RU2127758C1 - Способ получения рекомбинантной стрептокиназы - Google Patents
Способ получения рекомбинантной стрептокиназы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2127758C1 RU2127758C1 RU96121788/13A RU96121788A RU2127758C1 RU 2127758 C1 RU2127758 C1 RU 2127758C1 RU 96121788/13 A RU96121788/13 A RU 96121788/13A RU 96121788 A RU96121788 A RU 96121788A RU 2127758 C1 RU2127758 C1 RU 2127758C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- bacteria
- expression
- streptokinase
- transformed
- Prior art date
Links
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 26
- 101150060587 SK gene Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 2
- 101100448340 Arabidopsis thaliana GG3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000031354 Hyphema Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQGMIPUYCWIEAW-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SF 2738 Natural products COc1cc(nc(C=NO)c1SC)-c1ccccn1 NQGMIPUYCWIEAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000003819 low-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения рекомбинантной стрептокиназы. Ген стрептокиназы амплифицируют с помощью РСR и рекомбинируют с прокариотическим экспрессирующим вектором-плазмидой RLY-4. Трансформируют E. coli pSTE-SK-I и индуцируют для экспрессии гена SK с помощью температуры. Полученные бактерии ферментируют и разрушают высоким давлением. Собирают тельца включения, затем извлеченную r-SK очищают в два этапа, включающих ионный обмен и гель-фильтрацию. Чистота и выход r-SK, полученной по настоящему изобретению, являются весьма высокими, а стоимость низкой. 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Конкретнее, настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантной стрептокиназы.
В настоящее время сильнодействующие тромболитические агенты включают рекомбинантный активатор тканевого плазминогена человека (rt-PA), стрептокиназу (SK) и комплекс анизоилированного плазминогена и стрептокиназы (APSAC), и др. В сентябре 1993 профессор Ridker с сотр. из Brigharm and women's hospital, США, обобщили лечебное действие тромболитической терапии 100 000 больных острым инфарктом миокарда (AM1). В результате выяснилось, что нет существенных различий в эффективности и побочных эффектах между этими тремя тромболитическими средствами. rt-PA является весьма дорогим, а цена SK в три раза ниже, чем rt-PA. Кроме того, степень рестеноза при использовании SK ниже, и SK традиционна для использования.
Зарубежные фирмы используют в качестве материала для продуцирования природной стрептокиназы патогенный гемолитический streptococcus aureus. При этом необходимо заботиться об охране окружающей среды и безопасности персонала, об удалении токсинов, которые могут вызвать гипотензию и лихорадку, поэтому процедуры и оборудование для получения природной SK были сложными, а стоимость высокой, из-за низкого уровня экспрессии SK в гемолитическом streptococcus aureus и трудностей очистки. В начале 80-х Ferritti JJ. et al выделили гены SK из фагов гемолитического streptococcus aureus и осуществили экспрессию гена. Уровень экспрессии r-SK был очень низким - только несколько сотен единиц на 1 мл среды. Продукт генной инженерии не создали. В патенте США DD 24898 и в патенте Японии JP 5317044 ген SK выделяли таким же способом, как способ Ferritti, но векторы экспрессии и условия культивирования отличались и уровни экспрессии составляли 60-274 мкг из 1 мл среды, 6420-29300 единиц/мл среды, соответственно. Не приводится данных о выходе очищенных продуктов, а также об образовании генно-инженерной SK. В 1992 HerrenaL Куба, получена рекомбинантная стрептокиназа сложными путями генетического конструирования и способами очистки. Кроме того, используются материалы, такие как аффинные абсорбенты плазминогена, которые являются очень дорогими, а чистота и выход продукта были низкими, следовательно, стоимость такой r-SK является очень высокой.
Цель настоящего изобретения состоит в представлении нового способа получения рекомбинантной стрептокиназы (r-SK) методами современной биотехнологии. Способ получения является безопасным, выход и чистота продукта высокие, а стоимость низкая.
Способ получения рекомбинантной стрептокиназы отличается тем, что
(1) в соответствии с нуклеотидными последовательностями конструируют праймеры и используют для амплификации гена SK с помощью полимеразной цепной реакции (OCR), в то время как в качестве матрицы используют макромолекулярную ДНК Streptococcus aureus;
(2) конструируют прокариотический вектор экспрессии гена SK;
(3) трансформируют бактерии-хозяева вектором экспрессии и отбирают;
(4) трансформированные бактерии-хозяева культивируют при подходящих условиях и индуцируют экспрессию продукта r-SK;
(5) выделяют и очищают.
(1) в соответствии с нуклеотидными последовательностями конструируют праймеры и используют для амплификации гена SK с помощью полимеразной цепной реакции (OCR), в то время как в качестве матрицы используют макромолекулярную ДНК Streptococcus aureus;
(2) конструируют прокариотический вектор экспрессии гена SK;
(3) трансформируют бактерии-хозяева вектором экспрессии и отбирают;
(4) трансформированные бактерии-хозяева культивируют при подходящих условиях и индуцируют экспрессию продукта r-SK;
(5) выделяют и очищают.
Термин "праймер" в настоящем изобретении означает олигонуклеотидный фрагмент одноцепочечной ДНК, который полностью или частично комплементарен амплифицируемой ДНК-последовательности, и используется в качестве источника продуктов удлинения. Длина и последовательность праймера должны быть способны к индуцированию удлиненных PCR продуктов.
Лучше, когда праймер включает 5-50 нуклеотидов. Конкретные длина и последовательность определяются сложностью ДНК- или РНК-мишени, а также условиями, такими как температура и ионная сила.
Термин "вектор" включает плазмиду, космиды, фаги или вирусы. В оптимальном варианте вектором является плазмида для экспрессии в прокариотах. Продукты, амплифицированные с помощью PCR, могут быть клонированы в определенные сайты вектора экспрессии для образования рекомбинантного экспрессирующего вектора.
После получения вектора экспрессии он может быть введен в подходящую клетку-хозяина любым подходящим способом, таким как трансформация, трансфекция, электропорация, осаждением фосфатом кальция и прямой микроинъекцией и т.п.
Подходящие для настоящего изобретения клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки. Идеальные прокариоты-хозяева включают E.coli и Bacillus subtitles и пр. Наилучшим прокариотом-хозяином является E.col, в то время как идеальным эукариотическим хозяином являются дрожжи.
Клетки-хозяева, в которые введен вектор, выращивают на селективной питательной среде, и отбирают клетки, содержащие вектор экспрессии. Отобранные клетки, которые содержат вектор экспрессии, затем выращивают при подходящих условиях, и при определенных условиях индуцируют эксперссию гена SK. Оптимально использовать для индукции экспрессии гена SK нагревание.
Продукты экспрессии гена SK могут быть очищены рядом процедур выделения и очистки, которые, вообще, хорошо известны специалистам в этой области техники, с помощью которых можно получить очищенные продукты. Лучше, чтобы продукты экспрессии присутствовали в клетке-хозяине в форме телец включений, в результате чего упрощается процедура очистки, и возрастает чистота продукта.
(1) Из ротовой полости человека выделяют гемолитический streptococcus aureus. Очищают стрептокиназу из питательной среды. Определяют 5 аминокислот из N- и C-конца SK, соответственно. Конструируют праймеры в соответствии с этими N- и C-концевыми последовательностями, и используют их для амплификации гена SK непосредственно с помощью PCR, в которой в качестве матрицы используют бактериальную макромолекулярную ДНК.
(2) Амплифицированный ген, проверенный методом анализа нуклеотидной последовательности, лигируют с прокариотическим экспрессирующим вектором, который содержит промоторы PL, PR, ген Clt 857, сигнал терминации 5S-РНК и другие регуляторные элементы для образования плазмиды высокоэффективной экспрессии psTE-SK-1.
E. coli трансформируют psTE-SK-1. Экспрессию гена SK индуцируют температурой. Продукты экспрессии r-SK, представленной в сконструированных бактериях, формируются в тельца включений. Молекулярную массу r-SK проверяют SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), и определяют ее в 43000, и r-SK составляет более 40% от общего количества бактериального белка. Сконструированную бактерию называют STE-SK-1.
(3) Сконструированные бактерии STE-SK-1 ферментируют в менее питательной среде, которую пополняют средой LB, глюкозой и микроэлементами до и после температурной индукции. Ферментацию осуществляют при 30-40oC. DO (растворенный кислород) 50-80%, pH 6-8, причем скорость перемешивания уменьшают при возрастании DO. Бактерии разрушают гомогенизатором высокого давления. Тельца включения собирают центрифугированием, промывают буферным раствором и растворяют гуанидингидрохлоридом. После повторной обработки r-SK и двух стадий очистки получают очищенную r-SK. По способу настоящего изобретения из 1 литра питательного бульона получают 20-30 г сырых бактерий, и затем получают 600 мг очищенного продукта r-SK с чистотой 97-99% и с удельной активностью 100 000 ME/мг. К очищенной r-SK добавляют сывороточный человеческий альбумин, глутамат натрия и фосфаты, затем фильтруют через фильтр Millipore и лиофилизуют. Продукт имеет вид белого порошка. Продукт, растворенный в воде для инъекций, и используют, главным образом, при лечении острого инфаркта миокарда и других тромбозных заболеваний.
При лечении острого инфаркта миокарда у собак и тромба бедренной артерии у кроликов (0,3 мг/кг) растворение тромба происходит за 30-60 мин, и просветы сосудов восстанавливаются. При лечении гифемы у кроликов гифема исчезает в течение 24 часов, и при лечении внутриглазной экссудации экссудат исчезает в течение нескольких часов.
В настоящем изобретении технологию рекомбинантных ДНК применяют для экспрессии r-SK с эффективностью непатогенных E.coli. Способ безопасен и безвреден для окружающей среды и персонала. Благодаря высокой эффективности экспрессии и простой процедуре очистки чистоты и выход продукта являются достаточно высокими, и эти преимущества могут в большой степени снизить стоимость получения r-SK
Рис. 1. Физическая карта вектора экспрессии PLY-4.
Рис. 1. Физическая карта вектора экспрессии PLY-4.
Рис. 2. Физическая карта вектора экспрессии psTE-SK.
1. Амплификация гена SK с помощью PCR.
Получают 60 штаммов streptococcus aureus из больничной лаборатории, и выращивают их в течение ночи. Отбирают штамм, который секретирует SK с наибольшей активностью (N 8), и выращивают его в большом количестве. Выделяют SK из питательной среды, и анализируют последовательности 5 аминокислот у N- и C-концов SK с помощью секвенатора белков или вручную. В соответствии с результатами анализа аминокислот у N- и C-концов конструируются праймеры PCR. В соответствии с показанными ниже праймерами получают специфическую полосу PCR.
Пример I:
5' CGC GAA TTC GGG ATG TTT GCA CTG CTG TTT GCA 3' - EcoR 1
Пример II:
5' GGC GGA TCC TTA TTT GTA TTT AGG GTT CTC AGG 3' - Bam H I
Эти два праймера синтезируют твердофазным фосфотриэфирным методом с помощью ДНК-синтезатора. После очистки праймеры используют для амплификации гена SK. 5'-конец каждого из этого пары праймеров PCR содержит сайты рестрикции, соответственно.
5' CGC GAA TTC GGG ATG TTT GCA CTG CTG TTT GCA 3' - EcoR 1
Пример II:
5' GGC GGA TCC TTA TTT GTA TTT AGG GTT CTC AGG 3' - Bam H I
Эти два праймера синтезируют твердофазным фосфотриэфирным методом с помощью ДНК-синтезатора. После очистки праймеры используют для амплификации гена SK. 5'-конец каждого из этого пары праймеров PCR содержит сайты рестрикции, соответственно.
Макромолекулярную ДНК Streptococcus aureus N 8 получают по способу Frerick M. Ausubel, и отношение A260/A280 > 2,0.
Система и условия PCP.
Матрица ДНК - 3 мкл (1 мкг)
Праймер I - 1 мкл (50,0 пмоль)
Праймер II - 1 мкл (50,0 пмоль)
dNTP - 10 мкл (2,0 ммоль/л)
Буфер, 5 x PCR - 20 мкл
dd H2O - 64 мкл
Tao ДНК-полимераза - 1 мкл (25 E).
Праймер I - 1 мкл (50,0 пмоль)
Праймер II - 1 мкл (50,0 пмоль)
dNTP - 10 мкл (2,0 ммоль/л)
Буфер, 5 x PCR - 20 мкл
dd H2O - 64 мкл
Tao ДНК-полимераза - 1 мкл (25 E).
PCR включает денатурацию при 90oC в течение 60 с, удлинение при 72oC в течение 120 с и отжиг при 52oC в течение 60 с. После 15 циклов в реакционную систему добавляют еще 25 E Tag ДНК-полимеразы, и осуществляют еще 15 циклов. По окончании реакции анализируют электрофорезом на агарозном геле 2,5 мкл образца, и наблюдают полосу в 1,3 т.п.о., которая совпадает с длиной полного гена SK.
2. Конструирование и секвенирование ДНК-гена из клона.
Продукты PCR и плазмиду pUC гидролизуют одной и той же рестриктазой, смешивают с ДНК-лигазой фага T4 при комнатной температуре в течение 1 часа, и используют для трансформации E.coli JM 83, которая рассеяна на планшетах LB с ампициллином, и инкубируют при 37oC для селективного культивирования.
Отбирают единичную колонию, и используют ее для получения плазмиды. После анализа с несколькими рестриктазами плазмиду со специфичным фрагментом называют psT-1.
Анализ последовательности нуклеотидов плазмиды
Так как существует сайт Hind III в гене SK, конструируют два субклона с фрагментами из 770 п. о. и 570 п.о. После определения последовательности нуклеотидов утверждается рамка гена SK. Результаты определения приводятся в табл. 1.
Так как существует сайт Hind III в гене SK, конструируют два субклона с фрагментами из 770 п. о. и 570 п.о. После определения последовательности нуклеотидов утверждается рамка гена SK. Результаты определения приводятся в табл. 1.
3. Экспрессия гена SK клона в E.coli
Конструирование вектора экспрессии. Удаляют ген в сайте Lacz вектора pGEM (3z), и в pGEM (3z) лигируют ген Clt 857, промоторы PR и PL, фрагмент со многими сайтами рестрикции, сигнал терминации PHK 5s и терминальные кодоны t1, t2, как показано на рис.1.
Конструирование вектора экспрессии. Удаляют ген в сайте Lacz вектора pGEM (3z), и в pGEM (3z) лигируют ген Clt 857, промоторы PR и PL, фрагмент со многими сайтами рестрикции, сигнал терминации PHK 5s и терминальные кодоны t1, t2, как показано на рис.1.
Конструирование экспрессирующей плазмиды. Плазмиду pST-1 переваривают двумя рестриктазами и разделяют электрофорезом на агарозном геле. Извлекают и очищают ген SK 1,3 т.п.о., затем лигируют с экспрессирующим вектором.
Трансформируют E.coli К802 лигирующей смесью по способу с фосфатом кальция и выращивают в питательной среде на планшете LB с ампициллином. Получают плазмиды из отобранной единичной колонии, и идентифицируют с помощью рестриктаз. Плазмиду, содержащую специфичные фрагменты гена SK, называют экспрессирующей плазмидой pSTE-SK-1, и сконструированные бактерии называют STE-SK-1.
4. Экспрессия гена в E.col
Отбирают единичную колонию STE-SK-1 и выращивают в жидкой питательной среде LB при 30oC в течение ночи при встряхивании при 2000 об/мин. Смесь разбавляют средой в соотношении 1:100, и встряхивают при 30oC до достижения A600 порядка 0,6 (примерно 4-5 ч). Поднимают температуру до 42oC в течение 3-4 мин, и снова встряхивают в течение 3-4 ч. Бактерии собирают центрифугированием при 5000 об./мин, дважды промывают ЗФР (pH 7,4), и хранят при -20oC, или сразу выделяют продукты экспрессии.
Отбирают единичную колонию STE-SK-1 и выращивают в жидкой питательной среде LB при 30oC в течение ночи при встряхивании при 2000 об/мин. Смесь разбавляют средой в соотношении 1:100, и встряхивают при 30oC до достижения A600 порядка 0,6 (примерно 4-5 ч). Поднимают температуру до 42oC в течение 3-4 мин, и снова встряхивают в течение 3-4 ч. Бактерии собирают центрифугированием при 5000 об./мин, дважды промывают ЗФР (pH 7,4), и хранят при -20oC, или сразу выделяют продукты экспрессии.
5. Идентификации продуктов экспрессии
Применяют электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) для определения молекулярной массы и уровня экспрессии r-SK, и для идентификации фибринолитической активности r-SK используют реверсивный фибрин-планшет.
Применяют электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) для определения молекулярной массы и уровня экспрессии r-SK, и для идентификации фибринолитической активности r-SK используют реверсивный фибрин-планшет.
Образец солюбилизирующего раствора содержит 0,0625 М трис-HCl (pH 6,7), 2% SDS, 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола и 0,001% бромфенолового синего.
Получение и загрузка образца
Центрифугируют 1 мл индуцированной бактериальной суспензии. Осадок суспендируют в 100 мкл образца солюбилизирующего раствора, нагревают в кипящей воде в течение 5 мин, и осадок должен раствориться. Образец, соответствующий хроматографическому пику, смешивают с 2 объемами солюбилизирующего раствора и нагревают. Количество загрузки 10 мкл. Так же обрабатывают контрольные бактерии и бактерии до индукции.
Центрифугируют 1 мл индуцированной бактериальной суспензии. Осадок суспендируют в 100 мкл образца солюбилизирующего раствора, нагревают в кипящей воде в течение 5 мин, и осадок должен раствориться. Образец, соответствующий хроматографическому пику, смешивают с 2 объемами солюбилизирующего раствора и нагревают. Количество загрузки 10 мкл. Так же обрабатывают контрольные бактерии и бактерии до индукции.
Окрашивают гели кумассии бриллиантовым голубым или солями серебра.
Сканирование белковых полос. Гель сканируют с помощью сканирующего денситометра с двойной длиной волны shimadzu CS-9100 данные обрабатывают на компьютере, и получают результаты в виде процента каждой белковой полосы относительно общего количества бактериальных белков.
Результаты. В лизатах индуцированных бактерий существует очень темная полоса 15 кД, что соответствует MW 43000, в то время как такой полосы не наблюдают в контрольных и неиндуцированных бактериях. Результаты показывают, что r-SK составляет более 65% общих белков бактерий.
Идентификация фибринолитической активности продуктов экспрессии. Упомянутый гель промывают 2,5% тритоном X-100 и обычным солевым раствором для удаления додецилсульфата натрия (SDS), затем помещают на агарозный гель, содержащий фибриноген, плазминоген человека и тромбин, и затем инкубируют при 37oC в течение 2 ч. В агарозном геле имеется литическая зона, соответствующая локализации полосы 43 кД, так как фибрин в этой области растворяется. Это означает, что продукт экспрессии обладает фибринолитической активностью.
Структура продуктов экспрессии, присутствующих в бактерии. Бактерии разрушают гомогенизатором высокого давления или ультразвуком и центрифугируют. Осадки и супернатант идентифицируют SDS-PAGE. Результаты показывают, что полоса 43 кД появляется в осадках, а не в супернатанте. Это означает, что продукты экспрессии r-SK образуют тельца включения.
Определение удельной активности r-SK. Для определения активности r-SK используют фибрин-планшет, пробу с хромогеном или растворение фибриновых сгустков, в то время как для определения концентрации белков используют способ lowrry. Удельная активность = ед-цы активности r-SK в ед-це объема (E)/содержание белков в ед-це объема (мг).
6. Ферментация бактерий, полученных генной инженерией.
Ферментация при встряхивании колбы.
Единичную колонию STE-SK-1 инокулируют в среде LB-Amp (ампициллин), инкубируют при 30oC в течение ночи, разбавляют на следующий день улучшенной средой M9 в отношении 1:50 до достижения культурой A600 0,6 - 0,8, и индуцируют в течение 3-4 часов. Суспензию бактерий центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4oC. Бактерии промывают ЗФР (pH 7,4), взвешивают и хранят при 20oC.
Ферментация в ферментере 5LNBS BiO F III.
Единичную колонию STE-SK-1 инокулируют в 100 мл питательной среды LB, инкубируют при 30oC в течение ночи, определяют A600 и используют в качестве инокулятивного раствора для ферментации.
Ферментер автоклавируют при 120oC, 15 pd (pd = psu=103 кПа), в течение 15 мин. После охлаждения устанавливают следующие параметры: температура -30oC, pH 6-8, растворенный кислород (DO) 50-80%, скорость перемешивания 225-800 об/мин (изменяется с изменением величины DO). Когда все параметры становятся стабильными, взвесь STE-SK-1 инокулируют в ферментер при соотношении 1:50 (инокулятивный раствор : среда). Когда A600 достигает примерно 0,6, ферментацию продолжают при условиях индукции без каких-либо изменений упомянутых параметров в течение 3-4 ч. Бактерии собирают и хранят при -20oC.
7. Очистка r-SK изоэлектрофокусированием Rotofor и гель-фильтрацией.
(1) Полученные генной инженерией бактерии (4 г) суспендируют в 25 мл гипотонического буферного раствора (0,05 M трис-JCl, pH 7,8, 0,2 М ЭДТК, лизоцим - 0,5 мг/мл/, перемешивают при комнатной температуре в течение 60 мин, и добавляют до 2% тритон X-100 и до 0,5 M NaCl. Бактерии диспергируют гомогенизатором, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 60 мин при 10oC, и промывают буферным раствором (0,05 M трис-HCl, pH 7,8, 0,02 M ЭДТК) три раза. Собирают осадки, и суспендируют их в 20 мл воды, диализуют против воды, и к удержанному веществу добавляют мочевину до 4 M для растворения телец включения.
(2) Выделение r-SK изоэлектрофокусированием Rotofor и извлечение r-SK.
К 49 мл вышеупомянутого раствора телец включений добавляют 1 мл амфолина (pH 3-10). После фокусирования в течение 4 часов на аппаратуре для изоэлектрофокусирования Rotofor при 12 в при 4oC образцы каждого сегмента идентифицируют SDS-PAGE. Растворы, содержащие SK, сливают, диализуют в 0,05 M ЗФР, pH 7,4, и 0,02 M ЭДТК для удаления мочевины, разбавляют буфером, солюбилизирующим аминокислоты, и повторяют процесс (refolding) при 4oC в течение 72 ч. После центрифугирования при 8000 об./мин собирают супернатант и концентрируют ультрафильтрацией.
(3) Гель-фильтрация и стерилизующая фильтрация.
Образец, сконцентрированный ультрафильтрацией, загружают в сефакрил S-200 (уравновешанный буфером, солюбилизирующим аминокислоты), и элюируют при скорости потока 1 мл/мин. Фракции, проверенные на аппаратуре для жидкостной хроматографии низкого давления Econo, собирают, и анализируют чистоту и удельную активность SDS-PAGE. Полученный раствор фильтруют через фильтр Millipore 0,2 мкм, и стерилизуют фильтрацией через Millipore 2,2 мкм и лиофилизуют. Концентрация белков, активность и удельная активность r-SK число очисток и степень извлечения приводится в табл. 2.
Пример 2.
1. Хранение полученных генной инженерией бактерий.
Инокулят помещают на хранение и хранят при -70oC в холодильнике.
Регулярно идентифицируют карту плазмиды, и проверяют, сохраняется ли уровень экспрессии 65%.
2. Выращивание сконструированных бактерий.
Среда.
Планшет LB-Amp.
Дрожжевой экстракт, г - 5
NaCl, г - 5
Триптон, г - 10
Агар, г - 10
Вода, мл - до 1000
Все автоклавируют при давлении 1 кг/см2 в течение 20 мин, и после охлаждения добавляют ампициллин.
NaCl, г - 5
Триптон, г - 10
Агар, г - 10
Вода, мл - до 1000
Все автоклавируют при давлении 1 кг/см2 в течение 20 мин, и после охлаждения добавляют ампициллин.
Жидкая среда LB.
То же, что и для планшета LB, за исключением агара и ампициллина.
Берут посевной бактериальный материал, хранящийся в холодильнике при -70oC, инокулируют на планшет (содержащий 100 мкг/мл ампициллина) и инкубируют при 30oC в течение ночи. Отбирают с планшета единичную колонию, инокулируют ее в жидкую питательную среду LB и инкубируют при 30oC в течение ночи. Получают инокулят первого порядка, который инокулируют в жидкую питательную среду LB в соотношении 1:10, и инкубируют при 30oC в течение ночи, чтобы получить инокулят второго порядка.
3. Ферментация
После автоклавирования в ферментер добавляют питательную среду, чтобы заменить ею воду. Устанавливают параметры, и инокулят второго порядка инокулируют в ферментер в соотношении 1:10. Ферментацию осуществляют при повышении давления воздуха в ферментере.
После автоклавирования в ферментер добавляют питательную среду, чтобы заменить ею воду. Устанавливают параметры, и инокулят второго порядка инокулируют в ферментер в соотношении 1:10. Ферментацию осуществляют при повышении давления воздуха в ферментере.
Во время ферментации поддерживают следующие условия: температура - 30oC, pH - 6-8, DO - 50-80%, скорость перемешивания изеняется с изменением величины DO. Каждый час следует отбирать 5 мл бактерий для определения плотности бактерий (OD600) и концентрации глюкозы.
Регулируют pH среды водным раствором аммиака, чтобы сохранять величину pH 6-8, и при необходимости следует добавлять пеногаситель.
Количество триптона, глюкозы и микроэлементов следует пополнять до и после индукции.
После индукционного культивирования в течение 3-4 ч, когда OD600 превысит 15, ферментацию останавливают, и бактерии собирают, центрифугируют, взвешивают и сразу же разбивают на изолированные тельца включения. В противном случае, бактерии хранят при -70oC.
4. Разрушение бактерий.
Влажные бактерии суспендируют в буферном растворе, загружают в гомогенизатор и разрушают при определенном давлении.
Показатель качества. Степень разрушения бактерий проверяют методом микроскопии следующим образом. Бактериальную суспензию разбавляют, намазывают на стеклянную пластину, окрашивают по способу Грамма и подсчитывают число бактерий (A) в 4 полях зрения микроскопа - до гомогенизации. Такие же процедуры проделывают с суспензией после гомогенизации, и получают число бактерий (B).
Степень разрушения бактерий = (A-B) A • 100%.
Когда упомянутая степень превысит 95%, осуществляют центрифугирование, и собирают осадок, который представляет собой сырые тельца включения. В них чистота r-sk составляет более 75-85% относительно общих белков бактерий.
5. Очистка телец включения.
Сырые тельца включения промывают несколько раз, и чистота r-SK составляет более 90% от общих белков бактерий.
6. Растворение и извлечение.
Очищенные тельца включения растворяют гуанидингидрохлоридом и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант диализуют в ФБ (PB) несколько раз и центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин. Чистота r-SK будет более 95% при удельной активности 65000 ME/мг, и извлечение r-SK будет порядка 65%.
7. Очистка.
Ионообменная хроматография. Используют системы хроматографии Waters 650 или Econo. Извлеченную r-SK загружают в анионообменную колонку, уравновешенную PB, при скорости потока 1,0 мл/мин. Элюируют PB линейным градиентом pH при скорости потока 4,00 мл/мин. Собирают первый пик элюирования (r-SK).
Анализ SDS-PAGE показывает, что чистота r-SK достигает 94% при удельной активности 80000 ME/мг, извлечение r-SK> 55%, и концентрация белка 7 мг/мл.
Гель-фильтрация. Гелю дают набухать в свободной от эндотоксинов и бактерий деионизованной воде, автоклавируют, заполняют им колонку и уравновешивают PB. В колонку загружают образец, профильтрованный через фильтр Millipore 0,22 мкм, и элюируют PB при скорости потока 5,0 мл/мин. Активность r-SK проверяют методом фибринового гелевого растворения и сливают вместе с содержимое пробирок с активным пиком. В этом случае удельная активность продукта составляет около 100000 ME/мг. Из 1 литра бульона получают около 600 мг очищенного продукта, и извлечение r-SK составляет 40-50%.
8. Фильтрация для освобождения от бактерий, расфасовка и лиофилизация.
В соответствии с концентрацией белка и активностью r-SK добавляют вспомогательные материалы и стабилизаторы в следующих пропорциях:
r-SK, ME - 500000
Фосфаты, мг:
Na3HPO4 - 1,33
NaH2PO4 - 0,31
Глутамат натрия (для инъекций), мг/ампула - 30
Человеческий альбумин, мг/ампула - 30
Вышеупомянутые материалы должны соответствовать требованиям к лекарственным средствам для инъекций.
r-SK, ME - 500000
Фосфаты, мг:
Na3HPO4 - 1,33
NaH2PO4 - 0,31
Глутамат натрия (для инъекций), мг/ампула - 30
Человеческий альбумин, мг/ампула - 30
Вышеупомянутые материалы должны соответствовать требованиям к лекарственным средствам для инъекций.
Стерилизация для освобождения от бактерий. Для достижения нужной степени очистки осуществляют 100 фильтрацией через 0,22 мкм.
Продукт разливают в ампулы по 500000 или 1500000 ME/ампула.
Аликвоты лиофилизуют, затем ампулы запаивают, наклеивают этикетки, и упаковывают ампулы в коробки.
Продукты хранят в холодильнике при 8-12oC.
Методом ангиографии доказывается, что r-SK является сильнодействующим средством при лечении тромба бедренной артерии и тромба коронарной артерии у собак.
Claims (8)
1. Способ получения рекомбинантной стрептокиназы (r - SK), включающий культивирование трансформированного микроорганизма, содержащего рекомбинантный вектор, включающий полидезоксирибонуклеотидный фрагмент, обеспечивающий синтез и секрецию стрептокиназы в подходящей для ее образования культуральной среде, и последующее выделение стрептокиназы из указанной культуры, причем трансформированным микроорганизмом является E.coli, отличающийся тем, что конструируют праймеры
5'CGC CAA TTC GGG ATG GCA CTG CTG TTT GCA3' - EcoRI
5'CGC GGA TTC TTA TTT GTA TTT AGG CTT GTC AGG3' - Bam HI
соответствующие нуклеотидным последовательностям SK в гемолитическом Streptococcus aureus, амплифицируют ген с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), при этом макромоллекулярную ДНК стрептококка, содержащую ген SK, используют в качестве матрицы; ген SK лигируют с прокариотическими экспрессирующими векторами с образованием рекомбинантного экспрессирующего вектора; клетки E.coli трансформируют рекомбинантным экспрессирующим вектором, отбирают трансформированные клетки, трансформированные клетки культивируют в подходящих условиях и индуцируют экспрессию гена SK; выделяют и очищают экспрессированную r-SK.
5'CGC CAA TTC GGG ATG GCA CTG CTG TTT GCA3' - EcoRI
5'CGC GGA TTC TTA TTT GTA TTT AGG CTT GTC AGG3' - Bam HI
соответствующие нуклеотидным последовательностям SK в гемолитическом Streptococcus aureus, амплифицируют ген с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), при этом макромоллекулярную ДНК стрептококка, содержащую ген SK, используют в качестве матрицы; ген SK лигируют с прокариотическими экспрессирующими векторами с образованием рекомбинантного экспрессирующего вектора; клетки E.coli трансформируют рекомбинантным экспрессирующим вектором, отбирают трансформированные клетки, трансформированные клетки культивируют в подходящих условиях и индуцируют экспрессию гена SK; выделяют и очищают экспрессированную r-SK.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что праймеры конструируют в соответствии с аминокислотными последовательностями N- и С-концов SK.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что Streptococcus aureus выделяют из ротовой полости человека.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ген SK рекомбинируют с прокариотическим экспрессирующим вектором - плазмидной PLY-4, которая содержит промоторы PL, PR, ген Cit 857, сигнал терминации РНК 5S и другие регуляторные элементы.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессию гена SK индуцируют с помощью температуры, а продукты экспрессии присутствуют в клетках E.coli в форме телец включений.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерии, трансформированные экспрессирующей плазмидой, ферментируют в крупном масштабе, а LB, глюкозу, микроэлементы восполняют несколько раз до и после индукции и устанавливают следующие параметры ферментации: температура 30 - 42oС, растворенный кислород -50-80% и pH 6-8.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерии после ферментации разрушают, собирают тельца включения, промывают их буфером и растворяют гуанидингидрохлоридом, извлекают r-SK и очищают ионным обменом и гель-фильтрацией.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в очищенную SK добавляют человеческий альбумин и другой стабилизатор, стерилизуют фильтрацией, разделяют на аликвоты и лиофилизуют для получения конечного продукта.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN94112106.2 | 1994-04-04 | ||
| CN 94112106 CN1035193C (zh) | 1994-04-04 | 1994-04-04 | 一种制备重组链激酶的方法 |
| PCT/CN1995/000024 WO1995027050A1 (fr) | 1994-04-04 | 1995-04-03 | Procede de preparation de streptokinase recombinee |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96121788A RU96121788A (ru) | 1998-12-27 |
| RU2127758C1 true RU2127758C1 (ru) | 1999-03-20 |
Family
ID=5035911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96121788/13A RU2127758C1 (ru) | 1994-04-04 | 1995-04-03 | Способ получения рекомбинантной стрептокиназы |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1035193C (ru) |
| CH (1) | CH688653A5 (ru) |
| RU (1) | RU2127758C1 (ru) |
| WO (1) | WO1995027050A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2189173C2 (ru) * | 1999-03-23 | 2002-09-20 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАМН | Способ диагностики открытия коронарной артерии у больных острым инфарктом миокарда |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1064406C (zh) * | 1998-05-11 | 2001-04-11 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 利用基因工程技术生产葡激酶的方法 |
| AR071169A1 (es) * | 2008-03-31 | 2010-06-02 | Council Scient Ind Res | Variantes de la estreptoquinasa que contienen cisteina y sus formas covalentemente modificadas |
| CN102936603A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-20 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的表达及酶活测定 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0151337A2 (en) * | 1983-10-10 | 1985-08-14 | The Board of Regents for the University of Oklahoma | Streptokinase-coding recombinant vectors |
| EP0407942A2 (en) * | 1989-07-11 | 1991-01-16 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Streptokinase proteins, corresponding genes, corresponding plasmid recombinants, corresponding transformants and processes for preparing same |
| EP0489201A1 (en) * | 1990-05-23 | 1992-06-10 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorganisms |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5066589A (en) * | 1984-03-02 | 1991-11-19 | Board Of Regents Of The University Of Okla. | Streptokinase-coding recombinant vectors |
-
1994
- 1994-04-04 CN CN 94112106 patent/CN1035193C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-03 CH CH03481/95A patent/CH688653A5/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-03 WO PCT/CN1995/000024 patent/WO1995027050A1/zh active Search and Examination
- 1995-04-03 RU RU96121788/13A patent/RU2127758C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0151337A2 (en) * | 1983-10-10 | 1985-08-14 | The Board of Regents for the University of Oklahoma | Streptokinase-coding recombinant vectors |
| EP0407942A2 (en) * | 1989-07-11 | 1991-01-16 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Streptokinase proteins, corresponding genes, corresponding plasmid recombinants, corresponding transformants and processes for preparing same |
| EP0489201A1 (en) * | 1990-05-23 | 1992-06-10 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorganisms |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2189173C2 (ru) * | 1999-03-23 | 2002-09-20 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАМН | Способ диагностики открытия коронарной артерии у больных острым инфарктом миокарда |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH688653A5 (de) | 1997-12-31 |
| CN1035193C (zh) | 1997-06-18 |
| WO1995027050A1 (fr) | 1995-10-12 |
| CN1096326A (zh) | 1994-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schlott et al. | High yield production and purification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy | |
| ES2420430T3 (es) | Sistema libre de productos de origen animal y procedimiento de purificación de una toxina botulínica | |
| Hardie et al. | In vitro activation of Escherichia coli prohaemolysin to the mature membrane‐targeted toxin requires HlyC and a low molecular‐weight cytosolic polypeptide | |
| JPS61501307A (ja) | 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 | |
| Frey et al. | Purification and partial characterization of a hemolysin produced by Actinobacillus pleuropneumoniae type strain 4074 | |
| DE3786317T2 (de) | Proteinanaloge des gewebs-plasminogenaktivators. | |
| JP2003289889A (ja) | シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質ｆ | |
| CN111378638B (zh) | 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法 | |
| RU2127758C1 (ru) | Способ получения рекомбинантной стрептокиназы | |
| EP1068301B1 (de) | Bakterielle transglutaminasen | |
| JPH0365189A (ja) | プラスミド、その製造方法及びこれをプラスミノ―ゲンアクチベーターの収得に使用する方法 | |
| JPS5867181A (ja) | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 | |
| US6897041B1 (en) | Expression of recombinant mature lysostaphin | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| CN101948865B (zh) | 一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法 | |
| RU2140453C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк p ua bc22, кодирующая модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, нетранслируемый днк-элемент - искусственная межгенная последовательность мгп14 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| RU2156299C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм escherichia coli sa 9325 - продуцент рекомбинантного белка | |
| CN114480353B (zh) | 一种制备重组人奥克纤溶酶的方法 | |
| RU2486249C2 (ru) | Способ продукции рекомбинантной стафилокиназы при регулировании уровня кислорода | |
| KR100339153B1 (ko) | 일부봉입체로발현된재조합스트렙토키나제의정제방법 | |
| KR100212979B1 (ko) | 스타필로키나제 발현 재조합 미생물 및 그를 이용한 스타필로키나제의 제조방법 | |
| JPS62181799A (ja) | 発酵工学により製造したカルジオジラチンを含む医薬およびその製造方法 | |
| WO1995027048A1 (fr) | Procede de preparation de staphylokinase recombinee | |
| CN114437953A (zh) | 一种制备重组人奥克纤溶酶原的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040404 |