KR20220018187A - 플라스미드 dna 추출키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라스미드 DNA를 대량으로 추출할 수 있는 키트에 관한 것으로서, 실리카 나노포어 매트릭스 및/또는 적절한 수소이온결합 억제물질과 염을 함유한 용액을 포함함으로써 플라스미드 DNA의 수율 및 순도를 현저히 높인 플라스미드 DNA 추출 키트에 관한 것이다.

Description

플라스미드 DNA 추출키트 {A Kit for Plasmid DNA extraction}

본 발명은 플라스미드 DNA를 대량으로 추출 및 정제하는 키트에 관한 것으로서, 실리카 나노포어 매트릭스 및/또는 적절한 수소이온결합 억제물질과 염을 함유한 용액을 포함함으로써 플라스미드 DNA의 수율 및 순도를 현저히 높인 플라스미드 DNA 추출키트에 관한 것이다.

플라스미드는 염색체 DNA와 무관하게 존재하며 자기 복제가 가능한 작은 이중 가닥 DNA 단위로 보통 원형이지만 때로는 선형이다. 각 플라스미드는 단지 몇 개의 유전자만 가지고 있다. 플라스미드는 박테리아 세포에 자연적으로 존재하며 일부 진핵 생물에서도 발생한다. 종종, 플라스미드에 담긴 유전자는 박테리아에 항생제 내성과 같은 유전적 이점을 제공한다.

플라스미드는 다양한 크기로 제공되며 생명 공학 분야에서 다양한 용도로 사용된다. 플라스미드는 1970년대 재조합 DNA 분야에서 처음으로 주목을 받았으며, 인간 인슐린과 같은 치료용 단백질의 생산을 장려하기 위해 박테리아에 유전자를 삽입하는 도구로 사용되었다.

좀 더 최근에는, 플라스미드 DNA가 감염성, 유전성 및 후천성 질환을 치료하기 위한 치료 플랫폼으로서 조사되기 시작했다. 예를 들어, 플라스미드 DNA는 에볼라, 말라리아, 인플루엔자 등에 대한 DNA 백신의 개발을 위한 유망한 도구로 여겨진다. 플라스미드는 병원체로부터 하나 또는 두 개의 특정 단백질을 생성하도록 유전적으로 변형된 후 정제된다.

플라스미드는 여러 특성으로 인해 유전자를 쉽게 수정할 수 있다. 먼저, 플라스미드는 1,000 내지 20,000개의 비교적 작은 DNA 서열을 갖는다. 두 번째로, 플라스미드는 떨어지지 않고 쉽게 자르고 다시 모양을 만들 수 있다. 이를 통해 새로운 DNA를 플라스미드에 쉽게 삽입할 수 있다. 새로운 DNA가 삽입되면, 변형된 플라스미드는 박테리아 내에서 자라서 자기 복제를 통해 끝없이 복제될 수 있다.

플라스미드의 조작 및 재생이 용이하고 장기적으로 안정하여 생명공학에서 없어서는 안 될 도구가 되었다. 이것은 외래 DNA를 박테리아에 도입하는 전달체 또는 벡터로서 기능한다.

플라스미드 DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 벡터 DNA로 사용되어 세포로부터 추출, 정제된 플라스미드 DNA를 제한효소로 자른 후 원하는 DNA 단편을 삽입하여 증식하는 유전자 클로닝과 단백질 발현에 널리 이용되며 이를 통해 백신, 인슐린 등의 대량 제조가 가능하다.

이같이 유전공학 연구와 산업에 유용한 플라스미드 DNA는 주로 대량 증식된 대장균 세포로부터 분리하여 사용하는데, 대장균 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리할 때는 대장균 세포 내에 염색체 DNA, 단백질 등 다른 물질들도 함께 존재하기 때문에 플라스미드 DNA만 선택적으로 분리하는 것이 중요하며, 알칼리 용균법과 같은 다양한 플라스미드 DNA 추출, 정제방법이 연구되고 있다.

기존에 미량 (mini scale)으로 플라스미드 DNA를 분리하는 정제 키트의 경우는 외국 제품뿐만 아니라 국내 많은 기업에서도 판매하고 있지만, 산업 및 유전공학 분야의 본격적인 적용을 위해 필요한 대량 (large scale) 플라스미드 DNA 추출 및 정제 키트는 거의 100%를 고가의 수입제품에 의존하고 있으며, 국내 다수의 회사에서 개발 및 제품화하여 판매를 시도하였지만 수입 제품과 품질 (DNA 회수율, DNA 순도 등) 면에서 경쟁력을 갖지 못하는 상황이다.

따라서 수입 제품과 비교하여 충분한 경쟁력을 갖는 순수 국내 기술로 플라스미드 DNA 대량 추출, 정제 키트가 개발 및 제품화된다면 수입대체 효과는 물론 고품질, 저가의 경쟁력을 바탕으로 수출효과도 기대할 수 있을 것이다.

한국특허 공개공보 10-1999-0082777호는 유리 미세섬유 컬럼을 이용한 방법으로 실리카 나노포어 매트릭스를 활용한 본 발명과 유사성이 없는 것으로 검토되었고, 한국특허 공개공보 10-2018-0084245호 역시 자성 나노 입자를 활용한 방법으로 본 발명과 유사성이 없으며, 또한 한국특허 10-0688349호는 소수성 크로마토그래피를 이용한 방법으로 본 발명과 유사성이 없다.

한국특허공개공보 10-1999-0082777 "유리미세섬유칼럼과 이를 이용한 플라스미드 DNA 제조 및 정제방법" (1999.11.25.공개) 한국특허공개공보 10-2018-0084245 "아민-코팅 자성 나노입자를 이용한 플라스미드 DNA 정제 방법 및 조성물" (2018.07.25.공개) 한국특허공보 10-0688349 "DNA 정제방법 및 정제된 DNA" (2007.02.22. 등록)

본 발명은 종래 기술에 비하여 플라스미드 DNA를 좀 더 효율적으로 추출하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 플라스미드 DNA 추출시 플라스미드 DNA를 효과적으로 흡착하는 매트릭스와 최적의 수소이온결합 억제물질 및 염을 포함하는 추출 키트를 이용함으로써 수율과 순도가 높은 플라스미드 DNA를 얻고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 키트에서 사용한 실리카 나노포어 매트릭스 (Nano-pore matrix)는 다양한 산업에 이용되는 구형의 실리카 파우더로 주로 화장품 산업에 사용되고 있으며, 입자의 크기는 평균 3-9um로 표면처리를 통해 특히 오일 흡유 기능을 향상시킨 실리카 매트릭스이다. 본 발명에서는 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 결합을 극대화할 수 있는 조건을 탐색, 확립하였으며, 대장균의 배양 규모에 따라 매트릭스의 양을 조절하여 플라스미드 DNA를 추출하는데 좀 더 탄력적으로 적용할 수 있게 하였으며, 따라서 1개의 키트로 다양한 규모, 조건으로 플라스미드 DNA를 추출할 수 있는 제품을 발명하였다.

본 발명자들은 DNA의 순도 및 동일한 대장균 배양액으로부터 추출되는 플라스미드 DNA의 양, 실제 플라스미드 DNA 추출 시간 등으로 세분화하여 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트를 국내 및 수입 제품과 비교하였다. DNA 순도의 경우는 염기서열분석을 진행하여 비교 확인하였고, 실제 제한효소 처리 등을 통해 높은 순도의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, OD 260/280 측정값을 통해 실제 추출된 플라스미드 DNA의 순도를 확인하였다. 또한, 동일한 대장균 배양액으로부터 추출되는 플라스미드 DNA의 양은 OD 260 측정값을 통해 확인할 수 있었다.

플라스미드 DNA의 순도가 높지 않은 경우 포유류 세포로의 도입에 문제가 생기게 되는데, 즉 세포가 죽거나 또는 DNA 도입이 원활하게 이루어지지 않게 된다. 따라서 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트로 추출한 플라스미드 DNA(pEGFP DNA)를 포유류 세포에 도입하여 도입효율을 측정하고 형광현미경 사진을 통해 플라스미드 DNA의 도입을 확인하였다.

마지막으로 본 발명의 추출 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 시간을 측정하고, 기존의 제품들과의 비교를 반복실험을 통해 플라스미드 DNA 추출 시간을 측정한 결과, 기존 사용되는 플라스미드 DNA 추출 제품과 비교하여 약 2/3의 단축된 시간으로 1.5배 ~ 2배 이상의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었다.

본 발명의 추출 키트는 화장품 산업에서 주로 사용되고 있는 실리카 파우더를 활용하여 저렴하고 효율적으로 플라스미드 DNA를 추출하는 기술로 기존에 사용되고 있는 실리카 멤브레인보다 현저히 낮은 단가로 제품을 생산할 수 있으며, 대장균 배양액에 따라 실리카 나노포어 매트릭스의 양을 조절하여 플라스미드 DNA를 추출할 수 있기 때문에 기존의 미디 스케일부터 기가 스케일까지 넓은 스펙트럼을 나타내는, 지금까지는 없었던 독창적이고 창의적인 기술이다. 이뿐만 아니라 본 발명의 키트는 플라스미드 DNA를 추출하는 시간을 효과적으로 단축함으로써 기존 고가의 수입제품과의 경쟁에서 우위를 차지할 수 있을 것이다.

본 발명은

대장균 세포 내의 플라스미드 DNA를 추출하는 키트에 있어서,

플라스미드 DNA 추출용 용액 I;

플라스미드 DNA 추출용 용액 II;

플라스미드 DNA 추출용 용액 III;

세척용 완충액;

용출 완충액;

RNase A;

실리카 나노포어 매트릭스; 및

스핀 컬럼;을 포함하는 플라스미드 DNA 추출 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드 DNA 추출용 용액 III이 구아니딘 티오시아네이트인, 플라스미드 DNA 추출 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드 DNA 추출용 용액 III이 구아니딘 티오시아네이트 및 아세트산 칼륨을 함유하는, 플라스미드 DNA 추출 키트에 관한 것이다.

본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트와 기존 타사 제품의 비교는 다음 표와 같다.

	Plasmid DNA Maxi prep kit (Q사)	Nano -pore matrix Plasmid Large Prep Kit (본 발명)
Cell culture / harvest	25-100ml 10min	50ml 5min
Cell Lysis	30min	10min
Cell lysate	30min	10min
DNA binding/ Washing	gravity column binding & washing 2hr	matrix binding & washing 5min
DNA recovery	Isopropanol - centrifugation 30min	column transfer - elution 10min
DNA amount	up to 500ug	500ug
total	~ 3hr 40min	~ 40min

본 발명은 유전공학 연구 및 제약, 의료 등 바이오산업에 널리 이용되고 있는 플라스미드 DNA를 대량으로 추출, 정제하는 키트에 관한 것으로서 기존의 플라스미드 DNA 맥시프렙 키트, 미디프렙 키트와 비교하여 실험 시간을 50% 이상 단축하면서도 수율을 30% 정도 개선할 수 있다.

종래에 많이 사용되고 있는 Q사의 맥시 프렙 키트의 경우 500ug의 플라스미드 DNA를 추출하기 위하여 약 4시간 이상 소요되는 데 비해서 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트를 이용하면 500ug의 플라스미드 DNA를 추출하기 위하여 약 40분 정도 소요된다.

또한, 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트는 추출하고자 하는 플라스미드 DNA의 양과 배양한 대장균의 양에 따라 매트릭스의 양을 조절하여 탄력적인 실험이 가능하다.

또한, 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트는 대장균에서 플라스미드 DNA를 추출하는 것뿐만 아니라 배양세포, 조직, 혈액 등에 적용하여 유전체 DNA를 추출하는 것도 가능하다.

도 1은 실리카 분말 매트릭스의 표면 구조를 촬영한 현미경 사진이다.
도 2는 수소이온결합 억제물질의 종류에 따른 플라스미드 DNA 추출을 비교한 것이다. A는 전기영동 결과이고, B는 플라스미드 DNA 농도 및 순도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 수소이온결합 억제물질 농도에 따른 플라스미드 DNA 추출 결과이다.
도 4는 아세트산 칼륨 농도에 따른 플라스미드 DNA 추출 결과이다.
도 5는 플라스미드 종류에 따른 본 출원인과 타사(Q사)의 방법에 의한 플라스미드 DNA 추출 결과이다.
도 6은 플라스미드를 293T 세포에 트랜스펙션한 후 12시간, 18시간, 24시간 경과 후의 녹색형광단백질 발현을 형광현미경으로 관찰한 것이다.
도 7은 본 발명의 키트를 이용하여 얻은 DNA 양을 타사의 키트로 얻은 결과와 비교한 것이다.

아래에서는 구체적인 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

상기 본 발명의 플라스미드 DNA 추출 키트는 다음과 같이 사용하여 플라스미드 DNA를 추출한다.

1) 플레이트에서 단일 콜로니를 골라 적절한 선택적 항생제가 포함된 10 ~ 50 ml의 적절한 배지 배양액을 접종한다. 격렬하게 흔들면서 37℃에서 12 ~ 16 시간 동안 배양한다.

2) 상온 (15-25 ℃), 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수확하고 상청액을 버린다.

3) 덩어리가 남지 않을 때까지 볼텍싱하여 용액 I의 1/5 부피 (2 ~ 10 ml)로 펠렛화된 박테리아 세포를 재현탁한다.

4) 재현탁한 세포에 동일한 부피 (2 ~ 10 ml)의 용액 II를 첨가하고 부드럽게 잘 혼합하지만 볼텍싱하지 않는다. 실온에서 5분 동안 배양한다.

5) 동일한 부피의 용액 III (2 ~ 10 ml)을 첨가하고 튜브를 4-6회 뒤집어 현탁액이 균질해지도록 잘 혼합한다.

6) 원심분리기에서 7,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리한다.

7) 원심분리 후 상등액을 조심스럽게 새 튜브에 옮긴다.

8) 적절한 부피의 실리카 나노포어 매트릭스를 첨가하고 잘 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양한다.

9) 배양 후, 2,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다.

10) 상청액을 제거하고 세척 완충액 10 ml를 첨가한다. 세척 단계를 한 번 더 반복한다.

11) 상청액을 제거하고 실리카 나노포어 매트릭스를 400 ul의 세척 완충액과 혼합한다.

12) 실리카 나노포어 매트릭스를 스핀 컬럼으로 옮기고 원심분리기로 1분간 최대 rpm으로 원심분리한다. 건조한 실리카 나노포어 매트릭스를 3분 이상 최대 rpm으로 원심분리한다.

13) 스핀 컬럼을 새로운 용출 튜브로 옮기고 실리카 나노포어 매트릭스 2배 부피의 용출 완충액과 볼텍스한 다음 3분 동안 배양한다.

14) 원심분리기로 3분 동안 최대 rpm으로 원심분리한다.

1. 실리카 나노포어 매트릭스의 표면 확인

본 발명에서 세포파쇄용액에서 선택적으로 DNA와 결합하여 고순도의 플라스미드 DNA의 추출을 가능하게 하는 실리카 나노포어 매트릭스는 주로 화장품 산업에 사용되는 실리카 파우더로 표면 특수 처리로 인해서 흡유율을 극대화시켜 색조 화장품의 원료로 주로 사용하고 있는 약 3-9um의 실리카 입자이다. 실리카 나노포어 매트릭스를 실험에 사용하기 앞서 전자현미경을 통해 실리카 파우더 표면의 모습을 관찰하였다 (도 1). 도 1 사진에서 관찰되는 바와 같이 다양한 크기의 매우 작은 실리카 입자들이 모여 있는 형태로서 겉표면이 매우 매끄럽게 형성되어 있어서 세포파쇄용액에서 DNA와의 접촉을 최적화할 수 있다.

2. 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 최적의 결합 조건 탐색

가. DNA 결합용액 (Sol III)의 대체 용액 조성의 탐색

먼저 수소이온결합 억제물질 (Chaotropic salt)의 종류에 따른 실리카 나노포어 매트릭스와 DNA의 결합조건을 탐색하였다.

일반적으로 실리카 막을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 경우에 첫 번째 단계에서 세포를 현탁한 후 pH가 높은 알칼리 용액으로 세포를 용해시키고 실리카 막에 잘 결합할 수 있도록 고농도의 수소이온결합 억제물질 염과 산성용액으로 환경을 맞추게 된다. 따라서 본 발명자들은 세 번째 단계인 DNA 결합용액, 즉 통칭 "용액 III"의 조성을 변화시킨 후 DNA와 실리카 막과의 결합 정도를 확인하였다. 이때 고농도의 수소이온결합 억제물질 염 (chaotropic salt)으로는 구아니딘 염산 (Guanidine hydrochloride: GuHCl)과 구아니딘 티오시아네이트 (Guanidine thiocyanate; GuSCN)를 사용하여 비교하였다. 관련된 모든 실험에서는 대장균 배양액 1ml을 사용하였으며, 이때 사용된 플라스미드 DNA는 high copy plasmid인 pUC19을 사용하였다. 그 결과, 구아니딘 티오시아네이트를 사용하여 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA가 효과적으로 결합할 수 있도록 하였을 때 약 3배 가까이 많은 양의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었다 (도 2).

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 GuHCl과 GuSCN 농도를 다르게 하여 플라스미드 DNA를 추출한 결과 GuSCN을 사용한 경우가 약 3배 정도 많은 양의 DNA를 추출할 수 있었다. 또한, 260nm, 280nm에서 흡광도를 측정하여 그 비율을 확인한 결과 DNA의 농도가 높을수록 DNA의 순도 또한 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 플라스미드 DNA를 직접 확인하기 위하여 1% 아가로즈 젤을 사용하여 전기영동한 후에 UV 하에서 가시화하여 관찰하였다. 이때 각각 추출한 플라스미드 DNA 3ul씩을 SAFELOAD 로딩 완충액을 사용하여 로딩하였다. 즉 GuSCN을 360ul 이상 사용하였을 경우에 고농도의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었고, 이때 DNA 순도도 약 1.82 이상으로 높은 순도를 나타냈으며, 전기영동 상으로도 양질의 플라스미드 DNA가 추출되었다는 것을 확인할 수 있었다.

나. 수소이온결합 억제물질 염의 농도에 따른 실리카 나노포어 매트릭스와 DNA의 결합조건 탐색

위의 염 종류에 따른 플라스미드 DNA의 추출 비교를 좀 더 다양한 농도에서 비교하기 위하여 GuHCl과 GuSCN의 다양한 농도로 용액을 제작하여 실험에 사용하였다. pUC18 플라스미드가 도입된 DH5a 대장균 배양액 1ml을 사용하였고, 일반적인 용액 I, 용액 II 사용 후 용액 III 대신 각기 다른 농도의 수소이온결합 억제물질로 제작한 용액을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 순도는 대부분 1.7에서 1.85 정도로 비교적 안정적으로 고순도의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었지만, DNA 농도의 경우는 역시 GuSCN을 사용한 경우에 1.5 ~ 5배 정도로 많은 양의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었다. 이때 용액 내 GuSCN의 농도가 높아짐에 따라 DNA 농도가 증가하는 것을 관찰할 수 있었지만 높은 농도에서는 DNA의 추출 양이 다시 감소하는 현상을 관찰할 수 있었다. 즉 수소이온결합 억제물질인 GuSCN은 실리카 나노포어 매트릭스와 DNA가 결합하는데 고농도로 필요하지만 적정 농도의 수소이온결합 억제물질이 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 결합을 극대화할 수 있음을 확인하였다 (도 3).

GuHCl의 경우는 농도가 높아지는 경우에도 추출되는 플라스미드 DNA의 양에는 크게 변화가 없었다. 즉 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 결합을 최적화하는데 있어서 GuHCl은 크게 영향을 주지 못한다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 반면, GuSCN의 경우는 농도가 높아질수록 추출된 DNA의 농도가 높아지는 양상을 보였는데 GuSCN을 약 500-600 ul정도 사용하였을 때 가장 높은 농도의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었다.

다. KOAc의 농도에 따른 실리카 나노포어 매트릭스와 DNA의 결합조건 탐색

위의 두 가지 실험 결과로 DNA 결합 용액의 수소이온결합 억제물질의 종류와 농도는 결정되었다. 따라서 DNA 결합 용액의 구성성분 중 수소이온결합 억제물질 외에 구성성분으로 용액 II에서 높여놓은 pH를 중화시키는 역할을 하게 되는 아세트산 칼륨 (KOAc)의 농도를 변화시켜 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 결합에 미치는 영향을 관찰하였다. 예비실험을 통하여 KOAc 이외에 아세트산 나트륨 (NaOAc) 등 비슷한 역할을 할 수 있는 물질을 비교 확인한 결과 다른 산성 물질과 비교하였을 때 KOAc의 효과가 월등히 우수했으며, DNA의 농도뿐만 아니라 순도 높은 플라스미드 DNA를 추출하는데 적합하다는 결론을 얻은 바 있었다. 따라서 본 발명에서는 수소이온결합 억제물질과 다양한 농도의 KOAc를 조합하여 용액을 제작한 후 플라스미드 DNA를 추출하는 데 사용하여 그 결과를 비교 확인하였다 (도 4). 이때 KOAc의 농도에 따라 pH가 달라짐을 확인하였고, GuSCN이 400 ul이고 3M KOAc가 100 ul일 때 가장 높은 농도의 플라스미드 DNA를 추출하는 결과를 얻을 수 있었다. 이때 DNA 순도 또한 약 1.83 정도로 추후 어떤 실험도 가능한 정도의 양질의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었다.

라. DNA 결합 용액 (용액 III)의 대체 용액 조성의 최적화

위의 일련의 실험을 통하여 대장균 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출할 때 사용하는 DNA 결합 용액 (용액 III)의 최적의 조성을 탐색할 수 있었다. 즉 DNA 결합 용액의 최적화를 통하여 실리카 나노포어 매트릭스와 플라스미드 DNA와의 결합에 최적화된 조건을 확립함으로써 실리카 나노포어 매트릭스를 사용하여 플라스미드 DNA를 효과적으로 추출하는 기술을 개발하는 데 중요한 결과를 확보할 수 있었다.

3. 실리카 나노포어 매트릭스의 용량 탐색

실리카 나노포어 매트릭스의 일정량에 최대한 결합할 수 있는 플라스미드 DNA의 양을 확인하기 위하여 두 가지 방법을 통하여 실험하였다.

하나는 일정량의 대장균 배양액 세포파쇄액에 실리카 나노포어 매트릭스의 양을 증가시켜 확인하는 것이고, 다른 하나는 일정량의 실리카 나노포어 매트릭스에 대장균 배양액 세포파쇄액의 양을 증가시켜 확인하는 것이다.

위의 실험 결과로 확인한 바와 같이 실리카 나노포어 매트릭스 1 ul 당 최대한 결합할 수 있는 플라스미드 DNA의 양은 46.59 ug였으며, 정확한 실리카 나노포어 매트릭스의 용량을 확인함에 따라 추출하고자 하는 DNA의 규모에 따라 대장균 배양액과 사용하는 실리카 나노포어 매트릭스의 양을 결정할 수 있는 근거 자료가 될 수 있었다.

4. 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 추출한 플라스미드 DNA의 순도 측정

본 발명의 실리카 나노포어 매트릭스를 사용하여 추출한 플라스미드 DNA의 순도를 확인하기 위하여 다음과 같이 세 가지 방법을 사용하였다. 그 첫 번째는 분광광도계를 260nm, 280nm에서 측정한 후 그 비율 값을 통하여 DNA의 순도를 확인하였고, 두 번째로는 DNA 염기서열 분석을 통하여 간접적인 방법으로 DNA 순도를 확인하였다. 마지막으로는 실제로 제한효소를 사용하여 효소에 의하여 플라스미드 DNA가 완전하게 절단되는지에 관한 실험을 통하여 DNA 순도를 확인하였다.

5. 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 추출한 플라스미드 DNA의 트랜스 펙션 효율 측정

본 발명의 실리카 나노포어 매트릭스를 사용하여 추출한 플라스미드 DNA와 기존에 판매되고 있는 Q사 제품과 I사 제품으로 추출한 플라스미드 DNA를 포유류 세포에 트랜스펙션한 후 약 12 ~ 24시간 동안 배양하면서 형광현미경 하에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 확인하였다. 만약 플라스미드 DNA의 순도에 문제가 있거나 플라스미드 DNA가 세포에 독성 영향을 주게 되면 형광현미경 하에서 녹색 형광 단백질의 발현 확인은 불가능할 것이다. 실험 결과 트랜스펙션 후 12시간째부터 24시간까지 고르게 녹색 형광 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 기존에 판매되고 있는 두 회사의 제품과 비교하였을 때 오히려 본 발명 방법으로 추출한 플라스미드 DNA의 트랜스펙션 효율이 높다는 것을 확인할 수 있었다.

6. 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 추출한 플라스미드 DNA의 최종 농도 확인

본 발명의 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 추출한 플라스미드 DNA와 기존에 판매되고 있는 제품을 이용한 플라스미드 DNA와의 정량적인 비교를 위하여 동일한 양의 대장균 배양액을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 분광광도계 분석을 통해 DNA의 최종 농도와 일정 배양액에 따른 추출된 플라스미드 DNA의 총량을 비교 확인하였다.

기존 제품은 키트 규모에 따라 배양액의 양이 결정되어 있기 때문에 Q사 제품인 midi 플라스미드 DNA prep kit의 매뉴얼에 따라 25ml의 대장균 배양액을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 마지막 플라스미드 DNA 용출 단계에서는 본 발명의 실리카 나노포어 매트릭스로 플라스미드 DNA를 추출한 경우는 600 ul의 용출 완충액을 사용하여 DNA를 회수하였고, 컬럼 타입인 두 회사의 키트를 사용한 경우는 350 ul 용출 완충액을 사용하여 DNA를 회수하였다. 회수한 DNA의 일부 (약 50 ul)씩을 새로운 튜브에 옮겨 DNA 농도를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 방법으로 플라스미드 DNA를 추출한 경우에 50ml 대장균 배양액 기준으로 약 560 ug의 플라스미드 DNA를 추출할 수 있었으며, 두 회사의 제품으로 추출한 플라스미드 DNA의 경우는 약 150 ug였다.

7. 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 데 소요되는 시간 측정 및 비교

본 발명의 실리카 나노포어 매트릭스를 이용하여 50 ml의 대장균 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하는 경우에 prep 당 소요되는 시간을 타사 제품과 비교하여 본 개발 제품의 경쟁력과 우수함을 확인할 수 있었다. 본 실험은 각기 다른 날짜 다른 시간에 50 ml의 대장균 배양액으로 본 발명의 방법을 적용한 제품과 타사 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하면서 그 소요시간을 특정하였다.

실험 결과 경력이나 실험숙련도에 따라 조금씩의 차이는 있었지만 거의 유사한 양상을 확인할 수 있었다. 본 발명의 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 경우는 약 40~ 50분 정도 소요되는 반면, Q사 제품과 I사 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하는 경우는 2시간부터 4시간까지 소요되는 것으로 확인되었다. 이때 추출되는 DNA의 양이나 순도의 경우도 본 개발 제품의 경우는 실험자에 따라 크게 차이가 없는 반면, 다른 두 회사 제품의 경우는 실험자에 따라 그 차이가 큰 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법은 실험숙련도나 경력에 따라 실험결과의 차이가 크지 않기 때문에 쉽고 빠르고 재현성 있는 실험결과를 얻을 수 있었다.

Claims (3)

1. 대장균 세포 내의 플라스미드 DNA를 추출하는 키트에 있어서,
   플라스미드 DNA 추출용 용액 I;
   플라스미드 DNA 추출용 용액 II;
   플라스미드 DNA 추출용 용액 III;
   세척용 완충액;
   용출 완충액;
   RNase A;
   실리카 나노포어 매트릭스; 및
   스핀 컬럼;을 포함하는 플라스미드 DNA 추출 키트.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 플라스미드 DNA 추출용 용액 III는 구아니딘 티오시아네이트인, 플라스미드 DNA 추출 키트.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 플라스미드 DNA 추출용 용액 III는 구아니딘 티오시아네이트 및 아세트산 칼륨을 함유하는, 플라스미드 DNA 추출 키트.
   

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