CN106552260A - 白介素37在调控血管生成疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了白介素37在调控血管生成疾病中的应用。具体地，白介素37或其激动剂被用于制备促进血管生成的药物或制剂。实验表明，白介素37可显著促进静脉内皮细胞的增殖、促进静脉内皮细胞的迁移。

Description

白介素37在调控血管生成疾病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及白介素37在调控血管生成疾病中的应用。本发明还涉及含白介素37或其激动剂的药物组合物及其应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)是指在原有的毛细血管的基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖，以芽生或非芽生形式形成新的血管系统的过程，与多种重大疾病(如心肌梗死、视网膜血管增生、肿瘤等)的病理过程密切相关，机制非常复杂。

白细胞介素-37(interleukin-37，IL-37)是IL-1家族成员之一，是近来受密切关注的细胞因子。IL-37属于IL-1家族，是一种新型的炎症抑制因子，在外周血单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞和上皮细胞内都有表达。目前对IL-37的研究主要集中在其抗炎作用上。IL-37可抑制免疫系统激活，对炎症性疾病和自身免疫性疾病如炎症性肠炎等具有保护作用。与常见的细胞因子在胞外发挥作用的方式不同，IL-37主要通过与细胞核内的Smad3结合形成复合体调节基因的转录来抑制炎症因子的释放。IL-37胞外的作用机制目前尚不清楚。此外，目前对IL-37功能研究主要集中在抗炎作用上，尚未有IL-37对血管生成的调控作用的报导。

临床上，对血管生成相关疾病的治疗作用十分有限。研究已表明，血管生成受多种细胞因子如VEGF、bFGF、TGF-β，IL-1β等调控，与发育、肿瘤、创伤愈合、血管病变等疾病密切相关。

目前，已经开发了一些与血管生成相关的药物，但是其效果尚难以令人满意，因此，本领域迫切需要开发一种新的、安全可靠的、可调控的新生血管的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一类安全有效的、可调控血管新生的多肽(即白介素37)及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种白介素37或其激动剂的用途，用于制备(a)促进血管生成的药物或制剂；(b)促进静脉内皮细胞的增殖的药物或制剂；和/或(c)促进静脉内皮细胞的迁移的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的静脉内皮细胞包括脐静脉内皮细胞。

在另一优选例中，所述的促进血管生成包括促进视网膜新生血管生成、体内植入基质胶血管生成、缺氧条件下视网膜新生血管生成及生理条件下视网膜新生血管的形成。

在另一优选例中，所述的药物含有：

(a)白介素37的激动剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型包括眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。

在本发明的第二方面，提供了一种白介素37拮抗剂的用途，用于制备(a)抑制血管生成的药物或制剂；(b)抑制静脉内皮细胞的增殖的药物或制剂；和/或(c)抑制静脉内皮细胞的迁移的药物或制剂。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括：化合物、抗体、siRNA、反义核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物或制剂还用于抑制肿瘤细胞的生长。

在另一优选例中，所述的药物还用于治疗或预防与血管新生相关疾病。

在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、中风、器官及组织缺血性坏死等。

在本发明的第三方面，提供了一种筛选促进血管生成或抑制血管生成的物质的方法，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中IL-37的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中IL-37的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的IL-37的表达量和/或活性显著高于对照组，就表明该测试化合物是对IL-37的表达和/或活性有促进作用的促进血管生成的候选化合物；而如果测试组中细胞的IL-37的表达量和/或活性显著小于对照组，就表明该测试化合物是对IL-37的表达和/或活性有抑制作用的抑制血管生成的候选化合物；和/或

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对血管生成的促进作用或抑制作用。

在另一优选例中，还包括：对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对静脉内皮细胞迁移的促进作用或抑制作用。

在另一优选例中，在测试组中，静脉内皮细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察静脉内皮细胞移动的距离和/或数量情况；在对照组中，在静脉内皮细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察静脉内皮细胞移动的距离和/或数量情况；其中，如果测试组中静脉内皮细胞的迁移距离或数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对静脉内皮细胞迁移有抑制作用的候选化合物；而如果测试组中静脉内皮细胞的迁移距离或数量显著高于对照组，就表明该测试化合物是对静脉内皮细胞迁移有促进作用的候选化合物。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试组测量值E1与对照组参比值E0之比(E1/E0)≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述的“显著小于”指测试组测量值E1与对照组参比值E0之比(E1/E0)≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在本发明的第四方面，提供了一种用于抑制血管生成的药物组合物，它含有：

(a)白介素37的拮抗剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(注射剂)、眼用凝胶或眼药膏。

在本发明的第五方面，提供了一种促进或抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤：给需要的对象施用白介素37或其激动剂，从而促进血管新生；或给需要的对象施用白介素37的拮抗剂，从而抑制血管新生。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。

在本发明的第六方面，提供了一种体外非治疗性的促进或抑制静脉内皮细胞增殖和/或迁移的方法，

所述方法包括步骤:在白介素37或其激动剂存在下，培养静脉内皮细胞，从而促进静脉内皮细胞增殖和/或迁移；或

所述方法包括步骤:在白介素37拮抗剂存在下，培养静脉内皮细胞，从而抑制静脉内皮细胞增殖和/或迁移。

在另一优选例中，所述方法用于促进促进静脉内皮细胞增殖和/或迁移；较佳地，所述培养在一培养体系中进行，所述培养体系中白介素37的浓度为0.001-100ng/ml，较佳地为0.001-10ng/ml，更佳地为0.001-2ng/ml。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了IL-37在体外促进血管生成和迁移；

a.IL-37显著促进血管内皮细胞增殖，与阳性对照VEGF相比效果显著；b.IL-37显著促进血管内皮细胞管腔形成，与阳性对照VEGF相比效果显著；c.IL-37促进管腔形成的统计结果(血管分支、管腔总长度)；d.IL-37促进内皮细胞迁移；e.IL-37促进血管内皮细胞划痕愈合。

图2显示了IL-37促进体内血管生成；

a.IL-37促进离体动脉环体外血管生成；b.IL-37促进体内基质胶模型中血管的生成；c.血红蛋白统计及血管面积统计显示IL-37促进体内基质胶模型中血管的生成。

图3显示了IL-37促进缺氧诱导的病理性视网膜血管生成；

a.构建氧诱导的视网膜模型并在小鼠出生后2d至5d时，每天注射1ng/g、15ng/g体重的IL-37，在荧光显微镜下观察小鼠视网膜的新生血管状况。结果表明，IL-37能明显促进视网膜新生血管的生成；b和c，血管密度和tip细胞的数量明显上升。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，IL-37能够在体外细胞实验和体内动物模型中显著促进血管生成。因此，白介素37或其激动剂可用于促进血管形成，而白介素37的抑制剂可用于抑制血管形成。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明实验证实，IL-37在体内血管内皮细胞培养和体外动物模型中有显著的促进血管生成的作用。因此IL-37可以用于作为血管生成相关疾病的治疗靶点，如癌症、心肌梗死、中风等。

术语

如本文所用，术语“血管新生”、“血管生成”、“血管形成”可互换使用。

活性成分

在本发明中，术语“本发明多肽”、“白介素37”、“IL-37”可互换使用，都指具有血管新生促进的白介素37全长蛋白、成熟序列或其活性片段、其融合蛋白、或衍生物。

此外，所述术语还包括具有促进血管新生功能的、IL-37野生型序列的变异形式。与相应的野生型序列相比，这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括IL-37的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)IL-37与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与野生型的人IL-37的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表I

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供IL-37蛋白的类似物。这些类似物与天然人IL-37蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的IL-37多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

激动剂

本发明还涉及IL-37的激动剂及其在促进血管形成等方面的应用。

在本发明中，所述的IL-37激动剂可以促进IL-37的表达、提高IL-37的稳定性、或提高IL-37的活性。

在本发明中，代表性的IL-37激动剂的例子包括(但并不限于)：合成多肽、序列相似的同源性多肽、小分子化合物等。

拮抗剂

本发明还涉及IL-37的拮抗剂及其在抑制血管形成等方面的应用。

在本发明中，所述的IL-37拮抗剂可以抑制IL-37的表达、降低IL-37的稳定性、或降低IL-37的活性。

在本发明中，代表性的IL-37拮抗剂的例子包括(但并不限于)：抗体、小分子化合物、反义核酸等。

一种优选的拮抗剂是针对IL-37蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。

一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸用来表达或生产重组的IL-37。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码IL-37的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化重组多肽。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种促进血管新生的药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明IL-37多肽或其激动剂或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽或激动剂的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。该组合物可用于促进器官缺血性坏死后修复的血管形成(包括但不限于中风、心肌缺血等)、血管内皮细胞迁移的等用途。

另一方面，本发明还提供了一种抑制血管新生的药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明IL-37多肽的特异性抗体或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。所述拮抗剂的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。该组合物可用于抑制血管形成(包括但不限于视网膜血管增生、肿瘤等)、血管内皮细胞迁移的等用途。

以抑制血管新生为例，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的IL-37的拮抗剂。此外，本发明的IL-37的拮抗剂可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药膏。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，眼药水的配制可这样进行：将IL-37的拮抗剂或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，IL-37拮抗剂或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术或注射植入待治疗的组织。此外，IL-37拮抗剂或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的IL-37拮抗剂或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt％，较佳地1-5wt％，每日可2-6次给药，每次1-2滴。

工业应用性

含有本发明IL-37拮抗剂或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生有显著的抑制活性，可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次揭示了IL-37对于血管形成有显著的促进作用。

(b)本发明首次揭示了IL-37对血管内皮细胞的激活有直接的促进作用。

(c)本发明首次揭示了IL-37在生理和病理条件下对视网膜血管生成有显

著的促进作用。

(d)本发明揭示了IL-37的特异性抗体对于IL-37诱导的血管形成有抑制作用。

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤、中风、心肌缺血、器官组织缺血性坏死等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 IL-37促进内皮细胞的增殖和迁移

1.1促增殖实验

将培养HUVEC于96孔板中，待细胞贴壁后加入不同剂量的IL37和VEGF，继续培养12h后加入10μL CCK-8，混匀后培养2h在450nm处测定吸光度值。

结果表明，IL-37对HUVEC有明显的促增殖作用，在低浓度下(0.001ng/ml)即能促进增殖，且在1ng/ml的浓度效果最明显。IL-37的促增殖效果在较低浓度下优于VEGF(图1a)。

1.2管腔形成

将基质胶均匀铺于96孔板的底部，待凝固后每孔接种HUVEC 8万个。细胞贴壁后添加不同剂量的IL37和VEGF，4h后在倒置显微镜下观察各实验组管腔形成的情况。图像经Imag软件处理得出管腔形成数量和管腔长度。

结果表明，在显微镜下能明显看到IL-37能够促进内皮细胞的管腔形成(图1b)，统计的管腔形成支点和管腔长度数据也表明IL-37能够促进内皮细胞的管腔形成(图1c)，且在较低浓度下IL-37的效果优于VEGF的效果。

1.3跨膜迁移实验

将HUVEC用ECM无血清培养基制成密度为2x10⁹个/ml，取100ul加入到Transwell小室上室中，下室加入IL-37，培养10h后，显微镜下观察迁移细胞数量并将其固定然后染色。

结果发现，加入IL-37的小室中细胞数量明显高于未加IL-37的细胞数量(图1d)。这表明，IL-37对HUVEC迁移有明显的促进作用。

1.4划痕实验

将HUVEC细胞培养至约90％覆盖度时，换成无血清培养基饥饿处理4h，用200μl移液枪头划痕，加入2.5ug阿糖胞苷抑制细胞增殖。加入不同剂量IL-37，6h和12h后分别拍照，测量细胞的迁移数目及迁移距离。

结果发现，加入IL-37的处理能够促进HUVEC向划痕处迁移，且在1ng/ml浓度时促进效果最好(图1e)。跨膜迁移实验和划痕实验共同表明，IL-37能够促进HUVEC的迁移。

以上实验共同表明，IL-37在体外能够显著促进HUVEC的增殖和迁移，在较低浓度下，效果不亚于VEGF的作用。

实施例2 IL-37的促进血管生成作用

2.1动脉环实验

取了8周左右的野生型老鼠，取出胸主动脉，冲净血液，剥离血管周围的结缔组织。将血管剪成1mm左右长的动脉环，在96孔板中加入50μlMatrigel，将动脉环包被于Matrigel中。待Matrigel凝固后，加入含IL-37、IL-37+IgG、IL-37+IL37antibody的完全培养基150μl，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。1周后，于显微镜下观察小鼠主动脉的出芽情况拍照后统计小鼠主动脉的出芽点。

结果表明，IL-37能促进小鼠主动脉出芽，且促进作用能被IL-37中和抗体特异性的抑制(图2a)，说明IL-37促进内皮细胞增殖是特异性的。

2.2小鼠基质胶栓实验

在冰上将Matrigel与肝素(10mg/ml)及不同浓度的IL-37与bFGF混匀备用，PBS作为阴性对照。取8周左右的雄性野生型小鼠，背部剃毛、消毒后，分别皮下注射0.5mlMatrigel混合液，注射后第七日小鼠麻醉处死，取出基质胶栓，拍照。将一半基质胶经固定、脱水、透明、石蜡包埋，切片后进行HE染色。显微镜下观察拍照后计算血管面积。

结果显示，如图2b和2c所示，IL-37能促进内皮细胞迁入胶栓内形成血管样结构，且是剂量依赖性的，同等浓度下促进效果优于b FGF。

另一半基质胶称重后加1ml PBS，破碎混匀制备悬液。离心，取上清液与德腊柿金溶液(Drabkin,S solution)按1:5的比例混合孵育，检测540nm吸光值。通过比色法检测基质胶中血红蛋白含量。

结果显示，添加IL-37的基质胶中的血红蛋白浓度明显高于对照组，且IL-37的浓度越高，血红蛋白浓度也越高，且在同等浓度下IL-37处理中的血红蛋白含量高于b FGF。(图2c)。

以上实验共同说明IL-37能在体内促进血管生成，且在同等浓度下IL-37的效果优于b FGF。

实施例3 IL-37对病理状态下新生血管生成的作用

在本实施例中，通过氧诱导的视网膜新生血管模型进一步研究IL-37对病理状态下新生血管生成的作用。

将小鼠出生后7天时随同2只哺乳母鼠放置到连接供氧的动物实验舱中，使氧浓度稳定控制在75％左右。至小鼠出生后12d时将小鼠及其哺乳母鼠返回正常空气环境中(21％O₂)，以诱导小鼠视网膜新生血管的产生。在小鼠出生后12d、14d、16d分别注射每克小鼠体重1ng、5ng、20ng的IL-37，对照组注射PBS。其中，注射20ng每克体重的小鼠死亡。小鼠出生后第17d，腹腔注射4％水合氯醛。打开小鼠胸腔，于左心室灌注异硫氰酸葡聚糖荧光素(FITC-dextRan，50mg/ml)，然后立即摘取眼球，置于4％多聚甲醛中避光4℃固定过夜。次日在解剖显微镜下取出角膜、晶状体、玻璃体后，将视网膜小心剥离置于载玻片上，以视乳头为中心成放射状，滴加明胶后封片，于荧光显微镜下观察并拍照，分析病理性血管生成情况。

结果表明，IL-37能显著促进病理性新生血管的生成(图3a)。

为进一步明确IL-37同病理性新生血管生成的关系，同样构建氧诱导的视网膜模型并在小鼠出生后2d至5d时，每天注射1ng/g、15ng/g体重的IL-37。在荧光显微镜下观察小鼠视网膜的新生血管状况。

结果表明，IL-37能明显促进视网膜新生血管的生成，血管密度和tip细胞的数量也明显上升(图3b、图3c)。

实施例4

眼药水的制备

利用常规技术，混合以下组分，制得1％眼药水，其配方如下：

IL-37拮抗剂(如特异性抗体) 10mg

羟丙基甲基纤维素 0.03g

无菌水 加至10ml

调节渗透压至300Osm，酸碱度(pH)至6.8-7.1。

经4位志愿者试用一周，每日3次，每次1滴/眼。结果表明该眼药水可抑制眼部的血管新生。

综上所述，本发明的IL-37的拮抗剂(如特异性抗体)可抑制血管内皮细胞增殖、迁移，具有广泛的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种白介素37或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备(a)促进血管生成的药物或制剂；(b)促进静脉内皮细胞的增殖的药物或制剂；和/或(c)促进静脉内皮细胞的迁移的药物或制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物含有：

(a)白介素37的激动剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

3.一种白介素37拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备(a)抑制血管生成的药物或制剂；(b)抑制静脉内皮细胞的增殖的药物或制剂；和/或(c)抑制静脉内皮细胞的迁移的药物或制剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物或制剂还用于抑制肿瘤细胞的生长。

5.一种筛选促进血管生成或抑制血管生成的物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中IL-37的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中IL-37的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的IL-37的表达量和/或活性显著高于对照组，就表明该测试化合物是对IL-37的表达和/或活性有促进作用的促进血管生成的候选化合物；而如果测试组中细胞的IL-37的表达量和/或活性显著小于对照组，就表明该测试化合物是对IL-37的表达和/或活性有抑制作用的抑制血管生成的候选化合物；和/或

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对血管生成的促进作用或抑制作用。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对静脉内皮细胞迁移的促进作用或抑制作用。

7.一种用于抑制血管生成的药物组合物，其特征在于，它含有：

(a)白介素37的拮抗剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(注射剂)、眼用凝胶或眼药膏。

9.一种促进或抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用白介素37或其激动剂，从而促进血管新生；或给需要的对象施用白介素37的拮抗剂，从而抑制血管新生。

10.一种体外非治疗性的促进或抑制静脉内皮细胞增殖和/或迁移的方法，其特征在于，

所述方法包括步骤:在白介素37或其激动剂存在下，培养静脉内皮细胞，从而促进静脉内皮细胞增殖和/或迁移；或

所述方法包括步骤:在白介素37拮抗剂存在下，培养静脉内皮细胞，从而抑制静脉内皮细胞增殖和/或迁移。