CN101890153A

CN101890153A - 肝细胞核因子4α治疗慢性肝病

Info

Publication number: CN101890153A
Application number: CN2009100473080A
Authority: CN
Inventors: 谢渭芬; 林勇; 岳海燕; 尹川; 陈岳祥
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2010-11-24

Abstract

本发明涉及肝细胞核因子4α治疗慢性肝病。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor-4α，HNF4α)治疗人肝纤维化等慢性肝病的方法和用途。本发明研究表明，通过调控肝细胞和肝星状细胞(HSC)中HNF4α基因表达，可抑制上皮细胞间质转型(epi thelial-to-mesenchymal transition，EMT)进程；更为重要的是通过体内HNF4α腺病毒载体注射，证实了HNF4α表达上调对肝纤维化发展过程中肝细胞和HSC EMT以及纤维化进程有阻断和逆转作用，从而提供了一种预防治疗肝纤维化等慢性肝病的新手段。

Description

肝细胞核因子4α治疗慢性肝病

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及医学领域。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α，HNF4α)诱导慢性肝病和肝硬化的方法和用途。本发明还涉及将HNF4α基因和蛋白导入人慢性肝病、肝硬化肝脏组织和细胞的方法以及提高这些组织和细胞内HNF4α表达的手段。

背景技术

慢性肝病、肝硬化是临床常见的慢性疾病，治疗难度大，临床预后差，占用了巨大的医疗资源，是危害国民健康的重大疾病。我国是肝病重灾国，目前乙型肝炎病毒表面抗原携带者约1.2亿，丙型肝炎病毒感染者约3800万，其中12％-20％慢性肝炎患者5年内可进展为肝硬化。肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内过多沉积为特征。目前认为，肝纤维化为一动态过程，属可逆性病变，肝硬化则是不可逆转的。因此，阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要手段。

以往认为，肝纤维化发生的中心环节是肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)激活并向肌成纤维样细胞(myofibroblasts，MFs)转化，抑制HSC激活、增殖与迁移、诱导凋亡是肝纤维化治疗的重要策略。近年来研究发现，在静息状态下，HSC可能是一种上皮细胞，对肝干细胞的分化和增殖以及肝细胞功能维持均起重要作用。此外也有研究显示，肝实质细胞如肝细胞以及胆管上皮细胞均可能转化为MFs，参与肝纤维化的发生发展。因此，抑制HSC活化和增殖可能不是治疗肝纤维化的最好策略，迫切需要针对肝纤维化发病的新机制重新确立新的有效治疗方法。

上皮细胞间质转型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)主要是指上皮细胞在细胞形态、细胞结构、细胞功能以及细胞粘附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。目前，EMT在肝脏、肾脏、肺脏等器官纤维化进程中的重要作用已经得到证实。一系列研究也表明，肝细胞、HSC、胆管上皮细胞也通过EMT转化为MFs，参与肝纤维化进程。这些研究重新认识了肝脏实质细胞和间质细胞作用，是肝纤维化机制与治疗领域新的突破。

尽管EMT在器官纤维化发生机制中的作用不断得到重视，但以EMT作为治疗靶点抑制肝纤维化仍少有报道。最近，国外有研究将重组骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)经腹腔注射至CCl₄所致慢性肝损伤的小鼠体内，治疗后小鼠肝纤维化程度得到改善；体外也证实BMP-7可拮抗TGF-β1诱导肝细胞EMT。但迄今为止，筛选与肝纤维化EMT相关的重要转录因子，并通过调控这些转录因子活性以抑制EMT进程同时增强肝细胞功能，进而治疗慢性肝病仍未有明确报道。

另外，虽然目前已经知晓在肝纤维化进程中存在某些基因的差异表达，然而目前尚不清楚能否通过调控转录因子表达来逆转肝纤维化，更不清楚应该通过调控何种转录因子来逆转肝纤维化进程。

综上，本领域尚缺乏有效地预防和治疗肝纤维化、慢性肝病和肝硬化的有效手段，因此本领域迫切需要开发与肝纤维化密切相关的特定转录因子及其调控基因，以便将其作为特异性调控的靶标，进而有效地预防和/或治疗肝纤维化等肝病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与肝纤维化等慢性肝病密切相关的特定的基因一HNF4α基因及其编码产物HNF4α蛋白，以及HNF4α基因/蛋白在预防和/或治疗肝纤维化等慢性肝病中的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种通过HNF4α基因/蛋白逆转肝纤维化进程从而治疗肝纤维化等肝病的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α，HNF4α)基因和/或蛋白的用途，它们被(i)用于制备预防和/或治疗肝纤维化的制剂或组合物；(ii)用于制备预防和/或治疗慢性肝病和肝硬化的制剂或组合物；(iii)用于降低肝脏中细胞外基质含量的制剂或组合物；(iv)用于制备提高肝脏组织或细胞中上皮表型标志物或肝细胞增殖标志物的表达量的制剂或组合物。

在另一优选例中，所述的上皮表型标志物包括E-钙粘蛋白(E-cadherin)。

在另一优选例中，所述的肝细胞增殖标志物包括增殖细胞核抗原(PCNA)。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有(a)HNF4α蛋白、HNF4α编码序列或含所述编码序列的表达载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体和非病毒载体。

在另一优选例中，所述的慢性肝病包括：各种病因导致的慢性肝脏损伤，例如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病和自身免疫性肝病。

在另一优选例中，所述的肝细胞核因子4α是人的肝细胞核因子4α。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，还单独或额外地提供了一种肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α，HNF4α)基因和/或蛋白的以下用途，它们被(v)用于制备阻断或逆转上皮细胞间质转型的制剂或组合物；或(vi)用于制备改善血清水平的肝功能指标的制剂或组合物。

在另一优选例中，所述的血清水平的肝功能指标包括：降低凝血酶原时间PT、降低丙转氨酶ALT浓度和降低谷草转氨酶浓度。

在本发明的第二方面，提供了一种携带肝细胞核因子4α基因的腺病毒载体的用途，它被(i)用于制备预防和/或治疗肝纤维化的制剂或组合物；(ii)用于制备预防和/或治疗慢性肝病和肝硬化的制剂或组合物；(iii)用于降低肝脏中细胞外基质含量的制剂或组合物；(iv)用于制备提高肝脏组织或细胞中上皮表型标志物或肝细胞增殖标志物的表达量的制剂或组合物；(v)用于制备阻断或逆转上皮细胞间质转型的制剂或组合物；和/或(vi)用于制备改善血清水平的肝功能指标的制剂或组合物。

在本发明的第二方面，提供了一种预防或治疗疾病的方法，所述的疾病包括肝纤维化和慢性肝病，其中，所述的方法包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用肝细胞核因子4α蛋白、其编码序列或含所述编码序列的表达载体。

在另一优选例中，所述的哺乳动物是人。

附图说明

图1.免疫组化法检测二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)肝损伤大鼠模型和胆管结扎(bile duct ligation，BDL)大鼠模型中肝纤维化发展不同阶段HNF4α和EMT相关蛋白的表达。

图2.HNF4α治疗DMN肝损伤大鼠模型示意图。

图3.HNF4α治疗BDL肝损伤大鼠模型示意图。

图4.表达HNF4α的重组腺病毒AdHNF4α经尾静脉注射导入不同类型肝纤维化大鼠体内对肝纤维化进程的抑制作用。

图5.TGF-β1诱导原代培养大鼠肝细胞发生EMT。

图6.AdHNF4α感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝细胞后，EMT相关指标和肝细胞功能基因表达的变化。

图7.HSC活化过程中伴随EMT变化。

图8.AdHNF4α感染不同活化阶段HSC后，EMT和纤维化相关指标表达的变化。

图9.AdHNF4α感染活化的肝星状细胞株HSC-T6后，EMT和纤维化相关指标表达的变化。

图10.AdHNF4α感染活化的肝星状细胞株HSC-T6后，细胞增殖受到抑制。

图11.Real time PCR检测AdHNF4α经尾静脉注射导入DMN肝损伤大鼠体内后，肝脏组织中HNF4α基因、肝细胞相关功能基因、纤维化指标及EMT相关指标mRNA表达变化。

图12.AdHNF4α体内导入对纤维化肝脏EMT进程的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种可有效地在体内阻断或逆转肝纤维化进程的关键基因/蛋白，即HNF4α基因/蛋白。体外实验表明，HNF4α对肝细胞和HSC的EMT进程有抑制作用，并且对肝细胞功能的重要维护作用；体内实验表明，HNF4α表达上调对肝纤维化进程的有阻断和逆转作用。因此HNF4α作为首次被证实的可有效地在体内阻断和逆转肝纤维化的关键基因/蛋白，具有潜在的应用前景。本发明人在此基础上完成了本发明。

具体而言，本发明通过以下实验证明了HNF4α在治疗和预防慢性肝病、肝纤维化和肝硬化等疾病中的应用。

1.对比测定不同肝纤维化大鼠模型和肝纤维化不同发展阶段HNF4α及EMT相关指标表达情况。

2.克隆获取HNF4α全长cDNA片段，外源插入重组复制缺陷性腺病毒载体多克隆位点，293细胞包装病毒，获取高效表达HNF4α的复制缺陷性腺病毒AdHNF4α。

3.AdHNF4α经尾静脉注射导入不同类型肝纤维化大鼠体内，研究上调HNF4α表达对肝纤维化进程的抑制作用。

4.证实TGF-β1可诱导肝细胞发生EMT改变；检测上调HNF4α对TGF-β1刺激的原代大鼠肝细胞EMT相关指标和肝细胞功能基因表达的影响。

5.体外检测HSC活化过程中EMT相关指标的变化；AdHNF4α感染不同活化阶段HSC和活化的肝星状细胞株HSC-T6后，检测HNF4α过表达对HSC EMT和纤维化相关指标表达的影响。

6.AdHNF4α感染活化的肝星状细胞株HSC-T6后，检测细胞增殖的变化。

7.AdHNF4α经尾静脉注射导入肝损伤大鼠体内后，证实上调HNF4α表达对纤维化肝脏EMT进程或状态的抑制作用。

如本文所用，术语“慢性肝病”指各种病因导致的慢性肝脏损伤，例如例如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病和自身免疫性肝病。广义的慢性肝病还包括肝纤维化以及肝硬化。

如本文所用，术语“基因/蛋白”指基因和/或蛋白。

如本文所用，术语“HNF4α蛋白”、“HNF4α多肽”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”可互换使用，都指肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor4α)蛋白。它们可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNF4α。狭义上，所述术语指人的HNF4α；广义上，所述术语不仅包括人的HNF4α，还包括其他哺乳动物的HNF4α，尤其是灵长类动物的HNF4α，如猿或猴的HNF4α。该术语还包括HNF4α蛋白的活性片段、活性衍生物和类似物。

本发明多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然HNF4α蛋白(如人HNF4α)相同的生物学功能或活性的多肽。这些多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

例如，在本发明中，术语“人HNF4α多肽”指具有野生型HNF4α序列的多肽。该术语还包括具有与人HNF4α蛋白相同的阻断或逆转肝纤维化进程的功能的、野生型序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。同样，该术语还包括人HNF4α蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明还包括人HNF4α蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HNF4α多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人HNF4α蛋白保守性变异多肽”指与野生型氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu

Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

如本文所用，术语“HNF4α基因”或“本发明基因”可互换使用，都指编码HNF4α蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与野生型编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有野生型氨基酸序列的蛋白质，但与野生型编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，只要这些多核苷酸变异体编码与本发明上述的HNF4α多肽或其的活性片段、活性类似物和活性衍生物。

在本发明中，人HNF4α核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人HNF4α的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明也涉及包含HNF4α编码序列的载体(尤其是病毒载体)，以及用本发明的载体或HNF4α编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用HNF4α多核苷酸序列可用来表达或生产重组的HNF4α多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用编码人HNF4α多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人HNF4α多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HNF4α编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；动物细胞如CHO、COS、293细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可用CaCl₂法或电穿孔方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达HNF4α多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

重组的HNF4α多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的HNF4α多肽可直接做为肝纤维化逆转剂治疗或预防肝纤维化等慢性肝病。此外，编码HNF4α蛋白的多核苷酸或携带HNF4α编码序列的载体也可用于治疗或预防肝纤维化等慢性肝病。

将多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达野生型的HNF4α蛋白，以增加肝脏组织中HNF4α蛋白的数量和活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HNF4α基因转移至细胞内。构建携带HNF4α基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人HNF4α基因可包装到脂质体中，然后再转入细胞内。

一种优选的基因治疗用载体是病毒载体，例如腺病毒载体(见CN200810034200.3)。

本发明HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸及载体，当施用(给药)于哺乳动物对象(如人)时，可阻断或逆转肝纤维化进程，进而治疗或预防慢性肝病、肝纤维化和肝硬化等疾病。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质(包括水性载体介质)，形成药物组合物。水性载体介质的pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于治疗或预防肝纤维化、慢性肝病和肝硬化，代表性的慢性肝病例子包括(但并不限于)：慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病和自身免疫性肝病等以及与慢性肝病有关的肝纤维化和肝硬化。在使用本发明HNF4α基因/蛋白或药物组合物时，还可同时或辅助使用其他治疗肝病的治疗剂，如抗氧化剂、细胞膜稳定剂、促肝细胞生长药物、免疫调节剂以及中药治疗等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量(如0.0001-90wt％，更佳地0.01-90wt％)的本发明HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明药物组合物中还可含有其他治疗剂。

使用药物组合物时，是将安全有效量的HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克蛋白/千克体重(HNF4α多核苷酸或载体可折算成蛋白表达量)，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了一种预防和治疗肝纤维化等肝病的方法，该方法包括给需要的哺乳动物对象(如人)施用本发明的HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体，从而在该对象体内阻断或逆转肝纤维化进程。

本发明还提供了一种治疗肝纤维化等肝病的基因治疗方法，它包括将HNF4α基因导入肝脏组织或细胞，使之表达HNF4α，其中所述将HNF4α基因导入肝脏组织或细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。

本发明的主要优点在于：

(a)利用多种基因工程技术方法研究并首次证实了HNF4α对于肝纤维化进程的阻断和逆转作用。

(b)在体内外证实了通过转录因子来治疗肝纤维化和慢性肝病的可行性。

(c)在体内外证实了EMT是促肝纤维化进程的重要因素。

(d)首次证实了HNF4α可通过抑制肝脏组织内肝细胞和HSC EMT逆转肝纤维化进程。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

免疫组化法测定不同肝纤维化大鼠模型和肝纤维化不同发展阶段HNF4α及EMT相关指标表达情况

1.肝纤维化动物模型制备：

DMN损伤肝纤维化模型：将雄性SD大鼠随机分为4组，各组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组予生理盐水腹腔注射作为阴性对照组；第2～4组为肝纤维化模型组，予1％DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射，每周连续注射3次，共注射5w，制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。于不同时间点处死大鼠，取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片作免疫组化测定；余肝组织液氮冻存。

BDL肝纤维化模型：将雄性40只SD大鼠分成4组，每组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组为假手术组，第2～4组为BDL组。BDL大鼠予10％水合氯醛溶液按照35mg/kg体重的剂量腹腔注射麻醉后，将四肢固定于鼠板上。腹部碘伏消毒后，从腹部正中剑突下剪开约1.5-2cm的皮肤切口，沿腹肌白线剪开下面腹肌直至腹膜，暴露肝脏。用棉签将肝叶向大鼠的上方拨开，充分暴露肝门，可见与门静脉伴行的白色管道即为胆总管，钝性分离胆总管，用三根“0”丝线穿过胆总管，为防治胆汁淤积导致结扎线脱落，胆总管上端结扎两根线，上面两根尽量接近左右肝管汇合成胆总管处结扎，胆总管下端结扎一根，与上面两根线留取一段距离，在此中间剪断胆管。清理腹腔，4号线逐层关腹，即完成胆总管结扎模型的制备。假手术组仅开腹分离胆总管而不结扎切断就直接关腹。于不同时间点处死大鼠，取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片作免疫组化测定；余肝组织液氮冻存。

2.免疫组织化学方法检测肝纤维化进程中HNF4α和EMT相关指标变化。

采用SABC染色方法(DAB显色)，具体步骤如下：大鼠肝组织石蜡切片，60℃烘烤固片，30min；脱蜡至水；清除内源性过氧化物酶：3％H₂O₂，室温10min；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次3min；抗原修复：柠檬酸缓冲液微波修复；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次3min；封闭：加1∶20正常山羊血清，室温，30min；封闭后吸去正常羊血清，加一抗，4℃过夜(一抗浓度均为1∶100)；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次5min；加二抗：37℃，30min；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次5min；加SABC，37℃，20min；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次5min；显色：滴加DAB，5min，流水冲洗；常规树脂封片；光镜下观察，阳性部位呈棕褐色，半定量分析。

结果表明：随着肝纤维化程度的逐渐加重，HNF4α和上皮表型指标E-cadherin表达逐渐下调，纤维化相关蛋白α-SMA和间质表型指标vimentin、FSP-1表达明显上调，提示肝纤维化发展过程中伴随EMT进程和HNF4α表达下降。(图1)

实施例2

构建表达HNF4α的重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α

1.获取HNF4α1425bp cDNA片段：根据人HNF4αcDNA序列设计、合成引物。正义引物(在5′端加入BglII酶切位点)：5′-CCG AGA TCT AGA ATG CGACTC TCC AAA ACC-3′(SEQID NO：1)。反义引物(在5′端加入EcoR V酶切位点)：5′-CGC GAT ATC GGC TTG CTA GAT AAC TTC CTG CT-3′(SEQ ID NO：2)。

PCR扩增HNF4αcDNA片段，产物1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定片段大小，并割胶回收置入Eppendorf管内，称取胶重量。Eppendorf管中加入NT液200ml/100mg胶，50℃5-10min至胶熔化，将液体过柱，13,000rpm离心1min，加入600μl NT3缓冲液，13,000rpm离心2min。30μl双蒸水过柱洗脱DNA片段，静放1min，13,000rpm离心1min，小心移取洗脱液于干净的Eppendorf管内。分光光度计测定OD₂₆₀值，1，5％琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，从而获得长度为1425bp的cDNA片段。

反应条件：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，35个循环。

2.构建表达HNF4α的腺病毒质粒pAdHNF4α：EcoRV、Bgl II酶切穿梭质粒pAdTrack-CMV(购自霍华德-休斯医学研究所，美国)和HNF4αcDNA 4h后并纯化，取0.1μg质粒pAdTrack-CMV、0.4μg HNF4αcDNA、10×T₄缓冲液2μl、T₄DNA连接酶1μl(2U)以及ddH₂O，总体积20μl，16℃连接过夜。将连接产物加入常规的感受态大肠杆菌DH5α转化，用含卡那霉素的LB培养基平皿铺板，37℃恒温过夜，选择单菌落克隆，将扩增出HNF4αcDNA片段的菌落克隆用Qiagen-tip 100试剂盒(购自Qiageng公司)抽提，获取质粒pAdTrack-CMV-HNF4α并鉴定。Pme I内切酶酶切线性化pAdTrack-CMV-HNF4α，分别取0.4μg线性pAdTrack-CMV-HNF4α和0.1μg超螺旋pAdEasy-1质粒(购自霍华德-休斯医学研究所，美国)2,000V、200Ohms、25μFD电穿孔共转化20μl感受态BJ5183细菌，卡那霉素LB培养基平板筛选，选择病毒质粒pAdHNF4α鉴定。

3.包装、扩增腺病毒AdHNF4α：复苏常规的293细胞，以4.8×10⁶/皿接种于10-cm的组织培养皿，加入DMEM 37℃、5％CO₂培养，24h后细胞密度生长至60％～80％。Pac I酶切线性化pAdHNF4α，与不含血清的DMEM培液250μl混匀，配成A液；取Lipofectamin 20μl，加入不含血清的DMEM培液250μl混匀，配成B液，A液与B液充分混匀，室温放置30min后加入待转染的293细胞中，4小时(h)后更换培液。7天(d)后收集293细胞以及上清，于液氮和37℃水浴中反复冻融4次，5,000rpm离心5min，收集病毒上清，病毒上清再次感染293细胞进行扩增，2～3d后收集病毒；重复感染、收集步骤，将最终收集的病毒上清分装，测定病毒上清滴度，最终得到滴度约为1×10¹⁰efu/ml的腺病毒AdHNF4α，置于-80℃保存备用。

4.重复步骤1-3，不同点在于用GFP基因替换AdHNF4α，从而制得表达GFP的重组复制缺陷型腺病毒AdGFP。

实施例3

上调HNF4α表达对大鼠肝纤维化进程的抑制作用

1.肝纤维化动物分组

DMN组：将雄性SD大鼠随机分为4组，各组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组予生理盐水腹腔注射作为阴性对照组；第2～4组为肝纤维化模型组，予1％DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射，每周连续注射3次，共注射5周(w)，制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。其中第2组设为模型对照组；第3组为空白病毒AdGFP对照组；第4组设为AdHNF4α导入组；分别在第2w、4w处死模型组大鼠各10只。于注射DMN注射第4w经尾静脉分别注入4×10⁹pfu AdGFP和4×10⁹pfu AdHNF4α，2w后处死，留取大鼠血清病本，同时取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片；余肝组织液氮冻存(图2)。

BDL组：将雄性48只SD大鼠分成4组，每组12只。分别为：第1组为假手术组，2-4组为BDL模型组，依次设为PBS对照组、空白病毒AdGFP对照组和AdHNF4α导入组。BDL术后2d经尾静脉分别注入4×10⁹pfu AdGFP和4×10⁹pfuAdHNF4α；造模3w后处死大鼠，组织处理同DMN模型(图3)。

2.分别检测各组大鼠血清肝功能指标。

结果表明，AdHNF4α治疗组大鼠部分肝功能指标明显改善(表2)。

表2.在两种模型中上调HNF4α对血清水平的肝功能指标的改善作用

^A与PBS组比较，P＜0.05；^B与AdGFP组比较，P＜0.05

3.肝组织石蜡切片分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、苦味酸-酸性品红(Van Gieson，VG)染色及Masson′s trichrome染色测定肝脏ECM沉积情况。

结果表明：AdHNF4α治疗组大鼠肝脏ECM量较对照组明显减少(图4)。其中，DMN模型：AdHNF4α治疗组ECM为AdGFP组的31％；BDL模型：AdHNF4α治疗组ECM为AdGFP组的29％。

实施例4

Real-time PCR和细胞免疫荧光证实TGF-β1可诱导原代大鼠肝细胞发生EMT

1.分离制备SD大鼠原代肝细胞：大鼠术前禁食12h，不禁水，以10％水合氯醛(35mg/kg体重)麻醉大鼠，常规消毒、铺无菌巾。上腹部正中切口开腹，解剖出门静脉，经门静脉近肝端插入医用软穿刺针并用4号线固定。取出软针针芯后将其输液端与一次性医用输血器连接，后者接输液瓶，先用含1000U肝素的39℃水浴预热D-hank’s液250ml液进行原位肝灌注(速度40ml/min)，在灌注的同时结扎肝上腔静脉，并将肝下腔静脉剪开，使灌注液由此流出，一直到肝脏颜色由红转为淡黄色，肝下腔静脉流出液变清亮时为止。从穿刺针注入37℃0.05％胶原酶IV液50ml，待肝下腔静脉流出液为胶原酶时，暂时夹闭肝下腔静脉，使胶原酶液充满整个肝脏，停止用0.05％胶原酶IV液灌注，完整切下肝脏并置其于37℃恒温箱内消化至肝脏表面出现裂隙、柔软无弹性(约10-15min)，放开肝下腔静脉让胶原酶液从肝内流出。将肝脏重新放入一无菌盘内，加入一定量的4℃高糖DMEM液，去除肝脏上的肝包膜、胆囊、大血管等纤维结缔组织，钝性撕裂肝组织，这时便有大量的肝细胞悬混于DMEM液中。在低温环境下(4℃左右)经100目、300目不锈钢滤网过滤，混悬肝细胞于DMEM培养液，并将过滤后获得的肝细胞悬液离心(4℃，800rpm/min，3min)，反复用DMEM培养液洗涤3-5次以去除细胞碎屑及混杂细胞。将获得的肝细胞用含10％胎牛血清的新鲜F12培养液制成肝细胞悬液。台盼兰染色并计数。

2.Real-time PCR和细胞免疫荧光检测TGF-β1刺激后原代大鼠肝细胞EMT指标及肝细胞功能基因表达变化。

原代培养大鼠肝细胞以1×10⁶/皿接种于35mm培养皿，培养48h后，PBS洗涤细胞，然后将培养液换成含有2ng/ml TGF-β1的诱导培养基(F12+0.05％FBS+ITS)培养48h，观察GFP表达及细胞形态变化，分别收集各组肝细胞，抽提细胞总RNA，制备cDNA：

RT反应体系及步骤如下：

随机引物 1μl

RNA 2μg

加DEPC水(注：焦碳酸二乙酯处理水)至总体积16.5μl，PCR仪上70℃，5min后快速置于冰上冷却5min，加入：

RNA酶抑制剂	1μl
		5×缓冲液	5μl
dNTPmix	1.5μl
		M-MLV(逆转录酶)	1μl

混匀，37℃，2h，-20℃保存备用。

逆转录成cDNA后，beta-肌动蛋白为内参照引物扩增反应，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，以检测逆转录情况。

Real-time PCR

反应体系如下：

ddH₂O 8.2μl

SYBR 10μl

正向引物 0.4μl

反向引物 0.4μl

cDNA 1μl

总计 20μl

反应条件为：94℃预变性30s，之后9410s，60℃30s，共进行40个循环后进行溶解曲线的检测。荧光本底信号和阈值一般采用仪器默认数值，每次运行结束以后自动生成，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数定义为Ct值；每对引物(基因)在每个模板中做3个重复管，得到Ct值取平均值；每个目的基因的Ct平均值减去对应模板的内参基因(ACTB)的Ct平均值，得到ΔCt。实验组的ΔCt减去对照组的ΔCt，得到ΔΔCt值，对照组和实验组中的待测基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。Real-time PCR引物见表3。

表3PCR引物

原代培养大鼠肝细胞以1×10⁶/皿接种于35mm培养皿培养48h后，将培养液换成含有2ng/ml TGF-β1的诱导培养基培养48h，预冷PBS洗涤2次；固定：加入4％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml，4℃，30min；洗涤：0.05％PBST，1.5ml/皿，洗涤5min×3次；封闭：5％马血清(PBS稀释)，1.5ml/皿，放入湿盒，30℃封闭2h；吸去培养皿中的封闭液，用蜡笔沿盖玻片的四周描一个方框，并沿玻片的中间画一条线，使左右两半面积一大一小；玻片面积小的一半加5％马血清，另一半加一抗稀释液，置湿盒内，4℃，孵育过夜；洗涤：次日0.05％PBST，1.5ml/皿，洗涤5min×3次；玻片的两半都加二抗稀释液，放入湿盒，30℃孵育30min；洗涤：次日0.05％PBST，1.5ml/皿，洗涤5min×3次；核DNA显色剂DAPI(4’6’-diamidino-2-phenylindole)用封闭液Mounting Solution 1∶1000稀释；取干净的载玻片一块，作上标记，滴上约30μl mounting solution(含DAPI)；用镊子取出盖玻片，边缘搭在吸水纸上吸去液体，细胞面朝下，盖在载玻片上；荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。

Real-time PCR结果显示TGF-β1刺激48h后的原代肝细胞HNF4α、E-cadherin以及部分肝功能相关基因表达下调，间质细胞表型基因vimentin(波形蛋白)，和snail以及I型胶原基因表达上调，表明TGF-β1可诱导肝细胞向间质细胞转化并具有分泌胶原等成纤维细胞的特性。

免疫细胞荧光结果也显示TGF-β1刺激后，肝细胞上皮表型标志物E-cadherin蛋白表达明显减少，间质表型标志物snail蛋白表达增多，与Real-time PCR结果一致。(图5)

实施例5

上调HNF4α表达可抑制TGF-β1对原代大鼠肝细胞EMT诱导作用并上调肝细胞功能基因的表达

原代培养的大鼠肝细胞以1×10⁶/皿接种于35mm培养皿，培养48h后，将培养液换成含有2ng/ml TGF-β1的诱导培养基(F12+0.05％FBS+ITS)，同时将AdGFP、AdHNF4α以MOI 10感染原代培养的肝细胞48h和72h，分别收集各时间点各组肝细胞，Real-time PCR检测上调原代大鼠肝细胞HNF4α表达对TGF-β1诱导的EMT抑制作用及肝细胞功能基因表达变化。

结果表明，HNF4α可有效抑制TGF-β1诱导的EMT进程，肝细胞上皮表型基因和肝细胞功能基因表达明显上调。(图6)

实施例6

Real-time PCR和细胞免疫荧光证实原代大鼠HSC活化过程伴随EMT进程

1.分离制备SD大鼠原代HSC：以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，1％肝素钠1ml/kg使大鼠全身肝素化；固定，消毒，开腹，暴露门静脉，插管；以37℃无钙D-HanK’s灌流液预灌流；迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出，灌流速度40～50ml/min，持续约10min；取出肝脏，剔除血管、筋膜，剪碎，倒入50ml离心管，加含0.05％IV胶原酶消化液40～50ml，37℃水浴，振荡消化30min；依次用100和300目筛过滤，滤液离心，1700rpm/min，7min；弃上清，用D-Hanks清洗离心2次，1700rpm/min，7min；弃上清，沉淀以1∶2体积的18％的Nycodenz(购自Axis-shield公司)混匀，行密度梯度离心，3400rpm/min，17min；取界面处细胞，用DMEM清洗2次，1700rpm/min，7min；取沉淀细胞悬浮于含10％小牛血清的DMEM中，用台盼蓝染色判存活率；将细胞以1×10⁵/cm²接种于35mm培养皿，置5％CO₂、37℃培养箱培养，24h细胞贴壁后换液，以后每隔2天换液1次；细胞鉴定：倒置显微镜下观察所分离的HSC形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜328nm波长的紫外光激发下，观察HSC的自发荧光；免疫荧光测定desmin(肌间线蛋白)表达进一步证实。

2.Real-time PCR和细胞免疫荧光检测HSC活化过程中EMT指标及纤维化相关指标表达变化。

原代大鼠HSC以1×10⁵/皿接种于35mm塑料培养皿，培养3d后可被自然激活。分别于第2、5、8和12d收集细胞，Real-time PCR和细胞免疫荧光检测HSC活化过程中EMT指标及纤维化相关指标表达变化。

结果表明，在HSC活化过程中，间质表型标志物和纤维化指标(α-SMA和TIMP-1)表达明显上调，同时伴有上皮表型标志物(E-cadherin)表达下调，说明HSC活化过程伴随EMT进程。(图7)

实施例7

上调HNF4α表达可抑制HSC活化及伴随出现的EMT。

原代大鼠HSC以1×10⁵/皿接种于35mm塑料培养皿，分别于培养2、5、9d加入AdGFP或AdHNF4α(MOI 100)，感染72h收集各组细胞。Real-time PCR和细胞免疫荧光检测上调HNF4α表达对不同活化阶段HSC活性和EMT进程的抑制作用。

结果表明，AdHNF4α感染活化HSC 72h后，E-cadherin，、occludin、plakoglobin、desmoplakin等上皮表型基因mRNA水平明显上调，间质表型标志物和纤维化指标表达则显著减少。(图8)

实施例8

外源导入HNF4α抑制活化的肝星状细胞株HSC-T6的活性并逆转EMT进程。

大鼠活化的HSC株HSC-T6是一种常规的鼠肝星形细胞(购自美国UCSF肝脏中心实验室)，其特性与原代分离并活化的HSC相似，所以采用HSC-T6作为本实施例的细胞模型。HSC-T6细胞以每盘2×10⁵接种于35mm培养皿，同时按照MOI 100分别加入AdGFP和AdHNF4α，感染72h后，Real-time PCR和细胞免疫荧光检测。

结果表明，HSC活性明显抑制，纤维化指标表达下调，E-cadherin表达升高，vimentin，和snail表达降低，EMT进程逆转。(图9)

实施例9

MTS法检测上调活化的肝星状细胞株HSC-T6HNF4α表达对其增殖的影响

取对数生长期的HSC-T6细胞按照MOI 100加入病毒AdGFP和AdHNF4α，然后按1×10³细胞/孔分入96孔板，每组设3个副孔。37℃培养箱，过夜；每隔24h，将待测细胞换成无血清DMEM 90μl，然后加入10μl Cell Counting Kit-8(Invitrogen公司，美国)，37℃培养箱，孵育1h；选择450nm波长，在酶联免疫分析仪上测定各孔光吸收值(OD)；上述实验重复三次，每组取平均值进行统计分析；然后以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线，分别观察HNF4α导入组和GFP对照组及空白对照组连续5天的细胞增殖情况。MTS法连续5d测定OD₄₅₀值。

结果表明：HNF4α导入HSC-T6后，细胞增殖明显抑制。从感染后24h开始，HNF4α导入组比正常对照组和病毒对照组具有明显的差异(P＜0.05)。(图10)

实施例10

HNF4α对肝纤维化的治疗作用是通过抑制肝脏实质细胞和间质细胞EMT进程以及改善肝细胞功能来实现的

1.提取DMN肝损伤模型各组大鼠肝组织总RNA：0.5～0.8g肝组织，加入TRizol试剂(1ml/100mg组织)，将组织碾碎至匀浆状，室温放置5min；加入氯仿0.2ml/ml TRizol，剧烈振荡15s后，室温下静置3min；4℃，12000rpm离心15min；取上层水相，加入异丙醇0.5ml/ml TRizol，颠倒混匀，室温静置10min；4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入无水乙醇1ml/ml TRizol，涡流混匀；4℃，7500rpm离心5min，弃去乙醇，室温下自然晾干；加50μlDEPC水溶解RNA；待RNA充分溶解后，各取1μl进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分光光度仪测定260nm、280nm波长处的光密度值，换算浓度。Real-time PCR检测EMT和肝细胞功能基因mRNA表达变化。

结果显示，AdHNF4α导入组，E-cadherin、HNF4α和肝细胞功能基因(如白蛋白、GS、CYP1α2)表达明显上调；α-SMA和间质表型基因表达下调。(图11)

2.免疫组化检测DMN和BDL肝纤维化大鼠模型肝脏组织EMT指标逆转情况。

免疫组化结果表明，AdHNF4α导入后，肝纤维化标志蛋白如α-SMA、TGF-β1表达随纤维化程度的改善而逐渐减少；上皮表型标志物E-cadherin表达明显增多，间质表型蛋白表达减少，EMT进程得到逆转；肝组织中PCNA(增殖细胞核抗原)表达显著提高，肝细胞增殖增强。(图12)

讨论

肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor，HNF4)是一种细胞核激素受体家族的转录因子，是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF4α是HNF4的重要亚型。野生型的人HNF4α序列的登录号为(Gene ID：419198)。

HNF4α是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，HNF4α以二聚体的形式与顺式作用元件结合，当HNF4α的DNA及配体结合域和孕烷X受体α形成二聚体时，其利用锌指DNA结合域识别DNA序列，并可通过乙酰化、磷酸化以及与SMADS 3或4结合调节自身活性，与一些转录激活蛋白如SRC-1、GRIP-1和CBP/p300等相互作用来改变启动子或增强子附近的染色体结构，从而在转录水平实现对分化和功能基因表达的调控。

HNF4α参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能，也是调控上皮细胞表型(如紧密连接、粘附连接、缝隙连接、桥粒以及细胞与细胞基质间粘附分子、上皮细胞极性和细胞骨架蛋白等)表达的重要基因。

本发明人的实验提示，HNF4α可能通过以下途径阻断肝纤维化进程：一是抑制肝细胞通过EMT转化为MFs，从而维持其上皮细胞表型和肝细胞功能；二是阻断或逆转HSC EMT进程，促使活化HSC向上皮细胞表型转化，从而达到既抑制活化HSC的间质细胞特性，又发挥HSC促进肝脏再生和肝干细胞分化的作用。

本发明人的研究还证实：与其他一些上皮表型标志物(如E-cadherin)不同，上调转录因子HNF4α表达可以阻断和逆转纤维化肝脏实质细胞和间质细胞中EMT状态并上调肝细胞相关功能基因的表达，并且对于肝纤维化有明确的治疗作用。因此，HNF4α能在抑制纤维化肝脏EMT进程和改善肝功能两方面起到治疗慢性肝病的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>肝细胞核因子4α治疗慢性肝病

<130>088593

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<170>PatentIn version 3.5

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<213>引物

<400>21

gatcatagtc agcgcaatcc tg 22

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>22

ccatctttct tcgggttttc ac 22

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>23

aactctgtgc gcctcaacta tg 22

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>24

atctcctcca tcctcacacc at 22

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>25

aagaagccca actacagcga ac 22

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>26

ccccaaagat gaggagtatc ca 22

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>27

cgctgaacga ggcatttg 18

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>28

agacggagaa ggcgtagctg 20

<210>29

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>29

ccttactcca gatacccgat gg 22

<210>30

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>30

cttgttgtcc gaattgagct gt 22

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>31

ccgagatctc accgactacc 20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>32

tccagagcga catagcacag 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>33

tccccagaaa tcatcgagac 20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>34

tcagattatg ccagggaacc 20

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>35

agctgcatac acaatggcct aa 22

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>36

cctatgactt ctgcgtctgg tg 22

<210>37

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>37

cctgaactca agagcggaga at 22

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>38

caggattgcc atagctgaac tg 22

Claims

1.一种肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α，HNF4α)基因和/或蛋白的用途，其特征在于，(i)用于制备预防和/或治疗肝纤维化的制剂或组合物；(ii)用于制备预防和/或治疗慢性肝病和肝硬化的制剂或组合物；(iii)用于降低肝脏中细胞外基质含量的制剂或组合物；和/或(iv)用于制备提高肝脏组织或细胞中上皮表型标志物或肝细胞增殖标志物的表达量的制剂或组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物含有(a)HNF4α蛋白、HNF4α编码序列或含所述编码序列的表达载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的表达载体包括病毒载体和非病毒载体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的慢性肝病包括慢性肝脏损伤，尤其是慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病和自身免疫性肝病。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝细胞核因子4α是人的肝细胞核因子4α。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的HNF4α基因和/或蛋白还单独或额外地(v)用于制备阻断或逆转上皮细胞间质转型的制剂或组合物；和/或(vi)用于制备改善血清水平的肝功能指标的制剂或组合物。

9.一种携带肝细胞核因子4α基因的腺病毒载体的用途，其特征在于，(i)用于制备预防和/或治疗肝纤维化的制剂或组合物；(ii)用于制备预防和/或治疗慢性肝病和肝硬化的制剂或组合物；(iii)用于降低肝脏中细胞外基质含量的制剂或组合物；(iv)用于制备提高肝脏组织或细胞中上皮表型标志物或肝细胞增殖标志物的表达量的制剂或组合物；(v)用于制备阻断或逆转上皮细胞间质转型的制剂或组合物；和/或(vi)用于制备改善血清水平的肝功能指标的制剂或组合物。

10.一种预防或治疗疾病的方法，所述的疾病包括肝纤维化和慢性肝病，其特征在于，所述的方法包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用肝细胞核因子4α蛋白、其编码序列或含所述编码序列的表达载体。