bajo condiciones iónicas donde el LPS 20 preferencialmente se une al medio interactivo hidrofóbico en relación al ADN plasmídico; y(2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN plasmídico y LPS con condiciones iónicas que permiten la extracción selectiva del ADN,donde dicho procedimiento se realiza en ausencia de disolventes orgánicos, detergentes, glicoles, hexamin cobalto, 25 espermidina, y polivinilpirolidona.
- 30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 9, 17 ó 22, donde el medio de interacción hidrofóbico comprende un soporte de cromatografía con grupos hidrofóbicos adheridos colgantes.30 31. Procedimiento según la reivindicación 30, donde dichos grupos adheridos colgantes son seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C3 a C10.
- 32. Procedimiento según la reivindicación 30 con respecto a las reivindicaciones 9 ó 17, donde el medio de interacción hidrofóbico es seleccionado del grupo consistente en un esqueleto de polímero o copolímero de metacrilato unido a al35 menos uno de un propilo, butilo, hexilo, octilo, nonilo o una mezcla de éstos como grupos hidrofóbicos adheridos colgantes.
- 33. Procedimiento según la reivindicación 30 con respecto a la reivindicación 1, donde el medio de interacciónhidrofóbico es seleccionado del grupo consistente en un esqueleto de polímero o copolímero de metacrilato unido a al 40 menos uno de un grupo hidrofóbico propilo, butilo, hexilo, octilo, nonilo o decilo.
- 34. Procedimiento según la reivindicación 30 con respecto a la reivindicación 22, donde el medio de interacción hidrofóbico es un esqueleto de polímero o copolímero de metacrilato unido a al menos un ligando propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo.
- 35. Procedimiento según la reivindicación 30, donde el medio es al menos uno de esqueleto de copolímero de metilacrilato y etilenglicol o una agarosa reticulada.
- 36. Procedimiento según la reivindicación 30, donde el medio es una resina en la forma de granos en el rango de 50 tamaños de 15 a 100 µm.
- 37. Procedimiento según la reivindicación 35, donde la sal es sulfato de amonio en un intervalo de concentraciones de 2,5M a 4M.
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