CN1064406C

CN1064406C - 利用基因工程技术生产葡激酶的方法

Info

Publication number: CN1064406C
Application number: CN98102132A
Authority: CN
Inventors: 李倩
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2001-04-11
Anticipated expiration: 2018-05-11
Also published as: CN1207414A

Abstract

本发明提供了一种利用重组菌株表达葡激酶蛋白质的方法。现有技术中葡激酶的表达水平较低，本发明通过将扩增的葡激酶基因与载体pBV220进行连接，构建成表达质粒，并将所构建的表达质粒转化大肠杆菌，构建成重组葡激酶工程菌株，葡激酶的表达量占该菌株菌体总蛋白的60-70%。

Description

利用基因工程技术生产葡激酶的方法

本发明涉及一种生产葡激酶的方法，具体地说，本发明涉及利用基因工程技术生产葡激酶的方法，以及用于表达葡激酶的重组表达质粒和葡激酶基因。

葡激酶(Staphylokinase，Sak)为某些金黄色葡萄球菌产生的一种蛋白水解酶。它是一种溶栓新药，尤其是在溶解富含血小板的冠状动脉血栓时，效果更好。

有关利用基因工程技术生产葡激酶已有报道。例如，Sako等将Sak基因插入含有λ噬菌体P_R启动子的表达质粒，转化大肠杆菌，诱导后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的25％〔Sako，T，et al，Eur．J．Biochem(1985)149：557-563〕；Schlott，B等构建的葡激酶工程菌株表达量也只占菌体总蛋白的10-15％〔Schlott，Bet al，Bio-Technology(1992)12：185-189〕；上海医科大学宋后燕等将葡激酶cDNA与质粒载体Ply-4重组，转化大肠杆菌，诱导后表达量占菌体蛋白的40％(CN1096325A，CN1096326A)。

本发明的目的是提供一种表达量更高，活性更好，更稳定的工程菌株，从而提供一种高效表达葡激酶的方法。

经过研究发现，将葡激酶基因与载体质粒pBV220连接，并转化进大肠杆菌后，可获得高效表达葡激酶的工程菌株。

本发明的方法包括以下步骤：

(1)扩增葡激酶基因；

(2)将扩增的激酶基因与载体pBV220进行连接，构建成表达质粒；

(3)用所构建的表达质粒转化大肠杆菌；

(4)培养转化的大肠杆菌；

(5)分离并纯化表达的葡激酶。

所述的葡激酶基因可以是任一种已知的葡激酶基因。

在本发明中，我们从烧伤病房烧伤病人感染创面分离到9株溶血性金黄色葡萄球菌，分别接种在含有人血浆的琼脂平皿上，选择出一株纤溶活性最高的作为PCR扩增模板，得到葡激酶的cDNA片段。经序列测定发现，该cDNA为葡激酶基因的一种新的DNA序列，与已知的序列不同。

葡激酶基因的扩增可使用PCR的方法进行，可根据已知的葡激酶基因的序列设计用于PCR的上游引物，其序列为：

5’CAC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA 3’；和下游引物，其序列为：

5’GGC GAA TTC TTA TTT CTT TTC TAT AAC AAC 3’。其中GAA TTC为EcoRI酶切位点；ATG为起始密码子；TTA为终止密码子。然后根据公知的方法进行PCR基因扩增。

载体pBV220为一种已知的载体(张智清等，病毒学报，6(2)：111-116，1990)。

在pBV220载体质粒上，紧挨SD序列的酶切位点共有八个，它们依次顺序为：EcoR I，Sma I，BamH I，Sal I，Hinc II，Pst I，Hind III，Xmn I。一般情况下，SD序列与起始密码子的距离会显著影响目的蛋白质的翻译水平。在引物设计时，我们在上下游引物两端设计了EcoRI单一酶切位点，这样Sak cDNA经EcoRI酶切后，插入pBV220 EcoRI酶切位点，与SD序列最近，可提高目的蛋白的翻译水平。然后将扩增的葡激酶基因和载体PBV220分别用EcoRI酶切，然后进行连接，构建成表达质粒。

所述的大肠杆菌可以是任一种已知的大肠杆菌菌株，优选DH5α菌株。

本发明也提供了一种新的葡激酶基因及其编码的蛋白质。该基因的核苷酸序列及其相应的氨基酸序列如下：ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TATMet Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys TyrAAA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAALys Lys Gly Asp Asp Als Ser Tyt Phe GluCCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTGPro Thr Gly Pro Tyt Leu Met Val Asn ValACT GGA GTT GAT GGT AAA GGA AAT GAA TTGThr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu LeuCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATTLeu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro IleAAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAALys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu LysATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATIle Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTTAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val ValGAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTCGlu Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu ValACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAThr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys GluGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAAGlu Thr Lys Ser Phe Pro Ile The Glu LysGGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CATGly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu HisATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACAIle Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile ThrAAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAALys Val Val Tle Glu Lys Lys

本发明也提供了一种重组表达载体，它是含有葡激酶基因的pBV220载体。

所述的大肠杆菌菌株可以是任一种已知的用于表达外源基因的大肠杆菌菌株，优选DH5α菌株。

用本发明的方法在大肠杆菌中表达葡激酶蛋白质，其表达量达到菌体总蛋白的60-70％，明显高于已知方法的表达量。

附图简要说明：

图1．Puc-Sak重组质粒的构建。

图2．一种重组葡激酶新的DNA序列。

图3．pBV-Sak重组质粒的构建。

图4．Sak表达产物鉴定。其中泳带1：未经诱导的工程菌株，泳带2：工程菌1，泳带3：工程菌2，泳带4：分子量为14．5kd的标准蛋白。

图5．对图4双波长扫描仪透视扫描。

图6．r-Sak经凝胶柱纯化后用HPLC测纯度结果。

实施例

通过下述实例对本发明的技术特征作详细描述实施例一：目的基因的筛选

从某医院烧伤病房分离到9株金黄色葡萄球菌，将其分别接种于含有血浆的琼脂糖平板上。以宿主细胞作阴性对照。琼脂糖平皿制做方法是：1％的琼脂糖20ml煮沸，放56℃备用，取5ml人血浆保存于56℃20分钟，二者混匀后倒平板。冷却后将待测菌及阴性对照菌接种于该平皿，37℃培养过液，观察菌落周围的溶解圈。阴性对照没有，9株待测菌中，有3株有溶解圈，选其中溶解圈最大的作为PCR扩增模板。实施例二：Sak基因工程菌株的构建

1、引物设计及PCR扩增

根据已知的葡激酶基因的序列设计上游含有EcoRI酶切位点和启动子的引物，其序列为：

5’CAC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA 3’；和下游的含有EcoRI酶切位点和终止子的引物：

5’GGC GAA TTC TTA TTT CTT TTC TAT AAC AAC 3’。其中GAA TTC为EcoRI酶切位点；ATG为起始密码子；TTA为终止密码子。

引物设计后，经DNA数据库查，3’端无二聚体。引物合成后，以纤溶性最高的葡萄球菌的细菌裂解液作为模板，循环参数为94℃60秒-45℃40秒-72℃60秒，经30个循环，得到Sak基因片段。

2、cDNA克隆及测序

Sak PCR扩增片段经EcoRI酶切，回收，与经EcoRI酶切后的载体质粒Puc18重组，转化大肠杆菌，筛选出含有Sak基因的阳性菌株，命名为Puc-Sak(图1)，对其进行DNA序列测定，DNA序列为一种新的序列(图2)。

3、cDNA在大肠杆菌中的表达

Puc-Sak质粒经酶切，回收Sak基因片段。原核表达载体pBV220经酶切后，与回收的Sak基因片段重组，转化大肠杆菌(图3)。同氨苄青霉素-LB平板筛选，挑取单个菌落，制备质粒，酶切鉴定，含有Sak基因特征者，命名为pBV-Sak。将pBV-Sak在30℃培养至OD600 0．4-0．6后，42℃诱导4-6小时，离心集菌进行SDS-凝胶电泳(图4)，用双波长薄层扫描仪扫描，计算机处理，测得目的蛋白占菌体总蛋白的60-70％(图5)。

4、表达产物测定：

〈1〉存在状态测定：对工程菌诱导后的培养基上清进行生物活性测定阴性，排除了表达产物以分泌状态存在；对诱导后的工程菌经高倍镜观察，看到有少量包涵体；诱导后的工程菌超声波破碎离心，离心上清和沉淀分别进行活性测定和SDS-凝胶电泳确定葡激酶95％以可溶状态存在于细胞间质，5％以包涵体形式存在。

〈2〉生物活性测定：

a．标准曲线的制备：150mg琼脂糖加入23ml生理盐水，煮沸溶解，冷却至56℃，加入凝血酶1．76u，入纤维蛋白原2．5mg，摇匀后倒入培养皿，凝固后打孔，将标准品10u、5u、2．5u、1．25u、0．625u、0．31u的样品加入孔内，放保湿盒内，25-30℃培养16-24h，量出溶解圈直径，以1g活性对数，1g溶解圈直径对数作标准曲线。

b．样品测定：13ml的0．7％的琼脂糖煮沸后冷却至56℃时加入1．76以凝血酶，2．5mg入纤维蛋白原，摇匀后倒平板，凝后打孔备用。将超声破碎的诱导后的工程菌离心上清测蛋白浓度，上清按1000倍、2000倍、4000倍、6000倍不同梯度稀释，取20μl加入孔内，30℃培养24h，测溶解圈大小，以标准Sak作对照，根据溶解圈大小在标准曲线上得到相应的活性单位。测得的比活为7-10万单位／mg。

实施例三、重组葡激酶的纯化

诱导后的工程菌经超声波碎，离心收集上清。

1、离子交换

Q-Sepharose柱经缓冲液平衡后，将上述样品加入该离子柱，用缓冲液洗脱杂蛋白，然后用盐梯度缓冲液洗脱r-Sak，合并含Sak活性的各管溶液用硫酸胺沉淀浓缩，离心后蛋白沉淀重新用缓冲液溶解，纯度达85％以上。

2、凝胶过滤：

Sephacryl-100凝胶柱经缓冲液平衡后，将上一步硫酸胺沉淀重新用缓冲液溶解的样品中入凝胶柱，用缓冲液洗脱，纯度经HPLC测定达98％以上(图6)。

Claims

1、一种利用基因工程技术生产葡激酶的方法，包括：

(1)扩增葡激酶基因；

(3)将所构建的表达质粒转化大肠杆菌DH5α菌株；

(4)培养转化的大肠杆菌并分离、纯化表达的葡激酶。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡激酶基因的扩增是使用下述引物的PCR进行的：

5’CAC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA3’；

5’GGC GAA TTC TTA TTT CTT TTC TAT AAC AAC3’，并且扩增的葡激酶基因和载体pBV220的连接是使用EcoRI酶切后进行连接的。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡激酶基因具有如下所示的序列：ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TATAAA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAACCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTGACT GGA GTT GAT GGT AAA GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATTAAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAAATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTTGAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTCACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAAGGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CATATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACAAAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAA

4、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述序列和所述载体是通过EcoRI单酶切位点相连的。