JPH02312590A - プラスミドｐＴＹ１ - Google Patents
プラスミドｐＴＹ１Info
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- JPH02312590A JPH02312590A JP1132686A JP13268689A JPH02312590A JP H02312590 A JPH02312590 A JP H02312590A JP 1132686 A JP1132686 A JP 1132686A JP 13268689 A JP13268689 A JP 13268689A JP H02312590 A JPH02312590 A JP H02312590A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はプロピオン酸生産菌プロピオニバクテリウム（
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌より分離
されるプラスミドに関する。
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌より分離
されるプラスミドに関する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕最近
、微生物を用いるＤＮＡ （デオキシリボ核酸）紐換え
実験が盛んになり大腸菌を中心として、これに導入する
ことができる有用なベクターの開発が広く行われている
。大腸菌以外の工業的に有用な微生物、例えば、アミラ
ーゼなどの生産菌である枯草菌、抗生物質などの生産菌
である放線菌および醸造用アルコールの生産菌である酵
母などでも組換えＤＮＡ技法を確立しようとの試みがな
されている。組換えＤＮＡ技法の導入にはベクターの取
得が必須であるため、これらの菌種ではプラスミドやフ
ァージの検索が行われてきた。
、微生物を用いるＤＮＡ （デオキシリボ核酸）紐換え
実験が盛んになり大腸菌を中心として、これに導入する
ことができる有用なベクターの開発が広く行われている
。大腸菌以外の工業的に有用な微生物、例えば、アミラ
ーゼなどの生産菌である枯草菌、抗生物質などの生産菌
である放線菌および醸造用アルコールの生産菌である酵
母などでも組換えＤＮＡ技法を確立しようとの試みがな
されている。組換えＤＮＡ技法の導入にはベクターの取
得が必須であるため、これらの菌種ではプラスミドやフ
ァージの検索が行われてきた。
一方、プロピオン酸菌は生理活性物質の生産に関して多
種多様な能力を有することから、醗酵工業の分野では古
くから重要視されてきている。にもかかわらず、プロピ
オン酸菌の育種の手法はきわめて限られており、それに
要する時間と労力は研究をすすめる上で大きな障害とな
っている。したがって、プロピオン酸菌の育種改良の手
段の一つとして、ＤＮＡ組換え実験を可能とする宿主−
ヘクター系の確立が望ましいとされている。
種多様な能力を有することから、醗酵工業の分野では古
くから重要視されてきている。にもかかわらず、プロピ
オン酸菌の育種の手法はきわめて限られており、それに
要する時間と労力は研究をすすめる上で大きな障害とな
っている。したがって、プロピオン酸菌の育種改良の手
段の一つとして、ＤＮＡ組換え実験を可能とする宿主−
ヘクター系の確立が望ましいとされている。
しかしながら、従来、プロピオン酸閑において、本発明
のプラスミドのごとき自律複製可能なプラスミドは知ら
れておらず、ＤＮＡ組換えによる育種改良を困難にして
きた。′ 〔課題を解決するだめの手段〕 本発明者らは、プロピオン酸生産菌であるプロピオニバ
クテリウム属細菌におけるＤＮＡＭｉみ換え技術を開発
すべく探索研究を行ったところ、該属菌から新規プラス
ミドが得られることを知り、これに基づいてさらに研究
した結果、本発明を完成した。
のプラスミドのごとき自律複製可能なプラスミドは知ら
れておらず、ＤＮＡ組換えによる育種改良を困難にして
きた。′ 〔課題を解決するだめの手段〕 本発明者らは、プロピオン酸生産菌であるプロピオニバ
クテリウム属細菌におけるＤＮＡＭｉみ換え技術を開発
すべく探索研究を行ったところ、該属菌から新規プラス
ミドが得られることを知り、これに基づいてさらに研究
した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、約４．９メガダルトンの分子量を
有し、制限酵素旧ｎｄＩＩＩ、ＢｇｌｌＴ及びＰｓｔＩ
によって切断されず、そして次の制限酵素地図：によっ
て特徴づけられるプラスミドｐＴｙ ｌに関する。
有し、制限酵素旧ｎｄＩＩＩ、ＢｇｌｌＴ及びＰｓｔＩ
によって切断されず、そして次の制限酵素地図：によっ
て特徴づけられるプラスミドｐＴｙ ｌに関する。
［具体的な説明〕
本発明において用いられるプロピオニバクテリウム属に
属し、プラスミドを有する微生物としてはたとえば、プ
ロピオニバクテリウム・ベントザセウム（紅卯バ叫巽脛
頃吐些−ヨ）が挙げられ、具体的にはプロピオニバクテ
リウム・ベントサセウムＩＦＯ１，２４２５（ＡＴＣＣ
４８７５）が挙げられる。
属し、プラスミドを有する微生物としてはたとえば、プ
ロピオニバクテリウム・ベントザセウム（紅卯バ叫巽脛
頃吐些−ヨ）が挙げられ、具体的にはプロピオニバクテ
リウム・ベントサセウムＩＦＯ１，２４２５（ＡＴＣＣ
４８７５）が挙げられる。
この微生物は財団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・
カルチャーズ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎＯｓａｋａ Ｌｉ５ｔ ｏｆ Ｃｕ１
ｔｕｒｅｓ １９８４）に収載され、該研究所より人手
することができ、またジ・アメリカン・タイプカルチャ
ー・コレクション（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国
）発行のカタログ・オブ・ストレインズ（Ｔｈｅ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｒ ５ｔｒａｉｎｓ
ＬＦｏｕｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８０
）に収載され、該コレクションから人１手することがで
きる。
カルチャーズ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎＯｓａｋａ Ｌｉ５ｔ ｏｆ Ｃｕ１
ｔｕｒｅｓ １９８４）に収載され、該研究所より人手
することができ、またジ・アメリカン・タイプカルチャ
ー・コレクション（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国
）発行のカタログ・オブ・ストレインズ（Ｔｈｅ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｒ ５ｔｒａｉｎｓ
ＬＦｏｕｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８０
）に収載され、該コレクションから人１手することがで
きる。
本発明に使用される培地としては、本発明の微生物が生
育し、その菌体内にプラスミドを保持しうるものであれ
ばいかなるものであってもよい。
育し、その菌体内にプラスミドを保持しうるものであれ
ばいかなるものであってもよい。
この培地の代表的なものを第１表に示す。また培養に際
して必要があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフ
ェニコールが加えられる。
して必要があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフ
ェニコールが加えられる。
第１表 培養培地組成例
酵母エキス ８．５ｇ／ｌポリペプトン
８．５ｇ／ｌグルコース １１
．０ｇ／Ｉ！。
８．５ｇ／ｌグルコース １１
．０ｇ／Ｉ！。
Ｋｌｌ。Ｐｏ、 ２．０ ｇ／ｌトマ
トジュース粉末 ３．７ｇ／ｆｆｉＴｗｅｅｎ ８
０ １．Ｏｇ ／ １培養温度は通常１
５″Ｃないし４２℃、さらに好ましくは約２４°Ｃない
し３５°Ｃであり、培地のｐＨは初発ｐＨが約６．０な
いし８．０でありさらに好ましくは約６．５ないし７．
５である。培養時間は通常１ないし４日、さらに好まし
くは約１ないし２日である。
トジュース粉末 ３．７ｇ／ｆｆｉＴｗｅｅｎ ８
０ １．Ｏｇ ／ １培養温度は通常１
５″Ｃないし４２℃、さらに好ましくは約２４°Ｃない
し３５°Ｃであり、培地のｐＨは初発ｐＨが約６．０な
いし８．０でありさらに好ましくは約６．５ないし７．
５である。培養時間は通常１ないし４日、さらに好まし
くは約１ないし２日である。
次に、上記培養によって生育された菌体を集め、溶菌し
、溶菌物からプラスミドを単離する。菌体を集める方法
自体は、公知の方法に従えばよく、たとえば遠心分離、
濾過などの方法が挙げられる。
、溶菌物からプラスミドを単離する。菌体を集める方法
自体は、公知の方法に従えばよく、たとえば遠心分離、
濾過などの方法が挙げられる。
プロピオニバクテリウム属菌の溶菌方法としてはたとえ
ば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方法があげら
れる。なお必要があれば溶菌酵素のほかにプロテアーゼ
などの酵素類やザルコシール、ラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤を加えたり、ペニシリンＧ処理、凍結
融解をほどこしたりして溶菌を容易にすることができる
。
ば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方法があげら
れる。なお必要があれば溶菌酵素のほかにプロテアーゼ
などの酵素類やザルコシール、ラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤を加えたり、ペニシリンＧ処理、凍結
融解をほどこしたりして溶菌を容易にすることができる
。
つぎに、このようにして得られた溶菌物からプラスミド
を単離するにはそれ自体公知の方法に従えばよく、たと
えばエタノールを用いるＤＮＡの沈殿法、エチジウムブ
ロマイドを含む塩化セシウム密度勾配遠心法、ショ糖密
度勾配遠心法、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳
動法、セロファン膜などを用いる透析処理法などを適宜
組み合わせてプラスミドを単離することができる。
を単離するにはそれ自体公知の方法に従えばよく、たと
えばエタノールを用いるＤＮＡの沈殿法、エチジウムブ
ロマイドを含む塩化セシウム密度勾配遠心法、ショ糖密
度勾配遠心法、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳
動法、セロファン膜などを用いる透析処理法などを適宜
組み合わせてプラスミドを単離することができる。
後述の実施例１で得られたｐＴＹ １は、次のような制
限酵素による切断部位を有している。ｐＴＹ １の制限
酵素切断地図を以下に示す。
限酵素による切断部位を有している。ｐＴＹ １の制限
酵素切断地図を以下に示す。
」二記の制限酵素切断地図は、ｐＴＹ ｌの分子量を４
．９メガダル１−ンとして作製されており、各種の制限
酵素による切断個所は地図上のＢａｍ Ｈｌによる切断
個所（０／４．９）を基にして定められている。
．９メガダル１−ンとして作製されており、各種の制限
酵素による切断個所は地図上のＢａｍ Ｈｌによる切断
個所（０／４．９）を基にして定められている。
ｐＴＹ １は各種制限酵素に対して次の感受性を有して
いる。
いる。
制限酵素によるｐＴｙ １の切断部位数制限酵素＊
切断個所数 Ｂａｍ Ｈｌ Ｉ Ｅｃｏ Ｒ１２ ｓｐｈ Ｔ Ｉ Ｘｈｏ Ｔ ］ Ｈｉｎｄ Ｉ［Ｉ Ｏ Ｂｇｌ ＩＩ ０ Ｐｓｔ Ｉ Ｏ ＊制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。
切断個所数 Ｂａｍ Ｈｌ Ｉ Ｅｃｏ Ｒ１２ ｓｐｈ Ｔ Ｉ Ｘｈｏ Ｔ ］ Ｈｉｎｄ Ｉ［Ｉ Ｏ Ｂｇｌ ＩＩ ０ Ｐｓｔ Ｉ Ｏ ＊制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。
Ｂａｍ ＩＩＩ ：ハチルス・アミロリクエファシェ
ンスＥｃｏＲＩ：エシェリヒア・コリ ５ｐｈＩ：ストレプトマイセス・ファエクロモゲネス Ｘｈｏｌ：キサントモナス・ボルシコーラＨｉｎｄ ｍ
：ヘモフイラス・インフルエンザＢｇｌＩＩ：バチラ
ス・グロビギー ＰｓｔＴ：プロビデンシア・スチュアーティー制限酵素
による切断部位数は過剰の制限酵素存左下でプラスミド
ｐＴＹ １を完全消化し、それらの消化物を０．６％の
アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能な断片の数か
ら決定される。分子量は大腸菌のラムダファージのＤＮ
Ａを旧ｎｄｌｌｌで消化して得られる分子量既知の断片
（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、非。
ンスＥｃｏＲＩ：エシェリヒア・コリ ５ｐｈＩ：ストレプトマイセス・ファエクロモゲネス Ｘｈｏｌ：キサントモナス・ボルシコーラＨｉｎｄ ｍ
：ヘモフイラス・インフルエンザＢｇｌＩＩ：バチラ
ス・グロビギー ＰｓｔＴ：プロビデンシア・スチュアーティー制限酵素
による切断部位数は過剰の制限酵素存左下でプラスミド
ｐＴＹ １を完全消化し、それらの消化物を０．６％の
アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能な断片の数か
ら決定される。分子量は大腸菌のラムダファージのＤＮ
Ａを旧ｎｄｌｌｌで消化して得られる分子量既知の断片
（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、非。
５５１−５６４（１９７５） ）の同一アガロースゲル
上での泳動距離で描かれる標準曲線に基づき、消化プラ
スミドｐＴＹ １の各断片の分子量を算出し、複数の断
片を生じる場合は加算して求められる。
上での泳動距離で描かれる標準曲線に基づき、消化プラ
スミドｐＴＹ １の各断片の分子量を算出し、複数の断
片を生じる場合は加算して求められる。
本発明により得られたプラスミドは種々の制限酵素によ
る切断部位を有しており、この事実はこのプラスミドを
修飾して多くの有用なベクターを開発できることを示し
ている。またこのプラスミドあるいはその誘導体に目的
とする遺伝子を組み込み、これを適当な宿主微生物に導
入して、宿主を形質転換させることも可能である。とり
わけ本発明のプラスミドはプロピオン酸菌など発酵工業
上重要な微生物に対しベクターとして有利に利用できる
。すなわちプロピオン酸菌からの遺伝情報を本発明のプ
ラスミドを用いてクローン化し、これを目的とする微生
物に導入することによりたとえば、プロピオン酸閑によ
る抗生物質、生理活性物質、ビタミンなどの代謝産物の
産生の増大をもたらすことができる。
る切断部位を有しており、この事実はこのプラスミドを
修飾して多くの有用なベクターを開発できることを示し
ている。またこのプラスミドあるいはその誘導体に目的
とする遺伝子を組み込み、これを適当な宿主微生物に導
入して、宿主を形質転換させることも可能である。とり
わけ本発明のプラスミドはプロピオン酸菌など発酵工業
上重要な微生物に対しベクターとして有利に利用できる
。すなわちプロピオン酸菌からの遺伝情報を本発明のプ
ラスミドを用いてクローン化し、これを目的とする微生
物に導入することによりたとえば、プロピオン酸閑によ
る抗生物質、生理活性物質、ビタミンなどの代謝産物の
産生の増大をもたらすことができる。
さらに本発明のプラスミドは微生物遺伝子のみならず、
高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマトスタチン、イン
スリンなどをコードする遺伝子や窒素固定に関与する遺
伝子）をクローニングするためのベクターとしても利用
可能である。
高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマトスタチン、イン
スリンなどをコードする遺伝子や窒素固定に関与する遺
伝子）をクローニングするためのベクターとしても利用
可能である。
上記使用において、目的とする遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドの作製方法それ自体は公知である。たとえば、
サンエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ） １９７５年第２３３巻Ｎ０
８１第２４〜３３頁に記載されている。
ラスミドの作製方法それ自体は公知である。たとえば、
サンエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ） １９７５年第２３３巻Ｎ０
８１第２４〜３３頁に記載されている。
また本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入する
には、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）Ｋ−１２で報告されて
いるように低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して
菌膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する方法
（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ ａｎｄ ｌｌｉｇａ、八、、Ｊ。
には、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）Ｋ−１２で報告されて
いるように低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して
菌膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する方法
（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ ａｎｄ ｌｌｉｇａ、八、、Ｊ。
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、、 ５３，１５９（１９７０））
、枯草菌で報告されているように増殖のある段階で自然
にプラスミドを取り込みやすくなること（いわゆるコン
ビ−テントな状態）を利用して、プラスミドを移入する
方法（Ｄｕｎｃａｎ、 Ｃ，１１，、Ｗｉｌｓｏｎ、
Ｇ、＾、ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ。
、枯草菌で報告されているように増殖のある段階で自然
にプラスミドを取り込みやすくなること（いわゆるコン
ビ−テントな状態）を利用して、プラスミドを移入する
方法（Ｄｕｎｃａｎ、 Ｃ，１１，、Ｗｉｌｓｏｎ、
Ｇ、＾、ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ。
Ｆ、Ｅ、＋ Ｇｅｎｅ、上、１５３（１９７７）） 、
更には枯草菌、放線菌、酵母の報告にあるように細胞を
プロトプラスト又はスフェロプラストにしてプラスミド
を移入する方法（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅ
ｎ、 Ｓ、Ｎ、、 Ｍｏ１ｅｃ。
更には枯草菌、放線菌、酵母の報告にあるように細胞を
プロトプラスト又はスフェロプラストにしてプラスミド
を移入する方法（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅ
ｎ、 Ｓ、Ｎ、、 Ｍｏ１ｅｃ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １６８．１１Ｈ１９７９）
： Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｗａｒｄ。
： Ｂｉｂｂ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｗａｒｄ。
Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ Ｉｌｏｐｗｏｏｄ、 Ｄ、Ａ、、
Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４，３９８（１９７Ｂ）：Ｈｉｎ
ｎｅｎ、 Ａ、、 Ｈｉｃｋｓ、 Ｊ、Ｂ、 ａｎｄ
Ｆｉｎｋ、 Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｕｒｅ、 ２７４，３９８（１９７Ｂ）：Ｈｉｎ
ｎｅｎ、 Ａ、、 Ｈｉｃｋｓ、 Ｊ、Ｂ、 ａｎｄ
Ｆｉｎｋ、 Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、７５．
１９２９（１９７８））等が知られている。
１９２９（１９７８））等が知られている。
また、本発明のプラスミドをベクターとして用い、目的
とする物質の生合成に必要な遺伝子を組み込んだプラス
ミドを導入された宿主微生物を自体公知の方法で培養し
て、目的とする物質を培地中あるいは菌体内に生成蓄積
させ、その培養物から目的とする物質を分離精製するご
とにより、目的とする物質を製造できる。
とする物質の生合成に必要な遺伝子を組み込んだプラス
ミドを導入された宿主微生物を自体公知の方法で培養し
て、目的とする物質を培地中あるいは菌体内に生成蓄積
させ、その培養物から目的とする物質を分離精製するご
とにより、目的とする物質を製造できる。
本発明のプラスミドはプロピオン酸菌のプラスミドであ
るから、プロピオン酸菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のダラム陽性菌、たとえばバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） 、ブレビバクテリウ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ４ｎｒｉｕｍ）などの細菌のベク
ターとしても使用できる可能性がある。
るから、プロピオン酸菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のダラム陽性菌、たとえばバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） 、ブレビバクテリウ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ４ｎｒｉｕｍ）などの細菌のベク
ターとしても使用できる可能性がある。
次に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこれに限定されるべきものではない。
本発明はこれに限定されるべきものではない。
第１表の培地１０ｍ２を試験管（１８ｍ＋ｎφ×１８０
ｍｍ）に分注後滅菌し、これにプロピオニバクテリウム
・ベントサセウムＩＰＯＬ２４２５を接種して３０°Ｃ
で２日間静置培養した。この培養物の全量を４００ｍｆ
ｌの前記と同様の組成の培地を１１の坂ロフラスコに分
注して予め滅菌したものに移植して３０゛Ｃで静置培養
した。６１０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、Ｏ
Ｄ ＝ １． Ｏになった時点で培養液中２単位／成の
濃度となるようにペニシリンＧを添加し、さらに３０°
Ｃ１２，５時間培養を継続した。培養液から菌体を集菌
し、ＴＢＳ緩衝液〔ｏ、ｏ３Ｍ ）リス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（トリス） 、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ 、０．０５Ｍ ＮａＣｆ ： ｐＨ８，０〕で
洗浄後、リゾチーム液〔２５％ショ糖、０、 ＩＭ Ｎ
ａＣｆｆ１．０．０５Ｍ ）リス、５ ｌｌ１ｇ ／
ｍｌリゾチーム： ｐＨ８，Ｏ）で２０戚に懸濁し、
３７°Ｃで１時間反応させた。反応液に、５Ｍ ＮａＣ
ｆｆ１２．４ ｍｌ、０，５Ｍ ＥＤＴ＾（ｐＨ８，５
） ０．６ ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウムと０．
７ＭＮａＣｆｆ１とからなる溶液４．４ ｍｌを順次添
加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時時間−た。
ｍｍ）に分注後滅菌し、これにプロピオニバクテリウム
・ベントサセウムＩＰＯＬ２４２５を接種して３０°Ｃ
で２日間静置培養した。この培養物の全量を４００ｍｆ
ｌの前記と同様の組成の培地を１１の坂ロフラスコに分
注して予め滅菌したものに移植して３０゛Ｃで静置培養
した。６１０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、Ｏ
Ｄ ＝ １． Ｏになった時点で培養液中２単位／成の
濃度となるようにペニシリンＧを添加し、さらに３０°
Ｃ１２，５時間培養を継続した。培養液から菌体を集菌
し、ＴＢＳ緩衝液〔ｏ、ｏ３Ｍ ）リス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（トリス） 、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ 、０．０５Ｍ ＮａＣｆ ： ｐＨ８，０〕で
洗浄後、リゾチーム液〔２５％ショ糖、０、 ＩＭ Ｎ
ａＣｆｆ１．０．０５Ｍ ）リス、５ ｌｌ１ｇ ／
ｍｌリゾチーム： ｐＨ８，Ｏ）で２０戚に懸濁し、
３７°Ｃで１時間反応させた。反応液に、５Ｍ ＮａＣ
ｆｆ１２．４ ｍｌ、０，５Ｍ ＥＤＴ＾（ｐＨ８，５
） ０．６ ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウムと０．
７ＭＮａＣｆｆ１とからなる溶液４．４ ｍｌを順次添
加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時時間−た。
溶菌物全量を遠心管に移し、４°Ｃで６０分間、６９４
００Ｘ ｇの遠心にかけ上澄液をとった。
００Ｘ ｇの遠心にかけ上澄液をとった。
これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール
６０００を加え、静かに混和して溶解液、氷水中に置い
た。１６時間後、１５００Ｘｇで１０分間遠心してベレ
ットを回収した。ＴＢＳ緩衝液５ ｍｌを加えて、ペレ
ットを静かに再融解してから５■／ｍｌエチジウムブロ
マイド０．５ ｍｆｌを添加し、これに塩化セシウムを
加えて静かに融解し、密度を１．５８０に合わせた。こ
の溶液を１０５０００ｘ ｇ、２０゛Ｃで４８時間遠心
した。この密度勾配遠心により、共有結合で閉じられた
環状のＤＮＡは紫外線ランプを照射することによって遠
心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出された
。このバンドを注射筒で遠心デユープの側面から抜きと
ることによってプラスミドｐＴｙ ｌが分離された。次
いで分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量
百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＢＳ緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）
〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、
しかる後に、ＴＢＳ緩衝液に対して透析した。
６０００を加え、静かに混和して溶解液、氷水中に置い
た。１６時間後、１５００Ｘｇで１０分間遠心してベレ
ットを回収した。ＴＢＳ緩衝液５ ｍｌを加えて、ペレ
ットを静かに再融解してから５■／ｍｌエチジウムブロ
マイド０．５ ｍｆｌを添加し、これに塩化セシウムを
加えて静かに融解し、密度を１．５８０に合わせた。こ
の溶液を１０５０００ｘ ｇ、２０゛Ｃで４８時間遠心
した。この密度勾配遠心により、共有結合で閉じられた
環状のＤＮＡは紫外線ランプを照射することによって遠
心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出された
。このバンドを注射筒で遠心デユープの側面から抜きと
ることによってプラスミドｐＴｙ ｌが分離された。次
いで分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量
百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＢＳ緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）
〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、
しかる後に、ＴＢＳ緩衝液に対して透析した。
このようにして得られたプラスミドｐＴｙ １を含む透
析液１ ｍｌに対して２Ｉｎ！！、のエタノールを加え
、析出する沈殿を濾取して一２０°Ｃで真空乾燥を行い
５０μｇのプラスミドｐＴＹ １を得た。また各種制限
酵素によってｐＴＹ １を単一消化、二重消化、あるい
は三重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動にかけ、その移動度から分子量を求めた（Ｍｅｔ
ｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２巻Ｐａｒｔ
Ｂ第３６１〜３７７頁、１９６８年アカデミツクプレ
ス、ニューヨーク（米国）参照〕ところ、数十回の観察
で約４．９メガダルトンであった。この場合、酵素は全
酒造あるいは東洋紡製を使用し、反応はすべて供給者に
よって定められた条件に従った。また分子量は、λＤＮ
Ａをｔｌｉｎｄｌｌｌで分解して得られた断片の標準移
動度のパターンを基にして決定した。
析液１ ｍｌに対して２Ｉｎ！！、のエタノールを加え
、析出する沈殿を濾取して一２０°Ｃで真空乾燥を行い
５０μｇのプラスミドｐＴＹ １を得た。また各種制限
酵素によってｐＴＹ １を単一消化、二重消化、あるい
は三重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動にかけ、その移動度から分子量を求めた（Ｍｅｔ
ｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２巻Ｐａｒｔ
Ｂ第３６１〜３７７頁、１９６８年アカデミツクプレ
ス、ニューヨーク（米国）参照〕ところ、数十回の観察
で約４．９メガダルトンであった。この場合、酵素は全
酒造あるいは東洋紡製を使用し、反応はすべて供給者に
よって定められた条件に従った。また分子量は、λＤＮ
Ａをｔｌｉｎｄｌｌｌで分解して得られた断片の標準移
動度のパターンを基にして決定した。
これらの結果から、前記の制限酵素地図を決定した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、約４．９メガダルトンの分子量を有し、制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII、ＢｇｌII及びＰｓｔ I によって切断されず
、そして次の制限酵素地図： ▲数式、化学式、表等があります▼ によって特徴づけられるプラスミドｐＴＹ１。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1132686A JPH02312590A (ja) | 1989-05-29 | 1989-05-29 | プラスミドｐＴＹ１ |
| EP90305756A EP0400931A1 (en) | 1989-05-29 | 1990-05-25 | Plasmid pTY1 |
| CA 2017605 CA2017605A1 (en) | 1989-05-29 | 1990-05-28 | Plasmid pty1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1132686A JPH02312590A (ja) | 1989-05-29 | 1989-05-29 | プラスミドｐＴＹ１ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02312590A true JPH02312590A (ja) | 1990-12-27 |
Family
ID=15087156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1132686A Pending JPH02312590A (ja) | 1989-05-29 | 1989-05-29 | プラスミドｐＴＹ１ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0400931A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02312590A (ja) |
| CA (1) | CA2017605A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972835A1 (en) * | 1998-06-25 | 2000-01-19 | Dsm N.V. | Propionibacterium vector |
| WO1999067356A2 (en) | 1998-06-25 | 1999-12-29 | Dsm N.V. | Propionibacterium vector |
-
1989
- 1989-05-29 JP JP1132686A patent/JPH02312590A/ja active Pending
-
1990
- 1990-05-25 EP EP90305756A patent/EP0400931A1/en not_active Withdrawn
- 1990-05-28 CA CA 2017605 patent/CA2017605A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2017605A1 (en) | 1990-11-29 |
| EP0400931A1 (en) | 1990-12-05 |
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