CN109970847A - 一类新的抑制新生血管的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新的抑制血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点,例如分子量小,可透过各种眼组织屏障;水溶性好,能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地一类新的抑制新生血管的多肽及其应用,所述的小肽是源于insulin-like growth factors II(IFG-II)的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术
新生血管的形成是一个极其复杂的过程,它包括:现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。
在眼部,约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关,例如:单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管,年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管,以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上,对于眼部病理性新生血管常运用激光光凝、光动力学疗法 (Photodynamic therapy,PDT)以及经瞳孔温热疗法(Thermal transpupillary therapy,TTT)等进行治疗。然而,这些治疗手段对局部组织易造成破坏,其远期疗效也并不十分令人满意。近年来抗血管内皮生长因子(anti-vascularendothelial growth factor,anti-VEGF)制剂的出现为临床治疗提供了新的武器,但是仍然面临着频繁眼内注射、无反应及耐药等问题。因此,人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。
在开发有效的血管新生抑制剂时,应充分考虑到眼科用药的特殊性。
第一,眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度;局部给药,如玻璃体腔注射,大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药,药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质,因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如:氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。
第二,药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
第三,基于上述主要原因,眼科用药的生物利用度很低;要使之提高,可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显,全身和局部均无法高剂量给药。此外,分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源, 可对眼部组织(如:葡萄膜)造成免疫损伤。
第四,目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实,如血管抑素(angiostatin),它由纤溶酶原Kringle结构域1-4 (plasminogen Kringle 1-4)组成,可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长,但由于其分子量较大且空间构象复杂,故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。
第五,目前用于治疗眼部新生血管的药物如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab(Avastin)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段ranibizumab(Lucentis) 等,价格高昂,需反复经玻璃体腔给药,甚至可引起血管栓塞等风险。在广泛的临床实践中,无反应及耐药等问题也提示我们需要寻找新的制剂通过不同的作用机制以达到抑制新生血管的目的。
由此可见,寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂通过新的作用途径以抑制新生血管,经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障,提高眼局部的生物利用度,降低给药剂量,减少局部和全身的副作用,对新生血管性眼病的临床防治具有十分重要的意义。因此,本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。
在本发明的第一方面,提供了一种下式I表示的多肽,或其药学上可接受的盐:
Z0-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CH R10-T-CHR11-T-CHR12-Z1
式I;
Z0为-NH2,或-NHY0,其中,Y0为1-2个氨基酸的肽段;
Z1为-COOH,或-COOY1,其中,Y1为1-2个氨基酸残基;
各T为-CO-NH-,
其中,
R1选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R2选自:(a)巯甲基(HSCH2-)和(b)羟甲基;
R3选自:(a)H和(b)甲基;
R4选自:(a)H和(b)甲基;
R5选自:(a)羧基亚乙基和(b)羧基亚甲基;
R6选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R7选自:(a)异丙基和(b)异丁基;
R8选自:(a)羧基亚甲基和(b)羧基亚乙基;
R9选自:(a)羟乙基和(b)羟甲基;
R10选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R11选自:(a)酰胺亚乙基和(b)酰胺亚甲基;
R12选自:(a)苄基和(b)异丁基;且所述的多肽或其药学上可接受的盐具有抑制血管新生的活性。
在另一优选例中,R1-R12中,至少9个为(a)类基团,优选至少10个、11 个、12个为(a)类基团。
在另一优选例中,所述多肽与式I0所示的结构相比,R1-R12中有0-1个基团被取代,
NH2-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-COOH
式I0;
其中,
R1选自:异丁基;
R2选自:巯甲基(HSCH2-);
R3选自:H;
R4选自:H;
R5选自:羧基亚乙基;
R6选自:异丁基;
R7选自:异丙基;
R8选自:羧基亚甲基;
R9选自:羟乙基;
R10选自:异丁基;
R11选自:酰胺亚乙基;
R12选自:苄基。
在另一优选例中,所述多肽的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例,所述SEQ ID NO.:1所示的序列具有式I0所示的结构:
NH2-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-COOH
式I0;
其中,
R1选自:异丁基;
R2选自:巯甲基(HSCH2-);
R3选自:H;
R4选自:H;
R5选自:羧基亚乙基;
R6选自:异丁基;
R7选自:异丙基;
R8选自:羧基亚甲基;
R9选自:羟乙基;
R10选自:异丁基;
R11选自:酰胺亚乙基;
R12选自:苄基。
在另一优选例中,所述多肽具有SEQ ID NO.:1-13所示的序列。
在另一优选例中,-T-CHRn-T-为-NH-CHRn-CO-,构成氨基酸残基,其中n 为1-12的正整数。
在另一优选例中,-CHRn-与在其位置前端的-NH-以及在其位置后端的-CO- 依次相连构成氨基酸残基,其中n为1-12的正整数。
在另一优选例中,所述多肽具有式I0所示的结构。
本发明第二方面提供了一种式II所示的多肽,或其药学上可接受的盐
[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13](II)
式中,
Xaa0是无,或1-3个氨基酸构成肽段;
Xaa1是选自下组的氨基酸:Leu、Ile、Val、Met、Ala、Phe;
Xaa2是选自下组的氨基酸:Cys、Ser;
Xaa3是选自下组的氨基酸:Gly、Pro、Ala;
Xaa4是选自下组的氨基酸:Gly、Pro、Ala;
Xaa5是选自下组的氨基酸:Glu、Asp;
Xaa6是选自下组的氨基酸:Leu、Ile、Val、Met、Ala、Phe;
Xaa7是选自下组的氨基酸:Val、Ile、Leu、Met、Phe、Ala;
Xaa8是选自下组的氨基酸:Asp、Glu;
Xaa9是选自下组的氨基酸:Thr、Ser;
Xaa10是选自下组的氨基酸:Leu、Ile、Val、Met、Ala、Phe;
Xaa11是选自下组的氨基酸:Gln、Asn;
Xaa12是选自下组的氨基酸:Phe、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr;
Xaa13是无,或1-3个氨基酸构成肽段;
所述多肽与SEQ ID NO.:1相比,其氨基酸序列的同一性(identity)≥85%;并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。
在另一优选例中,
Xaa1是选自下组的氨基酸:Leu和Ile;
Xaa2是选自下组的氨基酸:Cys和Ser;
Xaa3是选自下组的氨基酸:Gly和Ala;
Xaa4是选自下组的氨基酸:Gly和Ala;
Xaa5是选自下组的氨基酸:Glu和Asp;
Xaa6是选自下组的氨基酸:Leu和Ile;
Xaa7是选自下组的氨基酸:Val和Leu;
Xaa8是选自下组的氨基酸:Asp和Glu;
Xaa9是选自下组的氨基酸:Thr和Ser;
Xaa10是选自下组的氨基酸:Leu和Ile;
Xaa11是选自下组的氨基酸:Gln和Asn;
Xaa12是选自下组的氨基酸:Phe和Leu。
在另一优选例中,
Xaa1为Leu;
Xaa2为Cys;
Xaa3为Gly;
Xaa4为Gly;
Xaa5为Glu;
Xaa6为Leu;
Xaa7为Val;
Xaa8为Asp;
Xaa9为Thr;
Xaa10为Leu;
Xaa11为Gln;
Xaa12为Phe。
在另一优选例中,所述多肽是人工合成。
在另一优选例中,所述多肽不是SEQ ID NO.:1所示的多肽。
在另一优选例中,所述多肽选自下组:
(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽;
(b)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过1-5个(较佳地1-3,更佳地1-2 个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有抑制血管新生功能的由(a) 衍生的多肽。
在另一优选例中,所述的多肽是由SEQ ID NO.:1所示的多肽经过1-3个较佳地1-2个,更佳地1个氨基酸取代、缺失;和/或
经过1-5,较佳地1-4个,更佳地1-3个,最佳地1-2个氨基酸的添加形成的。
在另一优选例中,所述的多肽长度为5-20个氨基酸,较佳地,8-18个,更佳地,10-15个,更佳地,11-14个。
在另一优选例中,所述的衍生多肽保留了≥70%的SEQ ID NO:1的所示多肽的抑制血管新生活性。
在另一优选例中,所述的衍生多肽与SEQ ID NO:1的相同性≥80%,较佳地≥90%;更佳地≥95%。
本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式,且所述二聚体和多聚体形式具有抑制血管新生活性。
本发明第三方面提供了一种分离的核酸分子,所述核酸分子编码本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。
本发明第四方面提供了一种药物组合物,包括:
(a)治疗有效量的本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐;和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述的多肽保留了≥70%、75%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、 150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、或200%的 SEQ ID NO:1所示多肽的抑制血管新生活性。
在另一优选例中,所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液,尤其是玻璃体腔内注射)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中,所述的组合物为缓释剂型。
本发明第五方面提供了一种本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐的用途,用于制备治疗血管新生相关疾病的药物。
在另一优选例中,所述的血管新生相关疾病选自下组:缺血缺氧性眼病,新生血管性眼病、肿瘤、缺血缺氧性脑病、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger’s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病、或其组合。
在另一优选例中,所述血管新生相关疾病为IGF-1R受体相关的血管新生相关疾病,包括神经变性性疾病(例如糖尿病性视网膜病变、阿尔兹海默症)。
在另一优选例中,所述药物还用于选自下组的一种或多种用途:
(a)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖;
(b)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的迁移;
(c)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞趋化作用;
(d)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成;
(e)抑制氧诱导的新生血管的形成。
本发明第六方面提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法,包括步骤:给需要的对象施用本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中,所述的施用包括眼表施用或玻璃体腔内注射施用
在另一优选例中,所述的对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中,所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第七方面提供了一种治疗血管新生相关疾病的方法,包括步骤:向需要的对象施用治疗有效量的本发明第一方面或本发明第二方面所述的多肽、和/ 或本发明第三方面所述药物组合物。
在另一优选例中,所述的对象是人或非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了显示了CW-703多肽对VEGF诱导的HUVECs细胞增殖的作用影响。其中,n=6,#表示与VEGF组相比p<0.05,##表示与VEGF组相比p<0.01, ###表示与VEGF组相比p<0.001,*表示与无血清组相比p<0.05,**表示与无血清组相比p<0.01。
图2显示了CW-703多肽抑制VEGF诱导的HUVECs迁移(6h),其中A:无血清组;B:VEGF(25ng/ml)组;C:VEGF+CW-703多肽(10nM)组;D:VEGF+CW-703 多肽(100nM)组;E:VEGF+CW-703多肽(1μM)组;F:VEGF+CW-703多肽(10μ M)组;G:VEGF+CW-703多肽(100μM)组;H:VEGF+Ranibizumab(1mg/ml)组; I:VEGF+CW-703s(100μM)组(虚线表示初始划痕区域范围,×40);J:6h后各组划痕区域未被细胞覆盖面积的百分比(n=4,*表示与VEGF组相比,p<0.05;**表示与VEGF组相比,p<0.01)。
图3显示了CW-703多肽抑制VEGF诱导的HUVECs迁移(24h),其中A:无血清组;B:VEGF(25ng/ml)组;C:VEGF+CW-703多肽(10nM)组;D:VEGF+CW-703 多肽(100nM)组;E:VEGF+CW-703多肽(1μM)组;F:VEGF+CW-703多肽(10μM) 组;G:VEGF+CW-703多肽(100μM)组;H:VEGF+Ranibizumab(1mg/ml)组; I:VEGF+CW-703s(100μM)组;J:24h后各组划痕区域未被细胞覆盖面积的百分比(n=4,*表示与VEGF组相比,p<0.05;**表示与VEGF组相比,p<0.01;*** 表示与VEGF组相比,p<0.001;#表示与无血清组相比,p<0.05;###表示与无血清组相比,p<0.001)。
图4显示了CW-703多肽抑制VEGF诱导的HUVECs趋化迁移(24h),图片显示各组Transwell小室下室面的HUVECs细胞A:无血清组;B:VEGF(25ng/ml) 组;C:VEGF+CW-703多肽(10nM)组;D:VEGF+CW-703多肽(100nM)组;E: VEGF+CW-703多肽(1μM)组;F:VEGF+CW-703多肽(10μM)组;G:VEGF+ CW-703多肽(100μM)组;H:VEGF+CW-703s(100μM)组;I:VEGF+Ranibizumab(1mg/ml)组(×40)。J:24h后各组迁移趋化至Transwell小室下室面的HUVECs细胞个数(n=5,**表示与VEGF组相比,p<0.01;***表示与VEGF 组相比,p<0.001)。
图5显示了CW-703多肽抑制VEGF诱导的HUVECs管腔样结构形成(6h)。各组管腔样结构形成情况A:无血清组;B:VEGF(25ng/ml)组;C:VEGF+CW-703 多肽(10nM)组;D:VEGF+CW-703多肽(100nM)组;E:VEGF+CW-703多肽(1μM) 组;F:VEGF+CW-703多肽(10μM)组;G:VEGF+CW-703多肽(100μM)组;H: VEGF+CW-703s(100μM)组;I:VEGF+Ranibizumab(1mg/ml)组(×20);J:6h后各组管腔样结构形成的相对长度;K:6h后各组管腔样结构(“网眼结构”)个数; L:6h后各组管腔样结构(“网眼结构”)连接点个数(n=3,**表示与VEGF组相比,p<0.01;***表示与VEGF组相比,p<0.001)。
图6显示了MTS法检测CW-703多肽和CW-703s混杂序列多肽对正常HUVECs 细胞活性的影响(n=6)。
图7显示了不同浓度CW-703多肽和CW-703s多肽对正常HUVECs细胞凋亡的影响,其中A:无血清组;B:正常血清组;C:1nM CW-703多肽组;D:100nM CW-703多肽组;E:1nM CW-703s多肽组;F:100nM CW-703s多肽组;G:各组细胞凋亡率统计(n=5,***表示与正常血清组相比,p<0.001)。
图8显示了CW-703多肽抑制鸡胚尿囊膜模型血管新生;A-D分别代表:PBS 组(A)、10μg CW-703多肽组(B)、50μg CW-703多肽组(C)、50μg CW-703s 多肽组(D),图片显示滤纸片周围2.5mm范围内新生血管生长情况(×10)。E:各组CAM毛细血管生长数量(n=16,***表示与PBS组相比,p<0.001)。
图9显示了PBS组全视网膜铺片;A:空气+PBS组P17乳鼠全视网膜铺片:均匀一致的亮红色染色,视网膜血管主干光滑连续,毛细血管分布呈致密网状结构(×4);B:高氧+PBS组P17乳鼠全视网膜铺片:视网膜血管主干迂曲,与中央无灌注区交界处,大片新生血管丛(×4);C:视网膜新生血管(箭头所指)(× 10);D:视网膜中央无血管区(黄色圈内)(×4)。
图10显示了各浓度CW-703多肽抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成;A:高氧+5mMCW-703多肽组;B:高氧+10mM CW-703多肽组;C:高氧+20mM CW-703 多肽组;(×4)D:各组中央无灌注区面积比例(n=8)。
图11显示了CW-703多肽抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成;A:空气+PBS 组;B:空气+CW-703多肽组(10mM);C:空气+CW-703s多肽组(10mM);D:高氧+PBS组;E:高氧+CW-703多肽组(10mM);F:高氧+CW-703s多肽组(10mM); G:高氧+Ranibizumab组(10mg/ml);(×4)。H:高氧各组中央无灌注区面积比例(n=8);E:高氧各组新生血管面积比例(n=8,*表示与高氧+PBS组相比, p<0.05;**表示与高氧+PBS组相比,p<0.01;***表示与高氧+PBS组相比, p<0.001)。
图12显示了CW-703多肽抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成(视网膜组织切片HE染色),其中A:空气+PBS组;B:高氧+PBS组;C:空气+CW-703多肽组(10mM);D:高氧+CW-703多肽组(10mM);E:高氧+CW-703s多肽组(10mM); F:高氧+Ranibizumab组(10mg/ml);(×20)G:各组有核细胞计数情况。(n=10, *与高氧+PBS组相比P<0.05,**与高氧+PBS组相比P<0.01,***与高氧+PBS 组相比P<0.001。
图13显示了CW-703多肽的纯度分析报告(HPLC方法)。
图14显示了CW-703s多肽的纯度分析(HPLC方法)。
图15显示了质谱分析报告:CW-703多肽的分子量鉴定。
图16显示了质谱分析报告:CW-703s多肽的分子量鉴定。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次制备了一类源自胰岛素样生长因子 -II(insulin-like growth factor-II,IGF-II)的、具有抑制血管新生功能的,分子量小于3kD(如仅约1.3kD)的小分子多肽。具体而言,本发明人应用生物信息学的方法,基于同源性分析和生物学特性等分析,设计了数个候选序列,采用固相法将其合成,分离纯化获得高纯度的小肽CW-703,并运用HPLC及MS 对之进行鉴定,再经VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖(MTS)实验,血管内皮细胞迁移实验(划痕实验),血管内皮细胞趋化实验(Transwell小室实验),人脐静脉内皮细胞管腔实验,鸡胚尿囊膜血管模型以及氧诱导小鼠视网膜病变模型筛选,获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。
本发明的小肽的分子量小,可透过各种眼组织屏障;水溶性好,能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度;安全性高,对生物组织毒副作用小;眼局部用药生物利用度高,可减少剂量,从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
活性多肽
在本发明中,术语“本发明多肽”、“CW-703多肽”、“CW-703小肽”、“短肽CW-703”或“肽CW-703”可互换使用,都指具有血管新生抑制活性的肽 CW-703氨基酸序列(LCGGELVDTLQF,如SEQ ID NO:1所示)的蛋白或多肽。此外,所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-5个(通常为1-4个,较佳地1-3个,更佳地 1-2个,最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内,较佳地为3个以内,更佳地为2 个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外,所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括CW-703多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)CW-703多肽与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His 等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比,有至多5个,较佳地至多3个,更佳地至多2个,最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
发明还提供CW-703多肽的类似物。这些类似物与天然CW-703多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙磺酸。其他盐包括:与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐,以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码CW-703多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列如SEQ ID NO:14所示,CTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTC,它编码SEQ ID NO:1 所示的短肽CW-703(LCGGELVDTLQF)。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:14所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,以SEQ ID NO:14为例,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1序列的多肽,但与SEQ ID NO:14中相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的CW-703核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或ZY多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
另一方面,本发明还包括对CW-703多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。
在两个核酸或多肽的背景下,当进行最大相符性序列比较和比对时,术语“基本相同”是指两个或多个序列或亚序列,其具有至少约80%,例如至少约 85%、约90%、约95%、约98%或约99%的核苷酸或氨基酸残基与特定的参考序列具有同一性,如使用以下序列比较方法和/或通过肉眼检查所测定。
制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的,或重组的。相应地,本发明多肽可用常规方法人工合成,也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术,如Boc固相法、Fmoc 固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品,可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如,Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂,Wang树脂结构为聚苯乙烯,与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇;用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟,以除去Fmoc保护基团,并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后,用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基,可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后,用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时,优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂,PAM树脂结构为聚苯乙烯,与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺;在Boc合成系统中,在去保护、中和、偶联的循环中,用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后,用含对甲苯酚(5-10%) 的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时,将肽链从树脂上切下,同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽,溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化,然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基,例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC),羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU) 进行直接偶联。对于合成得到的短肽,其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中,本发明多肽CW-703,按其序列,采用固相合成的方法制备,行高效液相色谱纯化,获得高纯度目的肽冻干粉,-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的CW-703多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码CW-703多肽的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短,因此可以考虑将多个多肽串联在一起,重组表达后获得多聚体形式的表达产物,然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
药物组合物和施用方法
另一方面,本发明还提供了一种药物组合物,它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐;以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂,较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/ 千克,较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外,本发明的多肽可以单用,也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常,可将治疗性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物,可将其通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):眼表、眼周、眼内(尤其是玻璃体腔内)、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物;尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时,可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地,可以例举的有眼药水、针剂(尤其是玻璃体腔内注射剂)、眼用凝胶和眼药膏。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制,并且偶尔添加合适的药物添加剂,如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂,而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如,眼药水的配制可这样进行:将短肽CW-703或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中,调节渗透压和酸碱度至生理状态,并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂,然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如,短肽CW-703或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中,然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外,短肽CW-703或其盐还可通过插入预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子,可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等,较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时,作为活性成分的短肽CW-703 或其药学上可接受的盐的剂量,可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如,当局部滴眼时,通常其浓度约为0.1-10wt%,较佳地1-5wt%,每日可2-6次给药,每次1-2滴。
血管新生相关疾病
含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物,对血管新生有显著的抑制活性。
血管新生为一极其复杂的过程,其包括了现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。血管新生在创伤愈合以及多种疾病的发生中均起到关键作用。
在本发明中,所述血管新生相关疾病没有特别限制,包括本领域中已知的各种与血管新生相关的疾病。代表性的、与血管新生相关的疾病例子包括(但并不限于):新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger’s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。
优选地,所述的新生血管性眼病包括(但并不限于):累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜,包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。
在一优选实施方式中,所述血管新生相关疾病为IGF-1R受体相关的血管新生相关疾病,包括神经变性性疾病(例如糖尿病性视网膜病变、阿尔兹海默症)。
经动物试验证实,本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生,还可抑制大鼠角膜新生血管,而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖作用。
此外,在肿瘤和自身免疫疾病治疗方面,越来越多的研究表明,血管新生在肿瘤和自身免疫疾病如银屑病、风湿性关节炎的发生和预后中起到主导作用,也有很多研究证实,抑制血管新生是一种行之有效的对抗肿瘤或改善自身免疫疾病症状的方法。
血管内皮生长因子与血管新生
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是新生血管形成过程中的一个主要介导因子,VEGF基因经过转录水平的剪切至少可产生7种VEGF变异体,其中VEGF165(VEGF-A,即原型VEGF)是最常见、最主要的一种。其主要的生物学功能为:选择性增强血管内皮细胞有丝分裂,刺激血管内皮细胞增殖并促进血管形成;增强血管尤其是小血管的渗透性,使血浆蛋白等大分子(主要是纤维蛋白原)外渗沉积在血管外的基质中,为新生毛细血管网的建立提供营养。
因此,科研人员针对VEGF的抑制进行了很多研究。贝伐单抗 (Bevacizumab,即Avastin)是一种重组抗人VEGF单抗,它是第一个美国FDA 批准能运用于治疗转移性结肠癌患者的抗新生血管药物。玻璃体注射 bevacizumab亦能有效抑制视网膜及脉络膜新生血管。另一种VEGF抑制剂 Ranibizumab,是一种重组抗人VEGF单抗片段。它是第一个被美国FDA批准用于治疗眼部新生血管性黄斑变性的抗新生血管类药物。目前,人们仍在不断寻找新的更加安全有效的治疗眼部新生血管的药物。
实验模型及评价体系
鸡胚尿囊膜(CAM)模型
CAM实验最早运用于研究肿瘤,时间可以追溯到1913年,James B Murphy 记录了在CAM上接种Jensen大鼠肉瘤的试验。其后多年CAM实验较多的被用于研究肿瘤生物学,包括肿瘤的化学敏感性、肿瘤的浸润和转移、肿瘤新生血管形成等。
Murphy也同时记录了CAM免疫应答的缺失,后来的许多研究者证实并解释了这一现象:鸡胚早期(小于12天)的免疫系统发育尚不完全,对各种外来抗原处于免疫耐受阶段,因此对外来的分子不会产生排斥反应。
CAM血管生长的特点是在孵育的第3~5d、7~10d血管生长最活跃,12d以后CAM血管逐渐萎缩,因此选取孵育的第7~12d做为抑制新生血管药物刺激的最佳时间。
相较于其他的体内血管新生实验,CAM实验取材方便、容易观察,实验周期短、费用低,且操作技术容易掌握,因此作为血管生成体内实验的常用方法,被用于研究药物诱导或抑制血管新生的作用。
本研究中采用CAM模型评估CW-703多肽在体内抑制新生血管的作用,实验结果显示两组不同剂量的CW-703多肽组,CAM血管数量少于PBS组和CW-703s 混杂序列肽组,高浓度CW-703多肽组CAM无血管区域扩大,数据结果显示差异有统计意义,由此初步推断CW-703多肽能有效抑制CAM血管形成,且具有剂量依赖性和序列依赖性。
小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)模型
OIR模型的发展历史要追溯到70年前,Theodore L Terry最早报道了7例早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP),当时称为“晶体后纤维增生症”(retrolental fibroplasia)。
后续的众多研究者如Thaddeus S Szewczyk发现了氧浓度与ROP发病的密切关系。为更深入地研究ROP的发病机制,Norman Ashton用新生小猫构建了最早的氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,并将OIR 划分为两个阶段,血管闭塞期和血管增殖期(“vaso-obliterative”and “vaso-proliferative”)。其后在不断地改进中,各种类型OIR动物模型应运而生:大鼠、小鼠、比格幼犬和斑马鱼。
由于小鼠视网膜血管在出生一周后逐步发育成熟,新生小鼠视网膜血管与人类早产儿很类似,且在高氧状态下,小鼠的视网膜病理改变也与人类ROP相似,表现为出血、视网膜皱褶和玻璃体纤维血管改变。同时由于小鼠OIR模型制作周期短、易重复、可量化、价格低,已成为目前运用最广泛的OIR模型,在研究血管新生(angiogenesis)疾病的发生发展和发病机理方面,起着关键的作用;同时也是评价抗血管新生药物疗效的经典动物模型。
本发明中采用C57BL/6J小鼠OIR模型,评价人工合成多肽CW-703对视网膜新生血管的抑制作用。由于未经修饰的小分子多肽半衰期短,在体内易被蛋白酶降解,反复给药能较好地维持药物有效浓度,因此采用P12和P14两次玻璃体腔注射。实验结果显示,在高氧状态下,相较于PBS和CW-703s混杂序列肽,CW-703多肽能有效抑制小鼠视网膜新生血管的生长,使视网膜中央无灌注区面积和新生血管面积明显缩小,其作用效果与Ranibizumab接近,后者抑制视网膜新生血管的作用已经在大量的文献和临床实践中获得证明;有理由相信, CW-703多肽在体内具有有效的抑制新生血管作用。
视觉电生理
视觉电生理是通过记录分析视觉系统对光刺激的电活动变化,反映视网膜和视觉通路功能状态的一种技术。视网膜电流图(Electroretinogram,ERG)是视网膜受到光刺激后,从角膜到视网膜电反应的总和。ERG代表了视网膜各层从视锥、视杆细胞到无长突细胞的电活动。正常ERG包含一个负向的a波、一个正向的b波和b波上升段中的连续多个小波,即OPs(振荡电位)。a波起源于光感受细胞的内段,,是从角膜面引导的一个负相波,主要由视感受器电位构成;b波是ERG中的角膜正相成分,起源于muller细胞[90]或双极细胞;视网膜振荡电位(Oscillatory Potentials,OPs)是叠加于b波上升支的一系列 (4~6个)节律小波,是ERG的亚成份。起源与内丛状层,属于抑制性的反馈突触活动,代表突触后神经元反应。
角膜新生血管患者疗效判断标准
以最佳矫正视力、角膜新生血管(包括:新生血管面积、新生血管总长度、新生血管平均管径)为主要判定指标。治疗情况分为显效、有效和无效3个等级,分别计分。
显效:①视力提高4行以上;②角膜新生血管:新生血管面积减少≥30%、新生血管总长度减少≥20%、新生血管平均管径减少≥10%。
有效:①视力提高2行以上;②角膜新生血管:新生血管面积减少≥15%、新生血管总长度减少≥10%、新生血管平均管径减少≥5%。
无效:①视力无提高;②角膜新生血管:新生血管面积减少≤5%、新生血管总长度减少≤3%、新生血管平均管径减少≤1%。疗效判断标准如下:
以最佳矫正视力、角膜新生血管(包括:新生血管面积、新生血管总长度、新生血管平均管径)为主要判定指标。治疗情况分为显效、有效和无效3个等级,分别计分。
显效:①视力提高4行以上;②角膜新生血管:新生血管面积减少≥30%、新生血管总长度减少≥20%、新生血管平均管径减少≥10%。
有效:①视力提高2行以上;②角膜新生血管:新生血管面积减少≥15%、新生血管总长度减少≥10%、新生血管平均管径减少≥5%。
无效:①视力无提高;②角膜新生血管:新生血管面积减少≤5%、新生血管总长度减少≤3%、新生血管平均管径减少≤1%。
脉络膜新生血管患者疗效判断标准
以最佳矫正视力、彩色眼底照相、光学相干段层扫描(OCT)、眼底血管荧光造影(FFA)为判定指标。
最佳矫正视力:
提高:①视力提高≥2行;不变:①视力提高<2行;下降:①视力下降≥2 行。
以彩色眼底照相、光学相干段层扫描(OCT)、眼底血管荧光造影(FFA)获取 CNV病灶消退、渗漏或吸收的情况,将CNV分为4级:
①CNV完全闭合:CNV病灶完全无荧光渗漏,仅表现为CNV纤维染色,OCT 检查显示水肿消失;
②CNV部分闭合:荧光素渗漏范围小于治疗前CNV渗漏范围的50%,OCT检查显示只有少许视网膜下或层间积液;
③CNV小部分闭合:荧光素渗漏范围占据治疗前CNV渗漏范围的50%以上, OCT检查显示比较明显的视网膜下积液;
④CNV复发:出现新的CNV或CNV病变区荧光素渗漏范围超过原病灶边界, OCT检查显示明显的视网膜下积液。
工业应用性
含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物,对血管新生有显著的抑制活性。经动物试验证实,本发明多肽不仅可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生,还可抑制大鼠角膜新生血管,而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖作用。
图像处理和统计学分析
图像采用Image J 1.50i软件进行分析和测量,获得的数据以统计分析软件SPSS22.0统计软件包进行统计(Statistical Software,Los Angeles,CA,USA),实验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多个群组间变量分析比较,方差具有齐性时采用 LSD法,方差不具有齐性时采用Dunnett T3方法进行组内变量分析比较,以p 值小于0.05作为差别有统计学意义的判别标准。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明多肽CW-703及其衍生多肽的分子量小,可透过眼组织屏障;
(b)水溶性好,能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度;
(c)安全性高,对生物组织毒副作用小;并且眼局部用药生物利用度高,可减少剂量,从而减小全身副作用;
(d)可通过固相合成的方法制备,纯度高,产量大,成本低;
(e)本发明多肽的稳定性好。
因此本发明多肽有望开发成药物,用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病,如肿瘤新生血管等。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
如无特别说明,本发明实施例中所用的试剂或材料均为市售产品。
实施例1多肽的筛选、合成和鉴定
1.1材料和方法
1.1.1材料
1)多肽合成相关试剂
2)多肽合成主要仪器和设备
1.1.2方法
1)多肽的合成和鉴定
多肽CW-703,氨基酸序列:LCGGELVDTLQF(SEQ ID NO.:1);同时合成一随机混杂序列多肽,氨基酸序列:GVTQGDLFCLLE(SEQ ID NO.:15),命名为CW-703s,作为体内外实验的质控对照。
2)多肽合成步骤
合成顺序:从C端到N端。
●采用固相合成方法合成多肽,树脂溶涨:将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中,加DCM(15g/ml),振荡30min。
●接第一个氨基酸:通过沙芯抽滤掉溶剂,加入三倍摩尔过量的 Fmoc-Phe-OH(CW-703)或Fmoc-Glu(OtBu)-OH(CW-703s)氨基酸,加入DMF溶解,再加入十倍摩尔过量的DIEA,振荡60min,用甲醇封闭。
●脱保护:去掉DMF,加20%哌啶DMF溶液(15g/ml),反应5min,去掉再加20%哌啶DMF溶液(15g/ml),反应15min。
●检测:去掉哌啶溶液,取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入检测试剂检测, 105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
●洗:DMF(10g/ml)两次,DCM(10g/ml)两次,DMF(10g/ml)两次
●缩合:保护氨基酸三倍过量,HBTU3倍过量,均用尽量少的DMF溶解,加入反应管,立刻加入DIEA十倍过量.反应30min.
●检测:取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入检测试剂检测,105℃-110℃加热5min,无色为阴性反应。
●洗:DMF(10g/ml)一次,DCM(10g/ml)两次,DMF(10g/ml)两次
●重复3至6步骤,从右到左依次连接序列中的氨基酸。
●抽干:按照下列方法洗树脂:DMF(10g/ml)两次,甲醇(10g/ml)两次, DMF(10g/ml)两次,DCM(10g/ml)两次;抽干10min。
●从树脂上切割多肽:配制切割液:TFA 95%;水1%;EDT 2%;TIS 2%,切割时间:120min。
●吹干洗涤:将裂解液用氮气尽量吹干,用乙醚洗六次,然后常温晾干。
●分析提纯:用高效液相色谱将粗品提纯。
●冻干:收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩,冻干成白色粉末,密封,-20℃保存。
●以电喷雾质谱法分析(ESI-MS)进行分子量鉴定,高效液相色谱法(HPLC)进行纯度分析。
1.2结果
1.2.1多肽序列的合成
合成的多肽序列如表5所示。
表5
其中,
多肽CW-703,氨基酸序列:LCGGELVDTLQF(SEQ ID NO.:1);混杂序列肽CW-703s,氨基酸序列:GVTQGDLFCLLE(SEQ ID NO.:15);分子量均为1294.49Da;经体外固相合成并以高相液相色谱法提纯,得到纯度为98%以上的冻干粉,-20冻密封、干燥、避光保存。
1.2.2多肽序列的鉴定
两种多肽均由高效液相色谱法和质谱分析鉴定。
结果如图13-16所示,结果表明,小肽分子量均为1294.49Da。
实施例2有效性实验
2.1血管内皮细胞增殖实验(MTS法):CW-703多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖作用
1)实验分组
无血清组、VEGF组(25ng/ml)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度CW-703多肽组 (10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度CW-703s多肽组(SEQ ID NO.:15,GVTQGDLFCLLE,SEQ ID NO.:16,GCQLEDLFGVLT)(10nM,100nM, 1μM,10μM,100μM)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度Ranibizumab组(1mg/ml, 10mg/ml)。
2)实验步骤
取对数生长期HUVECs以胰蛋白酶-EDTA消化后,收集并计数细胞,将细胞密度调整至3.5×104/mL,再接种于96孔细胞培养板,每孔 100μL;37℃、5%CO2细胞培养箱内培养24h后,更换为无血清的含 ECGS的ECM培养基使细胞饥饿过夜。
弃去细胞培养上清,按照实验分组,每孔分别加入不同浓度的多肽、 VEGF、Ranibizumab和新鲜的无血清的含ECGS的ECM培养基共100μl,并使多肽和VEGF的终浓度符合实验分组;每个实验组设置6个复孔, 37℃细胞培养箱内继续培养24h。
各孔中加入20μl MTS,继续培养1-4h;设置吸光度为490nm,酶标仪读取各孔的吸光度(OD值)。
结果:
MTS细胞增殖实验中,无血清组平均OD值为1.087±0.086;VEGF组 (25ng/ml)平均OD值为1.245±0.053,与无血清组相比差异具有统计学意义 (p<0.01),说明VEGF(25ng/ml)能够有效诱导HUVECs增殖(图1)。
VEGF+CW-703多肽组在1nM~10μM浓度范围内,平均OD值分别为1.202 ±0.161、1.202±0.170、1.146±0.050、1.147±0.055、1.139±0.075,与 VEGF组相比差异不具有统计学意义(p>0.05),CW-703多肽浓度达到100μM时,平均OD值为1.116±0.052,与VEGF组比较,差异有统计意义(p<0.05)。说明CW-703多肽具有抑制VEGF诱导HUVECs细胞增殖的作用,随着浓度的上升,这样的作用更明显;VEGF+CW-703s混杂序列肽在1nM~100μM浓度范围内,平均OD值为1.206±0.086、1.156±0.086、1.148±0.173、1.176±0.102、1.223 ±0.151、1.158±0.024,与VEGF组相比差异不具有统计学意义(p>0.05)(图 1)。
VEGF+Ranibizumab 1mg/ml和10mg/ml组,平均OD值分别为1.080±0.073 和0.918±0.073,与VEGF组相比差异具有统计学意义(p<0.01),说明 Ranibizumab可以有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖(图1)。
根据上述实验结果推断,CW-703具有抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的作用,且抑制作用具有序列依赖性和浓度依赖性。
2.2血管内皮细胞迁移实验(划痕实验):CW-703多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞迁移作用
1)实验分组
无血清组、VEGF组(25ng/ml)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度CW-703多肽组 (10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)、VEGF(25ng/ml)+CW-703s混杂序列肽组 (100μM)、VEGF(25ng/ml)+Ranibizumab组(1mg/ml)。
2)实验步骤
取对数生长期的HUVECs细胞,以胰蛋白酶-EDTA消化,收集并计数细胞,调整细胞密度至1×105/ml,接种细胞悬液于12孔细胞培养板中;待细胞贴壁并长至近90%时,更换为无血清的含ECGS的ECM培养基,细胞在37℃、5%CO2细胞培养箱内饥饿过夜。
用200μl灭菌塑料移液枪头尖端,在12孔细胞培养板的每个孔中央划出一直线划痕,注意划痕过程中动作轻柔,力度保持一致。用PBS 轻轻洗去漂浮的细胞残屑,按照实验分组,每孔分别加入不同浓度的多肽、Ranibizumab和VEGF共1000μl,并使多肽、VEGF和Ranibizumab 的终浓度符合实验分组;每个实验组设置3个复孔,
在倒置相差显微镜下,分别于划痕后的0h、6h和24h,对12孔细胞培养板内的细胞划痕进行观察并拍照,测量划痕区域内未被细胞覆盖的面积。以划痕区域未被细胞覆盖面积的百分比(Uncovered wound area,%) 来判断细胞迁移的活性。划痕区域未被细胞覆盖面积的百分比=(划痕区域未被细胞覆盖面积,初始时间点划痕面积)×100%。
结果:
划痕后即刻观察,可见划痕边界清晰,宽度均匀一致。划痕后6h,不同组的HUVECs细胞开始从划痕边缘向中央迁移(图2)。随着时间延长,迁移出的细胞逐渐增多。划痕后24h,无血清组的部分划痕区域被迁移的HUVECs细胞覆盖,尚有48.84%±2.12%的划痕区域未被HUVECs细胞覆盖(图3A); VEGF(25ng/ml)组可见大量细胞向划痕区域迁移,仅7.90%±2.69%的划痕区域未被HUVECs细胞覆盖(图3B),与无血清组相比差异具有统计学意义(p<0.01),说明25ng/ml VEGF能够有效诱导HUVECs细胞迁移。
VEGF+Ranibizumab组,向中间划痕区域迁移的细胞明显少于VEGF组(图 3H),划痕区域未被HUVECs细胞覆盖面积百分比为46.18%±5.11%,与VEGF 组相比差异具有显著统计学意义(p<0.01)。
VEGF+CW-703多肽组,在各个浓度组(10nM-100μM),均可见到HUVECs细胞向划痕区域的迁移减少,各组未被HUVECs细胞覆盖的区域分别为29.07%± 4.17%(10nM)、41.41%±11.60%(100nM)、44.91%±7.16%(1μM),46.70%± 6.75%(10μM),44.78%±2.63%(100μM)。除了VEGF+100nM CW-703多肽组与 VEGF组相比差异不具有统计学意义(p=0.08),其余各组与VEGF组相比,差异均具有统计学意义。尤其在CW-703多肽浓度达到1μM以上时,HUVECs细胞向划痕区域的迁移明显减少,划痕区域未被迁移细胞覆盖的面积也明显增加(图3E、3F、3G),且10μM CW-703多肽组的抑制效果优于1μM CW-703多肽组,100μM CW-703多肽组与10μM CW-703多肽组的抑制效果没有明显差异。说明CW-703多肽抑制VEGF诱导HUVECs细胞迁移的作用具有剂量依赖性。
而VEGF+CW-703s多肽组,在较高的浓度(100μM)时仍可见到明显的细胞迁移(图3I),中央未被迁移细胞覆盖的区域仅为9.89%±2.63%,与VEGF组相比差异不具有统计学意义(p>0.05);与无血清组比较,差异具有显著统计学意义(p<0.05)。说明CW-703s多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs细胞迁移的作用,进而说明CW-703多肽抑制VEGF诱导HUVECs细胞迁移的作用具有序列依赖性。
以上实验结果表明,CW-703多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞迁移作用,且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性
2.3血管内皮细胞趋化实验(Transwell小室实验):CW-703多肽抑制VEGF 诱导的血管内皮细胞趋化作用
1)实验分组
无血清组、VEGF组(25ng/ml)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度CW-703多肽组 (10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)、VEGF(25ng/ml)+CW-703s多肽组(100μM)、 VEGF(25ng/ml)+Ranibizumab组(1mg/ml)。
2)实验步骤
取对数生长期的HUVECs细胞,以无血清的含ECGS的ECM培养基培养,使细胞饥饿过夜;以胰蛋白酶-EDTA消化后制备成细胞悬液;
Transwell小室提前24h平衡,37℃培养箱内放置过夜;
调整HUVECs细胞密度为4×105/ml,预先与不同浓度CW-703多肽、 CW-703s混杂序列肽和Ranibizumab(浓度遵循实验分组)混合,37℃预处理30min;
将细胞与多肽(或Ranibizumab)的混合悬液(共100μl)加入 Transwell小室(8.0μm孔径)的上室;Transwell小室下层加入600μl 含VEGF(25ng/ml)的ECM培养基;37℃、5%CO2细胞培养箱内继续培养 24h;
培养24h后,取出Transwell上层小室,用PBS轻冲洗3次,放入 4%多聚甲醛中室温固定30min,再以PBS轻冲洗3次后晾干;
将Transwell上层小室放入苏木素染液中染色10min,取出并以PBS 轻冲洗3次,用干棉签将Transwell上层小室上室面的细胞轻轻擦去,余下的细胞即为发生趋化作用迁移至下室面的细胞;
显微镜下观察计数:光学显微镜下每个Transwell小室膜选取5个视野(上、下、左、右、中),观察并拍照,计数每个视野内迁移趋化的细胞数。
结果:
VEGF诱导HUVECs趋化24h后,无血清组平均7.40±3.36个细胞发生趋化,迁移至Transwell小室的下室面(图4);VEGF组(25ng/ml)平均趋化细胞数量为136.80±22.90个,与无血清组相比差异具有统计学意义(p<0.01)(图4B),说明25ng/ml VEGF能够有效诱导HUVECs发生趋化迁移。
VEGF+CW-703多肽组,在10nM~100μM浓度范围内,HUVECs趋化细胞数量较VEGF组减少,分别为103.8±26.13个、98.80±19.87个、78.40±14.43 个、71.40±22.70个和50.20±10.73个,与VEGF组相比差异具有统计学意义 (p<0.01),且CW-703多肽的浓度越高,抑制HUVECs细胞趋化的作用越强,说明CW-703多肽抑制VEGF诱导HUVECs细胞趋化的作用具有一定的剂量依赖性;VEGF+CW-703s多肽组,在较高浓度(100M)时仍可见到较多的细胞发生趋化,迁移至Transwell小室的下室面(图4H),趋化细胞数量为134.80±17.05 个,与VEGF组比较,差异不具有统计学意义(p>0.05),说明CW-703s多肽不具备抑制VEGF诱导的HUVECs细胞趋化的作用,也说明CW-703多肽抑制VEGF 诱导的HUVECs细胞趋化的作用具有序列依赖性。
VEGF+Ranibizumab组,仅见少量细胞发生趋化迁移(图4I),HUVECs趋化细胞数量为33.80±16.69个,与VEGF组相比,差异具有显著统计学意义 (p<0.001)。
上述实验结果说明,CW-703多肽能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞趋化作用,并且具有序列依赖性和一定程度的剂量依赖性。
2.4血管内皮细胞管腔形成实验:CW-703多肽抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成
1)实验分组:
无血清组、VEGF组(25ng/ml)、VEGF(25ng/ml)+不同浓度CW-703多肽组(10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)、VEGF(25ng/ml)+CW-703s多肽组(100μM)、 VEGF(25ng/ml)+Ranibizumab组(1mg/ml)
2)实验步骤:
实验前将96孔细胞培养板、200μl移液枪头等置于4℃冰箱预冷待用;
Matrigel液化:预先将Growth Factor Reduced Matrigel置于4℃冰箱过夜以使其充分液化;
铺胶:用预冷的移液枪头吸取充分液化的Matrigel,加入预冷的96孔细胞培养板,每孔50μl,37℃细胞培养箱内静置30min,使Matrigel充分凝固;
处理细胞:收集对数生长期的HUVECs,将每孔3×104细胞预先与不同浓度CW-703多肽、CW-703s混杂序列肽和Ranibizumab混合,37℃预处理30min,然后向细胞悬液中加入VEGF,并使VEGF终浓度为25ng/ml,充分混匀后接种至预先包被Matrigel的96孔细胞培养板,37℃细胞培养箱内继续培养6h;
6h后于倒置相差显微镜(40倍)下观察并拍照,每孔记录4个视野。拍照后采用Image J 1.50i图像分析软件,分析计算每孔内管状结构形成的长度。以VEGF组管状结构形成长度为100%,计算成管率:
成管率=(多肽处理组管腔形成长度/VEGF组管腔形成长度)×100%。
结果如图5A-5L所示:
在HUVECs细胞接种到Matrigel上6h后,无血清组(对照组)排列形成管腔样结构的细胞数量少(图5A),管腔样结构形成的相对长度为31.79%±4.26%;与无血清组相比,VEGF(25ng/ml)组细胞形成管腔样结构明显增多,彼此交错呈网状(图5B);两组间管腔样结构形成长度相比,差异有统计意义(P<0.001),说明25ng/ml浓度的VEGF能够有效诱导HUVECs管腔样结构形成。
VEGF+各浓度CW-703多肽组在10nM~100nM浓度范围内,HUVECs管腔样结构形成相对长度分别为93.44%±2.23%、81.13%±7.73%、49.10%±7.57%、 44.68%±6.29%和39.87%±8.42%,10nM CW-703多肽组与VEGF组相比差异不具有统计学意义(p>0.05);当CW-703多肽浓度达到100nM及以上时,HUVECs的管腔样结构逐步减少,与VEGF组相比差异具有统计学意义(p<0.01),并且随着浓度的升高,管腔样结构几乎很少出现,说明CW-703多肽能够有效抑制VEGF 诱导HUVECs细胞管腔形成,且作用具有剂量依赖性;VEGF+CW-703s混杂序列肽组在较高浓度(100μM)时仍可见到较多的管腔样结构形成(图5),管腔样结构形成的相对长度为101.61%±2.80%,与VEGF组相比差异不具有统计学意义(p>0.05),说明CW-703s混杂序列肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成的作用,并推断CW-703多肽抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成的作用具有序列依赖性。
在VEGF+Ranibizumab(1mg/ml)组,仅见少量管腔样结构形成(图5H),管腔样结构形成的相对长度为38.86%±5.31%,与VEGF组相比差异具有统计学意义(p<0.001)。
实验结果显示,CW-703多肽在体外管腔形成实验中,与Ranibizumab一样均能够有效抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成,并且具有良好的剂量依赖性和序列依赖性。
2.5 CW-703多肽抑制鸡胚尿囊膜模型血管新生实验
1)滤纸片的制备
采用5mm打孔机将滤纸制成每个直径为5mm的圆形滤纸片,剔除边缘毛糙的滤纸片,高压消毒灭菌。将灭菌双蒸水与醋酸考的松片配制成5μg/μL的悬浊液,在每个滤纸片上加5μL的醋酸可的松悬浊液(5μg/μL),待自然风干后,在每个滤纸片上再加5μL不同的样本溶液(PBS溶液,10μg CW-703多肽,50μg CW-703多肽,50μg CW-703s多肽),风干备用。
2)消毒
取20ml 5%苯扎溴铵与980ml双蒸水混合,配成1:1000苯扎溴铵溶液。刷净鸡蛋表面污垢,将其放入1∶1000苯扎溴铵溶液中浸泡10min,自然晾干。 1:1000苯扎溴铵清洗蛋托,自然晾干。
3)孵育
消毒好的鸡蛋置于蛋托上,所有鸡蛋气室朝上,并向同一方向倾斜45°放入温度为37℃、湿度在60~70%范围的恒温恒湿箱内,连续孵育5d,每日定时翻动鸡蛋两次,保持气室朝上并倾斜45°。
4)鸡胚开窗
借助照蛋灯观察鸡心位置,在远离鸡心的气室边缘处,将蛋壳上开一个约 1.0cm×1.0cm小窗,并穿透气室壳膜。在壳膜上滴加一滴灭菌的生理盐水,使尿囊膜与壳膜分开,撕去表面壳膜。
5)接种加药
观察鸡心的位置和血管走向,选择近胚头1cm处两条前卵黄静脉之间的相对无血管区,将事先准备的含有不同样本溶液:1×PBS、10μg CW-703多肽(2 μg/μl)、50μg CW-703多肽(10μg/μl)、50μg CW-703s多肽(10μg/μl) 的滤纸片的放置相对在卵黄膜表面。透明胶带封闭蛋壳开口,开口朝上放置于恒温孵育箱内继续培养48hr,期间不翻动鸡蛋。
6)结果观察
揭去透明胶,扩大蛋壳开口至充分暴露鸡胚尿囊膜,以滤纸片为中心10mm 直径范围进行观察和拍照,计数滤纸片边缘2.5mm范围环形区域内2、3级血管数目。
结果:
PBS组滤纸片周围2.5mm直径内CAM毛细血管生长良好,平均毛细血管数量68.73±11.00(图8A);CW-703多肽10μg组(2μg/μl)CAM平均毛细血管数量43.47±6.36(图8B);CW-703多肽50μg组(10μg/μl)CAM平均毛细血管数量32.33±7.89(图8C)。与PBS组相比,两组CW-703多肽组CAM平均毛细血管数量减少,差异具有统计学意义(P<0.001)。
CW-703s多肽50μg组(10μg/μl)CAM平均毛细血管数量65.53± 11.35(图8D),与PBS组比较差异无统计学意义(P=0.963)。
以上结果表明,CW-703多肽具有抑制CAM毛细血管形成的作用,且具有序列依赖性。CW-703多肽50μg组较CW-703多肽10μg组作用更明显,因此认为在一定程度上CW-703多肽抑制CAM新生血管形成的作用具有剂量依赖性。
2.6 CW-703多肽抑制氧诱导小鼠视网膜病变模型新生血管的形成
1)氧诱导小鼠视网膜病变模型的建立
将出生后7d(Postnatal day 7,P7)的C57BL/6J乳鼠连同哺乳母鼠放入室内的恒温氧气箱内,放置足够的饲料和饮水,每窝乳鼠数量不超过6只;
恒温氧气箱内放置氧气浓度计和适量碱石灰干燥剂,维持箱内湿度在 70%左右;每日固定时间检测温度和氧气浓度共四次,维持箱内温度在23±2℃,氧气浓度在75±2%;
控制气体流速,维持供氧的气流速度为1.5-2L/min;
室内以日光灯照明,照度200lx,维持12h昼夜明暗交替;
在恒温氧气箱内生活5d后(P12),将乳鼠和母鼠移到正常氧浓度(空气) 环境中,继续饲养5d;
将P17的乳鼠称重,筛选体重>6g的乳鼠,腹腔注射过量麻醉药物处死,取眼球做后续实验;体重<6g的乳鼠由于可能存在不正常表型,则予以剔除;
将正常氧浓度(空气)下生长的同龄乳鼠作为对照组;
1)玻璃体腔注射方法:
所有乳鼠均于P12和P14,接受两次玻璃体腔药物注射,以右眼为注射眼;
注射前,所有非一次性手术器械均以75%乙醇浸泡30min以上,实验室用紫外线照射30min以上,所有操作均在体式显微镜下进行,遵循无菌操作原则;注射前30min内,以无菌1×PBS溶液配置所需的玻璃体腔注射药物,并置于4℃冰箱备用;将幼鼠侧卧置于塑料垫板上,腹部和四肢以胶布固定;显微无齿镊钝性分开乳鼠上下眼睑,0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉,5%聚维酮碘清洗眼睑、睑缘及结膜囊3min;充分暴露角膜和角巩膜缘,微量注射器抽取 1μl药物溶液,自角膜缘后约0.5mm处垂直于巩膜进针,在瞳孔区观察到注射器针头后,缓慢推入药物,5s后拔出微量注射器,以氧氟沙星眼膏涂眼;每次注射后,微量注射器针头用75%乙醇浸泡5min,并以无菌1×PBS冲洗微量注射器内腔和针头表面;所有实验操作均由同一实验者完成。2)实验分组:
为筛选最有效玻璃体注射浓度,我们将高氧乳鼠按照玻璃体腔注射CW-703 多肽的药物浓度,分成不同浓度的三组,观察三种不同注射浓度下小鼠视网膜无血管区和新生血管分布情况,并进行分析计算,甄选出最有效浓度作为后续实验中玻璃体腔注射的多肽浓度(表2)。
表2不同浓度CW-703多肽抑制视网膜新生血管(以右眼为实验眼,n=8)
经不同浓度比较后选出最有效CW-703多肽浓度为10Mm,所有其他药物玻璃体腔注射均参照此浓度。CW-703多肽抑制氧诱导小鼠视网膜病变模型新生血管的形成实验分组见表3。
表3CW-703多肽抑制氧诱导小鼠视网膜病变模型新生血管的形成
(以右眼为实验眼,n=8)
3)视网膜固定和分离:
完整取下的眼球直接投入4%多聚甲醛溶液中,室温(23±2℃)固定1h后取出,1×PBS溶液冲洗5min×3次,置于1×PBS溶液中4℃保存(眼球固定后最长可保存5d);体式显微镜下,用显微剪沿角巩缘环行剪开眼球,去除角膜、虹膜和晶状体。显微无齿镊钝性分离视网膜与其下脉络膜及巩膜,并自视神经根部剪断视网膜与视神经的连接,使视网膜完整游离呈半球状(整个操作在1× PBS溶液中进行),置于1×PBS溶液中4℃保存。
4)视网膜铺片和视网膜血管内皮细胞特异性染色:
将完整取下的视网膜置于500μl 0.5%Triton X-100溶液中4℃过夜;室温下1×PBS溶液冲洗视网膜5min×3次,转入500μl Isolectin B4溶液(10μ g/ml)中,铝箔包裹避光,室温下摇床振荡过夜,再以1×PBS溶液冲洗15min ×3次(以上所有操作动作轻柔,以免损伤标本)。
将视网膜移至载玻片上,视网膜内层朝上,体式显微镜下扫除视网膜表面残留色素、杂质及玻璃体。3:00、6:00、9:00和12:00方位,距离视盘1mm处将视网膜放射状切开,使之呈十字架形状平铺于载玻片上,30%甘油封片。
5)影像摄取和图像处理:
避光条件下,荧光显微镜观察全视网膜铺片并摄取图像。所有荧光图片遵循统一的技术标准,采用绿色光激发,4×物镜观察拍摄,每个视网膜标本均拍摄5张重叠图像(5个象限:左上/右上/左下/右下/中央,每个象限间至少有 15%的重叠),运用AdobePhotoshop cs5软件对图像进行拼接,组合成完整的视网膜图像。
6)结果观察
运用Image J 1.50i软件对整张视网膜图像进行分析,测量所有视网膜血管中央无灌注区(foveal avascular zone,FAZ)和新生血管(neovascularization,NV)的面积,计算无灌注区和新生血管比例(FAZ%和NV %):无灌注区比例(FAZ%)=(无灌注区面积/全视网膜面积)×100%;新生血管比例(NV%)=(新生血管面积/全视网膜面积)×100%。
结果:
所有母鼠在实验过程中未发生意外死亡。在高氧组中,有1窝(共4只)乳鼠中的2只分别于P8和P13被母鼠吞食,其余动物在实验结束前均未出现全身不良反应;所有玻璃体注射眼均未发现存在或疑似眼内炎表现。
各空气组P17乳鼠的视网膜采用异凝集素(Isolectin B4-568)染色后,荧光显微镜下各级视网膜血管呈现光滑均一的红色荧光(绿色光激发),未见到典型视网膜血管无灌注区(血管闭塞)、血管迂曲扩张以及簇状或丛状的新生血管染色(图9)。
不论玻璃体腔内注射的是1×PBS、CW-703多肽或CW-703s多肽,空气组 P17乳鼠的视网膜血管并未发生形态学上的改变,说明重复玻璃体注射方法的安全性,也说明在正常氧状态下,CW-703和CW-703s多肽不影响新生乳鼠视网膜的血管构建(图11A、11B、11C)。
高氧+PBS组和高氧+CW-703s组的P17乳鼠,视网膜大血管粗细不均、管壁毛糙、近端迂曲变细,视网膜中央出现大片毛细血管无灌注,在无灌注区边缘充斥着大片簇状和丛状新生血管(图9A、9B、9C、9D)
高氧组中,玻璃体腔注射3种不同浓度CW-703多肽(5mM、10mM和20mM) 的P17乳鼠,视网膜中央无灌注区较高氧+PBS组明显缩小,视网膜大血管粗细也相对均匀;高氧+CW-703组视网膜中央区域仍存在部分毛细血管扩张,某些区域也还能看到簇状新生血管,但与高氧+PBS组比较,毛细血管扩张区域明显缩小,新生血管也明显减少(图10A、10B、10C)。
运用图像处理软件对所有组的全视网膜铺片进行分析和数据测量,并计算无灌注区面积比(FAZ%)和新生血管面积比(NV%):
高氧+5mM CW-703组FAZ%为7.10%±2.80%,高氧+10mM CW-703组FAZ%为2.46%±2.15%,高氧+20mM CW-703组FAZ%为3.79%±2.03%,5mM CW-703组与 10mM、20mM CW-703组FAZ%比较,P值分别为0.003和0.046,p<0.05,差异均有统计学意义;10mMCW-703与20mM CW-703组FAZ%比较,P=0.483,p>0.05,两组差异无统计学意义(图10D)。
高氧+5mM CW-703组NV%为2.40%±0.88%,高氧+10mM CW-703组NV%为1.22%±0.54%,高氧+20mM CW-703组NV%为2.06%±0.94%,20mM CW-703组与5mM、 10mM CW-703组NV%比较,P值分别为0.844和0.159,p>0.05,差异均没有统 计学意义;5mM CW-703与10mM CW-703组NV%比较,P=0.011,p<0.05,两组 差异有统计学意义。因此认为,不同浓度的CW-703多肽玻璃体腔注射,对FAZ% 和NV%的影响有差异,浓度升高,FAZ%和NV%缩小,但到达一定浓度后,其作 用并不会无限增加。
通过上述实验的观察,CW-703多肽在摩尔浓度为10mM时,FAZ%和NV%较 5mM和20mM浓度时数值更低,因此认为10mM CW-703多肽抑制OIR模型视网膜新生血管的作用相对较强,在后续实验中,均选择10mM作为CW-703多肽玻璃体腔注射的浓度。
高氧+PBS组FAZ%为19.41%±3.99%,高氧+10mM CW-703s混杂序列肽组FAZ%为16.80%±3.61%,高氧+10mM CW-703多肽组FAZ%为2.46%±2.15%,高氧 +Ranibizumab组FAZ%为4.74%±1.51%。高氧+CW-703多肽组、高氧+Ranibizumab 组与高氧+PBS组的FAZ%比较,P<0.001,差异有统计学意义;高氧+CW-703s 混杂序列肽组与高氧+PBS组FAZ%比较,P值为0.704,p>0.05,两组差异没有统计学意义(图11H)。
高氧+PBS组NV%为4.10%±0.96%,高氧+10mM CW-703s混杂序列肽组NV%为3.55%±1.02%,高氧+10mM CW-703多肽组NV%为1.22%±0.54%,高氧 +Ranibizumab组NV%为1.86%±1.29%。高氧+CW-703多肽组、高氧+Ranibizumab 组与高氧+PBS组NV%比较,P值分别为<0.001和0.033,P<0.05,差异有统计学意义;高氧+CW-703s混杂序列肽与高氧+PBS组NV%比较,P=0.855,p>0.05,差异没有统计学意义(图11I)。
以上结果表明,在小鼠OIR模型中,CW-703多肽与Ranibizumab一样,能很大程度地消除缺氧效应对新生乳鼠视网膜血管构建的影响,能够有效地缩小视网膜中央无灌注区面积,抑制视网膜新生血管的生长。
CW-703多肽抑制小鼠OIR模型视网膜新生血管形成的作用具有序列依赖性,但不具有剂量依赖性。
2.7小鼠视网膜组织切片HE染色观察
1)实验分组:18只C57BL/6J乳鼠被分为6组,每组3只,以右眼为实验眼
空气+PBS组、空气+CW-703组、空气+CW-703s组、高氧+PBS组、高氧+CW-703 组、高氧+CW-703s组。
2)氧诱导小鼠视网膜病变模型的建立:方法见前。
3)实验步骤:
完整取下小鼠眼球,4%多聚甲醛固定24h;移入70%乙醇,经梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡,制成石蜡标本;每个眼球标本以视神经为中点,沿矢状位方向制作连续切片10张,切成10μm厚切片,切片间隔30μm;切片脱蜡、复水;苏木素染色10min,1%盐酸酒精分化5s,伊红染色2min;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,50%中性树胶封片;显微镜下观察并拍照,计数突破入视网膜内界膜的血管内皮细胞数量。
结果:
空气+PBS组和空气+CW-703多肽组(图12A、12C),视网膜自色素上皮层至内界膜层,各层均完整连续,视网膜厚度正常,各层细胞结构清晰、排列整齐,无出血及渗出物沉积。内界膜完整,少见有核细胞突出于视网膜内界膜,突出于视网膜内界膜的有核细胞数分别为2.30±2.83个和2.10±2.02个,组间差异无统计学意义(p>0.05)。
在高氧+PBS组和高氧+CW-703s多肽组(图12B、12E),视网膜内界膜的完整性遭到破坏,突出于视网膜内界膜的有核细胞数量明显增多,分别为25.40 ±10.35个和25.20±9.72个,且排列成管腔样结构,两组差异不具有统计学意义(p>0.05)。
而在高氧+CW-703多肽和高氧+Ranibizumab组(图12D、12F)视网膜内界膜结构相对完整,仅见少量有核细胞突出于视网膜内界膜,突出细胞数为6.70± 3.53个和4.20±3.36,与高氧+PBS组比较,差异具有统计学意义(p<0.01)。
图像及数据统计结果显示对于高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的形成, CW-703多肽具有有效的抑制作用,且抑制作用具有序列依赖性。
实施例3.安全性实验
3.1血管内皮细胞活性实验(MTS法):CW-703多肽对血管内皮细胞活性无影响
1)实验分组:
无血清组、不同浓度CW-703多肽组(1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)、不同浓度CW-703s多肽组(1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)。
2)实验步骤:
取对数生长期HUVECs,胰蛋白酶消化后收集细胞并计数,将细胞密度调整至3.5×104/ml,每孔100μl接种于96孔细胞培养板;37℃细胞培养箱内培养24h使细胞贴壁;弃去细胞培养上清,按照实验分组,加入不同浓度的CW-703和CW-703s多肽(1nM~100μM)溶液,每个浓度组设置6个复孔,37℃细胞培养箱内继续培养24h;各孔中加入20μL MTS,继续培养4-6h;设置吸光度为490nm,酶标仪读取各孔的吸光度值(OD值)
结果:
MTS法检测细胞活性的实验中,无血清组平均OD值为1.058±0.072; CW-703多肽组在1nM~100μM浓度范围内,平均OD值分别为1.054±0.087、 1.051±0.073、1.042±0.088、1.052±0.073、1.049±0.071、1.047±0.085,与无血清组相比差异不具有统计学意义(p>0.05);CW-703s混杂序列多肽在 1nM~100μM浓度范围内,平均OD值为1.053±0.093、1.055±0.091、 1.044±0.083、1.049±0.065、1.050±0.060、1.044±0.056,与无血清组相比,差异也不具有统计学意义(p>0.05)。
由此可见,CW-703多肽和CW-703s多肽在实验浓度范围内,对正常血管内皮细胞的细胞活性不产生影响。
3.2血管内皮细胞凋亡实验(TUNEL方法):CW-703多肽对正常血管内皮细胞的凋亡无影响
1)实验分组:
无血清组、正常血清组、不同浓度CW-703多肽组(10nM,100nM,1μM,10μM, 100μM)、不同浓度CW-703s多肽组(10nM,100nM,1μM,10μM,100μM)。
2)实验步骤:
接种细胞:取对数生长期HUVECs,胰蛋白酶消化后收集细胞并计数,将细胞密度调整至1×105/ml,以每孔200μl接种于24孔细胞培养板(孔底事先放置一玻璃片);37℃细胞培养箱内培养24h使细胞贴壁。
加药:24h后弃去细胞培养上清,根据实验分组,在每孔中加入含有不同浓度CW-703多肽、CW-703s多肽的溶液,每组设置3个复孔,37℃继续培养 24h;取出细胞培养板底部玻片进行后续实验:细胞固定:将玻片浸入4%多聚甲醛溶液中固定,4℃放置25min;洗涤:PBS漂洗5min×3次;细胞通透:室温下,将玻片置入0.2%Triton X-100溶液,通透化处理5min;洗涤:PBS漂洗 5min×3次;平衡:滤纸吸干,置入100μl平衡缓冲液中,室温下湿盒平衡10min,滤纸吸干多余液体;加入含末端脱氧核糖核酸转移酶(rTdT)孵育缓冲液,将玻片置湿盒中,37℃避光孵育60min发生加尾反应。
以下实验过程均在避光环境中进行:去离子水1:10稀释20×SSC,将配好的2×SSC封闭溶液加满一个标准染色缸(40mL),玻片浸没在染色缸内,室温下放置15min以终止反应;室温下PBS漂洗5min×3次;每个玻片上加DAPI染料 (1:3000)200μl,室温下作用15min;去离子水漂洗5min×3次;30%甘油封片,荧光显微镜下观察样本并拍照,观察绿色荧光(波长520nm)和DAPI蓝色荧光(波长360nm)显影情况,凋亡阳性细胞细胞核呈绿色荧光,正常细胞细胞核呈蓝色荧光;在400倍显微镜下,随机计数5个相邻视野中凋亡阳性细胞细胞核数和总细胞核数,计算细胞凋亡率:细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞核数/同视野细胞核总数)×100%。
结果:
凋亡细胞由于被荧光素标记而显示绿色;正常细胞为了区别于凋亡细胞,使用DAPI染料染色,其细胞核显示为蓝色。
实验中,正常生长的HUVECs细胞与CW-703和CW-703s多肽共同孵育24h 后,通过TUNEL方法检测细胞凋亡情况:在各个浓度的CW-703多肽组,仅检测到极少数凋亡细胞,CW-703多肽的浓度变化并未改变凋亡细胞的数量;在各个浓度的CW-703s多肽组,细胞凋亡情况与CW-703多肽组相似;而在无血清组,凋亡细胞的数量略有增加,与正常血清组和各多肽组比较,差异有统计学意义 (p<0.05)。而CW-703和CW-703s多肽各组间比较,差异不具有统计学意义 (p>0.05),正常血清组与多肽各组间差异也无统计学意义。
上述实验结果说明CW-703和CW-703s多肽对正常血管内皮细胞的凋亡无促进作用。
3.3大鼠视觉电生理检查
选取8只6周龄健康雄性Wistar大鼠,左眼玻璃体腔注射CW-703多肽 (10mM),右眼注射等量1×PBS溶液;于玻璃体注射前、注射后1天、7天和14 天进行视觉电生理检查,按国际视觉电生理协会(International Society for Clinical Electrophysiology ofVision,ISCEV)2015年版标准化方法检测视网膜电流图(Electroretinogram,ERG)[64],记录暗适应0.01ERG(视杆反应)、暗适应3.0ERG(视锥和视杆混合反应)和明适应3.0ERG(视锥反应)的结果。
ERG检查步骤:大鼠完全暗适应18小时;盐酸氯胺酮(0.1g:2ml)按70mg/kg 的剂量一次性肌肉注射[65],5-10分钟后起效,将动物固定于测试台上。实验前以0.4%盐酸奥布卡因滴眼液和复方托吡卡胺滴眼液点眼进行角膜表面麻醉和扩瞳。大鼠尾部皮下、颊部皮下及角膜上分别固定接地电极、参考电极以及角膜电极。第二次暗适应20分钟后,进行ERG测量和记录。
实施例4
对实施例1中的多肽进行活性测试
以CW-703及其衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用为例,进行详细说明。
按实施例2-3所示的方法,测定CW-703及其衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用,结果如表4所示,其中,VEGF组(25ng/ml)平均OD490 值为1.245±0.053,CW-703及其衍生多肽的浓度达到100μM,平均OD490值为1.105-1.126。
表4
结果表明,CW-703及其衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖有显著的抑制作用。
同样,采用实施例2-3的方法,测定CW-703衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞迁移的抑制作用,对VEGF诱导的血管内皮细胞趋化作用的抑制效果,对VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成的抑制效果,以及对血管新生的抑制效果。
结果表明,CW-703衍生多肽对VEGF诱导的血管内皮细胞迁移,对VEGF诱导的血管内皮细胞趋化作用,对VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成,以及对血管新生有显著抑制作用,其效果与CW-703多肽相当。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市第一人民医院
许迅
孙俏
王卫峻
<120> 一类新的抑制新生血管的多肽及其应用
<130> P2017-0919
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
ctgtgcggcg gggagctggt ggacaccctc cagttc 36
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
Gly Val Thr Gln Gly Asp Leu Phe Cys Leu Leu Glu
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Gly Cys Gln Leu Glu Asp Leu Phe Gly Val Leu Thr
1 5 10
Claims (10)
1.一种式I表示的多肽,或其药学上可接受的盐:
Z0-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-Z1
式I;
Z0为-NH2,或-NHY0,其中,Y0为1-2个氨基酸的肽段;
Z1为-COOH,或-COOY1,其中,Y1为1-2个氨基酸残基;
各T为-CO-NH-,
其中,
R1选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R2选自:(a)巯甲基(HSCH2-)和(b)羟甲基;
R3选自:(a)H和(b)甲基;
R4选自:(a)H和(b)甲基;
R5选自:(a)羧基亚乙基和(b)羧基亚甲基;
R6选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R7选自:(a)异丙基和(b)异丁基;
R8选自:(a)羧基亚甲基和(b)羧基亚乙基;
R9选自:(a)羟乙基和(b)羟甲基;
R10选自:(a)异丁基和(b)丁基;
R11选自:(a)酰胺亚乙基和(b)酰胺亚甲基;
R12选自:(a)苄基和(b)异丁基;且所述的多肽或其药学上可接受的盐具有抑制血管新生的活性。
2.如权利要求1所述的多肽,或其药学上可接受的盐,其特征在于,R1-R12中,至少9个为(a)类基团,优选至少10个、11个、12个为(a)类基团。
3.如权利要求1所述的多肽,或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述多肽与式I0所示的结构相比,R1-R12中有0-1个基团被取代,
NH2-CHR1-T-CHR2-T-CHR3-T-CHR4-T-CHR5-T-CHR6-T-CHR7-T-CHR8-T-CHR9-T-CHR10-T-CHR11-T-CHR12-COOH
式I0;
其中,
R1选自:异丁基;
R2选自:巯甲基(HSCH2-);
R3选自:H;
R4选自:H;
R5选自:羧基亚乙基;
R6选自:异丁基;
R7选自:异丙基;
R8选自:羧基亚甲基;
R9选自:羟乙基;
R10选自:异丁基;
R11选自:酰胺亚乙基;
R12选自:苄基。
4.如权利要求1所述的多肽,或其药学上可接受的盐,其特征在于,所述多肽具有SEQID NO.:1-13所示的序列。
5.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐。
6.一种药物组合物,其特征在于,包括:
(a)治疗有效量的权利要求1的多肽或其药学上可接受的盐;和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.一种权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐的用途,其特征在于,用于制备治疗血管新生相关疾病的药物。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述的血管新生相关疾病选自下组:缺血缺氧性眼病,新生血管性眼病、肿瘤、缺血缺氧性脑病、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger’s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病、或其组合。
9.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述药物还用于选自下组的一种或多种用途:
(a)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖;
(b)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的迁移;
(c)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞趋化作用;
(d)抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔样结构形成;
(e)抑制氧诱导的新生血管的形成。
10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法,其特征在于,包括步骤:给需要的对象施用权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐。
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