CN1850976A

CN1850976A - 抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法

Info

Publication number: CN1850976A
Application number: CN 200610007522
Authority: CN
Inventors: 徐东刚; 邹民吉; 王旻; 蔡欣; 王金凤; 陈光宇; 刘深; 徐涛
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2026-02-14
Also published as: CN1850976B

Abstract

本发明公开了属于基因工程及生物溶栓药物制备技术范围的涉及一种抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法。公开了抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体的核苷酸序列。其制备方法为利用基因体外重组技术将RGD序列、水蛭素的C末端序列与构建的低抗原性高活性SAK突变体基因相融合，同时引入Xa因子切割位点和柔性连接臂，将其C末端氨基酸进行修饰，另外添加一个赖氨酸。利用双酶切和PCR对构建的突变体碱性鉴定，构建了融合蛋白表达载体，获得高效表达的重组SAK衍生体。该衍生体具备了抑制血小板聚集和阻断凝血酶活性的功能，为研制新一代溶栓药物奠定了基础，同时将大大拓展新型SAK衍生体的应用范围。

Description

抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法

技术领域

本发明属于基因工程学及生物溶栓药物制备技术范围，特别涉及一种抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法。

背景技术

心脑血管疾病是目前危害人民健康的第一杀手，其中急性心肌梗塞是造成病人死亡的主要病因。目前市售的溶栓药物在溶栓效果、特异性、毒副作用和药物价格等方面仍存在很多亟待解决的问题。

天然的葡激酶(Staphylokinase，SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，无二硫键，分子量15.5kDa。20世纪90年代，SAK的纤维蛋白选择性被发现，因此引起人们的广泛关注。临床研究表明，SAK是在溶栓效果和特异性上唯一可与tPA媲美的新型溶栓药物，但由于它属于外源蛋白，在临床使用中，尤其是多次应用时其抗原性对疗效有很大的影响。另外，有些病人还出现溶栓后再次堵塞的情况。我们承担的国家一类新药【重组葡激酶(rSAK)】研究目前已进入II期临床实验。与国外同行一样，在临床前动物试验阶段和目前的临床研究中，都发现了其抗原性对溶栓效果的影响。同时，从血栓的形成和溶栓机理方面分析，如果将溶栓和抗凝的功能有机地结合，则对相关疾病的治疗效果将有很大程度的提高。因此对其抗原性的系统分析、阐明及其利用体外重组的方法进行定向修饰，是降低SAK抗原性和扩大其临床应用范围的关键。而将其低抗原性突变体与凝血酶抑制因子等连接成融合蛋白，使融合蛋白既具溶栓活性，又有抗凝、防止血管再堵塞的作用。这些探索是目前新型溶栓药物研究的另一个热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法。其特征在于：所述重组葡激酶衍生体的核苷酸序列如下：

AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC

Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TAT

Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr

GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA

Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala

TTA GAT GCG ACA GCA TAT CAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACT

Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr

TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC

Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val

CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA GCG GTT GTT ATA GAA CGT GCG

Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Ala Val Val Ile Glu Arg Ala

AAA ATT GAA GGT CGT CGT GGT GAT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GAT TTT

GAA GAA att cca gaa

Lys Ile Glu Gly Arg Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Phe Glu Glu

Ile Pro Glu

GAA TAT CTG CAA

Glu Tyr Leu Gln

所述葡激酶衍生体的制备方法为在构建了低抗原性SAK突变体的基础上，我们利用基因体外重组技术将RGD序列、水蛭素的C末端序列与构建的低抗原性高活性SAK突变体基因相融合，同时引入Xa因子切割位点和柔性连接臂以保障各个部分的生物学活性。首先在不影响SAK活性的N端进行缺失条件下，具体缺失前10位氨基酸，然后我们将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第74、130、135和136位氨基酸，为提高突变体的溶栓活性，我们将其C末端氨基酸进行修饰，另外添加一个赖氨酸。利用双酶切和PCR对构建的突变体碱性鉴定(图1)，构建了SAK-RGD-Hirudin融合蛋白表达载体，获得了高效表达的重组SAK衍生体蛋白，溶圈活性表明与野生型相比其溶栓活性有所提高，而抗原性有所降低，同时衍生体蛋白具备了抑制血小板聚集和阻断凝血酶活性的功能；RGD(Arg-Gly-Asp)序列能够与纤维蛋白原受体(GpIIb/IIIa)结合，抑制血小板聚集。而水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶天然抑制剂，其羧基端的10余个氨基酸是特异性结合并使凝血酶失活的关键区域。

所述Xa因子切割位点是Ile-glu-gly-arg，因SKA具有较强的血纤维蛋白特异性，将构建的融合蛋白定向富集到血栓形成部位，这个环境也恰恰是Xa因子的富集区域，这样，Xa因子切割位点Ile-glu-gly-arg使融合蛋白可以在血块周围被降解成具有不同功能的多肽，SAK用于溶栓；

RGD---Linker----Hirudin-C用于阻断血小板聚集和抑制凝血酶活性

所述引入柔性连接臂-GGGGS-序列的目的在于使RGD序列和水蛭素C末端功能域能够同时展示正确的结构。

本发明的有益效果是利用基因体外重组技术将RGD序列、水蛭素的C末端序列与构建的低抗原性高活性SAK突变体基因相融合，RGD(Arg-Gly-Asp)序列能够与纤维蛋白原受体(GpIIb/IIIa)结合，得到的衍生体蛋白，该衍生体蛋白具备了抑制血小板聚集和阻断凝血酶活性的功能，为研制新一代溶栓药物奠定了基础，同时将大大拓展新型SAK衍生体的应用范围。

附图说明

图1为重组SAK突变体质粒的鉴定示意图，图中1.子量标准物，2.pBV220EcoRI/BamHI酶切，3.重组质粒EcoRI/BamHI酶切，4.重组质粒PCR鉴定结果。

图2为重组SAK突变体的序列分析结果。

图3为PCR扩增结果，图中1为分子量标准；2、3为PCR扩增产物。

图4为SAK衍生体重组表达质粒的鉴定图谱，图中1..分子量标准物，2..pBV220EcoRI/BamHI酶切，3.重组质粒EcoRI/BamHI酶切。

图5为重组克隆的诱导表达结果，图中1：蛋白分子量标准物，2、3：重组克隆，4：pBV220空载体对照。

图6为重组SAK衍生体蛋白的纯化结果，图中1.蛋白分子量标准物，2、3：纯化的rSAK衍生体蛋白。

图7为纯化产物的活性测定，图中A2、A3、A4：测试样品，B1-5、C1-5：参照品的溶圈情况，D2、D3、D4：测试样品A2、A3、A4的重复上样。

具体实施方式

本发明提供一种抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体和制备方法。结合附图对本发明说明如下：

1.实验材料和设备

1.1菌株：金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus 1.1476)购自国家菌种保藏中心(CGMCC)，E.coli DH5，BL21等(军事医学科学院基础医学研究所保存菌种)。

1.2质粒：pT-SAK-M(军事医学科学院基础医学研究所构建)，pBV220表达载体大小为3.66kb，是一种温敏型高效表达载体，含有P_RP_L串联的启动子，cIts857温敏调控基因与P_RP_L的存在，使该载体可以转化任何受体菌，SD序列的后面紧跟多个克隆位点，为基因的操作提供了便利(军事医学科学院基础医学研究所保存)。

1.3酶与生化试剂：BamH I、EcoR I和T4 DNA连接酶、小提、大提质粒试剂盒蛋白分子量标准等购自美国Promega公司。

1.4实验器材：PCR仪为美国PE公司产品。电泳仪、层析仪为BIO-RAD公司产品。超净工作台、摇床等为国产。

2.实验方法

2.1葡激酶突变体的构建和鉴定

突变体的构建策略为最大限度地降低野生型SAK的抗原性，首先我们将不影响SAK活性的N端进行缺失，具体缺失前10位氨基酸，然后我们将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第74、130、135和136位氨基酸，为提高突变体的溶栓活性，我们将其C末端氨基酸进行修饰，另外添加一个赖氨酸。利用双酶切和PCR对构建的突变体碱性鉴定(图1)。然后进行核酸序列分析(图2)核苷酸序列如下：

AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC

Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

AAA ATT GAA GGT CGT CGT GGT GAT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GAT TTT

GAA GAA att cca gaa

Lys Ile Glu Gly Arg Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Phe Glu

Glu Ile Pro Glu

GAA TAT CTG CAA

Glu Tyr Leu Gln。

2.2切割位点的选择

因为SKA具有较强的血纤维蛋白特异性，因此它具有较好的导向作用可将拟构建的融合蛋白定向富集到血栓形成部位，这个环境也恰恰是Xa因子的富集区域，因此利用Xa的切割位点(Ile-glu-gly-arg)是一个巧妙的设计，这样融合蛋白可以在血块周围被降解成具有不同功能的多肽，SAK用于溶栓；

GD--Linker--Hirudin-C用于阻断血小板聚集和抑制凝血酶活性。

2.3水蛭素C末端片段的选择

检索Gebank可以获得多种水蛭素的变异体，大多有60余个氨基酸(64～69)组成。它可以与凝血酶的催化中心和纤维蛋白原结合中心发生不可逆的结合，使凝血酶失活。但研究发现其羧基端的10个氨基酸是特异性结合并使凝血酶失活的关键区域，我们比较了6种不同的Hirudin，其较为保守的序列为：GDFEEIPEEYLQ。国外已有研究表明，水蛭素的C末端片段具有相似的抑制凝血酶作用，因此为选择以上序列作为构建融合蛋白之用。

2.4柔性连接臂的设计

为实现SAK的溶栓活性，必须尽量保持SAK C末端的结构，我们前期对其C末端进行了修饰，引入的Xa因子切割位点仅有4个氨基酸对其活性影响较小。引入柔性连接臂的目的在于使RGD序列和水蛭素C末端功能域能够同时展示正确的结构。结合我们的前期工作我们选择-GGGGS-序列作为连接臂。

2.5抑制血小板聚集的功能的实现

许多抗血小板成分含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列，它能够与纤维蛋白原受体(GpIIb/IIIa)结合，抑制血小板聚集。而且由于该功能域较小适于进行融合蛋白的构建，因此我们选择RGD结构用于抑制血小板聚集。

2.6融合基因的设计和获得

首先利用primer5.0设计相应的引物，并在基因的3’或5’端添加相应三酶切位点。利用PCR方法获得融合基因(图3)。序列示意图如下：

SAK(11～74，135，136，137)--IEGR--RGD--GGGGS-GDFEEIPEEYLQ。

2.7表达载体的构建和鉴定

双酶切构建的融合基因和表达载体，然后分别回收，T4连接酶连接，转化DH5α后筛选阳性克隆，利用酶切鉴定筛选到的阳性克隆(图4)。

2.8重组融合蛋白的表达和纯化

将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素(Ap⁺)的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，次日再以5％的浓度接种于LB培养基中，30℃震荡培养2小时至OD₆₀₀为0.4-0.6之间，将培养物迅速移至42℃水浴中，震荡培养，诱导表达5小时，同时以含有空载体的BL21菌株作为对照，诱导结束后，以12000rpm离心20秒，收取诱导表达菌体BL21，加入80μl TE缓冲液悬浮菌体，再加入等体积的2X载样缓冲液混匀，100℃煮沸处理5分钟，然后进行SDS-PAGE检测(图5)。

重组蛋白的纯化：将诱导表达菌以PB缓冲液(50mM PB pH7.6，2mM EDTA)洗涤菌体两次，再以适当体积的PBE缓冲液悬浮，置于冰浴中，利用超声破碎仪破碎细菌，破碎结束后，将菌体破碎液倒于离心管中，在4℃条件下12000rpm离心20分钟，取上清备用。利用离子交换负吸附的原理，将破碎后的上清穿过阴离子交换柱(Q Sephrose FF)，使rSAK衍生体蛋白穿过，菌体蛋白吸附于柱上，收集穿过液。经过纯化后，去掉一部分杂蛋白，使rSAK的纯度得到提高，从而达到初步纯化的作用。将经过阴离子交换纯化的蛋白溶液，调pH为6.15，然后经过阳离子交换(SP Sephrose FF)的纯化，使rSAK衍生体蛋白的纯度进一步提高。然后，选择Amersham--Phamacia公司生产的Sephacryl S-200为凝胶过滤介质，将阳离子交换洗脱液上样，收集洗脱峰。利用SDS-PAGE电泳进行纯度分析(图6)，重组蛋白的纯度＞95％。

2.9融合蛋白的活性分析

2.9.1测活原理：人纤维蛋白原和凝血酶形成不溶性的纤维蛋白。葡激酶和纤溶酶原(h-plg)结合形成复合物，从而活化游离的h-plg使其成为有活性的纤溶酶，纤溶酶降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段，形成溶圈。

2.9.2纤维蛋白平板的制备：称取125mg琼脂糖(Biorad电泳级)，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要边加边摇匀，加2.2ml人纤维蛋白原(6mg/ml)，不停地摇匀，混浊后马上倒平板(直径8cm)，4℃冰箱水平放置至少半小时，充分凝固后待用。

2.9.3标准品和待测样品的稀释：标准品按如下方法进行对倍稀释如下表所示，待测样品根据标示量稀释至5μg/ml的浓度，待用。

管号	1	2	3	4	5
管号	1	2	3	4	5	生理盐水(μl)	500	500	500	500
参考品溶液(μl)	1000	500	500	500	500	生理盐水(μl)	500	500	500	500
参考品溶液(μl)	1000	500	500	500	500	参考品活性(AU/ml)	250	125	62.5	31.25	15.625

2.9.4打孔，点样：在形成的纤维蛋白平板内打孔(直径2mm)，每孔点样6μl，每个样品和标准品复孔点样，湿盒(在饭盒内加少量水以保持一定的湿度)于25℃水平放置16h。

2.9.5结果计算和检定报告：点样平板在黑色背景下纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(x)为横坐标，以溶圈直径的平均数(四次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，采用生物统计软件分析结果。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得y＝a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。图7所示即为重组葡激酶的溶圈结果，经过计算，其溶栓比活性为4.93×10⁴AU/mg。

2.10融合蛋白的抗原性分析

我们对重组蛋白的抗原性变化进行了初步分析，分别用野生型SAK和构建的SAK衍生体包被96孔板，封闭后洗涤3次，分别加入SAK鼠多抗，37℃温育1h，洗涤5次，加入辣根酶标记的羊抗鼠抗体，温育1h，洗涤5次，加入底物显色，利用2M的H₂SO₄终止反应，每板作8个复孔，在490nm比较其OD值OD(SAK野生型)＝1.13±0.21；OD(SAK衍生体)＝0.87±0.32。可见衍生体的抗原性有所降低，有关抗体的动态变化情况的动物实验正在进行中。

Claims

1.一种抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体，其特征在于：所述葡激酶衍生体的核苷酸序列如下：

AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC

Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

AAA ATT GAA GGT CGT CGT GGT GAT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GAT TTT

GAA GAA att cca gaa

Lys Ile Glu Gly Arg Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Phe Glu

Glu Ile Pro Glu

GAA TAT CTG CAA

Glu Tyr Leu Gln

2.权利要求1所述抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体的制备方法，其特征在于：所述葡激酶衍生体的制备为在构建了低抗原性SAK突变体的基础上，我们利用基因体外重组技术将RGD序列、水蛭素的C末端序列与构建的低抗原性高活性SAK突变体基因相融合，同时引入Xa因子切割位点和柔性连接臂以保障各个部分的生物学活性，首先在不影响SAK活性的N端进行缺失条件下，具体缺失前10位氨基酸，然后我们将SAK分子中的一些B淋巴细胞表位区段进行修饰，主要包括：第74、130、135和136位氨基酸，为提高突变体的溶栓活性，我们将其C末端氨基酸进行修饰，另外添加一个赖氨酸；利用双酶切和PCR对构建的突变体碱性鉴定(图1)，构建了SAK-RGD-Hirudin融合蛋白表达载体，获得了高效表达的重组SAK衍生体蛋白，溶圈活性表明与野生型相比其溶栓活性有所提高，而抗原性有所降低，同时衍生体蛋白具备了抑制血小板聚集和阻断凝血酶活性的功能；RGD(Arg-Gly-Asp)序列能够与纤维蛋白原受体(Gp IIb/IIIa)结合，抑制血小板聚集，而水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶天然抑制剂，其羧基端的10余个氨基酸是特异性结合并使凝血酶失活的关键区域。

3.根据权利要求2所述抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体的制备方法，其特征在于：所述Xa因子切割位点是Ile-glu-gly-arg，因SKA具有较强的血纤维蛋白特异性，将构建的融合蛋白定向富集到血栓形成部位，这个环境也恰恰是Xa因子的富集区域，这样，Xa因子切割位点Ile-glu-gly-arg使融合蛋白可以在血块周围被降解成具有不同功能的多肽，SAK用于溶栓；RGD---Linker----Hirudin-C用于阻断血小板聚集和抑制凝血酶活性。

4.根据权利要求2所述抑制血小板聚集和凝血酶活性的葡激酶衍生体的制备方法，其特征在于：所述引入柔性连接臂-GGGGS-序列的目的在于使RGD序列和水蛭素C末端功能域能够同时展示正确的结构。