CN101481412B - 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因与应用。该多肽，是包含序列表中序列2的第39-51位氨基酸残基的多肽。本发明的多肽能够通过特异黏附肿瘤细胞表面异常表达的整合素α_vβ₃和α_vβ₅，从而抑制肿瘤血管生成、肿瘤转移以及实体肿瘤的生长。该多肽的急性毒理学试验最大给药量没有表现出任何毒性作用，在其有效抑制肿瘤血管生成、肿瘤转移以及实体肿瘤的生长剂量下，无明显细胞毒作用，对正常血管内皮细胞及血管再生无不良影响。

Description

一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因与应用。

背景技术

肿瘤浸润和转移是癌症致死的主要原因。癌细胞脱离原发部位突破基底膜，并将基底膜与其它组织分开，癌细胞穿透基底膜周围血管，经内皮细胞层进入血液，最后达到毛细管，黏附并再次穿透毛细管壁，形成一个新的转移灶。肿瘤转移和入侵需要细胞和细胞外基质之间的相互黏附作用。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞可引起血管内皮细胞收缩，露出基底膜，部分基底膜蛋白结合在细胞表面的特定受体上，从而使肿瘤细胞有效地锚定到细胞外基质蛋白上。

肿瘤细胞表面与细胞外基质蛋白结合的受体主要由整合素组成，整合素在肿瘤细胞侵袭和转移中发挥重要作用。它是细胞表面的一类蛋白质，介导细胞之间以及细胞与其周围基质间的相互作用，现已发现许多类型的整合素。整合素是异源二聚体，由1个α亚基和1个β亚基组成。整合素作为受体复合物具有横跨细胞膜的结构，一端与细胞骨架连接，一端与细胞外基质连接，为细胞营造一个有机联系的环境。纤维蛋白原、玻粘连蛋白和层粘连蛋白这些参与细胞粘附、转移或整合作用的蛋白分子，都具有共同的或特征的氨基酸序列。整合素是细胞外基质蛋白(如纤连蛋白、纤维蛋白原、玻粘连蛋白、层粘连蛋白和胶原)的受体，这些基质蛋白通过其亚基上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD序列)与整合素结合。最初认为β亚基主要参与细胞外基质粘连，目前又发现整合素的其他功能，如β₂调解细胞-细胞粘附连接，β₃亚基参与血小板聚集并作为玻粘连蛋白受体，而β₃亚基与玻粘连蛋白受体的结合被认为是肿瘤侵袭和恶变的基础。

整合素α_vβ₃是恶性肿瘤细胞表面的一个特殊标记，这个粘附受体在恶性肿瘤生长过程中起着至关重要的作用，整合素α_vβ₃基因的表达和由此产生的粘附现象直接参与恶性肿瘤扩散。

血管生成是从原有的血管形成新的血管的生物过程，实体肿瘤生长、伤口愈合和炎症恢复过程中都有新生血管生成，这一过程中，由平滑肌细胞和血管内皮细胞产生的细胞粘附分子起着关键作用。血管生成调控失衡是肿瘤新生血管生成的主要动因，已发现两个依赖细胞因子的血管生成途径，分别是α_vβ₃和α_vβ₅途径。在肿瘤血管生成过程中，碱性成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子和肿瘤碎片能诱导α_vβ₃和α_vβ₅表达，α_vβ₃和α_vβ₅刺激血管生长和分化。

发明内容

本发明的目的是一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因。

本发明所提供的具有抗肿瘤作用的多肽，来源于乌苏里蝮蛇(Gloydiusussurinsis)，是包含序列表中序列2的第39-51位氨基酸残基的多肽。

上述多肽具体可为如下1)或2)的多肽：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗肿瘤作用的由1)衍生的多肽。

为了使1)中的多肽便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中多肽的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述具有抗肿瘤作用的多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。

具有抗肿瘤作用的多肽的编码基因具体可为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述具有抗肿瘤作用的多肽的DNA分子；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述具有抗肿瘤作用的多肽的DNA分子。

所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由195个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-195位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2。

扩增上述具有抗肿瘤作用的多肽编码基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述具有抗肿瘤作用的多肽编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种具有抗肿瘤作用的药物。

本发明所提供的具有抗肿瘤作用的药物，它的活性成分是上述任一种多肽。

上述多肽可用于制备具有抗肿瘤作用的药物。

本发明从乌苏里蝮蛇(Gloydius ussurinsis)毒腺中分离提取总RNA，利用RT-PCR方法反转录成cDNA，设计引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物转入表达载体表达得到多肽进行抗肿瘤作用实验。结果表明，该多肽能够通过特异黏附肿瘤细胞表面异常表达的整合素α_vβ₃和α_vβ₅，从而抑制肿瘤血管生成、肿瘤转移以及实体肿瘤的生长。该多肽的急性毒理学试验最大给药量没有表现出任何毒性作用，在其有效抑制肿瘤血管生成、肿瘤转移以及实体肿瘤的生长剂量下，无明显细胞毒作用，对正常血管内皮细胞及血管再生无不良影响。

附图说明

图1为第一次葡聚糖凝胶G-50凝胶过滤色谱图

图2为第二次葡聚糖凝胶G-50凝胶过滤色谱图

图3为以整合素α_vβ₃为配基的亲和色谱图

图4为葡聚糖凝胶G-25凝胶过滤色谱图

图5为多肽的分子量测定

图6为多肽的高效液相色谱图

图7为家兔的四头肌肌肉切片的染色结果

图8为多肽作用于HeLa细胞24h后的抑制曲线

图9为多肽作用于HeLa细胞48h后，细胞形态的改变(250×)

图10为多肽作用于SMMC-7721细胞24h后的抑制曲线

图11为多肽作用于SMMC-7721细胞48h后，细胞形态的改变(250×)

图12为多肽作用于SGC-7901细胞24h后的抑制曲线

图13为多肽作用于SGC-7901细胞48h后，细胞形态的改变(250×)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的多肽做进一步说明，但并不限于实施例中的多肽。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因的获得

一、具有抗癌作用的多肽的编码基因的获得

1、制备毒腺mRNA

(1)剥取毒腺

取乌苏里蝮蛇(Gloydius ussurinsis)(购自吉林省辉南椅山蛇场)的蛇头，剥离蛇皮，沿着上颌的管状毒牙，寻找与之相连的毒腺管，沿毒腺管，找到毒腺并确定位置；按照相同的方法找到另一侧的毒腺，剥离毒腺，称重，放入预先准备好的液氮中。

(2)总RNA的制备

实验过程中，所有玻璃器皿、研钵和塑料制品均用0.1％体积百分含量的DEPC水溶液浸泡；所有试剂(除含有氨基外)均加入DEPC，使DEPC在溶液中的终浓度为0.1％，浸泡24小时后，高压处理15分钟；电泳槽用3％体积百分含量的H₂O₂浸泡20分钟，DEPC水溶液冲洗。

将研钵倒满液氮，放入上述步骤(1)剥离的毒腺，将毒腺研磨至适宜颗粒；在冰浴上放好小烧杯，将研碎的毒腺组织和少量液氮转入小烧杯中，按照每1g毒腺组织加入10ml 75℃预热的Trizol变性剂，混匀，用注射器反复吹打；然后再加入等体积的苯酚和1/5体积的氯仿，混匀，冰上放置5分钟，再混匀，8000rpm离心10分钟。

取上清液，移至另一离心管中，加入1/10体积pH5.2的3mol/L乙酸钠和等体积预冷的异丙醇，混匀，在液氮中放置15分钟，10000rpm离心10分钟，取核酸沉淀，室温晾干。

按照每1g核酸沉淀加入10ml Trizol溶解核酸沉淀，再加入等体积苯酚和1/5体积的氯仿，混匀，8000rpm离心10分钟；取上清液，用等体积的由氯仿和异戊醇组成的混合溶液(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)反复抽提两次。

取上清液，加入3倍体积pH7.0的4mol/L乙酸钠，-20℃放置1小时，0℃条件下5000rpm离心20分钟，得到RNA沉淀。相同条件将RNA沉淀洗涤一次。用70％体积百分含量的乙醇将RNA沉淀洗涤三次，室温晾干。

(3)采用PolyATtract mRNA Isolation Systems制备mRNA

在无RNA酶的试管内加入0.125ml的20×SSC和4.75ml无RNA酶的无菌水制成0.5×SSC；在无RNA酶的试管内加入50μl的20×SSC和9.95ml无RNA酶的无菌水制成0.1×SSC。

在无菌、无RNA酶的试管中加入5mg上述步骤(2)获得的总RNA，用DEPC水补足体积至2.43ml，65℃加热10分钟；向试管中加入10μl的Biotinlated-Oligo(dT)探针和60μl的20×SSC，轻轻混匀，室温放置30分钟，得到退火反应物。

轻弹含有Streptavidin-Paramagnetic磁珠(SA-PMPs)的离心管，使磁珠彻底分散，把离心管放在磁铁上30s，使磁珠沉于管底，仔细移去上清液。

用1.5ml的0.5×SSC洗涤SA-PMPs三次，每次都用磁铁将磁珠吸于离心管底，用0.5ml的0.5×SSC悬浮洗过的磁珠。

将上述制备的退火反应物加入制备的悬浮磁珠中，室温放置10分钟，每隔1-2分钟轻轻反转离心管；用磁铁吸附磁珠，移去上清夜，勿使沉淀悬起；将磁珠用1.5ml的0.1×SSC洗涤4次，轻弹管底使磁珠悬起，用磁铁吸附磁珠，移去上清液。

加入1.0ml无RNA的无菌水，轻弹离心管使磁珠悬起，用磁铁吸附磁珠，移取上清液于另一个无菌、无RNA酶的试管中。

加入1/10体积pH5.2的3M乙酸钠和等体积的异丙醇，-20℃过夜；12000g离心10分钟，取沉淀，用70％体积百分含量的乙醇洗涤沉淀两次，将得到的沉淀溶于无RNA酶的水中，得到乌苏里蝮蛇毒腺的mRNA。

2、乌苏里蝮蛇毒腺cDNA的获得

(1)cDNA第一链的合成

取灭菌的微量离心管，置于冰上，依次加入：

poly(A)RNA(100ng/μl)           10μl

SMART寡核苷酸(1μg/μl)         2.0μl

CDS/3’PCR引物(1μg/μl)        2.0μl，

将上述物质混匀，短暂离心后收集液滴至管底，72℃温浴2分钟，再冰浴2分钟，然后依次加入：

Tris-HCl(1mol/L，pH8.3)        2.5μl

第一链缓冲液                   5.0μl

MgCl₂(250mmol/L)               2.0μl

dNTP混合物(各5mmol/L)          10.0μl

DTT(0.1mol/L)                  2.0μl

步骤1获得的mRNA                25.0μl

Superscript II 200u/μl        2.0μl，

在上述混合物中加水至总体积为50μl，离心混匀，42℃反应2小时。

上述SMART寡核苷酸的序列为5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGAAGGG-3’；

CDS/3’PCR引物的序列为5’-ACGTGCGGCCGCGGATCC(dT)₃₀N_-1N-3’，其中，N为A、G、C或T，N_-1为A、G、C或T。

(2)LD-PCR扩增cDNA双链

冰浴上在0.2ml的薄壁管中依次加入：

10×Klen Taq PCR Buffer                  10μl

50×dNTP(10mmol/L)                       2μl

5’-PCR引物(10μmol/L)                   2μl

CDS/3’PCR引物(10μmol/L)                2μl

上述步骤(1)获得的第一链cDNA              2μl

Mili-Q水                                 80μl

50×Advantage Klen Taq Polymerase Mix    2μl，

其中5’-PCR引物的序列为5’-TACGGCGGCCGCCGAGAAGACGACAGAA-3’；

CDS/3’PCR引物的序列为5’-ACGTGCGGCCGCGGATCC(dT)₃₀N_-1N-3’，其中，N为A、G、C或T，N_-1为A、G、C或T。

将上述物质混匀后，短暂离心，收集液滴至管底，进行PCR扩增。具体的PCR反应条件为：先95℃预变性1min；然后95℃15sec，68℃5min，共22个循环。

(3)限制性内切酶酶切

在上述步骤(2)获得的PCR产物中加入10μl NE Buffer(New England Biolabs)、1μl BSA(10mg/ml)和10μl(10U/μl)NotI，加水补足体积至100μl，50℃酶切2小时。

将酶切产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化。在得到的纯化后的PCR产物中加入1μl 1％质量百分含量二甲苯青做指示剂，置冰上待用。

取1ml移液管作为Sepharose CL-4B柱(27×0.3cm)，用含0.1mol/L NaCl的TE缓冲液彻底冲洗，填充硅化好的棉花，将用含0.1mol/L NaCl的TE缓冲液平衡的Sepharose CL-4B装柱，用6倍体积的含0.1mol/L NaCl的TE缓冲液平衡柱。关闭流出口，吸取柱顶缓冲液，将50μl上述酶切后的cDNA上样，放开流出口，使样品进入凝胶，洗脱收集流出液，进行电泳检测。将较亮的条带所在离心管中的液体用苯酚/氯仿进行抽提，乙醇沉淀，将沉淀溶于50μl TE缓冲液中，得到乌苏里蝮蛇毒腺的cDNA。

二、具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因的获得

1、从cDNA PCR扩增具有抗肿瘤作用的多肽的编码基因

以上述步骤一获得的cDNA为模板，以5′-taggatccgactctcctgcaaatccg-3′和5′-atgaattcggcatggaagggatttct-3′为引物，进行PCR扩增；对上述PCR扩增产物进行测序，测序结果表明，其脱氧核糖核酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、在大肠杆菌BL21中的表达

将上述步骤1获得的PCR产物用BamHI和EcoRI(购自大连TAKARA生物科技有限公司)进行双酶切，酶切产物插入质粒pUC18的多克隆位点中，将得到的重组表达载体转入大肠杆菌DH5a进行扩增；提取质粒，BamHI和EcoRI双酶切后进行电泳鉴定，切胶回收200bp左右的目的DNA片段，插入质粒pGEX2-T(购自联星生物科技有限公司)的多克隆位点中，将得到的重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导多肽的表达。

3、在毕赤酵母菌中的表达

将上述步骤1获得的PCR产物用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切产物插入质粒pPIC9K(购自联星生物科技有限公司)的多克隆位点中，将得到的重组表达载体转入毕赤酵母菌GS115(购自联星生物科技有限公司)进行扩增，在组氨酸缺乏的条件下，利用不同浓度的G418进行筛选，得到对G418具有抗性的菌株，甲醇诱导多肽的表达。

4、多肽的鉴定

将上述步骤3获得的多肽用截留分子量分别为30,000Dal和3000Dal的超滤膜过滤除杂质、浓缩，采用SephadexG-50柱进行第一次凝胶过滤层析对获得的多肽进行纯化。上样后控制流速，测定OD₂₈₀，绘制洗脱曲线，结果如图1所示。收取图1中目标蛋白所在的峰(峰3)，将该峰所含的溶液进行浓缩，再进行一次SephadexG-50凝胶过滤，结果如图2所示。收集图2中目标蛋白所在的峰(峰II)，然后利用整合素α_vβ₃(购自美国Sigma化学试剂公司)为配基用环氧氯丙烷为交联剂，交联到Sepharose 4B FF(购自美国GE公司)进行亲和层析，结果如图3所示。收集洗脱液，利用Sephadex G-25层析柱进行脱盐处理，结果如图4所示。

上述获得的多肽经过以上层析技术纯化后采用Tricine-SDS-PAGE测定其分子量，结果如图5所示。图5中，泳道1为上述获得的多肽，泳道2为蛋白质分子量标准。根据蛋白质分子量标准和多肽的R_f值，通过直线回归方程计算出上述获得的多肽的分子量约为7000Da。

利用高效液相色谱鉴定上述获得的多肽的纯度，结果如图6所示。结果表明，上述获得的多肽的纯度达到了95.8％。

实施例2、多肽的急性毒性试验

1、小鼠急性毒性实验预试验

将上述实施例1获得的多肽用生理盐水进行溶解，使其浓度达到300mg/ml。对10只昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)尾静脉注射上述浓度为300mg/ml的多肽，注射剂量为0.5ml/20g体重，观察小鼠的存活情况。结果表明，14天之内，小鼠陆续死亡，故进行多肽的LD₅₀测定试验。

2、小鼠尾静脉注射给药急性毒性实验

将20只昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)禁食不禁水16小时后，按0.5ml/20g体重/次的剂量分别尾静脉注射浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml、800mg/ml或1000mg/ml的上述实施例1获得的多肽，每隔2.5小时注射1次，共注射4次。按体重计算，给药后即刻并逐日观察小鼠14天，对死亡的小鼠进行尸检，测定LD₅₀值。实验设三次重复，结果表明，LD₅₀平均为1600mg/kg体重。

3、小鼠腹腔注射给药急性毒性实验

将20只昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)禁食不禁水16小时后，按0.5ml/20g体重/次的剂量分别腹腔注射浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml、800mg/ml或1000mg/ml的上述实施例1获得的多肽，每隔2.5小时注射1次，共注射4次。按体重计算，给药后即刻并逐日观察小鼠14天，对死亡小鼠进行尸检，测定LD₅₀值。实验设三次重复，结果表明，LD₅₀平均为1600mg/kg体重。

实施例3、多肽的溶血试验

将体重约为2.3kg的健康家兔背位固定于兔台上，处死后分离颈总动脉插管取血于离心管中，用玻璃棒轻轻搅去纤维蛋白，加生理盐水摇匀，离心后倾去上清液，如此反复三次得到红血球，将红血球稀释成2％的红细胞悬液备用。

取7只试管，编号并按表2所示加入各种溶液，轻轻摇匀，置于37℃水浴中，分别观察并记录加入溶液后0.5、1、2、3、4小时的结果，观察有无溶血和红细胞凝集现象，室温下放置24小时后继续观察有无溶血及红细胞凝集现象。

表2多肽的溶血试验

试管编号	1	2	3	4	5	6	7
								制备的多肽(ml，1mg/ml)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	-	-
0.9％氯化钠注射液(ml)	2.4	2.3	2.2	2.1	2.0	2.5	-
								蒸馏水(ml)	-	-	-	-	-	-	2.5
2％红细胞悬液(ml)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
								结果
0.5h	-	-	-	-	-	-	+
								1h	-	-	-	-	-	-	+
2h	-	-	-	-	-	-	+
								3h	-	-	-	-	-	-	+
4h	-	-	-	-	-	-	+

表2中，“-”表示无溶血和红细胞凝集，“+”表示有溶血。

实验设三次重复，结果表明，上述实施例1获得的多肽在37℃水浴中观察4小时后，除第7管呈明显粉红色溶血，无红细胞下沉外，其它试管在0.5、1、2、3、4小时均未出现溶血和红细胞凝集现象，可见红细胞下沉，摇动试管后，下沉的红细胞上浮，未见红细胞凝集。室温观察24小时亦无溶血和红细胞凝集现象。

实施例4、多肽的过敏性试验

取健康豚鼠18只(体重260～289g，雌雄各半)，随机分为3组，即阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)、阳性对照组(1％鸡蛋清)和抗癌肽组，每组6只，分别隔日腹腔注射0.9％质量百分含量的氯化钠注射液、1％体积百分含量的鸡蛋清和上述实施例1获得的浓度为1mg/ml的多肽各0.5ml，共注射3次。再将每组6只豚鼠分为2组，每组3只，一组于第一次注射14天后，一组于第一次注射21天后分别由股静脉注射0.9％质量百分含量的氯化钠注射液、1％体积百分含量的鸡蛋清和上述实施例1获得的浓度为1mg/ml的多肽1ml，观察注射后30分钟内有无过敏现象。

实验设三次重复，结果表明，第一次注射第14天及第21天后再次股静脉注射后，阴性对照组及抗癌肽组均未出现过敏症状，动物活动如常，无一死亡；而阳性对照组的豚鼠出现不安宁、连续干咳、用爪抓鼻、竖毛、四肢发软和呼吸困难等症状。阳性对照组于首次给药后14天由股静脉给药攻击后，3只豚鼠出现痉挛死亡；阳性对照组首次给药后21天由股静脉给药攻击后，2只豚鼠出现痉挛死亡。

以上结果表明，上述实施例1获得的多肽过敏反应阴性。

实施例5、多肽的肌肉、血管刺激性试验

1、多肽肌肉刺激性试验

健康家兔2只，体重2.3～2.5kg，饲养观察1日无异常后，分为2组：多肽组及空白对照组(生理盐水)。在家兔左右两腿股四头肌以无菌操作法分别注射上述实施例1获得的浓度为1mg/ml的多肽1ml或生理盐水，注射24小时后将动物处死，解剖取出股四头肌，沿注射部位纵向切开，观察注射部位有无有局部刺激反应，并按下表换算成相应的反应级数。

反应级数	刺激反应
		0	无明显变化
1	轻度充血，范围在0.5×1.0cm以下
		2	中度充血，范围在0.5×1.0cm以下
3	重度充血，伴有肌肉变性
		4	出现坏死，有褐色变性
5	出现广泛坏死

实验设三次重复，结果如表3所示。

表3肉眼观察注射后局部刺激反应

将上述各组家兔的四头肌肌肉常规固定后切片染色，进行镜下病理观察。结果如图7所示，其中，A为对照组，B为给药组。与对照组相比，注射上述实施例1获得的多肽后，家兔的四头肌肌肉无明显变化，表明上述实施例1获得的多肽无明显局部刺激性。

2、多肽的血管刺激性试验

取健康家兔4只(体重2.3～2.5kg，雌雄各半)。按体重及性别分为0.9％氯化钠注射液对照组和多肽组，每组2只。将上述实施例1获得的多肽按照10ml/kg体重的剂量于家兔左耳耳缘按1mg/ml的给药浓度进行静脉滴注，滴注速度为1ml/min，每日滴注1次，连续滴注7日。对照组按照相同方法静脉滴注0.9％质量百分含量的氯化钠注射液。除每次给药时及给药后观察给药局部表现外，于末次静脉滴注后剪下给药侧耳廓，常规固定后在距静脉滴注入针近心端1cm处，每隔2cm切取0.5cm宽的标本，切片染色，进行镜下病理观察。

实验设三次重复，结果表明，肉眼观察未见兔耳廓血管扩张，无红肿；镜下病理检查，对照组及药物组均未见炎细胞浸润，未见明显改变。

实施例6、多肽对体外培养的人肿瘤细胞株生长的抑制作用

将人胃癌细胞SGC-7901(购自上海迪奥生物科技有限公司)、人肝癌细胞SMMC-7721(购自上海迪奥生物科技有限公司)和人宫颈癌细胞Hela(购自上海迪奥生物科技有限公司)分别在37℃，5％CO2孵箱内培养，于含10％体积百分含量小牛血清的RPMI 1640(购自Hyclone生物科技有限公司)细胞培养液中贴壁生长，以0.25％胰酶消化传代。取对数生长期的上述各细胞(人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞SMMC-7721和人宫颈癌细胞Hela)分别以2.5×10⁴/孔的量接种于96孔板上，每孔100μl。培养6小时待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0.18μg/ml、0.36μg/ml、0.54μg/ml、0.72μg/ml、0.90μg/ml的用培养液溶解的上述实施例1制备的多肽，每一浓度重复8个孔，每孔100μl，对照组加同量的培养液，调零组只加培养液200μl，孵育44h后，每孔加入20μl 0.5％MTT溶液，继续孵育4h，然后倾去所有液体，每孔再加入100μl DMSO，以酶联免疫仪490nm波长测定各孔OD值，计算不同浓度的多肽对细胞的抑制率。

运用MTT法检测上述实施例1制备的多肽对HeLa细胞的抑制作用，绘制抑制曲线，结果如表4和图8所示。结果表明，给药24小时后，上述实施例1制备的多肽能以剂量依赖性方式抑制HeLa细胞的增殖，多肽抑制HeLa细胞增殖的半效应量(50％inhibiting concentration，IC₅₀)为0.52μg/ml；且HeLa细胞的形态发生改变，如图9所示。其中，A为对照组细胞，B为给药组细胞。

表4多肽作用于HeLa细胞24h后的生长抑制作用

采用相同方法检测上述实施例1制备的多肽对SMMC-7721细胞的抑制作用。结果如表5和图10所示。结果表明，上述实施例1制备的多肽能以剂量依赖性方式抑制SMMC-7721细胞的增殖，IC₅₀为0.54μg/ml；并能引起细胞形态的改变，如图11所示。其中，A为对照组细胞，B为给药组细胞。

表5多肽作用于SMMC-7721细胞24h后的生长抑制作用

采用相同方法检测上述实施例1制备的多肽对SGC-7901细胞的抑制作用。结果如表6和图12所示。结果表明，上述实施例1制备的多肽还能以剂量依赖性方式抑制SGC-7901细胞的增殖，IC₅₀为0.62μg/ml；并能引起该细胞形态的改变，如图13所示。其中，A为对照组细胞，B为给药组细胞。

表6多肽作用于SGC-7901细胞24h后的生长抑制作用

实施例7、多肽的抗肿瘤黏附功能

将96孔板用含1μg/ml多肽和1μg/ml玻粘连蛋白(购自美国Sigma化学试剂公司)的PBS 4℃包被16h，将包被液甩掉，用浓度为15mg/ml的热变性牛血清白蛋白(购自上海生工生物工程有限公司)溶液冲洗三次，将上述热变性牛血清白蛋白溶液重新加入96孔板中，37℃放置1h，PBS清洗后备用。

将牛肾上腺血管内皮细胞(Bovine Capillary Endothelial Cell，BCEC)(购自美国ATCC菌种与培养物保藏中心)用毛玻璃研磨，研磨液过200目不锈钢网，收集滤液800rpm离心10min除掉组织块，再2500rpm离心15min沉淀细胞；弃上清液，将细胞用胰酶消化、PBS吹打悬浮、反复离心，再用DMEM悬浮、计数，按照每孔1×10⁴个细胞的量接在上述包被的96孔板上，第一行为空白对照、第二行加入浓度为1μmol/ml的上述实施例1制备的多肽，第三行加入浓度为1μmol/ml的抗整合素α_vβ₃的抗体(购自美国Sigma化学试剂公司)，第四行加入浓度为1μmol/ml的整合素α_vβ₃(购自美国Sigma化学试剂公司)，37℃5％CO₂条件下培养4h，吸掉培养液，加入PBS冲洗，用考马斯亮蓝染色，540nm处测定吸光度值。实验设三次重复，用空白行细胞数的平均值计算其它三行细胞数的平均值，结果如表7所示。

表7多肽作用于BCEC 72h后的生长抑制情况

结果表明，上述实施例1获得的多肽可抑制牛肾上腺血管内皮细胞表面整合素α_vβ₃对包被层的黏附，进而抑制整合素介导的细胞黏附作用。

实施例8、多肽的抗血管内皮细胞再生功能

将牛肾上腺血管内皮细胞(Bovine Capillary Endothelial Cell，BCEC)用毛玻璃研磨，研磨液过200目不锈钢网，收集滤液800rpm离心10min除掉组织块，再2500rpm离心15min沉淀细胞；弃上清液，将细胞用含10％胎牛血清和5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(购自宝生物科技有限公司)的DMEM培养基吹打悬浮、计数，接在24孔培养板上，37℃5％CO₂条件下培养24h；吸掉培养液，再加入含5％胎牛血清的DMEM培养基，同时加入不同量的上述实施例1获得的多肽(多肽在培养基中的终浓度如表7所示)；培养30min后，加入用含5％胎牛血清的DMEM培养基溶解的bFGF，使其在培养基中的终浓度为1ng/ml，培养72h后吸掉培养液，加入胰酶消化，PBS悬浮、计数，计算生长抑制率。实验设三次重复，结果如表8所示。

表8多肽作用于BCEC 72h后的生长抑制情况

结果表明，上述实施例1获得的多肽可抑制bFGF诱导的牛肾上腺血管内皮细胞的分裂，其IC₅₀的平均浓度为1.0μg/ml。

实施例9、多肽的抗实体瘤生长功能

将小鼠肉瘤S180细胞(购自上海迪奥生物科技有限公司)接种于昆明种小鼠的腹腔内，选择接种小鼠肉瘤S180细胞7～10天后腹水生长良好的小鼠作为瘤源动物，脱颈椎处死。

在无菌条件下抽取上述瘤源小鼠的腹水，计算肿瘤细胞数，用无菌的生理盐水将肿瘤细胞稀释至1×10⁷个细胞/ml，置冰水中存放。再取80只昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)，将小鼠随机分为4组，分别为：①空白对照组、②多肽高剂量组(给药剂量为15μg/kg体重)、③多肽中剂量组(给药剂量为10μg/kg体重)和④多肽低剂量组(给药剂量为5μg/kg体重)。于每只小鼠右前肢腋下皮下注射上述稀释后的小鼠肉瘤S180细胞0.2ml，注射小鼠肉瘤S180细胞24小时后，再分别腹腔注射不同剂量的上述实施例1制备的多肽，每天注射一次，共注射30次。末次给药24小时后，称量小鼠的体重，然后将小鼠脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重。按下面的公式计算瘤重抑制率。实验设三次重复，结果如表9所示。

表9抗癌肽对移植性小鼠S₁₈₀瘤体生长的影响

结果表明，上述实施例1制备的多肽对小鼠肉瘤S180细胞有明显的抑制肿瘤生长作用，且具有一定的量效依赖关系。

实施例10、多肽的抗肿瘤转移功能

将B₁₆瘤细胞(购自上海迪奥生物科技有限公司)接种于C₅₇小鼠(购自上海迪奥生物科技有限公司)的腹腔内，选择接种B₁₆瘤细胞7～10后天腹水生长良好的C₅₇小鼠作为瘤源动物，脱颈椎处死。

取80只昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)，将小鼠随机分为4组，分别为：①空白对照组、②多肽高剂量组(给药剂量为15μg/kg体重)、③多肽中剂量组(给药剂量为10μg/kg体重)和④多肽低剂量组(给药剂量为5μg/kg体重)。抽取上述瘤源小鼠的腹水，计算肿瘤细胞数，用无菌的生理盐水将肿瘤细胞稀释至1×10⁷个细胞/ml，置冰水中存放。将不同量的上述实施例1制备的多肽和上述稀释后的B₁₆瘤细胞混合，尾静脉输入到小鼠体内，每天给药一次，共注射30次。末次给药24小时后，称量小鼠的体重，然后将小鼠脱颈椎处死，剥取肺脏制成组织切片，显微观察。

实验设三次重复，结果表明，空白对照组均出现了肿瘤细胞向肺部转移的现象，低剂量组有2只小鼠出现肿瘤细胞向肺部转移的现象，而中剂量组和高剂量组均未出现肿瘤细胞向肺部转移的现象。

实施例11、多肽对已转移肿瘤的生长抑制功能

将Lewis肺癌瘤细胞(购自上海迪奥生物科技有限公司)接种于C₅₇小鼠的腹腔内，选择接种Lewis肺癌瘤细胞7～10后天腹水生长良好的C₅₇小鼠作为瘤源动物，脱颈椎处死。

在无菌条件下剥取瘤源C₅₇小鼠的瘤组织，称重后剪碎，按照每克瘤细胞加3毫升生理盐水的量混合，用无菌匀浆器将细胞研磨成匀浆，置冰水中存放备用。

取健康的C₅₇小鼠，每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个上述Lewis肺癌细胞混悬液。小鼠移植瘤细胞96小时后，Lewis肺癌细胞在小鼠的肺部着床。将小鼠随机分为4组，分别为：①空白对照组；②多肽高剂量组(给药剂量为15μg/kg体重)；③多肽中剂量组(给药剂量为10μg/kg体重)；④多肽低剂量组(给药剂量为5μg/kg体重)。将不同量的上述实施例1制备的多肽尾静脉输入到小鼠体内，每天给药一次，共注射30次。末次给药24小时后，将小鼠脱颈椎处死，作肺部切片，显微观察。

实验设三次重复，结果表明，多肽高剂量组、多肽中剂量组和多肽低剂量组均没有发现肿瘤着床或生长，上述实施例1制备的多肽具有显著的抑制肿瘤转移和转移后生长的功能。多肽对转移性肿瘤的抑制作用，来自于它对整合素α_vβ₃的拮抗作用，导致肿瘤“二次生长”所需的物质基础-血管再生无法进行。

序列表

<110>吉林大学

<120>一种具有抗肿瘤作用的多肽及其编码基因与应用

<130>CGGNARZ92062

<160>2

<210>1

<211>195

<212>DNA

<213>乌苏里蝮蛇(Gloydius ussurinsis)

<400>1

gactctcctg caaatccgtg ctgcgatgct gcaacctgta aactgagacc aggggcacag     60

tgtgcagaag gactgtgttg tgagcagtgc agatttatga aagaaggaac agtatgccgg    120

atagcaaggg gtgatgacat ggatgattac tgcaatggca tatctgctgg ctgtcccaga    180

aatcccttcc atgcc                                                     195

<210>2

<211>65

<212>PRT

<213>乌苏里蝮蛇(Gloydius ussurinsis)

<400>1

Asp Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg

1               5                   10                  15

Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly Leu Cys Cys Glu Gln Cys Arg Phe

            20                  25                  30

Met Lys Glu Gly Thr Val Cys Arg Ile Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp

        35                  40                  45

Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His

    50                  55                  60

Ala

65

Claims (9)

1.一种多肽，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.权利要求1所述多肽的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.扩增权利要求2或3所述基因的引物对，由引物5′-taggatccgactctcctgcaaatccg-3′和引物5′-atgaattcggcatggaagggatttct-3′组成。

8.一种具有抗肿瘤作用的药物，它的活性成分是权利要求1所述的多肽；所述肿瘤为胃癌、肝癌或宫颈癌。

9.权利要求1所述的多肽在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用；所述肿瘤为胃癌、肝癌或宫颈癌。

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