CN104004057B - 一类抑制新生血管的小肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类预防和抑制血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。

Description

一类抑制新生血管的小肽及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽，称之为UK12多肽。具体地说，本发明涉及UK12多肽的氨基酸序列和制备方法，以及该多肽抑制体外血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成和抑制体内小鼠视网膜新生血管的作用。

背景技术

新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括：现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。

在眼部,约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如：单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管,年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血管常规运用激光光凝、光动力学疗法(Photodynamic therapy,PDT)以及经瞳孔温热疗法(Thermal transpupillary therapy,TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部组织易造成破坏，其远期疗效也并不十分令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。

在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。

第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如：氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。

第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正 相关。

第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源,可对眼部组织(如:葡萄膜)造成免疫损伤。

第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)，它由纤溶酶原Kringle结构域1-4(plasminogen Kringle1-4)组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab(Avastin)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段ranibizumab(Lucentis)等，但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血管栓塞等风险。

由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，对新生血管性眼病的临床防治具有十分重要的意义。

因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13] (I)

式中，

Xaa0是无，或1～3个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Tyr；Trp；Phe；Thr；或Ser；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Val；Ile；Leu；Met；Phe；或Ala；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Gln；或Asn；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Val；Ile；Leu；Met；Phe；或Ala；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly；Pro；或Ala；

Xaa6是选自下组的氨基酸Leu；Ile；Val；Met；Ala；或Phe；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Lys；Arg；Gln；或Asn；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Pro；或Ala；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Leu；Ile；Val；Met；Ala；或Phe；

Xaa10是选自下组的氨基酸：Val；Ile；Leu；Met；Phe；或Ala；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Gln；或Asn；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Glu；或Asp；

Xaa13是无，或1～3个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性,且所述多肽的长度为12～18个氨基酸。

更佳地，所述的多肽中：

Xaa0是无；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Tyr；或Phe；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Val；或Leu；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Gln；或Asn；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Val；或Leu；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly；或Ala；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Leu；或Ile；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Lys；或Arg；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Pro；或Ala；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Leu；或Ile；

Xaa10是选自下组的氨基酸Val；或Leu；

Xaa11是选自下组的氨基酸：Gln；Asn；

Xaa12是选自下组的氨基酸：Glu；Asp；

Xaa13是无。

在另一优选例中，所述多肽的长度为12～16个氨基酸；

在另一优选例中，所述多肽的长度为11～14个氨基酸。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-4，更佳地1-3个，最佳地，1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70%的SEQ ID NO:2的所示多肽的抑制血管新生活性。

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO:2的相同性≥80%，较佳地≥90%；更佳地≥95%。

本发明还提供了具有抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。

在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。

在本发明的第四方面，提供了本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。

在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了小肽UK12对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖的影响。小VEGF10ng/ml能够显著诱导HUVECs增殖，与无VEGF对照组相比，差异具有统计学意义(＃＃与No VEGF组相比，P<0.01)。UK12在浓度为100nM、1μM、10μM时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖，并且随着UK12浓度的增加，抑制作用逐渐增强。(**与VEGF组相比，P<0.01)。UK12S多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs增殖的作用。

图2显示了UK12多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞迁移的抑制作用VEGF25ng/ml能够显著诱导HUVECs迁移，与无VEGF对照组相比，差异具有统计学意义(＃＃与No VEGF组相比，P<0.01)。UK12在浓度为1μM、10μM时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs迁移，并且随着UK12浓度的增加，抑制作用明显增强(**与VEGF组相比，P<0.01)。UK12S多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs迁移的作用。

图3显示了UK12多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞管腔形成的抑制作用。

A图为No VEGF组管腔样结构形成少，B图为VEGF组管腔样结构形成明显增多，彼此交错呈网状。C图UK12多肽10μM浓度时管腔样结构形成与VEGF组相比明显减少。D图UK12S多肽10μM浓度时管腔样结构形成与VEGF组相比无明显减少。E图UK12多肽在浓度为100nM、1μM、10μM时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs管腔形成，并且随着浓度的增加，抑制作用明显增强(**与VEGF组相比，P＜0.01)。UK12S多肽不能抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成。

图4显示了视网膜Isolectin染色后，UK12多肽抑制小鼠视网膜新生血管。

空气+PBS组及空气+UK12多肽组小鼠视网膜血管形态正常，无视网膜血管扩张迂曲等改变；氧气+PBS组小鼠视网膜中央可见大片无灌注区，视网膜血管扩张迂曲，在中央无灌注区和周边灌注区交界处可见大量异常新生血管；与氧气+PBS组相比，氧气+UK12多肽组小鼠视网膜中央无灌注区面积明显缩小，中央视网膜血管扩张迂曲情况好转，视网膜异常新生血管减少；氧气+UK12S多肽组小鼠视网膜中央也可见大片无灌注区，视网膜血管扩张迂曲明显，在中央无灌注区和周边灌注 区交界处可见大量异常新生血管。(圆圈显示新生血管丛，星号显示无灌注区，箭头显示突出于视网膜表面的新生血管)

图5显示了视网膜组织切片HE染色后，UK12多肽抑制小鼠视网膜新生血管。

空气+PBS组和空气+UK12多肽组突出于视网膜内界膜的有核细胞数相比差异不具有统计学意义(p>0.05)。高氧+PBS组和高氧+UK12S组可见大量突出于内界膜长入玻璃体腔的有核细胞，组成管腔样结构，两者相比差异不具有统计学意义(p>0.05)。高氧+UK12组仅见少量突出于内界膜长入玻璃体腔的有核细胞，与空气+PBS组相比差异具有统计学意义(p<0.01)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类具有抑制血管新生功能的，分子量小于3kD的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，对源自人体的各种蛋白的不同区域进行了大量的筛选，从中鉴别并合成了一类小分子多肽(如UK12)，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经氧诱导小鼠视网膜新生血管模型、VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型和人脐静脉内皮细胞管腔模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生相关疾病的小分子多肽。在此基础上完成了本发明。

本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。

尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)

uPA是一种高度特异的丝氨酸蛋白酶，基因位于第10号染色体，分子质量55ku，以低活性的前体分泌(pro_uPA)。uPA由一个羧基端蛋白酶区域、一个生长因子样的区域和一个kringle结构域组成，其中uPA的kringle结构域为一种大分子蛋白类新生血管抑制剂，能够抑制碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和上皮细胞生长因子(EGF)诱导的内皮细胞增生，并且能够有效的抑制体内新生血管形成。

活性多肽

在本发明中，术语“本发明多肽”、“UK12多肽”、“UK12小肽”、“短肽UK12”或“肽UK12”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽UK12氨基酸序列(如SEQ ID NO:2所示)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为4个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。一种典型的多肽为C末端和/或N末端缺失一个氨基酸，即构成12个氨基酸的多肽。

本发明还包括UK12多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)UK12多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多4个，更佳地至多3个，最佳地1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu

Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro；Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供UK12多肽的类似物。这些类似物与天然UK12多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬 酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

编码序列

本发明还涉及编码UK12多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是(SEQ ID NO:1，编码序列：tatgtgcaggtgggcctaaagccgcttgtccaa gaa)，它编码SEQ ID NO:2所示的短肽UK12。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:1为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列的多肽，但与SEQ ID NO:1中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的UK12核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或UK12多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

另一方面，本发明还包括对UK12多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以 除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中，本发明多肽UK12，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的UK12多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码UK12多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后 获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

血管新生相关疾病

在本发明中，血管新生相关疾病没有特别限制，包括本领域中已知的各种与血管新生相关的疾病。代表性的、与血管新生相关的疾病例子包括(但并不限于)：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。

优选地，所述的新生血管性眼病包括(但并不限于)：累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成 在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药膏。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

例如，眼药水的配制可这样进行：将短肽UK12或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽UK12或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽UK12或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽UK12或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt%，较佳地1-4wt%，每日可2-6次给药，每次1-2滴。

工业应用性

含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生有显著的抑制活性。经动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生及氧诱导的小鼠视网膜新生血管，而且可以抑制人脐静脉血管内皮 细胞的增殖及管腔形成。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明多肽UK12的分子量小，可透过眼组织屏障；

(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；

(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用；

(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低；

(e)本发明多肽的稳定性好。

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤新生血管等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

小肽UK12及衍生多肽的合成

利用SYMPHONY型12通道多肽合成仪(美国Protein Technologies公司)，根据其软件(Version.201版)计算和配制所需要的Fmoc保护氨基酸溶液，缩合试剂和切割试剂。编辑程序，其中树脂溶涨时间为30min；脱保护两次，时间分别为5min和15min；缩合时间为30min；切割时间为2h。开机按照上述程序合成多肽，采用高效液相色谱仪(SHIMADZU公司)纯化多肽，获得纯度>95%的白色粉末状多肽。

取少量的成品小肽UK12，进行HPLC分析的纯度鉴定和ESI-MS的分子量鉴定。

结果显示，纯度鉴定大于95%，小肽UK12共有12个氨基酸，分子量约为1.788Kd，与预测值相符。小肽UK12为YVQVGLKPLVQE(SEQ ID NO.:2)。

将白色粉末状的小肽，密封包装，置于-20℃长期保存。

实施例2UK12多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖

(1)人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的体外培养

原代HUVECs(购自ScienCell公司)采用ECM培养基添加ECGS(ScienCell公司)以及5%胎牛血清(ScienCell公司)，培养于37℃、含5%CO₂的培养箱中。本发明中所有体外细胞实验均采用第3～8代HUVECs细胞。

(2)MTS方法检测UK12多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖

MTS细胞增殖定量检测方法是一种通过四氮唑和电子偶联化合物在代谢旺盛细胞线粒体脱氢酶的作用下，产生水溶性有色产物，作为检测信号来比色定量测定活细胞增殖的方法。

具体实施方法如下：HUVECs生长接近融合后，传代，按照3.5×10⁴/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，37℃、5%CO₂培养箱中培养24h后，更换无血清ECM培养基，细胞饥饿过夜。吸出96孔板内培养基，各组分别加入含有浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM UK12多肽药物的无血清培养基50μl，37℃预处理30min后，各孔加入含有VEGF(R&D公司)的无血清培养基，使VEGF的终浓度为10ng/ml。另设空白对照组(无VEGF无多肽组)和VEGF对照组，每个实验组设置5个平行孔。37℃、5%CO₂培养箱中继续培养24h后，各孔中加入20μlMTS溶液(Promega公司)，37℃作用1～4h，酶标仪(Bio-Rad公司)490nm检测各孔的吸光值。

结果：与空白对照组相比，VEGF组各孔OD值明显增加，并且差异具有统计学意义(LSD法，P<0.01),表明10ng/mlVEGF能够有效刺激HUVECs增殖。与VEGF组相比，UK12组100nM、1μM、10μM时各孔OD值明显降低，并且差异具有统计学意义(LSD法，P<0.01)，表明UK12多肽在浓度为100nM、1μM、10μM时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖，并且随着UK12多肽浓度的增加，抑制作用逐渐增强。与VEGF组相比，打乱UK12多肽氨基酸序列合成的对照多肽UK12S(KGEQLLPYVVQV，SEQ ID NO.:12)在1nM～10μM浓度范围内，各孔OD值无明显改变，差异不具有统计学意义(LSD法，P>0.05)，表明UK12多肽抑制VEGF诱导HUVECs增殖作用具有序列依赖性。

结论：UK12多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖，并且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性。

实施例3UK12多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞迁移

血管内皮细胞迁移实验采用Transwell小室(Corning公司)方法。

具体实施方法如下：HUVECs生长接近融合后，无血清培养基饥饿过夜，0.25%胰酶消化，制成细胞悬液。将多肽与含有4×105个HUVECs的细胞悬液混合，配制成体积为100μL、UK12多肽浓度分别为1nM、10nM、100nM、1μM、10μM的上室液，37℃培养箱中预处理30min后，加入上室。下室中加入含有25ng/mlVEGF的无血清培养基600μL作为趋化因子。将Tranwell小室37℃培养箱中继续培养24小时，取出Transwell上室，棉签擦去聚碳酸酯膜上室面未迁移的细胞，苏木素染色。显微镜下观察迁移到聚碳酸酯膜下室面的细胞数。每个小室膜取5个视野，取5个视野中细胞的平均数进行比较。

结果：在相同条件下，VEGF组与空白对照组相比，每个视野平均迁移细胞数量明显增加，两者差异具有统计学意义(LSD法，P<0.01)，表明25ng/mlVEGF能够有效诱导HUVECs迁移。UK12多肽1nM、10nM、100nM组每个视野平均迁移细胞数量与VEGF组相比无明显减少，差异不具有统计学意义(LSD法，P>0.05)。UK12多肽1μM、10μM组每个视野平均迁移细胞数量与VEGF组相比显著减少，差异具有统计学意义(LSD法，P<0.05)。与VEGF组相比，UK12S多肽10μM组迁移细胞数量无明显改变，差异不具有统计学意义(LSD法，P>0.05)。上述结果表明UK12多肽能够抑制VEGF诱导的HUVECs迁移。

结论：UK12多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞迁移，并且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性。

实施例4UK12多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔形成

血管内皮细胞管腔形成实验采用Matrigel(BD公司)联合VEGF诱导管腔形成方法。

具体实施方法如下：无生长因子Matrigel预先包被预冷的96孔板，每孔50μl，37℃聚合30min。HUVECs生长接近融合后，无血清培养基饥饿过夜，0.25%胰酶消化，制成细胞悬液。将不同浓度的UK12多肽溶液(1nM、10nM、100nM、1μM、10μM)分别与含有3×104个HUVECs的细胞悬液混合，37℃培养箱中预处理30min后，各组加入含有VEGF(R&D公司)的无血清培养基，使VEGF的终浓度为15ng/ml。另设空白对照组(无VEGF无多肽组)和VEGF对照组(无多肽组)，将上述细胞悬液加入铺满Matrigel的96孔板内，每个实验组设置5个平行孔，37℃培养箱中继续培养6小时。倒置显微镜下观察细胞管腔形成情况，每孔选取4个视野拍照记录。应用 NIH ImageJ1.32图象分析软件比较各组管腔形成长度。

结果：在相同条件下，空白对照组(无VEGF无多肽组)血管内皮细胞排列形成管腔样结构少，VEGF组管腔样结构形成明显增多，彼此交错呈网状，两组间管腔形成长度相比差异具有统计学意义(LSD法，P<0.01)，表明15ng/ml VEGF能够有效诱导HUVECs管腔形成。UK12多肽1nM、10nM各组管腔样结构形成相对长度与VEGF组相比无明显减少，100nM～10μM浓度时各组管腔样结构形成与VEGF组相比明显减少,差异具有统计学意义(LSD法，P<0.01)，并且各组随着多肽浓度的增加，抑制作用逐渐增强。与VEGF组相比，UK12S多肽10μM组内皮细胞管腔形成相对长度无明显改变，差异不具有统计学意义(LSD法，P>0.05)。

结论：UK12多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔形成，并且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性。

实施例5UK12多肽抑制体内高氧诱导小鼠视网膜新生血管

本发明将采用体内高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型说明UK12多肽抑制体内新生血管的作用。

具体步骤如下：

(1)高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型的建立：

出生7d C57BL/6乳鼠连同母鼠置于75%±2%氧气浓度密闭暖箱中，饲养5d后(即小鼠出生后第12天)，取出小鼠，放置于正常氧浓度环境中继续饲养5天；同时将在正常氧浓度环境中饲养的乳鼠做为对照组。

(2)UK12多肽干预视网膜新生血管实验分组：每组包括1窝(7-9只)小鼠，每只小鼠取右眼作为实验眼(表2)。分别在小鼠生后第12天和第14天，行玻璃体腔注射，至生后第17天，以过量麻醉处死小鼠，取眼球。

表2UK12多肽抑制小鼠视网膜新生血管实验分组情况

组别	玻璃体腔注射
		空气+PBS组	PBS1μl
空气+UK12组	UK121μl(50mM)
		氧气+PBS组	PBS1μl
氧气+UK12多肽组	UK121μl(50mM)
		氧气+UK12S多肽组	UK12S1μl(50mM)

(3)Isolectin荧光染色方法定量观察小鼠视网膜新生血管、无灌注区等变化情况；同时行小鼠视网膜组织切片HE染色观察，定量分析视网膜新生血管变化。

(4)结果：

小鼠视网膜铺片Isolectin荧光染色观察显示，空气+PBS组小鼠视网膜血管形态正常，未见明显视网膜血管扩张迂曲等改变，未见无灌注区；空气+UK12多肽组小鼠视网膜血管形态正常，无视网膜血管扩张迂曲等改变，说明UK12多肽玻璃体腔注射未影响小鼠视网膜血管的正常构建。氧气+PBS组小鼠视网膜中央可见大片无灌注区，视网膜血管扩张迂曲，在中央无灌注区和周边灌注区交界处可见大量异常新生血管；与氧气+PBS组相比，氧气+UK12多肽组小鼠视网膜中央无灌注区面积明显缩小，中央视网膜血管扩张迂曲情况好转，视网膜异常新生血管减少；氧气+UK12S多肽组小鼠视网膜中央也可见大片无灌注区，视网膜血管扩张迂曲明显，在中央无灌注区和周边灌注区交界处可见大量异常新生血管。

小鼠视网膜组织切片HE染色观察并计数突出于内界膜的有核细胞数显示，空气+PBS组和空气+UK12多肽组突出于视网膜内界膜的有核细胞数分别为3.49±1.06个和3.21±1.43个，两者相比差异不具有统计学意义(p>0.05)。高氧+PBS组和高氧+UK12S组可见大量突出于内界膜长入玻璃体腔的有核细胞，组成管腔样结构，两者突出于视网膜内界膜的有核细胞数分别为24.62±5.20个和26.33±7.04个，两者相比差异不具有统计学意义(p>0.05)，说明UK12S多肽不能够有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管。高氧+UK12组仅见少量突出于内界膜长入玻璃体腔的有核细胞，平均数量为11.58±3.82个，与空气+PBS组相比差异具有统计学意义(p<0.01)，说明UK12多肽能够有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管，并且抑制作用具有序列依赖性。

结论：小分子多肽UK12在体外能够全面抑制血管新生过程中血管内皮细胞的增殖、迁移与管腔形成，并且能够有效抑制体内新生血管生长。

实施例5

衍生多肽的活性测试

按实施例3所示的方法，测定各UK12衍生多肽的抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖效应。结果如表3所示：

表3

样品	序列	SEQ ID NO.:	平均OD490
				衍生多肽1(UK12-1)	YVQVGLKPLIQE	3	0.652
衍生多肽2(UK12-2)	YVQIGLKPFVQE	4	0.655
				衍生多肽3(UK12-3)	FVQVGLKPLVQD	5	0.648
衍生多肽4(UK12-4)	PWCYVQVGLKPLVQECMV	6	0.642
				衍生多肽5(UK12-5)	YVQVGLKPLVQ	7	0.661
衍生多肽6(UK12-6)	YVQIGLRPFVQFY	8	0.662
				对照(VEGF)			0.74

结果表明，与对照组相比，衍生多肽1-6在低浓度(10μM)都具有显著抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的效应。

实施例6

眼药水的制备

利用常规技术，混合以下组分，制得1%眼药水，其配方如下：

经5位志愿者试用一周，每日3次，每次1-2滴/眼。结果表明，该眼药水可抑制眼部的血管新生。

对比例1

对uPA的Kringle结构域进行片段切割与筛选，最后定位到除本发明以外的以下3个肽段，分别命名为UK20、UK30、UK10，按照实施例2的方法进行测试，氨基酸序列及结果如表4：

表4

肽段	SEQ ID NO.:	序列	平均OD490
				UK20	9	YEGNGHFYRGKASTDTMGRP	0.721
UK30	10	LPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNY	0.712
				UK10	11	RNPDNRRRPW	0.719
对照(VEGF)			0.720
				阴性对照			0.639

上述三段肽段分别位于uPA氨基酸序列中第71～90位、第92～121位、第123～132位。

结果显示，uPA的Kringle结构域中的小肽片段UK20、UK30、UK10并未降低VEGF组中的OD值，因此，这些肽段对抑制血管新生并无作用。

讨论

Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守双环结构。本发明人对uPA的Kringle结构域进行了大量的片段切割与筛选，最后定位到的肽段，命名为UK12，位于uPA氨基酸序列的第134～145位。

经实验证明uPA的Kringle结构域中，UK12小肽及其衍生多肽具有良好的抑制体内外血管新生的作用。因此，UK12及其衍生多肽作为小分子肽段用于治疗血管新生及其相关疾病中，有着良好的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13] (I)

式中，

Xaa0是无；

Xaa1是Tyr；

Xaa2是Val；

Xaa3是Gln；

Xaa4是Val；

Xaa5是Gly；

Xaa6是Leu；

Xaa7是Lys；

Xaa8是Pro；

Xaa9是Leu

Xaa10是Val；

Xaa11是Gln；

Xaa12是Glu；

Xaa13是无。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的多肽。

3.一种药物组合物，其特征在于，其含有：

(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为针剂、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。

5.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关的疾病的药物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关的疾病选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎 症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。