CN108586605A - Tsm1多肽及其在制备抗补体药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于猪肉绦虫的TSM1多肽。采用基因工程技术，经设计引物，克隆，表达纯化得到TSM1蛋白，通过经典途径补体溶血实验确定TSM1抗补体功能。TSM1多肽由63个氨基酸组成，编码该蛋白的基因全长189bp，该蛋白的理论分子量9820Da，有3对二硫键，包含1个Kunitz结构域，理化性质稳定。本发明为寻找补体对抗靶点及抗补体天然药物奠定基础，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子，TSM1有望成为在经典途径中抗补体的天然新药。

Description

TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物医药医疗领域，具体涉及来源于猪肉绦虫的TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用。

背景技术

猪肉绦虫(Taenia solium)又称猪带绦虫、链状绦虫、有钩绦虫，绦虫纲，带形科，分布广泛，但是其感染率不高。猪肉绦虫是人畜共患的寄生蠕虫，人体是该虫唯一的终宿主。猪肉绦虫自身分泌一些蛋白酶及蛋白酶抑制剂，使其寄生在人体的长期过程中与人体形成了相互作用的免疫机制，通过免疫隔离、分子模拟、破环抗体、免疫抑制、免疫调节等进行免疫逃避。

近年来，以绦虫的基因组数据库和蛋白质数据库为研究对象，从猪带绦虫中鉴别出199个蛋白酶和35个蛋白酶抑制剂，这些蛋白酶分别属于金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶五大蛋白超家族，蛋白酶抑制剂分别属于丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂四大家族，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂是两种猪带绦虫分泌的主要蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂包括可逆的kunitz抑制剂家族及可逆的Kazal抑制剂家族、不可逆的MEROPS抑制剂家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂的三级结构高度保守，包含9个α螺旋和3个β折叠，分为基序、螺旋状反应位点(RSL)和信号序列三部分，其中RSL主要包括P1和P1′两个活性位点。结构决定功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与一些基本的生物学反应，发挥了其重要的作用生物学作用，比如免疫应答、抗凝作用、抗肿瘤作用、纤维蛋白的溶解作用、炎症反应、信号传导的级联放大反应和荷尔蒙的信号传导等，但是在免疫应答方面的作用机制和应用价值没有系统和深入的研究，仍需进一步的研究。

补体是一组不耐热，可介导免疫和炎症反应的无活性的蛋白酶原。补体存在于人和动物的血清和组织液中。目前已经发现补体是由50多种补体固有成分，补体受体成分及补体调节蛋白组成的复杂生物反应系统，又称补体系统。补体系统构成了固有免疫和适应性免疫之间的桥梁。正常生理状态下，补体活化及其活化产生的产物可介导抗感染、细胞吞噬、细胞溶解、炎症介质作用等基本的生物学作用。但是，在病理情况下，补体系统成分的缺陷或者异常激活可引发多种疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、白细胞黏附缺陷症、遗传性血管神经性水肿、类风湿性关节炎、肾脏疾病、缺血-再关注损伤等。因此，近年来，随着对补体系统的深入研究及生物技术的快速发展，抗补体药物的寻找及开发成为人们关注的焦点。

但是，目前还没有开发出较好的抗补体制剂。化学合成的抗补体制剂成本高，工艺复杂，并且效果不佳，长期使用产生多种副作用，寻找天然的抗补体活性药物已经引起国内外学者广泛的关注。截止目前，国内对天然化合物类补体抑制剂的研究主要局限于对肝素以及麻黄等少量植物和微生物培养的研究，对其他类型的补体抑制剂的研究较少，基本处于空白状态，而国外对补体抑制剂已进行了广泛的研究，发现了多种类型的天然抗补体制剂，包括多糖类化合物、黄酮类化合物、甾体类化合物、皂苷类化合物、酶及多肽类化合物等多种天然化合物。研究表明，临床上广泛使用的免疫抑制剂药物如糖皮质激素、环孢素、大环内酯类抗生素等虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，特异性差，难以口服，长期使用会降低机体的免疫抑制力，导致抗感染能力下降，容易继发感染和使潜在病灶扩散，并产生多种并发症和副作用。天然产物来源的抗补体活性成分开发成本低，专一性强，因此，寻找天然来源的高度有效的补体调控分子具有十分重要的意义。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷，本发明用分子生物学技术研究绦虫基因组学，从绦虫蛋白质数据库中筛选出猪肉绦虫TSM系列多肽，并设计引物，克隆及表达纯化蛋白，通过抗补体经典途径中绵羊红细胞溶血的抑制率实验研究猪肉绦虫TSM系列多肽的功能。本发明证实了多肽TSM1能对抗补体、抑制补体经典途径的溶血。TSM1多肽由63个氨基酸组成，编码该蛋白的基因全长189bp，该蛋白的理论分子量9820Da，有3对二硫键，包含1个Kunitz结构域，理化性质稳定，有望成为补体的天然抑制剂，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种多肽TSM1，所述多肽包含SEO ID NO.1所示氨基酸序列。

本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码多肽TSM1。进一步的，所述核酸分子包含SEO ID NO.2所示核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含编码多肽TSM1的核酸分子。

本发明提供了一种细菌，所述细菌包含多肽TSM1或编码多肽TSM1的核酸分子。

本发明提供了一组引物，所述引物组包含3对引物，分别为：

SEO ID NO.5所示的TSM1-3FP1和SEO ID NO.6所示的TSM1-4RP1；

SEO ID NO.4所示的TSM1-2FP2和SEO ID NO.7所示的TSM1-5RP2；

SEO ID NO.3所示的TSM1-1FP3和SEO ID NO.8所示的TSM1-6RP3。

进一步的，本发明还提供了上述引物在扩增多肽TSM1的编码核酸分子中的用途。

本发明提供了一种多肽TSM1，和/或编码多肽TSM1的核酸分子在制备抗补体制剂中的用途。所述制剂为试剂盒、药物或药物组合物，优选药物或药物组合物。

本发明的有益效果是：

多肽TSM1能与体系中的补体结合发挥作用，补体系统是TSM1多肽的作用靶点，本发明为寻找补体对抗靶点及抗补体天然药物奠定基础，为抗补体天然药物研发提供了新的先导分子，TSM1有望成为在经典途径中抗补体的天然新药，具有重要的抗补体药物开发应用价值。

附图说明

图1.原核表达体系pET-28a(+)质粒图谱。

图2.TSM1在NCBI中Blast结果分析。

图3.TSM1目的序列的PCR产物电泳图：泳道M是DNA Marker条带，泳道1是TSM1的基因PCR产物条带。

图4.pET-28a-TSM1重组质粒菌落PCR电泳图：泳道M是DNA Marker条带，泳道1，2，3，4，5是TSM1重组质粒菌落PCR产物条带。

图5.TSM1重组蛋白高效液相色谱图。

图6.经典途径的不同稀释度的豚鼠血清(补体)的效价(％，Mean±SD)。

图7.TSM1经典途径抗补体活性的浓度依赖性验证。

图8.猪肉绦虫TSM1多肽对补体浓度依赖的实验验证。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：结构蛋白序列分析

1、利用生物信息学方法，通过互联网在三大核酸数据库里进行检索得到绦虫多肽序列，将得到的序列编号。

2、利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站对序列分析去除信号肽序列。

3、根据kunitz模式氨基酸序列6个半胱氨酸呈规律排布。

XXXXXXXCXXXXXXXXCXXXXXXXXXXXXXXXCXXXXXXXCXXXXXXXXXXXXCXXXCXXXXX

可以从序列中筛选出具有此结构的序列，分析比对，最后得到TSM系列多肽的序列，并且可能具有抗补体功能的序列。

4、TSM1多肽的氨基酸序列：

KMSYINRCNLPISSGQCRGYFLRYGYDSEADECRRFVYSGCRGNRNNFFTYNECMNRCYMRFK(SEQID NO.1)

5、TSM1多肽的密码子优化的核酸序列：

AAAATGAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGCAGCGGCCAGTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCGAAGCGGATGAATGCCGCCGCTTTGTGTATAGCGGCTGCCGCGGCAACCGCAACAACTTTTTTACCTATAACGAATGCATGAACCGCTGCTATATGCGCTTTAAA(SEQ ID NO.2)

6、TSM1在NCBI中Blast比对：TSM1由63个氨基酸组成，属于kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂通常含一个或多个kunitz结构域。kunitz结构域由<100氨基酸残基组成，含有6个Cys并形成3对分子内二硫键，TSM1在NCBI中Blast结果如图2所示。

实施例2：TSM多肽克隆

1、TSM1引物设计：

TSM1-1(FP3):

CTGCATATGAAAATGAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGC(SEQ ID NO.3)

TSM1-2(FP2):

AACCTGCCGATTAGCAGCGGCCAGTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTAT(SEQ ID NO.4)

TSM1-3(FP1):

TATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCGAAGCGGATGAATGCCGCCGC(SEQ ID NO.5)

TSM1-4(RP1):

GTTGCGGTTGCCGCGGCAGCCGCTATACACAAAGCGGCGGCATTCATC(SEQ ID NO.6)

TSM1-5(RP2):

GCGGTTCATGCATTCGTTATAGGTAAAAAAGTTGTTGCGGTTGCCGCG(SEQ ID NO.7)

TSM1-6(RP3):

GTGCTCGAGTCATTTAAAGCGCATATAGCAGCGGTTCATGCATTC(SEQ ID NO.8)

2、引物配制：将引物粉末12000r离心2min，按说明加超纯水到100uM，离心30s，取10μl+90μlddH2O，离心30s，12000r，-20℃低温保存。

3、目的基因的合成：按照OverlapPCR通过3轮PCR扩增出完整的目的基因序列，第一轮PCR用引物FP1和RP1进行扩增，进行18个循环，第二轮PCR用引物FP2和RP2，进行25个循环，模板为第一轮产物，第三轮用引物FP3和RP3进行扩增，进行25个循环，模板为第二轮产物。

PCR反应条件：

第一轮循环18cycles，第二轮和第三轮循环25cycles(视具体情况而定)

4、PCR产物鉴定(1％琼脂糖凝胶电泳)：

(1)制胶:托盘天平称取0.2g琼脂糖于锥形瓶，加入20ml 0.5xTBE溶解，数分钟后置微波炉中将琼脂糖融化均匀。加热过程中要不时摇动使黏附于瓶壁上的琼脂颗粒进入溶液，加热时应盖上封口膜以减少水分蒸发；

(2)胶板的制备：将胶槽置于胶板上，插上样品梳子，梳齿下缘应于胶槽底面保持1mm左右间隙，待胶溶液冷却至45℃左右时加入0.5ug/mlEB1ul摇匀。轻轻倒入制胶板上，除掉气泡。待胶冷却后垂直拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加入0.5XTBE使电泳缓冲液面刚好高出胶面；

(3)加样：在点样板或薄膜上将DNA样品/DNA Marker与上样缓冲液(按

比例3:1混合均匀，用10μL微量移液器将样品与Marker分别加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个枪头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量)；

(4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，恒压90V。当溴酚蓝移动到距离

胶板下沿约3cm处时，停止电泳；

(5)观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观看DNA

存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，于凝胶成像系统中拍照并保存。

5、PCR产物纯化：操作方法参照DNA纯化试剂盒。

6、质粒提取：

(1)取2ml过夜培养的菌液(170r，37℃，12h)，加入离心管，12000r离心2min,去上清；

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl buffer P1,充分混匀，使菌体悬浮(用移液枪吹打混匀)；

(3)向离心管中加入250μl buffer P2，上下颠倒6次，使菌体破裂，变得清凉粘稠；

(4)向离心管中加入350μl buffer N3，温和的颠倒6次，出现白色絮状沉淀，12000r，离心10min；

(5)4中所得上清转入吸附柱，12000r离心2min，倒掉废液；

(6)向吸附柱中加入750μl buffer PW，12000r离心3min，倒掉废液；

(7)空柱离心，12000r 2min，倒掉废液，置于室温15分钟晾干；

(8)将吸附柱置于一新的离心管中，向吸附柱中加入50μl buffer EB，室温放置2min，12000r离心2min，吸附柱弃于废液缸，离心管做好标记，-20℃低温保存。

7、限制性内切酶消化质粒和PCR产物：

双酶切体系：双酶切体系总共40ul，37℃水浴锅温育14h。

8、酶切产物的纯化：操作方法参照DNA纯化试剂盒。

9、酶切产物的连接：

双酶切后的DNA片段与载体的连接，体系如下：

10、连接产物的转化：

(1)将10μl连接产物加入到30μl的感受态细胞中(Trans5α)冰浴30min(感受态细胞应提前放置在冰上5min)；

(2)将混合物置于42℃热激90s，冰上冷却5min；

(3)加入500μl无抗LB培养基，180r/min，37℃培养45min，3700r离心5min去上清，留适量上清吹散细胞沉淀；

(4)将吹散的菌液涂布到100μg/ml的抗kanaLB平板，37℃恒温培养箱培养13h。

11、阳性克隆子的鉴定

(1)挑选平板上的单菌落放入500ul含有100μg/ml的卡那LB液体培养基，每个平板挑取5个单克隆子，做好标记；

(2)放置在恒温摇床，37℃，240r培养6h；

(3)取1μl菌液作PCR模板，做菌落PCR；

(4)用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(阴性对照为不加模板、阳性对照是已经成功的质粒)；

(5)阳性菌液加入500ul30％甘油，使甘油的终浓度为15％，取200μl送去测序，剩余的-20℃低温保存；

(6)将测序成功的20ul菌液加入10ml抗Kana LB培养基中，在恒温摇床培养37℃，170r，12h，然后提取质粒-20℃保存。

12、结果：TSM1经加工修饰后基因的长度为210bp，我们利用合成的六条TSM1引物，根据OverlapPCR原理，使用PCR仪器经过三轮PCR合成TSM1的目的序列，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定TSM1的PCR产物(图3)，我们发现DNA条带在100-200bp之间，与TSM1的基因序列长度吻合。将TSM1目的片段与pET-28a(+)载体经酶切，酶连，转化，挑选阳性克隆子，菌落PCR等一系列实验，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定TSM1的菌落PCR产物(图4)，我们发现DNA条带在100-200bp之间，与TSM1的基因序列长度吻合，最终提取重组质粒，保存。

实施例3：TSM重组蛋白的表达和纯化

1、目的片段转化到表达菌：

(1)取2μl中提取的质粒加入E.coli/Transetta(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却5min，加入500μl LB液体培养基，放恒温摇床37℃，180r，培养45min，然后3700r离心5min，去上清，留适量上清吹散细胞沉淀涂于含有100ug/ml Kana的LB培养基平板上，37℃恒温培养13h；

(2)挑取平板上单菌落，加入抗Kana LB培养基500μl，放恒温摇37℃，180r，培养10.5h，得到表达菌，加入500μl 30％甘油混匀-20℃低温保存。

2、融合蛋白的表达：

(1)取表达菌100μl加入装有100ml抗Kana LB液体培养液过夜扩增，放恒温摇床37℃，150r，培养10-12h(保证种子浓度足够)；

(2)将扩增的表达菌50ml接种到1000ml抗Kana LBLB培养基中，放置恒温培养箱37℃，210r，培养至OD600＝0.6-0.8时(大约需要1h50min)，加入1ml IPTG进行诱导表达，37℃，210r培养4h，用高速落地低温离心机，6000r，4℃，6min离心收集菌体；

(3)收集菌体加入25ml预冷的PBS，充分悬浮超声破碎细胞：200HZ，工

作3sec/次，间歇8sec/次，20min至菌液颜色变深，高速落地低温离心机，12000r，4℃，离心20min，弃去上清得到沉淀即为包涵体。

(4)包涵体的洗涤：用10ml预冷的PBST溶液重悬包涵体沉淀，于冰上冰浴20min，5000g离心15min，弃上清；重复上述步骤，此时得到的沉淀即为纯度较高的包涵体沉淀；

(5)包涵体的变性：取5ml变性液(每毫升变性液加入0.03g还原型谷胱甘肽)加入包涵体沉淀充分悬浮，于室温静止2h；

(6)包涵体的复性：将变性的包涵体12000rpm离心15min，弃沉淀，取上清；

(7)按变性液和复性液体积比为1:100的比例来配置复性液。将烧杯中复性液，置于磁力搅拌器上，边搅拌边慢慢滴加变性之后的蛋白液。滴加过程中观察是否有白色絮状沉淀产生，若有，则停止滴加蛋白液。然后将复性液置于16℃培养箱中静止复性16h；

(8)将复性的蛋白液用高速落地低温离心机12000r，4℃离心20min，取上

用超滤器超滤浓缩，再用截留分子量为5KD的超滤管脱盐浓缩，用高速落地低温离心机3500g，4℃离心50min，其间用蒸馏水洗涤1～2次，终体积为每升菌液浓缩至1～3ml(<＝5ml，HPLC上样一次最多5ml)蛋白溶液，按1ml/EP管分装。

3、HPLC分离：

取浓缩后的蛋白液12000rpm离心20min后，取上清，用RP-HPLC分离进行纯化。过HPLC的上样体积为4ml，流速4ml/min。RP-HPLC的流动相：溶液B为0.1％TFA，D溶液为0.1％的TFA+90％的乙腈，固定相C18反相柱。RP-HPLC的洗脱梯度为：60min的线性梯度，初始时：B为95％、D为5％，结束时：B为5％、D为95％；测量波长选择230nm。

4、蛋白质冻干：

用RP-HPLC纯化获得的蛋白在-80℃冰箱中预冻8h后经真空冻存干燥后，用超纯水重新溶解，分装，剩余的适量蛋白进行质谱法测量其实际分子量，经BCA定量试剂盒准确定量蛋白浓度，且再次用冷冻干燥机冻干，蛋白干粉-80℃冰箱中保存。

5、结果：pET-28a-TSM1重组质粒转化入表达菌E.coli/Transetta(DE3)，经扩增，IPTG诱导，收集菌体，超声破碎，包涵体洗涤，变性，复性及浓缩，再经HPLC纯化，收集蛋白，17min得到主峰图(图5)，冻干后的TSM1蛋白经BCA定量确定其准确质量(表1)，再次冻干，TSM1蛋白干粉-80摄氏度保存，待做抗补体功能研究。

表1.TSM1蛋白BCA定量

BCA定量浓度(ug/ul)	0.3581
		TSM1总量(mg)	1.6185

实施例4：TSM1重组蛋白的抗补体活性检测

1、实验方法：

(1)巴比妥缓冲液：取巴比妥0.2875g，溶于40ml热水中，玻璃棒搅拌至溶解，再加入NaCl 4.25g，MgCl2.6H2O 0.084，CaCl2 0.014g，巴比妥钠0.1g，定容至100ml配制出5倍浓缩的巴比妥缓冲液(5×BBS)。使用时，将5ml此溶液加入20ml超纯水混合，配制成1×巴比妥缓冲液，现配现用；

(2)2％的绵羊红细胞(2％SRBC)：取300ul绵羊血于1.5ml管中，加入1×巴比妥缓冲液1ml，混匀，低温离心机800r，离心10min，重复洗涤三次(洗涤至上清是澄黄清色)。取20ul绵羊红细胞加入980ul1×BBS配制成2％的绵羊红细胞；

(3)豚鼠血清的制备：取3只豚鼠，分别是雌性(586g)、雌性(530g)、雄性(660g)，用水合氯醛麻醉(4ul/g)，用采血针心脏采血，室温静置1h，2000r离心10min，分别取上清；

(4)绵羊红细胞(SRBC)的洗涤：取300ul绵羊全血于1.5mlEP管中，加入1ml生理盐水，吹打混匀，低温离心机2000r离心10min，重复洗涤三次(洗涤至上清是澄黄清色)，最后尽量把上清吸干，留下压积的红细胞；

(5)血清的吸附：按照VSRBC:V血清＝1：10的比例，把绵羊红细胞分别加入到豚鼠的血清中进行吸附，冰上冰浴30min，低温离心机2000r，4℃，离心10min，然后将吸附后的3只豚鼠血清进行混合，分管-80℃低温保存；

(6)1：2000溶血素：取溶血素适量，加入BBS，配制成1：2000溶血素；

(7)补体经典溶血系统的建立：取补体(豚鼠血清)0.1ml，加入BBS配制成1:5溶液，用BBS对倍稀释成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640溶液。取2％SRBC，1：2000溶血素0.1ml，加入0.3ml BBS中，各浓度补体0.1ml，混匀，37℃水浴30分钟之后低温高速离心机，在5000r，4℃条件离心10min。分别每管取上清0.2ml于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml超纯水中)；

(8)多肽经典途径抗补体活性测定：临界浓度的补体与多肽混匀，于37℃预水浴10min后，然后各加入100ul溶血素、100ul 2％绵羊红细胞(2％SRBC)、200ul BBS。将每管37℃水浴30min后放入台式低温高速离心机，5000r，4℃条件下离心10min后分别每管取上清200ul于96孔板，用酶标仪在405nm下测定吸光度。实验同时设定阳性对照组(100ul溶血素、100ul2％SRBC、100ul 10mg/ml肝素钠、200ul BBS)，补体组(100ul溶血素、100ul 2％SRBC、300ul BBS)，全溶血组(100ul 2％绵羊红细胞、500ul超纯水)如表2。

表2补体经典途径溶血体系各成分的体积(ul)

2、统计分析：

统计学处理所有实验重复至少3次，实验结果用平均值±标准偏差表示(Mean±SD)。统计学处理所有数据应用SPSS 2.0软件进行统计学分析，均数比较采用t检验。以p<0.05为差别有统计学意义。

3、结果：

(1)经典途径补体效价确定

已经制备三只豚鼠的混合血清(补体)，用1×BBS分别稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，将100ul各个稀释倍数的血清，100ul 2％SRBC与100ul1：2000稀释倍数溶血素及200ul 1×BBS组成补体经典途径的溶血体系，评价其效价。以豚鼠血清(补体)稀释浓度为X轴，以溶血百分率为Y轴作图(图6)。

在豚鼠血清(补体)稀释浓度为1:5-1:40时，基本达到全溶血，在补体稀释度为1:80时，溶血率基本达到50％，在补体稀释度为1:80时，补体量合适，其灵敏度更高，为提高TSM系列多肽对经典途径抗体功能的灵敏度，因此经典途径抗补体筛选实验选择1:80稀释的豚鼠血清(补体)。

(3)TSM1蛋白在经典途径的抗补体功能验证

设置TSM1蛋白浓度梯度为0uM，1.25uM，2.5uM，5uM，6.25uM，7.5uM，10uM，100ul各浓度TSM1蛋白和100ul血清在37℃温育10min，加入补体溶血系统，以溶血抑制率评价TSM1蛋白经典途径抗补体功能，并做出TSM1蛋白经典途径抗补体的浓度依赖性曲线(图7)。

进一步做了TSM1对补体浓度依赖实验，TSM1在体系终浓度为10uM，分别设置补体的浓度为1：40，1：60，1：80，分别加入补体溶血体系中，用酶标仪在405nm的波长下测定溶血率(如图8)。实验表明，TSM1与体系中的补体结合发挥作用，补体系统是TSM1多肽的作用靶点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> TSM1多肽及其在制备抗补体药物中的应用

<130> CP11802121C

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 63

<212> PRT

<213> TSM1多肽的氨基酸序列

<400> 1

Lys Met Ser Tyr Ile Asn Arg Cys Asn Leu Pro Ile Ser Ser Gly Gln

1 5 10 15

Cys Arg Gly Tyr Phe Leu Arg Tyr Gly Tyr Asp Ser Glu Ala Asp Glu

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Val Tyr Ser Gly Cys Arg Gly Asn Arg Asn Asn Phe

35 40 45

Phe Thr Tyr Asn Glu Cys Met Asn Arg Cys Tyr Met Arg Phe Lys

50 55 60

<210> 2

<211> 189

<212> DNA

<213> TSM1多肽的密码子优化的核酸序列

<400> 2

aaaatgagct atattaaccg ctgcaacctg ccgattagca gcggccagtg ccgcggctat 60

tttctgcgct atggctatga tagcgaagcg gatgaatgcc gccgctttgt gtatagcggc 120

tgccgcggca accgcaacaa cttttttacc tataacgaat gcatgaaccg ctgctatatg 180

cgctttaaa 189

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> TSM1-1（FP3）

<400> 3

ctgcatatga aaatgagcta tattaaccgc tgcaacctgc cgattagc 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> tsm1-2（fp2）

<400> 4

aacctgccga ttagcagcgg ccagtgccgc ggctattttc tgcgctat 48

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> TSM1-3（FP1）

<400> 5

tattttctgc gctatggcta tgatagcgaa gcggatgaat gccgccgc 48

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> TSM1-4（RP1）

<400> 6

gttgcggttg ccgcggcagc cgctatacac aaagcggcgg cattcatc 48

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> TSM1-5（RP2）

<400> 7

gcggttcatg cattcgttat aggtaaaaaa gttgttgcgg ttgccgcg 48

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> TSM1-6（RP3）

<400> 8

gtgctcgagt catttaaagc gcatatagca gcggttcatg cattc 45

Claims (9)

1.一种多肽TSM1，其特征在于，所述多肽包含SEO ID NO.1所示氨基酸序列。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述多肽TSM1。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEO ID NO.2所示核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2或3所述核酸分子。

5.一种非人细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述核酸分子、或权利要求4所述载体。

6.一组引物，其特征在于，引物组包含3对引物，分别为：

SEO ID NO.5所示的TSM1-3FP1和SEO ID NO.6所示的TSM1-4RP1；

SEO ID NO.4所示的TSM1-2FP2和SEO ID NO.7所示的TSM1-5RP2；

SEO ID NO.3所示的TSM1-1FP3和SEO ID NO.8所示的TSM1-6RP3。

7.权利要求6所述引物在扩增多肽TSM1的编码核酸分子中的用途。

8.权利要求1所述多肽、和/或权利要求2或3所述的核酸分子在制备抗补体制剂中的用途。

9.根据权利要求9所述用途，其特征在于，所述制剂为试剂盒、药物或药物组合物，优选药物或药物组合物。