JPS58189199A - 枯草菌用のプラスミド・クロ−ニング・ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡの手法を使用して各種の遺伝子
を挿入しうるクローニングベクターとして有用な新規な
合成プラスミド、ｐ０８４　　に関する。

発明の背景 バクテリア中の大抵の遺伝物質は、細胞の染色体として
存在する巨大ＤＮＡ分子として存在する。しかしながら
、ある量の遺伝物質は、プラスミドとして知られる比較
的小さな閉環状ＤＮＡ分子の形で存在することもある。

特定の遺伝形質に関連するＤＮＡ分子の部分は、遺伝子
と呼ばれる。遺伝子工学と呼ばれる技術によって、特定
の蛋白質の産生のためにコード付けする遺伝子を一つの
微生物からもう一つの微生物に移す（ｔｒａｎｓｆｅｒ
　）　　ことが可能である。

酵素のようなある種の特定の蛋白質のすぐれた生産者で
ある微生物を提供するこれらの技術を多くの研究者が使
用している。

壌の形に相互に連鎖をなした一連の遺伝子を含むプラス
ミドは、一つの微生物の細胞から取出されそして比較的
容易にもう一つの微生物の細胞に挿入されうろことが発
見された。プラスミドは、また新しい遺伝物質を宿主微
生物に運ぶベクターとして使用されつる。これはまずＤ
ＮＡの環を開く制限エンドヌクレアーゼとして知られる
酵素でプラスミドを切断することによって行なわれる。

所望の遺伝子をもつ外来ＤＮＡの断片は、ＤＮＡ壌が切
断された場所に挿入される。場はＤＮＡリガーゼとして
知られるもう一つのｌ！ｆＦ素で処理することによって
修復される。組換えられたプラスミド、すなわち新しい
環状のＤＮＡ分子は、元のプラスミドの遺伝子に加えて
、挿入されたＤＮＡの断片からの新しい遺伝子を含む。

このプラスミドは宿主微生物中に導入される。新しい遺
伝子を含むグラスミドは、次に宿主微生物中で再生され
そしてその遺伝物質の一部となる。組換えられたプラス
ミドを有する微生物は、次にこのプラスミ□ドの遺伝子
によってコード付けされた蛋白質を産生ずる。

商業的規模で容易に発育せしめられる一つの微生物ｉｉ
、枯草％　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｅ　）
　（以下１θｕｂｔｌｉｓと略称する）である。この理
由努めた。プラスミドベクターが宿主中でのそのプラス
ミドの存在を容易に離間せしめる着干のマーカーを含有
することが重要である。更に、シθｕｂｔｌｉｓ中で複
製する能力を変えることなくベクター中Ｋ　ＤＮＡ断片
を挿入することが可能であるべきである。

これらのうちＫは、フレ７　）　（Ｋｒｅｆｔ　）らＭ
ｏ１ｅｃ。

Ｇｅｎ、　Ｇｏｎｅｔ、、　１６ノ、５９−６７（＋９
７８ン：ケギｙ　ス（Ｋｅｇｇｉｎｓ　）ら、Ｐｒｏｃ
、　ＮａｔｌムＣａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＴＪ、　８．ム、、７５，１４２３−１４
２７（１９７８）；グリスザン（Ｇｒｙｃｚａｎ　）　
らｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　ムｃａｄ、８ｃｉ、、Ｕ、８．ム、、７
５，１４２８−１４５２（１９７Ｂ）；およびグリスザ
ン（Ｇｒｙｃｇａｎ　）らＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ’ｌｏ
ｇｙ、　ｌ　４１　、２４６−２５５（１９８０）があ
る。これらの研究者によって開示され九プラスミドベク
ターは、宿主中でのそれらの同定を可能にする抗生物質
抵抗性マーカーを有する。

本発明は、２種の耐抗生物質性のマーカーを有する新規
な合成プラスミドに関する。このベクターは、遺伝物質
と結合されて種Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの工業的に１を
要な微生物中に容易に挿入されそしてその中に保持され
る雑種プラスミドを形成しうる。

本発明の概要 本発明に従えば、約５．８キロベース（ｋｂ）の分子ｔ
′５を有しそして添付図面に示されているような制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断地図を示すことを特徴とす
る、エリスロマイシン抵抗性ならびにカナマイシン抵抗
性のコード付は遺伝子をもつ本質的に純粋東プラスミド
、ＤＯ８４が提供される。

更に、その細胞がプラスミド、ｐ０８４　　を含有する
ことそして培地１ｔｄ当りカナマイシフ５μｍおよびエ
リスロマイシン５μ？　を含有する培地上で増殖するこ
とを特徴とする、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＯＯ５
９，０９７の生物学的に純粋な培養酌が提供される。

図面の親羽 添付図面は、　　ｐ０８４　　の制限エンドヌクレアー
ゼによる切断地図を示す。この地図は約！Ｌ　８　ｋｂ
の分子量を有するプラスミドｐ０８４　　を基礎にして
構成されている。種々の制限部位の地図上の位置は、（
ＬＯ／ａ８ｋｂ　　における−ＢａｍＨｌ　　制限部位
に対する座標上のキロペース数として示される。制限エ
ンドヌクレアーゼの略語は、下記のとおりである： ら得られた酵素である； （２）μ旦Ｉはバチルス・カルトリティクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕａ　）から得られ７
ｊ＃累である； （３１Ｂ１５４璽はバチルス・グロビギー（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｇｌｏｂｉｇｉｉ　）　　から得られた酵素であ
る；＋４１　　ＫｃｏＲｌ　　ｉｊ大腸菌（ｆｆ１ｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）から得られた酵素であ
る： （５）　　肋Ｌ＠■はへモフイルス・ニジブチウス（Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａ＠ｇｙｐｔｉｕｓ　）から得
られた酵素である： られ７を酵素である； （７）　　Ｘｂａｌｉ；ｉキサントモナス−バドリー（
Ｘａｎ−ｔｈｏｍｏｎａｓ　ｂａｄｒｉｉ　）から得ら
れた酵素である。

プラスミドｐＯ８４＃′ｉ、　　’１種のすでに知られ
ているプラスミド、ｐＢＸ５およびｐＫ　＋９４−　ｃ
ｏｐ　６　（Ｄ単離されたプラスミドｐ８］１５　　は
、カナマイシン耐性遺伝子をもち、そして耐熱性の複製
源（ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）
を有する。それは４、５　ｋｂ　の分子量を有する。こ
のプラスミドは、ドをもつＢ、　５ｕｂｔｉｌｉａの菌
株は、アメリカン・タイプ―カルテュア拳コレクション
（ｔｈｅ　Ａｍ・−ｒｉｃａｎ　’ｌ”ｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　０ｏｌｌｅｃｔ１ｏｎ　）　（ＡＴＯＣ）か
らムＴｏＯＳ　９，０９８として入手されうる。

プラスミドｐＫ１９４−ＣＯｐ６Ｆｉ、ワイスプルムら
（Ｗｅｉｓｉｂｌｕｍ　、　ａｔ　ａ’ｌ　）　Ｉｃよ
って記載された（　、Ｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、＋　５７　、　６５５−６４５（＋９７９）参照）。

それはＡ　６　ｋｂ　の分子量を有し、そしてエリスロ
マイシン耐性遺伝子をもつ。それはｉた温度に敏感な被
製源を有し、そして約５２℃以上の温度においてＦｉ最
適に複製するわけではない。このプラスミドをもつム５
ｕｂｔｉ’ｌｉｇ　　の菌株は、ＡＴＯＣからムＴＯＣ
５９，０８９として入手されうる。

プラスミドｐｓＥ５　　およびｐＩＣ１９４−（ｊＯＴ
ｌ　６　　を、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎ
ｆｌｕｓｎｇａｅ　　よシの酵素である制限エンドヌク
レアーゼＨｐＷＬ璽によって切断した。このエンドヌク
レアーゼは、上記プラスミドの抗生物質耐性マーカーを
破壊しなかった。

得られた直線状ＤＮム配列の混合物をこの技術分野にお
いてよく知られた技術を用いてリガーゼで処理した。こ
の目的で使用されたりガーゼは、重版のＴ、　ＤＩムリ
ガーゼであった。

リガーゼ反応から得られたプラスミドは、Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　　ＲＭ　１２５の菌株の宿主細胞に
形質転換することによって生物学的に活性化された。

カナマイシン耐性もエリスロマイシン耐性も示さないこ
の菌株は、ウオズミ（ｕｏｇｕｍｉ　）　　らによって
初めて記載された（　Ｍｏ１ａｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｏｎ
ｅｔ、。

１５２．６５−６９（１９７７）参照）。それはムＴｏ
＋、５９，０８８として入手できる。形質転換は、チャ
ン（Ｏｈａｎｇ　）とコーエン（Ｃｏｈ＠ｎ　）のプロ
トプラスト形質転換法（Ｍｏｌ・ｃ、Ｇ・ｎ。

Ｇｅｎ＊ｔａ、　　　１　　１　８　、　　看　　１ｌ
−１１５（１９７９）瓢照）Ｋよって達成された。

エリスロマイシンおよびカナ、マイシンの存在下に４５
℃において増殖した細胞を得た。これらの細胞は、耐熱
性複製機構ならびに２種の抗生物質耐性マーカーを有す
るプラスミドをもっていた。

宿主細胞によって生産された合成プラスミドは、パーン
ボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　）　　とドリー（Ｄｏｌｙ
　）　　による透化細胞溶解物法（ｃｌｅａｒｅｌｌｙ
ｓａｔｅ　ｐｒｏｃ・ｄｕｒｅ　）　　の改良法（Ｍｕ
Ｃ，ム０１１Ｒａｓ、、　７　、　ｌ　５１５−１５２
５　（１９７？　）参照）を使用して分離された。この
プラスミドは、ｃｓａｚ−臭化エチジクム密度勾配超遠
心分離法によって精製された。

この方法によって得られたプラスミドｐ０８４は、宿主
バクテリアに形質転換によって導入されうる新規な組換
えプラスミドをつくる几めのプラスミドベクターとして
有用である。上記のプラスミドがこの目的で使用される
場合には、それは制限エンドヌクレアーゼによって特定
の部位において切断される。環状ＤＩム分子であるこの
プラスミドは、かくしてＤＮムを切断する酵素によって
線状のＤＩム分子に変換される。所望の蛋白質について
コード付けする遺伝子をもつ他のＤＮムが同様に同じ酵
素により切断される。

線状のベクターまたはその部分と所望の遺伝子対をなす
ことができ、そしてリガーゼの存在下Ｋ、共有結合的に
結合してＤＮＡの単一環を形成することができる。

例えば、この過程は、アミラーゼ酵素に対してコード付
けするある長さのＤＮＡ１ｒ、切断され７ｊ　ｐ０８４
　　プラスミドに挿入するために使用することができる
。得られ次環状ＤＮム分子は、アミラーゼの合成につい
てコード付けする挿入された長さのＤＮＡを有するプラ
スミドｐｏ８４　　からなる。所望の遺伝物質を含む新
規な合成プラスミドは、更に複製のための宿主微生物内
に導入されて、所望のアミラーゼ酵素の多量を産生ずる
結果をもたらす。

プラスミドｐ０８４　　の重要な特徴は、それが６種の
異なった制限酵素−ハ三Ｈ１％Ｂｃ’ｌ　ｌ　、Ｂｇｘ
層、Ｋｃｏ　Ｒ１、”ニジ艷、■およびλ匹Ｉ、の単一
認識部位を有することである。このことは、これらの酵
素によって切断され′ｆｃＤＮム断片の挿入を可れると
、カナマイシン耐性遺伝子が破壊される。

他方、Ｂｃｌ　ｌまたは−ジ＞ｔｓ、　ｌによるプラス
ミドの切断は、エリスロマイシン耐性を破壊する。その
ような挿入による不活化社、ベクターとしてのｐ０８４
　　に多面性を加える。何故ならば、それは組換えプラ
スミドを有する細胞の、特定の部位における遺伝子挿入
による分離を容易にするからである。

プラスミドｐ０８４　　四Ｂ、　ｓｕｂｔｌｉｇおよび
若干の他のグラム陽性宿主のような微生物におけるプラ
スミドベクターとして機能しうるので％に有用である。

−シ５ｕｂｔｉｌｉ−の菌株が合成プラスミドのための
宿主として使用される場合、細胞によって産生される酵
素またはその他の蛋白質は、細胞から培地に運び出され
うる。この仁とは、費用のかかる細胞溶解の工程が省か
れるので酵素またはその他の蛋白質の工業的生産にとっ
て重要なことである。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉａは、大規
模な工業的発酵に容易に適合するｌ！！種であるので、
殊に望筐しい宿主である。

以下の例は、本発明の若干の具体化例を例示するもので
ある。特記しない限り、割合および百分率に、すべて重
量基準で示されている。

ＡＴＯＣ寄託番号を付されたすべての菌株は、アメリカ
ン・タイプ・カルチュア・コレクション（ムｍａｒｉｃ
ａｎ　Ｔ７ｐ＠　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ　、　Ｒｏｃ−ｋｖｉｌｌｃ＋　、　Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ　、　Ｕ、　８．ム、）から入手されうる。ディ７コ
（Ｄｉｒｃｏ　）名称を付されたすべての試薬は、ディ
フコ研究所（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ−ｅｓ
ｉ　、　Ｄｅｔｒｏｉｔ　、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ　、　
Ｕ、Ｓ、ム、）から入手されうる。

例 プラスミドｐＢＢ５　　の分離 Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　、　ＡＴＣＯ５９，０９８の
培養菌を、５μ？／−の濃度のカナマイシンの存在下に
Ｌ−グロス（ディフコトリプトン１ｅｓ１デイフコイー
スト抽出物ａ　５　％　、　　Ｍａｉｌ　　ＣＬ　５暢
ン中で培養した。細胞を遠心分離によって採集し、次い
でこれらの細胞からバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　
）とドリー（Ｄｏ’ｌｙ　）　　の方法の改良法（Ｎｕ
ｃ、ムｃｉｄＲｓｓ、、７．１５１５−１５２５（１９
７９）参Ｊ’ｆｌ（）Ｋ！ツーｒ透化細胞溶解物（ｃｌ
ｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ）を調製した。公表されてい
る方法において規定されているようにして溶液１．ｌお
よびｌｔ−調製した。細胞ペレットを溶液１２０−中に
再懸濁した。室温において５０分ないし１時間培養した
後、溶液１１４０−を添加した。懸濁液を混合し、０℃
において５ないし２０分間保った後、溶液１５０ｗｄを
添加し友。混合は緩やかに反転させることによって行な
われ、細胞溶Ｍ物は、０℃において少くとも１時間貯蔵
された。得られ皮沈殿物を１０，０００Ｘｆ［おいて１
５分関連心分離にかけることによって集めた。傾瀉によ
って上澄みを除去し、そして再度遠心分離にかけて残り
の沈殿物を除去した。上記の溶液を一２０℃において２
倍過剰量の冷エタノールと混合し、そして−２０℃にお
いて少くとも１時間貯蔵してＤＮＡを沈殿させた。得ら
れた沈殿物を遠心分離によって集め、酢酸す）　ＩＪウ
ムα１Ｍを含有する１０５モルのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンハイドロクロライド５〜１０−にｐ
ａａｏにおいて溶解した。アルコールによる沈殿を繰返
した。ただし今度は、沈殿物′ｆｒ溶解するために、　
ｐＨ７においてＮ＠Ｃｊ）１［１０１５Ｍおよび酢酸ナ
トリウムα００１５を含有する溶液を使用した。次Ｋ、
細胞溶解物を、リボヌクレアーゼ−Ａ（シグマ・ケミカ
ル・カンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　、　ａｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）　　から市販されているウシの膵
臓から得られたタイプ１−ム）αｌ　ｍＷ／−とりボヌ
クレアーゼー’Ｉ’！（アスペルギルス・オリゼー（−
リ見ｎμよリヱ江り憇ン　から得られたグレード■、シ
グマ・ケミカル・カンパニー）（すいし１０率位／−と
の混合物と一緒に３７℃において少くとも５０分間培養
した。次いで、上記細＃＠ＩＦＩ解物を、Ｔｌ８　（Ｔ
ｌＣ８は、トリス−Ｈ０ｊ５０　ｍＭ、　ｐＨａ　Ｏ，
Ｍａｉｌ　　５０　ｍＭ、エチレン−ジアミンテトラ酢
＊　５　ｍＭ　　であるンの２倍過剰ｔを５−入れ換え
て平衡せしめた再蒸留フェノールを用いて１回抽出した
。上記の７エノール処理に続いてクロロホルムとイソア
ミルアルコールとの２４対１の混合物を用いて１回抽出
し友。

透化細胞溶解物をｔａＸＴＥ８および十分な水で８ｍま
で希釈して、約Ｉ　Ｘ　ＴｌＣ８の最終濃度を得た。こ
の溶液にｃａｃｉ＆ｏｔおよび挿入色素（ｉｎｔｅｒｃ
ａｌａｔｉｎｇ　ｄｙｅ　）　、臭化エチジウムｔｆ＆
加シテ約１５　ｗｔｆ　／ｗｌの濃度とした。ラドロフ
（Ｒａｄｌｏｆｆ　）らの一般的超遠心分離法（Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、ムｃａｄ、　８ｃｉ、、　Ｕ、　８．ム、、
５７．１５１４−１５２１（１９６７７参照）によって
全ＤＮＡがらプラスミドＤＮＡを分離した。約ｔ　５　
ｋｂ　の分子量を有するプラスミドｐｓＦｆ３　　が得
られた。

プラスミドＰＰ　ｔ９ｎ−ｃｏｐ６ノ分１１［Ｅプラス
ミドｐＫ＋９４−ｃｏｐ６（ムＴｃ０５９，０８９１を
もつＢ、　５ｕｂｔｉｌｉａの菌株を培養し、そしてこ
のプラスミドをプラスミドｐＢＩＬ５　の分離に使用さ
れた一般的手法に従って細胞から分離した。

このプラスミドは、約１６　ｋｌ）の分子量を有する。

それはヴアイスブルーム（Ｗ・ｔ８ｂｌｕｍ　）　　ら
によって記載されている（　Ｊ、　Ｂａｃｔ＠ｒｉｏｌ
Ｏｇ７ｍ＋！５７，６５５−６４５（１９７９）参照）
。

プラスミドｐ０８４　　の調製 ｎ＃されたプラスミドｐ８に５　　およびｐＨ９４−ｃ
ｏｐ　６を混合し、そして急速アルコール沈殿法によっ
て濃縮した。５Ｍの酢酸ナトリウム溶液の１／１０容を
遠心分離用管内の精製プラスミド溶液に加えた。−２０
℃において２倍過剰のエタノールを添加し、管を一８０
℃において、２５分間保った。沈殿物を遠心分離によっ
て集め、７０％エタノールて２回内滌し、減圧下に乾燥
し、そして緩衝溶液中に再溶解した。次に、ペセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（Ｂ
ｅｔｈｅＭａ　Ｒｓａｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−
ｒｉｅｓ　　、　　工ｎｃ、、　　Ｇａ１ｔｈ　＠ｒｓ
ｂｕｒｇ　　、　　Ｍａｒｙｌａｎｌ　　）　　　　Ｋ
　　よって規定された緩衝溶液を使用して、この生産者
から入手されうる）！ｐａＨｌ累の過剰量で消化した。

アガロースゲル電気泳動によって測定された消化（ｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎ　）が９５％以上完了したとき、制限酵
素は、６５℃に加熱することによって不活化された。

切断プラスミドの溶液を過剰の７４ＤＩムリガーゼにュ
ー・イングランド・バイオラプス・インコーホレーテッ
ド（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ工ｎｃ、
　、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｇｓａｃｈｕｇ・ｔｔｓ
　）から市販されているンを使用し、この供給者によっ
て推奨された緩衝溶液を用いてａｔにおいて４６時間リ
ガーゼを反応せしめた。典型的なリゲーション混合物は
、２６０μｔ／−のＤＮム濃度において約等量の消化さ
れたｐＢ］］ｉ３　　およびｐＨ１９４−Ｃｏｐ６を消
化せしめた。

２種のドナープラスミドから得られたＤＮムのリゲート
された断片を、Ｂ、　ｓｕｂｔｉｌｉｇ　、　ム’ｒｃ
ｃ５９．０８８のプロトプラストへと形質転換した。

形質転換は、チャン（Ｏｈａｎｇ　）およびコーエン（
Ｏｏｈ＠ｎ　）のプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ・
Ｃ６Ｇｅｎ、Ｇｅｎ＠ｔ、、１１８．　１１１−１１５
　（１９７９７−照）Ｋよって達成された。形質転換さ
れたプロトプラストをα０５μｆ／ＩＩＩｇの濃度まで
エリスロマイシンをａｍする紡に５０℃において少くと
も１時間培養した。５０℃において少くとも３０分間更
に培養し７ｊ後に、上記のプロトブラストヲエリスロマ
イシン５μｆ／ｓｇｉ含有するＤＭＳｊｌｌ地を有する
寒天平板上にブレーティングした（　ＤＭ５　Ｆｉ、１
を当り下記の無Ｉｉｌ溶液からなる：４囁寒天２００−
１ｐＨ７，３の１Ｍコハク酸ナトリクム５００ｍ、５’
ｌデイフコ力スアミノｇｌｌ１００ｍｇ、１０％ディフ
コイースト抽出物５００１１℃％１５　％　Ｋ１ＨＰＯ
４オヨＯｔ　５　％　Ｋ１ＨＰＯ４Ｉ００−１２０％グ
ルコース２５−１ｌ　Ｍ　ＭｇＯ１ｚ２０−および２囁
ウシ血清アルブミン５−）。

ブレーティングされた細胞を５０℃において培養した。

エリスロマイシンを含有するＤＭ５平板上で増殖したコ
ロニーをディフコ研究所から市販されている２枚のＴＢ
ＡＢ　（）リプドース血液寒天培地ｊ板上に格子模様に
貼付けた。これらを５０℃および４５℃において別々に
培養した。

これらの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔ・）をカナマイシン５μ
ｔ／−およびエリスロマイシン５μｔ／−を含＾するＴ
ＢＡＢ寒天板上に複製的にブレーティング（ｒｅｐｌｉ
ｃａｔ＠ｐｌａｔｅｄ　）　　した。これらの平板を鋳
型と同じ温度で培養した。４５℃において抗生物質を用
いてＴＢＡＢ上で増殖したコロニーを分別し、ｐ８１ｅ
！ｉ　　の分離について述べた方法を用いてそれらのコ
ロニーからプラスミドを分離した。所望の性質を付与さ
れそして適当な制限のパターンをもった一種のプラスミ
ドをその後の研究の皮めに選択しそしてｐ０８４　　と
名付けた。

プラスミドｐ０８４　　を有するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ
−の菌株は、ムチｏａからムＴｏｏ　５９，０　？　７
として入手されつる。

プラスミドｐ０８４　　をもったーＢ、　ｓｕｂｔｉｌ
ｉｇ　　ｆ）−株は、好ましくはエリスロマイシンおよ
びカナマイシンをそれぞれ５μｆ／ｄ含有するＬ−グロ
スのような適当な培地で培養されうる。培養は、３０℃
ないし５７Ｃにおいて行なわれる０次の細胞溶解を容易
にするため、培養１１＋社、細胞密度が、６６０ナノメ
ートルにおける吸光度が約１ｌＬ６ないしＣ７となるよ
うな程度に達したときに［Ｅｌ＋１収される。プラスミ
ドＤＩ’　ｎ　％　プラスミドｐ８１ｃ５　　の分離に
用いられた方法によって分離されそして精製される。

プラスミドｐ８０４　　の分析 添付図面に示された地図を構成するために、プラスミド
ｐ８０４　１に制限分析によって分析した。

使用されたすべての制限酵素は、ペセスダ・リサーチ・
ラボラドリース・インコーホレーテッド（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ工
ｎｃ、）から購入されそしてジャランコ（Ｊａｌａｎｋ
Ｏ）らの方法（Ｇｏｎｏ、１４．　５２５−５２８　（
１９８０ス１０−１Ｍａｓｔ　１０　ｗａｇ　、　Ｍｇ
Ｃ４１０ｍｌＪおよびジチオスレイトール１−　を含有
する低塩緩衝溶液中で使用された。＃；ＪＢＩＬＩＨＩ
、Ｂｇｌ　ｌ、ＢＣＩ　ｌ、ｌｃｏ　Ｒ１、およびＸｂ
ａ　Ｉは、Ｎａ０ｔが５０ｖａＭ　　の＃ｋｆで存在す
る同様な緩ＩＩ溶液を便用した。低塩および高温緩衝溶
液を必要とする＃累の組合せｆ：使用する場合には、低
塩浴液を必要とする酵素をまず５７℃において２時間使
用し、次いで６５℃において１５分間不活化した。次に
、更にＮａ０ｌ　　を添加して塩濃度ｔ−高高級緩衝溶
液それまで高め、そして第２の酵素を５７Ｃにおいて２
時間培養した。代表的なものとして、５μｌ　中に約２
μｔ　含有するｐ８０４　　＃液を、最終容積５０μｔ
　中で５単位の制限酵素を用いて５７℃において２ｗ＃
間消化した。

単一＃累による消化の結果は、第１表に示されており、
そして二重酵素による消化の結果は、第厘表に示されて
いる。単一および二重酵素による消化のデータを比較す
ることによって、添付図面に示されたｐ０８４　の地図
が得られた。

第　　　　１　　　　表 Ｈｐａｌ　　　　　５７００　　−　　−　　　　−　
　　　５７００Ｂｃ’ｌｌ　　　　５７００　　−　　
−　　　　−　　　５７００Ｂａ！ＩＩＨＩ　　　　５
７００　　−　　−　　　　−　　　　５７００Ｈｐａ
１　　　２８００　１９５０　７８０　　１５０”　　
　５６８０Ｈａｅ　ｌ　　　　４２００　５７０　４８
０（Ｘ２）　　−５７５０ａ）　　７ラグメントの大き
さくおよび合計）Ｆｉ、塩基対として示されておＬＳＩ
の誤差範囲内である。

ｂ）　ポリアクリルアミドゲル上でのみ観察された。

第　　　２　　　表 屡Ｉ台Ｒ１５６４５２１１５−５７６０Ｂｇｌ　１−Ｂ
ａｎ　Ｈｌ　　　２８５０　２８５０　−　　　　　　
５７００Ｂｇｌ　１−Ｂｃｘ　ｌ　　　　４７００　　
９５０　−　　　　　　　５６５０ち１ニドμ邑１　　
　３１５０　２６００　−　　　　　　５７５０Ｂｃｌ
　１−ＢａｎＨｌ　５９００１９４０−　５８４０Ｂｃ
ｌ　１−Ｘｂａ　ｌ　５５７０２１８０−　５７５０Ｈ
ｐａ　１−ＢａｎＨｌ　４２００１５８０−　５５８０
Ｈａｅｌ−ＢａｍＨｌ　　　　　２２００　　１９５０
　　５７０　４８０（Ｘ２）　　　５６８０Ｈａｓ■−
１１ｉｃｏＲ１２８２０１５２０５７０４８０（Ｘ２）
　５６７０ａ）フラグメントの大きさくおよび合計）は
、塩基対として示されており、５参の誤差範囲内にある
。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ−の宿主菌株中のｐ０８４　　プ
ラスミドの安定性は、下記の実験によって醐定された。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　＠株ＡＴ（ＩＣ５９，０９７
のプラスミド含有細胞をディフコハートインフュージョ
ンブロスを含有する培地で１４世代の関４５℃において
培養した。これらの細胞をディ７コのトリプトース血液
寒天ベース板上にプレーディングした。各希釈液から透
明に分離されたコロニーヲ、エリスロマイシンおよびカ
ナマイシンの両方を含有する抗生物質平板上に採取した
。＋４世代の後に、すべての細胞は、１４世代の間プラ
スミドの損失（ｌｏｇ８）　　が起らなかったこと全示
し、このことは両抗生物質に対する抵抗性を示している
。すなわち、この実験は、本発明のベクターがＢ、　Ｂ
ｕｂｔｉｌｉ８宿主において安定に保たれることを示し
ている。

本明細書中に記載された操作は、すべて米国国立衛生研
究所（ＮＩＨ）の指針に規定された物理的ならびに生物
学的封じ込めの要請事項に従って行なわれた。

【図面の簡単な説明】

１面は、本発明によ、６ｐ０８４　　についての制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断地図を示す。 第１頁の続き ［相］発　明　者　マーガレット・エム・ドーリイアメ
リカ合衆国オハイオ州コロ ンバス・ノース・スター・ナン バー２　１８５０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　約！ａ８ｋｂ　の分子量および添付図面に示すよ
   うな制限エンドヌクレアーゼによる切断地図を有するこ
   とを特徴とする、エリスロマイシン耐性ならびにカナマ
   イシン耐性のコード付は遺伝子をもつ本質的に純粋なプ
   ラスミド、ｐ０８４゜ λ　その細胞がプラスミド、ｐ０８４　　を有するとと
   そして培地１−当りカナマイシフ５μ？　およびエリス
   ロマイシン５μｍ　を含有する培地上で増殖することを
   特徴とする、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉＪ１）、Ａ
   ＴＯｏ、　５９，０９７の生物学的に純粋な培養菌。