CN101709083B

CN101709083B - 一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101709083B
Application number: CN2009101942108A
Authority: CN
Inventors: 谭竹钧; 黄锦兵; 韩雅莉; 陈雅雄; 丁鸿
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2029-11-27
Also published as: CN101709083A

Abstract

本发明公开了一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用，本发明的一种来自蝎尾的分子量为37.69kD纤溶活性蛋白其制备方法是：将蝎尾洗净，磨碎，加入磷酸钠缓冲液，4℃浸提过夜；离心去沉淀，分段盐析，取40％-70％部分；最后进行二乙氨基乙基-32纤维素离子交换层析柱纯化，用Tris-HCl缓冲液洗脱，收集活性蛋白峰，浓缩，冻干；本发明的纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用；发明涉及的纤溶活性蛋白是蝎尾中的一种单组分蛋白，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是理想的抗肿瘤药物。

Description

一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其是蝎尾中纤溶活性蛋白的提取。本发明从蝎尾中提取一种纤溶活性蛋白，并且涉及这种纤溶活性蛋白的制备方法，以及这种纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

蝎子为进化上最古老的物种之一，距今已经有4亿年的历史，在漫长的进化过程中，其形态几乎没有改变。世界各地大约有1500多种蝎，分为6个科，蝎之所以引起科学家的极大兴趣，不仅是因为蝎经历了漫长的进化历程，更重要的是由于蝎尾腺分泌的蝎毒具有极大的医学价值。蝎毒含有多种生物活性组分，包括酶、多肽、核苷、脂类、粘蛋白、生物胺及其他未知成分。蝎毒的主要活性成分是一类由28-76个氨基酸残基组成的小分子多肽。它们绝大多数含3-4对二硫键，可选择性地与动物可兴奋细胞膜上的钠钾钙氯离子通道结合，改变细胞对离子的通透能力；少数不含二硫键，具有舒缓激肽增效肽或抗菌等功能及功能有待确定的新的蝎毒液多肽。

蝎作为一种传统的药物应用于临床已于人有悠久的历史，蝎是一种传统的中药材，其药性味成、辛、平，有毒，归肝经；具有熄风镇痉、攻毒散结、通络止疼的功效；传统验方中主要用于治疗小儿惊风、抽搐痉挛、中风、半身不遂、破伤风、风湿顽痹、疮疡、瘰疬和癫痫。但用蝎毒制成注射剂或口服胶囊用来治病历史却不长。蝎毒临床应用方面的研究在国外几乎是空白，多以理论研究为主，没有成型的蝎毒药品，临床应用只是用抗蝎毒血清治疗被蝎蛰伤患者。中国对蝎毒的理论研究比国外晚，但蝎毒制药进展较快，目前中国的蝎毒药品按剂型有3种：第1种为注射粉剂；第2种为口服胶囊；第3种为药膏。

1蝎毒注射粉剂

蝎毒千粉经过生化分离，除去致痛物质和其他不需要组分，经常规制药而成。这种制剂的主要成分是蝎毒神经毒素。由于蝎毒成分复杂，因此从中纯化特异的成分比较困难。蝎毒药品注射粉刻工艺较复杂，一般有以下3大步骤：第1步，蝎毒中药用成分的分离纯化。本步骤的技术含量最高，为制药过程的关键。因为蝎毒中含有十几种至几十种蛋白质，许多蛋白质是有毒的或不需要的成分，该步的任务是将蝎毒通过生化方法分离，取出药用蛋白。不同厂家(有些尚处于试验阶段)使用的方法不同，但都通过离子交换凝胶柱和分子筛层析进行分离、纯化。常用的离子交换凝胶有CM-Sephadex C-50，CM-Sephadex C-25和DEAE-SephadexA-50；常用的分子筛凝胶为Sephadex C-75和Sephadex C-50。一般先进行离子交换层析，用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱；然后进行分子筛层析。为获得高纯度蛋白质，往往需要反复使用离子交换层析和分子筛层析。目前利用基因工程制备蝎毒特异蛋白质的研究正在进行之中，但成本过高，数量有限，蝎毒仍是获得蝎毒蛋白质的主要来源。第2步，蝎毒有效成分浓度的测检。该步骤的目的有2个，一是检测蝎毒是否分离合格，是否还有其他毒性物质存在。这些毒性物质包括出血毒素、细胞毒素和其他神经毒素等。该步骤第2个目的是为第3步做准备，因为第3步是分装阶段，如果不知道蛋白质的浓度，就不知道要加多少稀释液。目前定量测定蝎毒的方法有免疫扩散、蛋白质含量的定量测定和半数致死量测定。第3步，一般制药过程。包括稀释、过滤灭菌、分装、冷冻干燥，封口和包装。由北京医科大学中国药物依赖性研究所和温州复旦生物工程有限公司研制的蝎毒注射液(scorpion venominjection)已经获得生产批号，新药批准号为(96)卫制申体第11号，商品名为“施康宁注射液”，临床多用于镇痛。尹燕东等，报道了蝎毒肤对动物具有抗栓及纤溶作用之后，又对大鼠脑血栓模型进行了实验研究，旨在开发适宜消化系统用药，而且简便、安全和有效的溶栓制剂。

2胶囊类药品

胶囊类药品的工艺包括原料的粉碎、各种原料的配比和胶囊制备。蝎毒制剂一痹痛灵胶囊是以蝎毒为主要原料的蝎毒胶囊类药品，批号为粤湛卫药制剂[98]DA10-01-121号，临床用于镇痛、风湿性关节炎和类风湿性关节炎的治疗。

3蝎毒药膏

国内蝎毒药膏一般停留在自制自用的状态，没有批号和形成批量生产。

至今仍未见到有关于蝎毒纤溶活性蛋白的相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种来自蝎尾的分子量为37.69千道尔顿kD的单一组分的纤溶活性蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种上述纤溶活性蛋白的制备方法。

本发明的另一个目的是提供含有所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。

本发明的再一个目的是提供所述纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

1)将蝎尾洗净，磨碎，加入磷酸钠缓冲液，4℃浸提过夜；

2)离心去沉淀，分段盐析，取40％-70％部分；

3)最后进行二乙氨基乙基-32纤维素离子交换层析柱纯化，用Tris-HCl缓冲液洗脱，收集活性蛋白峰，浓缩，冻干。

所述步骤1)中缓冲液是pH7.2浓度为0.02mol/L的磷酸钠溶液，蝎尾重量与磷酸钠缓冲液体积之比为1∶5。

所述步骤2)中分段盐析是，在上清液中加固体硫酸铵达40％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达70％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集沉淀。

所述步骤3)中洗脱缓冲液是含有1mol/L氯化钠的0.02mol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸。

所述步骤3)中对纤溶组分浓缩是指超滤浓缩而且浓缩之前要用透析袋进行除盐，冻干是指冷风吹干或冷冻干燥。

含有所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。

所述纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果是：

发明涉及的纤溶活性蛋白是蝎尾中的一种单组分蛋白，分子量在37.69KD的一种纯的纤溶活性蛋白，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是理想的抗肿瘤药物。

附图说明

图1，SDS-PAGE测定蝎毒纤溶活性蛋白的分子量。

具体实施方式

下面能过实施例详细说明本发明，但是这些实施例不在任何方面限制本发明的范围。

实施例1：

蝎毒纤溶活性蛋白的制备。

材料：东亚钳蝎(产地：中国)

制备：1、粗提液的制备

取蝎子，剪蝎尾，称重，剪碎，按1∶5(重量∶体积)的比例加入预冷的0.02mol/L磷酸钠缓冲液pH7.2，研磨至糜状，4℃浸提过夜。将浸提液在8500转/分，4℃的离心泵中离心15min，收集上清液，在上清液中加固体硫酸铵达40％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达70％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集沉淀进行透析浓缩，得到粗提液。

2、离子交换层析

预先用0.02mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-32纤维素柱，用含1mol/LNaCl的0.02mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，分部收集器收集，流速为1ml/min，收集各个峰，透析除NaCl，浓缩，冻干。

3、电泳

将纯品用使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用5％的浓缩胶和12％的分离胶进行电泳，考马斯亮兰R-250染色，测定蛋白质纯品的分子量为37.69KD(如图1所示)，具有纤溶活性。此为本发明的纤溶活性蛋白。

实施例2：

本发明纤溶酶生物活性的测定。

试剂：

牛血纤维蛋白原溶液：浓度10mg/mL。牛血纤维蛋白原为Sigma公司产品。

牛凝血酶：浓度100U/mL。牛凝血酶为Sigma公司产品。

操作：

配制0.8％的琼脂糖，煮沸冷却至45-55℃，加入7mg/ml的牛血纤维蛋白原0.8ml，6U/ml的凝血酶0.5ml，迅速摇匀倒入直径9cm的培养皿中，盖上玻璃盖，冷却凝固后移到4℃冰箱中保存半小时，用0.2ml枪头在制备好的纤维蛋白凝胶板上打孔，每孔加样20μL，置37℃培养箱中培养24小时，考马斯亮兰R-250染色30min，脱色2h，测定溶圈两垂直直径的大小算出溶解圈的面积，对照尿激酶标准曲线得出酶活力。

实施例3：

含有本发明纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

分别测定此纤溶活性蛋白对小鼠腹水瘤细胞S180的抑制作用，设计腹腔注射、腋下注射实体瘤相关实验，以及运用MTT检测法检测此纤溶活性蛋白对S180细胞的直接作用。

1)小鼠腹腔注射S180实验模型的建立及结果

接种老鼠(20±2g)细胞密度8×10⁷，腹腔注射，每组设定8只重复组，阳性对照环磷酰胺组浓度为20mg/ml，阴性对照组为等体积生理盐水，药物浓度组为上述蝎尾纤溶活性蛋白浓度组25mg/ml、100mg/ml，腹腔注药7天，每次20μL，7天后测腹水细胞浓度，计算各组平均值，记录数据，结果如下表：

根据抑瘤率计算公式：

抑瘤率＝(对照组平均值-治疗组平均值)/对照组平均值×100％

得出抑瘤率见下表：

由表可以看出蝎尾纤溶活性蛋白的抑瘤率在高浓度组时接近于阳性对照组环磷酰胺。

2)小鼠S180实体瘤模型的建立及结果

接种老鼠(20±2g)细胞密度7.6×10⁷，每组设定8只重复组，腋下注射，阳性对照环磷酰胺组浓度20mg/ml，阴性对照组为等体积生理盐水，药物浓度组为上述蝎尾纤溶活性蛋白浓度组，设定低中高浓度三个浓度组。浓度分别为25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml，腹腔注药7天，每次20μL，7天后测实体瘤体积和脾重，计算平均值，记录数据，结果如下表：

由上表可知，蝎尾纤溶活性蛋白的脾重指数都高于阳性对照组和阴性对照组，说明其对小鼠的生长具有很小的毒害作用，同时在中浓度组和高浓度组的抑瘤率明显高于阳性对照组环磷酰胺，但在低浓度组时效果不明显。

3)MTT检测蝎毒纤溶活性蛋白对的S180作用

取对数生长期S180细胞，用培养液调细胞浓度至5×10⁴/ml，将细胞加入96孔板，每孔加样100μL，将细胞放入37℃CO₂培养箱培养6个小时，加药，设空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入消毒灭菌过的PBS20μL，阳性对照组加入0.5mg/ml的顺铂20μL，设定蝎毒纤溶活性蛋白药物浓度组为1、2、4、8、16mg/ml，培养24h、48h、72h，于培养结束前4h，各孔加入5mg/ml的MTT20μL，4h后取出，弃去上清液，各孔加入DMSO100μL，震荡5min，使紫色结晶物溶解，离心，在酶标仪中测定490nm处的OD值，结果如下表：

(*P＜0.1，**P＜0.05)

由上表可以看出24h时16mg/ml的纤溶活性蛋白的抑瘤率与阳性对照组相近，随着浓度的降低抑瘤率慢慢下降，48h时纤溶活性蛋白的抑瘤率随着浓度的降低也在逐渐降低，72h使抑瘤率达到最大，高浓度组达到56％左右，与阳性对照组相近。

因此，实施例3可以证明蝎尾纤溶活性蛋白具有抗肿瘤作用。

Claims

1.一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白的制备方法，其特征在于如下步骤：

1)将蝎尾洗净，磨碎，加入磷酸钠缓冲液，4℃浸提过夜；

2)离心去沉淀，分段盐析，取40％-70％部分；

3)最后进行二乙氨基乙基-32纤维素离子交换层析柱纯化，用Tris-HCl缓冲液洗脱，收集活性蛋白峰，浓缩，冻干；

所述步骤1)中缓冲液是pH7.2浓度为0.02mol/L的磷酸钠溶液，蝎尾重量与磷酸钠缓冲液体积之比为1∶5；

所述步骤2)中分段盐析是，在上清液中加固体硫酸铵达40％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集上清液；再加入固体硫酸铵达70％饱和度，8500转/分，4℃离心泵中离心，收集沉淀；

2.根据权利要求1所述的纤溶活性蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中对纤溶组分浓缩是指超滤浓缩而且浓缩之前要用透析袋进行除盐，冻干是指冷风吹干或冷冻干燥。

3.含有权利要求1所述纤溶活性蛋白的抗肿瘤药物组合物。

4.权利要求1所述的纤溶活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。