CN104707133A - 葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物医药领域的葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用。所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。本发明中的葡激酶衍生体经静脉注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鹌鹑后可以显著降低血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等时间内其降脂效果优于其疗效优于他汀类药物。经静脉注射后2周即可显示出明显的降脂效果，同时还可以明显抑制机体炎症水平，改善氧化应激状态。利用生物工程方法制备SAK-HV蛋白工程菌，经过工艺优化其表达量可达45％，经发酵纯化获得纯化蛋白纯度可达95％以上。

Description

葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及葡激酶衍生体(SAK-HV)在制备降血脂药物中的应用。

背景技术

葡激酶(staphylokinase SAK)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种含有136个氨基酸残基的胞外蛋白质。葡激酶在本世纪四十年代末被发现，并在五十年代至六十年代发现其具有纤溶作用。

中国专利文献(CN1850976B)中公开了一种葡激酶衍生体(SAK-HV)(其氨基酸序列在文献中权利要求1中所示)并且在文献(Min Wang,Yuanyuan Wang,et al.Construction and characterization of a novel staphylokinase variant withthrombin-inhibitory activity.Biotechnol Lett(2009)31:1923–1927)中也进行了公开。上述公开的葡激酶衍生体(SAK-HV)是具有多功能结构域的融合蛋白。

目前降脂类药物主要包括HMG-CoA还原酶抑制剂，胆酸螯合剂，纤维酸类，烟酸及其衍生物，中药成分如枸杞多糖、茶叶多糖、黄连素等。目前临床应用最广泛的降脂药物为他汀类药物，其作用机理为抑制HMG-CoA还原酶，他汀药物的治疗周期一般为6-8周。

发明内容

本发明的目的在于提供葡激酶衍生体(SAK-HV)在制备降血脂药物中的应用。

所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。

一种降血脂组合物，包含权利上述葡激酶衍生体。

所述葡激酶衍生体的制备方法为：培养含有葡激酶衍生体基因序列重组表达载体的工程菌，通过破碎菌体分离上清经过纯化后获得葡激酶衍生体蛋白液，将纯化的葡激酶衍生体中加入赋形剂，4℃保存；再加入冻干保护剂，冷冻干燥。

所述赋形剂为海藻糖。

所述保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化钠、甘氨酸中的一种以上。

其中，将SAK-HV的基因序列重组构建到表达载体中，转化宿主菌。所用重组表达载体可为pBV220、pET17b、pET15a或pET28a。可使用的表达宿主菌为E.coliBL21、E.coliDH5α、E.coliHB101、E.coliJM109或E.coliJM103

具体的，SAK-HV粉剂的制备方法为：

利用基因重组技术将SAK-HV蛋白的基因序列构建到表达载体中，进一步转化宿主菌。通过筛选获得高表达，高活性的工程菌株。从转化好的菌种平板上挑取单菌落在无菌环境下接种于3ml含氨卞青霉素(25μg/ml)的LB培养基的试管中，25～30℃振荡培养过夜制成一级种子液。一级种子液于无菌环境下按0.1:1000的比例接种于2000ml含氨卞青霉素(25μg/ml)的LB培养基中，25～30℃振荡培养过夜制成二级种子液。二级种子液接种于发酵罐中，发酵培养，富集菌体，通过调节诱导过程中的不同PH值，溶氧量，诱导温度等条件选择最佳的发酵条件，发酵结束后，离心收菌，称重并取菌体破碎进行SDS-PAGE检测SAK-HV表达水平。经过发酵后富集工程菌，获得的SAK-HV表达水平可达45％以上。菌体在冰浴中超声破碎，离心，收集上清进行离子交换层析分离及凝胶过滤分离通过SDS-PAGE，HPLC检测蛋白纯度，纯度可达95％以上。选择不同浓度的冻干保护剂，包括甘露醇、右旋糖酐、蔗糖和甘氨酸等组成不同浓度的单一和复合配方，冷冻干燥后检测冻干样品的活性和成型的变化，经过37℃加速实验后，检测其活性和成型状况的改变，确定SAK-HV蛋白粉剂制备的主要成分。

上述降血脂组合物，可通过静脉、皮下或口服给药。

将上述降血脂组合物复溶后使用生理盐水稀释至0.005～0.5mg/ml静脉注射，注射周期为14天，每天注射一次连续注射14天；在小鼠上的用量为0.05mg/kg～5mg/kg，鹌鹑上的用量为0.01mg/kg～5mg/kg。

本发明的有益效果：通过本发明人的研究显示葡激酶衍生体可能通过stat3信号通路调控脂肪代谢相关基因表达。本发明中的葡激酶衍生体经静脉注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鹌鹑后可以显著降低血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等时间内其降脂效果优于其疗效优于他汀类药物。经静脉注射后2周即可显示出明显的降脂效果，同时还可以明显抑制机体炎症水平，改善氧化应激状态。经过基因芯片分析肝脏转录组发现SAK-HV蛋白可能通过stat3信号通路调控脂肪代谢相关基因表达。

附图说明

图1为SRH-HV工程菌发酵结果，1-分子量标准物，2-发酵全菌，3-破碎上清，4-破碎沉淀。

图2为SRH-HV纯化后SDS-PAGE及HPLC分析结果，(A)为SDS-PAGE结果：1-分子量标准物，2-4-纯化产物收集；(B)为HPLC分析蛋白纯度结果。

图3为ApoE-/-小鼠血脂检测结果。

图4为高脂喂养鹌鹑血脂检测结果。

具体实施方式

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社(J.Sambrook，David W.Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,2001(1).J.))或参阅所用试剂盒的说明书。如无特别指明，下述实施例中所使用的试剂，试验方法等皆为本领域技术人员所熟知。

实施例1 含有本发明SAK-HV蛋白基因的工程菌的制备

(1)含有SAK-HV蛋白基因表达载体的构建

将质粒pBV220用EcoR I和BamH Ⅰ双酶切，将质粒pET17b用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，将SAK-HV全长片段分别用EcoR I和BamH Ⅰ双酶切，Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切。使用T4DNA连接酶链接酶切后的SAK-HV片段及pET17b质粒。SAK-HV酶切片段5μl，载体1μl，10×Ligand Buffer3μl，T4Ligand 1μl，ddH2O15μl，14-16℃过夜连接。

(2)含有SAK-HV蛋白基因载体转化工程菌

将过夜连接的产物全部加入200μl感受态细胞中，0℃冰浴30min。42℃热休克90sec，迅速放入冰浴中冷却1－2min。在每管中加入800μl LB(Amp^-)培养基，37℃摇床180－200rpm培养45－60min。将每管4000rpm离心5min。吸取800μl上清弃之，用剩余的200μl上清将沉淀悬起来。然后涂在LB固体平板(100μg/ml Amp+)上。待平板全部吸收后，倒置于37℃温箱，培养12-16h。

(3)含有SAK-HV蛋白的工程菌表达活性检测

挑取单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床220rpm过夜培养。将活化菌液以1:100比例接种于3ml含氨苄青霉素的LB培养基中。30℃摇床220rpm培养。取约100μl菌液用分光光度计测得OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，加入100mMIPTG，终浓度为0.5mM，将菌液转入30℃摇床中诱导表达5h。4℃离心收集菌体。用SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果显示在17kD的位置有一表达量很高的蛋白条带，此蛋白的大小与SAK-HV相同，而空载体对照则无此蛋白带，说明以此制备的工程菌可以高效表达SAK-HV蛋白，薄层扫描结果显示SAK-HV的表达量占菌体总蛋白的45％以上。图1为使用SDS-PAGE方法分析工程菌种发酵后的表达情况，取少量发酵菌，悬浮于20mMPBE和2mMEDTA的缓冲液之中，超声破碎，12000转/分钟4℃离心5分钟，分别取全菌、离心上清和离心沉淀进行SDS-PAGE检测发酵菌的表达情况。泳道1为分子量marker，泳道2为全菌蛋白，可见在分子量14kD与20kD之间有目的条带表达(箭头所示)。泳道3为破碎后上清，泳道4为破碎后沉淀，可见目的蛋白主要存在于上清中以可溶形式表达。

实施例2 含有SAK-HV蛋白粉剂的制备

(1)纯化SAK-HV蛋白的制备

根据SRH蛋白的等电点及分子量等理化特性，选择经济实用的分离材料，经过不同的缓冲体系、不同的酸碱度、不同的离子强度、不同的洗脱条件等综合研究，获得了经济、适用、分离效果好的SRH融合蛋白的纯化工艺，具体流程如下：使用Source Q15阴离子交换柱，用20-60mMPB(PH6-9，2mMEDTA)缓冲液平衡纯化柱，流动速度为2ml/min。将破碎后上清上柱，流动速度为0.5ml/min。上样结束后用20-60mMPB(PH6-9，2mMEDTA)缓冲液洗脱杂蛋白，流动速度为2ml/min。当蛋白穿过峰下降至基线水平后，用10-50mMNaCl溶液洗脱，收集蛋白峰。用1MNaCl溶液再生离子交换柱上，流速2ml/min，再用PB缓冲液洗柱将NaCl除去。凝胶过滤层析：层析介质为Sephacryl S-200，缓冲液为20-50mMPB(PH7.4，2mMEDTA)，流速0.9ml/min,上样40ml，18h后收集洗脱峰。待缓冲液洗柱两个柱体积后用20％乙醇洗柱。最后将柱子存于20％乙醇中。4℃保存。将所得的样品SDS-PAGE蛋白电泳，并将收集的蛋白液进行HPLC分析纯度，如图2所示。各泳道为Sephacryl S-200洗脱后收集的目的蛋白，未见明显杂蛋白条带。HPLC分析蛋白纯度，结果显示目的蛋白纯度在95％以上。

(2)SAK-HV蛋白的冻干

溶液配制及配方组成:配制50％蔗糖溶液、1mol/L甘氨酸溶液、20％右旋糖酐溶液，组成不同的冻干保护剂配方。分装结束后，将样品置于冷井中密封，预冻至冷井温度-70℃，物料-63℃，开始启动干燥程序24h后取出样品，加盖密封。在40W的日光灯下，观察成型状况，然后加入1ml生理盐水，在40W日光灯下观察样品溶解状况及有无不溶物。

实施例3

高脂血症动物模型构建

(参考Nhat-Tu Le,A Crucial Role for p90RSK-Mediated Reduction of ERK5Transcriptional Activity in Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis,Circulation.2013；127:486-499.Satoshi Imaizumi,et al.Mitogen-activated protein kinasephosphatase-1deficiency decreases atherosclerosis in apolipoprotein E null mice byreducing monocyte chemoattractant protein-1levels.Molecular Genetics andMetabolism 101(2010)66–75)

将16周龄ApoE-/-小鼠高脂饲养1～2周(饲料配方：胆固醇2％，猪大油10％，蔗糖5％，基础饲料83％)至17-18周龄，开始给药。SAK-HV尾静脉注射连续每天给药一次，共给药14次，饲养过程中动态观察血脂变化。

将4周龄鹌鹑高脂饲养20周(饲料配方：蔗糖10％，胆固醇5％，猪大油10％，基础饲料84％)后开始给药。尾静脉注射连续每天给药一次，共给药14次，饲养过程中动态观察血脂变化。

治疗方案及结果

将SAK-HV蛋白使用生理盐水稀释至所需浓度(0.005～0.5mg/ml)，300μl/只小鼠尾静脉注射。连续注射每天一次，共注射14次。治疗结束后处死小鼠，心脏采血后分离血清，检测血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)指标。研究结果显示SAK-HV可以显著降低ApoE^-/-小鼠TC及LDL-c水平，降脂效果优于他汀口服，如图3所示。

将SAK-HV蛋白使用生理盐水稀释至所需浓度(0.01～0.5mg/ml)，300μl/只鹌鹑静脉注射。连续注射每天一次，共注射14次。治疗结束后处死鹌鹑，颈动脉采血后分离血清，检测TC，TG，LDL-c指标。研究结果显示SAK-HV可以显著降低高脂饲养鹌鹑的TC，TG，LDL-c水平(图4)，降脂效果优于他汀口服给药。

Claims (6)

1.葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。

3.一种降血脂组合物，其特征在于，包含权利要求1或2中所述的葡激酶衍生体。

4.根据权利要求3所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述葡激酶衍生体的制备方法为：培养含有葡激酶衍生体基因序列重组表达载体的工程菌，通过破碎菌体分离上清经过纯化后获得葡激酶衍生体蛋白液，将纯化的葡激酶衍生体中加入赋形剂，4℃保存；再加入冻干保护剂，冷冻干燥。

5.根据权利要求3或4所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述赋形剂为海藻糖。

6.根据权利要求3或4所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化钠、甘氨酸中的一种以上。