ES2525669T3 - Inhibidores de la vascularización - Google Patents
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Abstract
El uso de un antagonista del receptor de tipo 1 de la angiotensina II (AT II), seleccionado del grupo que consiste en candesartán, candesartán cilexetil, losartán, valsartán, irbesartán, tasosartán, telmisartán y eprosartán, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención de diabetes en pacientes que exhiben una presión sanguínea normal o baja.
Description
DESCRIPCiÓN
Inhibidores de la vascularización
Campo técnico
Esta invención se refiere a una composición farmacéutica novedosa para su uso como un agente antineoplásico, que comprende un inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz.
Técnica anterior
En el pasado, se sabía que cuando las células tumorales salen fuera de los vasos sanguíneos, las células endoteliales vasculares se rompen. TambiérJ se sabe que la neovascularización está profundamente implicada en la proliferación y la migración del cáncer y que las células tumorales producen y liberan una variedad de factores de neovascularizacioo Especialmente, la neovascularización está considerada como crucial para la proliferación de tumores sólidos
Por lo tanto, una sustancia que inh iba la neovascularización tiene el potencial de ser un agente anticanceroso que es proporcionado con un nuevo modo de acción. Por esta razoo, ya se ha probado el uso de varios tipos de sustancias inhibidoras de la neovascularización tales como esteroides y productos metabólicos de microorganismos. ("Manual for Studies on Cancer Invasion and Metastasis," The Gancer Metastasis Society Ed., Kinhodo Publisher, 159-182 (1994». Sin embargo, se desea fuertemente descubrir nuevas sustancias inhibidoras de la neovascularizacioo con la acción de inhibir más eficazmente la proliferaciórJ y la metástasis de cánceres.
Divulgación de la invención
Esta invención se define en las reivindicaciones
Específicamente, los autores de la presente invención llevaron a cabo extensas investigaciones con objeto de resolver los problemas identificados anteriormente; y como resultado han descubierto que cuando se crean ratones con genes inactivados que carecen del factor estimulante del crecimiento de células pre-Blfactor derivado de células estromales (denominado en lo sucesivo "PBSF/SDF-I" o "SDF-1 "), que es una quimiocina de CXC, así como de CXCR4, que es un receptor de quimiocinas, se suprime la vascularización en los ratones y concretamente, la supresión de CXCR4 da como resultado una supresioo de la vascularizaciÓll. Dicho descubrimiento significa que el receptor de quimiocinas CXCR4 es esencial para la neovascularización.
La neovascularización de tejidos vivos se produce generalmente a través de un remodelado del sistema vascular previamente existente cuando crecen para realizar sus funciones específicas durante el desarrollo. Los análisis de los ratones mutantes han determinado que las moléculas requeridas por los sistemas vasculares tempranos son en su mayoria receptores de cinasas de tirosina y sus ligandos. (Risau, W. Nature 386, 671-674 (1997); Folkman, J. & D'Amore,
P. A. Cell 87, 1158-1155 (1996); Y Lindahl, P. y col., science 277, 242-245 (1997)). Sin embargo, las sustancias responsables de la vascularización durante la organogérJesis todavía no han sido identificadas, porque la mayoría de estos ratones muere durante la gestaciórJ temprana antes del desarrollo de sus tejidos.
La estructura del receptor de quimiocinas CXCR4 según esta invención ya se conocía. (Bleul, C. C. y col., Nature 382, 829-883 (1996); Oberlin, E. y col., Nalure 382, 888-835 (1996); Y Nagasawa, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93, 14726-14729 (1996». El CXCR4 es una proteína acoplada a proteína G que abarca siete dominios transmembrana y un receptor de PBSF/SDF-1, que es una quimiocina CXC. Se cree que el factor mencionado anteriormente es responsable de la linfopoyesis de los linfocitos B, de la mielopoyesis en la médula ósea y de la formación del tabique ventricular cardiaco (Nagasawa, T. y col., Nalure 382, 685-688 (1996)). El CXCR4 también funciona como un co-receplor para el VIH-1trófico de los linfocitos T (Feng, Y. y col., Science 272, 872-877 (1996». Adicionalmente se ha informado de que el CXCR4 se expresa. en células endoteliales cultivadas (Volin, M. V. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 46-53 (1998»
Además, los autores de la presente invención han descubierto que el anteriormente mencionado CXCR4 se expresa en células endoteliales vasculares en desarrollo y que los ratones que carecen del CXCR4 o de su ligando PBSF/SDF-1 , muestran una formación defectuosa de los grandes vasos sanguíneos que abastecen el tracto gastrointestinal. Dicho descubrimiento significa que los sistemas de señalizacioo CXCR4 y PBSF/SOF-1 son esenciales para la formacioo de las arterias y venas medianas que aportan nutrientes al tracto gastrointestinal. Adicionalmente, los autores de la presente invención han descubierto que los ratones que carecen del CXCR4tienden a morir en el útero, tal como se observa en los ratones que carecen de PGSF/SDF-1 Dicho descubrimiento sugiere que el CXCR4 es el receptor fisiológico primario más crítico de PBSF/SDF-1
Basándonos en las anteriores observaciones de los autores de la presente invención, se contempla que las sustancias capaces de inhibir la acción debida al CXCR4 puedan inhibir la vascularización y por tanto puedan ser eficaces agentes anticancerosos, dado que la vascularizaciÓll es esencial para el mantenimiento y la expansiórJ de los tejidos cancerosos.
Asimismo, se contempla que las sustancias capaces de inhibir el CXCR4 podrán ser agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades que implican una neovascularizaciórJ.
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Adicionalmente se contempla que la promoción de la acción debida al CXCR4 acelere la vascularización y por lo tanto pueda ser un remedio para una enfermedad en la que se desea una vascularización
Más especificamente, como se resumirá a continuación, esta invención proporciona la materia objeto como se define en las reivindicaciones
Asi, esta invención proporciona una composición farmacéutica para su uso como un agente antineoplásico que comprende un inhibidOf del CXCR4 como el ingrediente eficaz, en el que dicho inhibidor está seleccionado del grupo según se define en la reivindicación 1.
Debido a que la formaciórJ de arterias y venas medianas o grandes es esencial para el mantenimiento y la expansión de un tejido canceroso que supera un cierto tamaño, el inhibidor de la vascularización para el uso de esta invenciórJ bloquea el sistema de señalización del CXCR4 o del PBSF/SDF-J, suprimiendo así el mantenimiento y la expansión del tejido canceroso
El descubrimiento obtenido en esta invención sugiere la posibilidad de que los sistemas de señalización del CXCR4 y del PBSFfSDF-1 contribuyan a la vascularización universal. Por lo tanto, en las enfermedades en las que la principal causa patológica es un tipo de cáncer o de neovascularizaci6n en particular, es probable que el CXCR4 o el PBSFfSDF-1 esté profundamente implicado en la causa patológica; en este caso, existe la posibilidad de que estas enfermedades puedan ser suprimidas bloqueando el CXCR4 o el PBSFfSDF-1 individual o simultáneamente con otras moléculas
En la presente memoria descriptiva y dibujos, las abreviaturas de las bases o aminoácidos siguen la comisión sobre nomenclatura bioquimica (Commission on Biochemistry Nomenclatura) de la IUPAC-IUB, o se basan en lo que es habitual en la técnica. A continuaciórJ se ilustran sus ejemplos. Cuando se habla de aminoácidos y pueden estar presentes sus isómeros ópticos, aquéllos representan las formas L salvo que se indique lo contrario.
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario
A: adenina
T: timina
G: guanina
C: citosina ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero G o Gly: glicina A o Ala: alanina v o Val: valina Lo Leu: Jeucina lo lIe: isoleucina s o Ser: serina T o Thr: treonina C o Cys: cisteína M o Me!: metionina E o Glu: ácido glutámico O o Asp: ácido aspártico K o Lys· lisina Ro Arg· argimna H o His: histidina
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F o Phe: fenilalanina
Yo Tyr: tirosina
W o Trp: triptófano
P o Pro: prolina
N o Asn: asparagina
Q o Gln: glutamina
BSA: albúmina de suero bovino
FBS: suero bovino fetal
PBS: disolución salina tamponada con fosfato
SDS: dcxlecilsulfato sódico
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico que muestra una estrategia de marcaje para el gen del CXCR4. En la figura se muestran el alelo natural de CXCR4 en la parte superior, un vector de marcaje en el centro y un alelo mutante predicho en la parte inferior. Las regiones codificantes de los genes están indicadas en recuadros negros. Los recuadros vacíos indican las regiooes no traducidas 5' y 3'. Las líneas punteadas indican fragmentos homólogos usados en el vector de marcaje. La sonda A es una sonda externa para la hibridación Soothem. Los sitios de restricción son E (EcoRI ), Sh (Sphl) y X (Xhol), respectivamente
La Fig. 2A es una fotografia que muestra el análisis por inmunotransferencia Soothem de colas de ADN de ratones de tipo natural (+/+) y mutantes heterocigotos (+/-). En la figura se muestran los fragmentos EcoRI-EcoRI del alelo de 11 ,8-kb de tipo natural y del de 8,2-kb de marcaje que fueron identificados por la sonda A.
La Fig. 2B es una fotografia que muestra el análisis de amplificación mediante RT-PCR de la expresión del CXCR4. Se prepararoo ARN totales a partir de embriones mutantes de E18.5 de tipo natural y homocigotos y se amplificaron con cebadores específicos para CXCR4. La amplificaciórJ mediante RT-PCR empleo ARNm de G3PDH, que era expresado universalmente, como control de la presencia de cualquier ARN amplificable
La Fig. 3 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales del mesenterio y de la región del asa intestinal media de un embrión de tipo natural para CXCR4~· en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino oon un anticuerpo anti-PECAM-1 La flecha indica una gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena mesentérica superior que abastece al intestino delgado en el mesenterio del tipo natural. "duO representa duo:::leno; "p," la parte proximal del asa intestinal media; y "dm," la parte distal del asa intestinal media.
La Fig. 4 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en los cortes transversales del mesenterio del embrión de tipo natural CXCR4~-en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino con el anticuerpo anti-PECAM-1. "a" representa arteria y V vena.
La Fig. 5 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en el yeyuno de un embrión de tipo natural CXCR4~-en E17.5, resultante de la inmunohislotinción del mesenterio y el intestino con el anticuerpo anti-PECAM-1. La flecha indica una gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena mesentérica superiofque abastece al intestino delgado en el mesenterio de tipo natural.
La Fig. 6 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en la parte más distal del yeyuno del embrión de tipo natural CXCR4~-en E17.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino con el anticuerpo anti-PECAM-1 La flecha indica una gran ramificación de la arteria mesentérica superior o de la vena mesentérica superior que abastece al intestino delgado en el mesenterio de tipo natural
La Fig. 7 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en el mesenterio yen las regiones del asa intestinal media de un embrión mutante CXCR4+-en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante oon el anticuerpo anti-PECAM-1 . Mp" representa la parte proximal del asa intestinal media; y "dm" la parte distal del asa intestinal media.
La Fig. 8 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en los cortes transversales del mesenlerio del embrión mutante CXCR4~-en E13.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante coo el anticuerpo anti-PECAM-I
La Fig. 9 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguineos gastrointestinales en el yeyuno de
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un embrión mutante CXCR44-en E17.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante con el anticuerpo anti-PECAM-1
La Fig. 10 es una fotografía que muestra los defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales en la parte más distal del yeyuno del embrión mutante CXCR44. en 17.5, resultante de la inmunohistotinción del mesenterio y el intestino del mutante con el anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 11 es una fotografía que muestra defectos en los vasos sanguíneos gastrointestinales, que soo una lesión hemorrágica del intestino sin teñir de un ratón mutante, un embrión CXCR4;¡· mutanle E16.5, resultante de la inmunohistotinci6n del mesenterio y el intestino del mulante con el anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 12A es una fotografía que muestra el resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E13.5 de tipo natural con el anticuerpo anti-PECAM-1. La flecha indica un gran vaso observado solo en el tipo natural.
La Fig. 128 es una fotografía que muestra el resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E13 .5 mutante con el anticuerpo anti-PECAM-1
La Fig. 12C es una fotografía que muestra el resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E15.5 de tipo natural con el anticuerpo anti-PECAM-1 . El inserto de la fotografía muestra cortes teñidos con hematoxilina y eosina de grandes vasos en la pared del estómago teñido en E15.5. La flecha indica un gran vaso observado solo en el tipo natural.
La Fig. 120 es una fotografía que muestra el resultado de la inmunohistotinción del estómago de un E15.5 mutante con el anticuerpo anti-PECAM-1.
La Fig. 13A es una fotografía que muestra la expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Los cortes sucesivos del mesenterio de tipo natural que conecta con el asa intestinal media se tiñeron con hematoxilina y eosina. "m" representa mesenterio, "i" intestino, "aH arteria mesentérica superior y V vena mesentérica superior.
La Fig. 138 es una fotografía que muestra la expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La hibridación se realizó con una sooda específica para CXCR4. Las flechas indican las células endoteliales teñidas de los vasos mesentéricos.
La Fig. 13C es una fotografía que muestra la expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La hibridación se realizó con una sonda específica para PBSF/SOF-1 El PBSF/SOF-1 era expresado en las células mesenquimatosas que rodean a las células endoteliales en el mesenterio.
La Fig. 130 es una fotografía que muestra la expresión de CXCR4 y PBSF/SOF-1 en un tejido del tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Los cortes sucesivos del mesenterio de tipo natural que conecta con el asa intestinal media se tiñeron con hematoxilina yeosina. La Fig. 130 es una ampliación de los vasos sanguíneos que surgen desde la arteria mesentérica superior mostrada en la Fig. 13A, en la que se observó una fuerte expresión del CXCR4 en las células endoteliales vasculares.
La Fig. 13E es una fotografía que muestra la expresiórJ de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del traclo gastrointestinal mediante una hibridación in situ. La hibridación se realizó con la sonda específica para CXCR4-. La Fig 13E es una ampliación de los vasos sanguíneos que surgen desde la arteria mesentérica superior mostrada en la Fig 138, en la que se observó una fuerte expresión del CXCR4 en las células endoteliales vasaJlares La flecha indica las células endoteliales teñidas de los vasos mesentéricos
La Fig. 13F es una fotografía que muestra la expresión de CXCR4 y PBSF/SDF-1 en un tejido del tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Es una sección de una médula ósea embrionaria de un E18.5 de tipo natural, que muestra la expresión del CXCR4 en células hematopoyéticas, pero ninguna expresión en células estromales fusifonnes.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
La composición farmacéutica para su uso como el agente antineoplásico seglil esta invención comprende como ingrediente eficaz una sustancia que inhibe la acción del CXCR4 como se define en la reivindicación 1 que es un receptor de quimiocinas
La secuencia de aminoácidos del CXCR4 ya se conocía. Específicamente, la secuencia de aminoácidos del CXCR4 humano y la secuencia de aminoácidos del CXCR4 murillO se establecen en las SEC ID N'''· 1 Y 3, respectivamente. La seruencia de bases del CXCR4 humano y la secuencia de bases del CXCR4 murino se establecen en la SEC ID N.O. 2
(posiciones de bases 1-1056) Y en la SEC ID N.O: 4 (posiciones de bases 1-1077), respectivamente.
También, se conocía ya la secuencia de aminoácidos del SOF-1, que es un ligando que se une al CXCR4 Existen dos tipos de SoF-1 que difieren en la longitud de la secuencia de aminoácidos, es decir, SOF-1-u y SoF-1 -¡3
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Específicamente, la secuencia de aminoácidos del SOF-1-a humano se establece en la SEC ID N.o: 5 y su secuencia de bases en la SEC ID N.o: 6 (posiciones de base 474-740). El SOF-1-p humano (SEC ID N.o: 9) deriva del SOF-1-o. humano mediante la adición de cuatro restos de aminoácidos, Arg Phe Lys Met, a un C-terminal del mismo.
La secuencia de aminoácidos del SoF-1 -a. murino se establece en la SEC ID N.o: 7 y su secuencia de bases en la SEC ID
N.O: 8 (posiciooes de base 82-348). El SOF-1-13 murino (SEC ID N.O: 10) deriva del SOF-1 -a murino mediante la adiciórJ de cuatro restos de aminoácidos, Arg Leu Lys Met, a un C-terminal del mismo. Para los SOF-I humano y murino, la secuencia de desde el primer aminoácido (Met) hasta el vigésimo primer aminoácido (Gly) es una secuencia señal
Las quimiocinas CXC conocidas hasta ahora incluían, además del PBSF/SOF-1 mencionado anteriormente, IL-8 (Yoshimura., T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84, 9233-9237 (1987», NAP-2 (Walz. A. y col., Biochem. Biophys Res. Comun., 159,969-975 (1989», NAP-4, GRO a. (Richmondo, A. y col., J. Cell. Biochem., 36, 185-198 (1988)), GRO 13 (Haskill, S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, 77732-7736 (1990», GROy (Haskill, S. y col., ¡bid. (1990)), GCP-2 (Proost, P. y col., J. Immunol., 150, 1000-1010 (1993», ENA-78 (Wayz, A. y col., J. Exp. Med., 174, 1355-1362 (1991», PF-4 (Deuel, T. F. Y col., Proc. Nat!. Acad. Sci. EE.UU. 74, 2256-2258 (1977)) e IP-10 (oewald, B. Y col., Immunol. Lett., 32, 81-84 (1992))
Las sustancias que inhiben la acción debida al CXCR4 que se pueden usar en esta invenciÓfl son: (1) una sustancia basada en la inhibiciÓfl de la propia unión entre el ligando (SOF-1) y el receptor (CXCR4); (2) una sustancia basada en la inhibición de la señalización desde el CXCR4 hacia los núcleos; (3) una sustancia que inhibe la expresión del propio CXCR4; y (4) una sustancia que inhibe la expresión del propio SOF-1, según se define adicionalmente en la reivindicaciÓfl
1
(1) Para la sustancia que inhibe la propia unión entre el SDF-1 y el CXCR4, hay una sustancia que inhibe el SoF-1 y una sustancia que inhibe el CXCR4
Más especificamente, la sustancia que inhibe el SoF-1 se clasifica en una sustancia que inhibe el CXCR4 en competiciÓfl antagonista con el SoF-1 y una sustancia que inhibe la unión del SoF-1 al CXCR4 uniéndose al SOF-1.
Para la sustancia que inhibe la unión del SoF-1 al CXCR4 uniéndose al SoF-1, concretamente se menciona un anticuerpo anti-SoF-1 y un fragmento del mismo que posee una actividad de uniórJ.
Más específicamente, la sustancia que inhibe el CXCR4 se clasifica en una sustancia que inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el CXCR4 por la uniÓfl al SOF-1 y una sustancia que inhibe la unión del SOF-1 al CXCR4 uniéndose al CXCR4.
Para la sustancia que inhibe la uniórJ del SOF-1 al CXCR4 uniéndose al CXCR4, concretamente se menciona un anticuerpo anti-CXCR4 y un fragmento del mismo que posee su actividad de uniÓfl
- (2)
- La limitación para la sustancia basada en la inhibiciórJ de la señalizaciÓfl desde el CXCR4 hacia los núcleos se define en la reivindicación 1, siempre que sea una sustancia que tenga dicha acciÓfl. Para la sustancia basada en la inhibiciÓfl de la señalizaciÓfl desde el CXCR4 hacia los núcleos, se mencionan inhibidores del sistema de señalizaciÓfl que existen posteriores a una proteína acoplada a proteína G, tal como un inhibidOf de la cascada MAK, un inhibidOf de la fosfolipasa C (PLC) y un inhibidOfde cinasa para la cinasa P13.
- (3)
- Para la sustancia que inhibe la expresiÓfl del propio CXCR4, se menciona una sustancia que aparentemente hace desaparecer el CXCR4 en células y una sustancia que inhibe la expresión del propio CXCR4. Un ejemplo especifico de la sustancia que aparentemente hace desaparecer el CXCR4 en células es una sustancia que induce regulación a la baja del CXCR4. La "inducción de regulación a la baja del CXCR4" significa específicamente una funciÓfl tal que actúa en la membrana celular para alterar la movilidad de la misma y de este modo hacer desaparecer el CDCR4 de la membrana celular.
- (4)
- Para la sustancia que inhibe la expresión del propio SoF-1 frente al CXCR4, se menciona una sustancia que inhibe el sitio de control de la expresión, tal como un promotor.
Los anticuerpos descritos anteriormente que pueden usarse en esta invención, tales como los anticuerpos anti-SoF-1 y los anticuerpos anti-CXCR4, pueden prepararse como anticuerpos policlooales o moooclonales usando técnicas que se conocen en la materia. Especialmente, se pl""efieren los anticuerpos moooclonales derivados de mamíferos como los anticuerpos que se usan en la invención. Los anticuerpos monocJonales derivados de mamíferos incluyen aquellos producidos por hibridomas y aquellos producidos por los huéspedes que han sido transformados con vectores de expresión que contienen los genes del anticuerpo mediante técnicas de ingeniería genética. Estos anticuerpos son aquellos que poseen las propiedades menciooadas anteriofmente.
Los hibridomas productores de anticuerpos pueden pl""epararse principalmente usando técnicas conocidas en la materia de la siguiente fOfma. Es decir, se usa un antígeno deseado como el antígeno sensibilizante para llevar a cabo la inmunización según un procedimiento de inmunización convenciooal; y las células inmunizadas resultantes se fusionan con células parentales conocidas en la técnica mediante un procedimiento de fusiÓfl celular convenciooal y las células
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productoras de anticuerpos monoclonales se someten a una donación mediante un procedimiento de donación convencional
Los mamíferos que se van a inmunizar con el antígeno sensibilizante no están particularmente limitados, pero deberían seleccionarse preferiblemente teniendo en cuenta su compatibilidad con las células parentales que se van a usar en la fusión celular. Generalmente se usan animales pertenecientes a la familia de los roedores, tales como ratones, ratas y hámsteres. La inmunización de los animales con el antígeno sensibilizante se lleva a cabo mediante un procedimiento conocido en la técnica
Para las células de mieloma de mamífero usadas como las otras células parentales para la fusión con los immunocitos, puede emplearse apropiadamente una variedad de líneas celulares ya conocidas en la materia. La fusión celular entre los immunocitos y las células de mieloma puede llevarse a cabo básicamente según un procedimiento convencional, tal como el procedimiento de Milstein y col. (Kohler, G. y Milstein, e ., Methods Enzymol., 73, 346 (1981)) con cualquier modificación posible.
Los hibridomas obtenidos se eligen cultivando en un medio de selección común, tal como medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en el medio HAT continúa durante un tiempo suficiente para permitir la destrucción de todas las células diferentes a los hibridomas objetivo (las células no fusionadas), que es habitua Imente desde unos pocos días hasta unas pocas semanas. Entonces se realiza el procedimiento de dilución limitante habitual para cribar y donar los hibridomas proouctores de los anticuerpos objetivo. Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de los hibridomas así obtenidos siguiendo un procedimiento que se emplea habitualmente
Además de la adquisición de los hibridomas mediante la inmunización de un animal distinto a un ser humano con el antígeno según se describió anteriormente, los linfocitos humanos son sensibilizados in vitro con una proteína de antígeno
o una célula que expresa el antígeno deseadas y los linfocitos B sensibilizados se fusionan con las células de mieloma humano, tales como U266, mediante lo que pueden obtenerse los anticuerpos humanizados deseados que poseen la actividad de unión hacia el antigeno o la célula que expresa el antigeno deseados. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados deseados pueden obtenerse según el procedimiento mencionado anteriormente administrando el antígeno o la célula que expresa el antígeno a un animal transgénico con un repertorio de genes de anticuerpos humanos.
Se clona un gen del antígeno como un anticuerpo monoclOflal a partir del hibridoma y se incorpora en un vector adecuado; y este se introduce en un hospedador y se usa la tecnología de manipulación gérJica para producir un anticuerpo recombinante, que puede ser usado entonces en esta invención. Véase, por ejemplo, Carl, A. K. Borrenbaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por Macmillan Publishers Ltd. 1990
En esta invención pueden usarse los anticuerpos recombinantes que han sido modificados artificialmente con el propósito de reducir la antigenicidad heterogérJea frente al ser humano, tales como anticuerpos quiméricos (publicación de patente eurq>ea EP125023) y anticuerpos humanizados (publicación de patente europea EP125023). Estos anticuerpos pueden producirse mediante procedimientos conocidos.
El anticuerpo quimérico comprende la región variable de un anticuerpo procedente de un mamífero distinto a un ser humano y la región constante (región e) procedente de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado comprende una región determinante de la complementariedad de un anticuerpo procedente de un mamífero distinto a un ser humano, una región marco (FR) procedente de un anticuerpo humano y una región e . Son útiles como los ingredientes eficaces en esta invención debido a la antigenicidad disminuida en el cuerpo humano
Los anticuerpos usados en esta invención pueden ser fragmentos de un anticuerpo o sustancias modificadas del mismo, siempre que puedan usarse de forma deseable en la invención. Los fragmentos del anticuerpo incluyen, por ejemplo Fab, F(ab')2, Fv y una cadena simple Fv (scFv) obtenible mediante la conexión del Fv de la cadena H y el Fv de la cadena L mediante un conector adecuado. Específicamente, se trata un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina, para producir fragmentos del anticuerpo. Altemativamente se construyen genes que codifican para estos fragmentos de anticuerpo y se introducen en un vector de expresión, tras lo que se expresan en células huésped adecuadas
Puede utilizarse el procedimiento de la biblioteca de fagos para obtener los anticuerpos que se usan en esta invención (Mar1<s, e . y col., lhe New England Joumal Medicine 335, 730-733). Por ejemplo, se obtiene una biblioteca de ADNc a partir de linfocitos B humanos que comprende una regiÓrl V de un anticuerpo humano, tal como el gen que codifica para el scFv. Esta biblioteca de ADNc se introduce en un vector fago, tal como el vector presentador de superficie del fago M13 y se deja que infecte a E. coli. La biblioteca de ADNc es expresada en E. cofi y la regiórl V del anticuerpo es producida en las superficies de la célula. Si se realiza una selección en una placa recubierta con el antígeno deseado basada en la actividad de unión del antígeno, puede obtenerse un gen que codifique para el anlicuerpo deseado.
Pueden obtenerse anticuerpos que posean una actividad de uniórl más fuerte a los antígenos mediante el procedimiento de intercambio de cadenas con la aplicación del procedimiento de la biblioteca de fagos. (Akamatsu, Y. y Tsurushita, N Medicallmmunology 27, 273-286 (1994» . Especificamente, se fija un miembro de la región V de un gen de un anticuerpo que ha sido separado (tal como VH); y se construye una nueva biblioteca a partir de la mezcla del primer miembro y del otro miembro preparada a partir de linfocitos B (tal como VL). Los clones que se unen al antígeno más fuertemente que
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los demás pueden ser separados de la biblioteca
También es posible obtener anticuerpos que posean una actividad de unión más fuerte a los antígenos introduciendo mutaciones artificiales en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. (Akamatsu, Y. y Tsurushita, N. Medical Immunology 27, 273--286 (1994))
Más específicamente, la mutación es introducida en un gen que codifica para la región V del anticuerpo donado y este gen es expresado mediante el procedimiento de la biblioteca de fagos descrito anteriOfTllente. Como consecuencia, resulta posible obtener un gen que codifica para el anticuerpo que posee una actividad de unión más fuerte al antígeno.
Estos fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos pOf hospedadores después de que sus genes sean obtenidos y expresados de la misma forma a la descrita previamente, anteriormente. Según se usa en la presente memoria descriptiva, ~anticuerpo~ engloba estos fragmentos de anticuerpo.
Las formas modificadas de anticuerpo pueden emplear anticuerpos que estén unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG). Según se usa en la presente memoria descriptiva, el ~anticuerpo~ engloba estas formas modificadas de anticuerpo. La obtención de estas formas modificadas de antiaJerpo puede realizarse sometiendo los anticuerpos obtenidos a una modificación química. Estos procedimientos ya han sido establecidos en la técnica
Los anticuerpos que se expresan y producen según se describió anterionnente pueden separarse de las células huésped intracelular o exlracelularmente y pueden purificarse hasta la homogeneidad según los procedimientos que se usan habitualmente La medida de la concentración puede llevarse a cabo mediante la medida de la absorbancia, ELlSA o similares
Según se explicó anteriormente, el uso del inhibidor de la vascularización según esta invención comprende el inhibidor del CXCR4 como el ingrediente eficaz que permite la inhibición de la vascularización; por lo tanto, ejercerá un efecto antitumoral (inhibición de la neovascularización) sobre cánceres sólidos, además de efectos antitumorales sobre el angiosarcoma (cáncer de los propios vasos sanguíneos) y el sarcoma de Kaposi. En aspectos de referencia también ejercerá efectos terapéuticos contra enfennedades causadas patológicamente por una neovascularización, tales como artritis reumatoide, pSOliasis y retinopalía diabética
Si se usa el agente terapéutico que comprende la sustancia que potencia la acción del CXCR4 para una enfermedad causada patológicamente por neovascularización, será posible promover la neovascularización. El uso ejercerá efectos terapéuticos sobre el infarto de miocardio y enfermedades que implican una neovascularización tras una cirugía, tales corno la cicatrización de heridas, la reparación yel remodelado de huesos, la reparación del cartílago, el crecimiento del pelo, el infarto de miocardio, el infarto cerebral y el traumatismo cerebral
Para los procedimientos de prueba de inhibición y promoción de la neovascularización que pueden usarse en esta invención puede emplearse un ensayo de neovascularización. No hay ninguna limitación en particular para este ensayo y puede usarse preferiblemente un procedimiento que es habitualmente conocido. ("Researdl Manual for Ihe Invasion and Metastasis of Gancers" Ihe Gancer Melastasis Study Group Ed., Kinhodo, 159-182, (1994». Especificamente se mencionan, entre otros, (1) el procedimiento para medir la segmentación de los espacios entre las células endoteliales vasculares (es decir, el efecto sobre las células endoteliales vasculares), que se basa en el descubrimiento de que las células endoteliales vasculares se rompen aJando las células tumorales salen fuera de los vasos sanguíneos (a partir de la permeabilidad del FllC dextrano); (11) el procedimiento de la cornea, conocido como un procedimiento de medición in lIivo para identificar un factor candidato que ejerza la función de un faclOf induclOf de la neovascularización in vivo; (IV) el procedimiento CAM (membrana corioalantoidea de embrión de pollo); (V) el procedimiento de la subcutánea dorsal para medir la cantidad de vasos sanguíneos inducidos a simple vista; y (VI) el procedimiento para determinar la formación de lumen por parte de las células endoteliales vasculares
Para confirmar el efedo antitumoral, pueden mencionarse experimentos in vivo usando un modelo de transplante o un modelo de metástasis de transplante y experimentos in vitro con células cancerosas. Específicamente, puede usarse el procedimiento descrito E!fl "Research Manual for Ihe Invasion and Metastasis of Cancers" the Cancer Metaslasis Study Group Ed., Kinhodo, 7-158 (1994).
La composición farmacéutica para su uso como el agente antineoplásico según esta invención puede administrarse sistémicamente (por vía ora l) o localmente. POf ejemplo, puede elegirse una inyección intravenosa (tal como una infusión intravenosa por goteo), una inyecdón intramuscular, una inyección intraperitoneal o una inyecx:ión subcutánea: puede elegirse un procedimiento de administraciÓf'l adecuado dependiendo de la edad o la gravedad del sujeto
La dosis unitaria eficaz se elige en el intervalo de de 0,09 mg hasta 1 ()() mg por kg de peso COfporal
Altemativamente, puede elegirse una dosis de 1-1000 rng, preferiblemente una dosis de 5-50 mg para el sujeto.
La composición farmacéutica para su uso como el agente antineoplásico seglil esta invención puede contener COlljuntamente vehículos o aditivos farmacéuticamente aceptables, dependiendo de la vía de administración. Algunos ejemplos de dichos vehiculos y aditivos induyen agua, disolventes orgánicos que sean farmacéuticamente aceptables,
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colágeno, alcohol polivinilico, polivinilopirrolidona, polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato sódico, arginato sódico, dexlrano soluble en agua, carboximetilalmidán sódico, pectina, metilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseina, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearilico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manito l, sorbitol, lactosa, tensioactivos que sean aceptados como aditivos para fármacos, etc.
Los aditivos que se van a usar pueden seleccionarse apropiadamente (o en combinación) entre aquellos mencionados anteriormente dependiendo de la forma de dosificación, pero no se limitan a los mismos.
Esta invención se ilustrará a continuación con mayor detalle mediante ejemplos.
Ejemplos
Creación y análisis de ratones que carecen completamente de CXCR4
Se aisló un AON genómico que contenía el Iocus del CXCR4 a partir de una biblioteca de ADN de la línea celular murina 129 (STRATAGENE).
Se sustiluyó un fragmento genómico de 1,1 kb que contenía la región codificante S' del exón 2 por un gen resistente a la neomicina y se ligó el gen de la cinasa de timidina del herpes simple al S' terminal
El vector marcador se introdujo en las células el dia 14.1 de la embriogénesis (denominado en lo sucesivo ~E14.1~) mediante eleclroporación y se seleccionó una recombinación homóloga usando G418 y ganciclovir y se identificó mediante PCR.
La estructura del Iocus mutante y la presencia de un único ínserlo en la colonia de células ES fueron confirmadas mediante una hibridación Southem. Según el procedimiento descrito en Nagasawa, T. y col., Nalure 382, 685-688 (1996), se usó la colonia de células ES mutantes para crear un ralón mutante mediante la inyección de células embrionarias no diferenciadas
Mediante hibridación Southem se digirió la cola de AON con EcoRl, se transfirió a una membrana de nailon y se hibridó ron una sonda A de 550 pb con la región 5' homóloga
Se realizó una RT-PCR durante 40 ciclos, usando 3 ¡.tg del ARN total aislado del hígado fetal de los embriones E18.S como material de partida, según el procedimiento convencional. Se amplificó un producto de PCR de 630 pb usando cebadores específicos para CXCR4, es decir, un cebador directo (SEC ID N.O: 11) Y un cebador inverso (SEC ID N.O: 12). Se llevaron a cabo un análisis histológico y un análisis por citometria de flujo, sustancialmente según el procedimiento descrito en Nagasawa, T. y col., Nalure 382, 685-688 (1996)
La inmunohistotinción siguió sustancialmente el procedimiento de Adachi, S., Yoshida, H., Kataoka, H Nishikawa, S.-I Inl. Immunol. 9, 507-514. Las secciones de los embriones y Ófganos se fijaron con paraformaldehído al 4%, se deshidrataron con metanol, se decoloraron con peróxido de hidrógeno al 30% en metanol y se hidrataron de nuevo.
Después de incubar en PBSMT (PBS que contiene leche en polvo desnatada al 1% y un 0,3% vlv de Tritoo X-1OO), la muestra se incubó con anticuerpo anti-PECAM diluido (1 :250) (PharMingen) en PBSMT a 4Q C hasta el día siguiente. Entonces la muestra se lavó con PBSMT y se incubó con anticuerpo Ig anti-rata marcado con peroxidasa de rábano diluido (1:500) (Biosource) en PBST a 4Q C durante toda la noche.
A continuación la muestra se lavó exhaustivamente. El embrión se inrubó en PBS que contenía 250 ¡.tgfml de diaminobencidina (Oojin Chemicals) y NiCI2 al 0,08% durante 30 mino Se añadió peróxido de hidrógeno a la muestra para proporcionar una concentración final del 0,01%, tras lo que se llevó a cabo la tinción con peroxidasa. La reacción se inactivó después de aproximadamente 30 min
Según el procedimiento descrito en Nagasawa, T. y col., Nalure 382, 685-688 (1996), se usó un fragmento de AONc de CXCR4 o de PBSF/SOF-1 murino como sonda para llevar a cabo la transcripción antisentido
Se crearon ratones carentes de CXCR4 para determinar la función fisiológica del CXCR4. Especificamente se construyó un vector marcador, de forma que la mayoría del exón 2 del gen de CXCR4 que contenia todas las regiones transmembranales críticas para la función del receptor habia sido deleciooada y la porción delecionada sería sustituida por un gen de resistencia a la neomicina (neo). Esto daría como resultado que, tras una recombinación homóloga, todo el gen del CXCR4 había sido sustancialmente delecionado.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra una estrategia de marcaje para el gen del CXCR4 (denotado como superior, central e inferior). Se muestran el alelo natural de CXCR4 en la parte superior, un vector marcador en el centro y un alelo mutante predicho en la parte inferior. Las regiones codificantes de los genes están indicadas mediante recuadros negros. Los recuadros vacíos indican las regiones S' y 3' no traducidas. Las lineas de puntos indican fragmentos homólogos usados en el vector marcador. La sonda A es una sonda exlerna para la hibridación Southern. Aquí, los sitios de restricción son E (EcoRI), Sh (Sphl) Y X (Xhol), respectivamente.
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La Fig_ 2A es una fotografía que muestra el análisis por inmunotransferencia SouIhem de las colas de ADN de ratones de tipo natural (+/+) y helerocigotos mulantes (+/-)_ En la figura se muestran los fragmentos EcoRI-EcoRI del alelo de tipo natural de 11 ,8 kb Y marcado de 8,2 kb que fueron identificados mediante la sooda A. La Fig. 2B es una fotografía que muestra el análisis de amplificaciórJ mediante RT-PCR de la expresión del CXCR4. Se prepararon ARN totales a partir de embriones naturales E18.5 y homoogotos mutantes y se amplificaron con cebadores específicos para CXCR4. La amplificación mediante RT-PCR empleó ARNm G3PDH, que se expresaba universalmente, como control de la presencia de cualquier ARN amplificable
Se crearon ratones con una mulaciórJ heterocigota CXCR4+/' Los ratones estaban sanos y eran fértiles_ Los embriones homocigolos mulantes CXCR44 están presentes en las proporciones esperadas hasla E15_5 de la embriogénesis_ Sin embargo, aproximadamente la mitad de los embriones CXCR4'¡· murieron en E18.5 y los neonatos CXCR4'¡' murieron en una hora, de forma similar a los ratones que carecían de PBSF/SDF-1, según se infOfTTló previamente (Nagasawa, T. y coL, Nature 382, 685---688 (1996»
Para elucidar las funciones del CXCR4 durante la embriogénesis, se examinó la expresión del CXCR4 en embriones en desarrollo mediante una hibridación in situ. Se detectaron allos niveles de transcritos de CXCR4 en el endotelio de los vasos sanguíneos en desarrollo durante la embriogénesis.
Basándose en este descubrimiento, se investigó el efecto de la deficiencia del gen del CXCR4 sobre la vascularizaciórJ En una inspección visual, los vasos vitelinos y umbilicales eran normales_ El examen histológico de los embriones E18_5 CXCR4'¡' mostró la presencia de los principales vasos sanguíneos, incluyendo la aorta, la vena cava, la arteria carótida, la vena yugular, la arteria celíaca y la arteria mesentérica SUperiOf y la vena mesentérica superior. Para visualizar el sistema vascular de los órganos se inmunotiñeron entonces preparaciones completas de embriones naturales y mulantes COfl un anticuerpo anti-PECAM-1_ Se sabe que PECAM-1 se eXlIesa específicamente y de forma eslable en todas las células endoteliales durante el periodo embrionario (Vecdli, A_ y col. Eur. J_cell BioL 63, 247-255 (1994); Baldwin, H_ S_ y col., Developmentl20, 2539-2558 (1994».
Consecuentemente, en el lraclo gastrointestinal, incluyendo el estómago, el intestino y el mesenterio, se observó una red vascular homogénea altamente ramificada, tanto en el de tipo natural como en el mutante, alrededor de E11.5. Se observó la formaciórJ de vasos sanguíneos grandes y pequeños mediante un remodelado en el mesenterio, que COfledaban COfl el asa intestinal media aproximadamente en E12_5_ Como muestra la Hg_ 3, se formaron muchas grandes ramificaciones de la arteria y la vena mesentérica superior que aportaban nutrientes al intestino en los embriones naturales en E13.5. Por otro lado, estas grandes ramificaciones no estaban presentes en los mesenterios de los embriones CXCR4'¡' en EI3.5; en su lugar solo se fOfTTlaron vasos pequeños. El análisis histológico al microscopio reveló arterias y venas mesentéricas superiores en los mesenterios de los embriooes naturales en E 13.5. Esto demostró que los vasos ramificados eslaban duplicados entre la arteria y la vena (Fig_4)_ Por el contrario, la mayoría de los vasos de los embriones CXCR4'¡' no eslaban duplicados, sino que eran simples, como puede observarse en la Fig_8_Sin embargo, las arterias y venas mesentéricas superiores de los mesenterios embriones de tipo natural eran normales. En los embriones de tipo natural E17.5, los grandes vasos mesentéricos se d ividen en varias ramas y alcanzan el intestino (Figs. 5 y 6). Sin embargo, en los embriones CXCR4'¡' dichos vasos, correspondientes a los grandes vasos mesentéricos, estaban suslancialmente ausentes (Figs _6 y 9)_También se observaron unos pocos grandes vasos con ramificaciones aberrantes en los mesenterios mulantes (Figs_6 y 9)_ En la mayoría de los embriones mulantes E16_5 se observaron múltiples lesiones hemorrágicas en sus intestinos delgados debidas a dicho sistema vascular defectuoso. Se cree que esta patogenia es el resultado de una aberración del sistema circulatorio que domina el intestino (Fig. 11).
Los resultados mencionados anteriormente han demostrado que el CXCR4 es esencial para la normal vascularizacián de intestino delgado: se cree que el mecanismo es debido a que el CXCR4 está implicado en la ramificación y/o el remodelado de los vasos mesentéricos
En el estómago se formaron grandes vasos que se ramificaban desde los vasos mesenquimatosos a lo largo de la curvatura menor y se distribuyeron por tocla la superficie ventral y dorsal en los embriones de tipo natural en E 13_5 (Figs 12A y 12C)_ El análisis histológico reveló que estos vasos estaban ubicados enlre la arteria y la vena en el ratón de tipo natural EI5.5, según muestra el inserto de la Fig. 12 C. Sin embargo, no se encontraron los correspondientes vasos en los embriones mutantes (Figs. 12B y 120). La formaciórJ de la red de pequeños vasos que roclea al estómago parecía ser normal en los embriones mutantes (Fig_120)
El análisis histológico de los estómagos y los intestinos de los embriones mutantes E18.5 no detectó anomalías evidentes en la organogénesis_ Por ejemplo, las capas musculares lisas (tanto la capa extema como la interna) del tracto gastrointestinal de los ratones mulantes parecian ser nOfTTlales en las direcciones longitudinal y vertical.
Las Figs_ 3-6 son fotografias que muestran los defectos de los vasos gastrointestinales en los embriones CXCR4.,!. y lambién fotografias que muestran la inmunohistotincián de los mesenterios y los intestinos de tipo natural con el anticuerpo anti-PECAM. La Fig. 3 muestra las regiones del mesenterio y del asa intestinal media en E13.5. La Fig. 5 muestra un yeyuno en E17.5. La Fig. 6 muestra un yeyuno en E17.5. La Fig. 7 muestra un corte transversal del mesenterio teñido en E13_5_Las flechas de las Figs_ 3, 5 Y 6 indican grandes ramificaciones de la arteria mesentérica superior o de la vena mesentérica superior que aportan nulrientes al intestino delgado en los mesenterios de tipo natural
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De forma similar, las Figs. 7-11 son fotografías que muestran los defectos de los vasos gastrointestinales en los
embriones CXCR4 ...· y también fotografías que muestran la inmunohistotinción de los mesenterios y los intestinos de los mutantes con el anticuerpo anti-PECAM. La Fig. 7 muestra las regiones del mesenterio y del asa intestinal media en E13.5. La Fig. 9 muestra un yeyuno en E17.5. Fig. 10 muestra un yeyuno en E17.5. La Fig. 7 muestra un corte transversal del mesenterio teñido en E13.5. La Fig. 11 muestra las lesiones hemooágicas del intestino sin teñir de un ratón mutante en E16_5. Las flechas de las Figs 9 y 10 indican grandes vasos que muestran un recorrido yfo ramificaciones aberrantes en los ratones mutantes
Las Figs. 12A-120 son fotografías que muestran los resultados de la inmunohistotinción de los estómagos con el anticuerpo anti-PECAM. Las Figs. 12A y 12B muestran E1 3.5; las Figs. 12C y 120 muestran E15.5; las Figs. 12A y 12C muestran los tipos naturales; y las Figs. 12B y 120 muestran los mutantes. El inserto en la fotografía de la Fig. 12C muestra una secciÓflteñida con hematoxilina y eosina de grandes vasos en la pared de un estómago teñido en E15.5. Las flechas de las Figs. 12A y 12C indican grandes vasos observados únicamente en el mutante. "du" representa duodeno; "p" representa la parte proximal del asa intestinal media; "dm" representa la parte distal del asa intestinal media; "a" representa arteria; y V representa vena.
Estos descubrimientos indican que las anomalías en la vascularización de los ratones CXCR4'¡" no son una conseruencia secundaria de las de los propios tractos gastrointestinales También se observaroo anomalías similares a las de la vascularización en los ratones que carecian de PBSFfSOF-1
El análisis de hibridación in situ indicó que los transcritos de CXCR4 se expresaban en las células endoteliales de los vasos sanguíneos en el mesenterio y en la pared del intestino y el estómago en los embriones de tipo natural E12.5 (Figs. 13B Y 13E). Particularmente, se observó una fuerte expresión en las células endoteliales de las ramificaciones que surgían de las arterias mesentéricas superiores (Figs. 13B Y 13E). POf el contrario, se expresaban altos niveles de PBSF/SOF-1 en las células mesenquimatosas que rodean a las células endoteliales del mesenterio, pero no en las células endoteliales o de la pared del intestino en el estómago (Fig. 13C).
Las Figs. 13A-13F son fotografías que muestran un análisis de la expresión de CXCR4 y de PBSF/SOF-1 en el tracto gastrointestinal mediante una hibridación in situ. Se usaroo cortes sucesivos del mesenterio de tipo natural que conectaba con el asa intestinal media; una porción se tiñó con hematoxilina y eosina (Figs. 13A y 130); otra porción se hibridó con la sonda específica para CXCR4 (Figs. 138 Y 13E); lila po..-ción adicional se hibridó con la sonda específica para PBSFISOF-1 (Fig. 13E). Las Figs. 130 y 13E son ampliaciones de los vasos ramificados que surgen de la arteria mesentérica superior mostrada en las Figs. 13A y 13B, indicando una fuerte expresién de CXCR4 en las células endoteliales del vaso. Las flechas y las cabezas de flecha de las Figs. 13B y 13E indican las células industriales de los vasos sanguíneos mesentéricos con la expresión obsefVada del CXCR4. El PBSF/SOF-1 es expresado en las células mesenquimatosas que rooean a las células endoteliales del mesenterio (Fig. 13E). La Fig. 13F es un corte transversal de la médula ósea del embriÓfl de tipo natural E18.5, que muestra la expresión del CXCR4 en células hematopoyéticas, pero no en células estromales fusifonnes. "m" representa mesenterio; "i" representa intestino; "a" representa arteria mesentérica superior; y "v" representa vena mesentérica superior
Los patrones de expresión obtenidos indican que el PBSFtsOF-1 producido por las células mesenquimatosas actúa sobre el CXCR4 de las células endoteliales; y esto sugiere fuertemente la presencia de una señal paracrina por parte de una citocina que juega un papel extremadamente importante en el mesénquima mesentérico. Por lo tanto, el fenotipo que carece de los grandes vasos en el estómago CXCR4 ...· y PBSFfSOF-1 ...· puede ser el resultado de anomalías en la ramificación y/o el remodelado vascular en el mesérJquima a lo largo de la curvatura menOf del estómago.
Para examinar los sistemas vasculares de otros órganos, se tiñeron preparaciones completas de saco vitelino, cerebro y cornzón con un anticuerpo monoclonal anti-PECAM-1. No hubo una diferencia evidente entre CXCR4 ...· y PBSF/SOF-1 ...· y el tipo natural en la formación de los grandes y pequeños vasos en la preparación completa de saco vitelino (E12.5, E14.5), la región de la cabeza (E11.5) y el corazón (E12.5-E14.5).
En resumen, los resultados experimentales mencionados anteriormente han demostrado que CXCR4 y PBSF/SOF-1 son esenciales para la formación de un sistema vascular maduro que abastece al tracto gastrointestinal, actuando sobre las células endoteliales de los vasos sanguíneos y regulando la ramificación y/o el remodelado vascular.
Un análisis citométrico de flujo reveló que el número de progenitores de linfocitos B en hígados fetales de ratones CXCR4/. estaba gravemente reducido. El análisis histológico no detectó mielocitos ni sus progenitores en la cavidad medular. Además, se encontraron defectos en la porción membranosa del tabique ventricular cardiaco en los corazones de los ratones mutantes E18.5. Estas anomalías eran muy sim ilares al fenotipo hallado en los ratones que carecen de PBSF/SOF.1, lo que apoyaba la creencia de que el CXCR4 es un receptOffisiológico primario para el PBSFfSOF-1.
En la médula ósea embrionaria de tipo natural E18.5, según se detenninó mediante una hibridaciÓfl in situ, los transcritos de CXCR4 se expresaban en células hematopoyéticas, mientras que no se expresaban en células estromales fusiformes, en las se había obsefVado la expresión de los transcritos de PBSFfSOF-1 (Fig. 3D) Los resultados de estos patrones de expresión indican la presencia de una señalización paracrina en la médula ósea.
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Los análisis de los receptores de las cinasas de tirosina (RTC), tales como Flk-1 y Tie-2 Y sus ligandos, tales como VEGF, angiopoyetina-1 y PDGF-B, de los que se ha informado hasta la fecha, usando ratones mutantes, han indicado que juegan un papel importante en el desarrollo del sistema vascular y que muchos de ellos son necesarios para la etapa más temprana de vascularización en la génesis, así como para la vascularización, de todas las partes del cuerpo, incluyendo el saco vitelina y la vasculatura extraembrionaria. (Shalaby, F. y col., Nature 376, 62-66 (1995); Fong, G. H., Rossant, J., Gertsenstein, M. & Breitman, M. L., Nature 376, 66-70 (1995); Dumount, D. H. Y col., Genes Dev 8, 1897-1909 (1994); Sato, T. N. Y col., Nature, 376, 70-74 (1995); Garmeliet, P. y col., Nature, 880, 435439 (1996); Ferrara, N y col., Nature, 380,439-442 (1996); YSUri, C. y col., Gell 87, 1171-1180 (1996».
Por el contrario, las funciones de CXCR4 y de PBSF/SDF-1 operan en etapas más tardías de la génesis y son específicas del &gano. Se cree que el Tie-2 y su ligando, la angiopoyetina-1 , son necesarios para la ramificación y/o el remodelado en el sistema vascular temprano. (Sato, T. N. Y col., Nalure 376, 70-74 (1995); Suri, C. y col., Cell87, 1171-1180 (1996». Sus papeles en la formación del sistema vascular maduro del tracto gastrointestinal no están daros. Las evidentes anomalías encontradas en el sistema vascular del saco vitelino vascular de ratones Tie-2 o angiopoyetina-14• no se apreciaron en los ratones CXCR4 ni PBSFfSDF-14-. Se ha informado de que las quimiocinas CXC, tales como PF4 (Maione, T. E. Y col., Science 247, 77-79 (1990», IL-8 (Koch, A. E. Y col., Science 258,1798-1801 (1992»,IP-10 (Luster,
A. D. Y col., J. Exp. Med. 182, 219-231 (1995)) Y Gro¡} (Cao, Y. H. Y col., J. J. Exp. Med. 182, 2069-2077 (1995)), son reguladores de la de neovascularización. Sin embargo, todavía no se ha elucidado la expresión de sus receptores en células endoteliales ni sus papeles fisiológicos. Aunque se ha demostrado que el factor de coagulación V (Cui, J. y col., Nature, 384, 66-68 (1996)) Y el factor tisular (Carmeliet, P. y col., Nature 883, 75-78 (1996)) son esenciales para el sistema vascular del saco vitelina, no está claro en cuanto a qué tipo de aceptar media en estos factores.
Con los antecedentes mencionados anteriormente, puede decirse que esta invención ha demostrado la presencia de un nuevo sistema de señalización -quimiocinas y receptores acoplados a proteínas G que abarcan siete dominios transmembrana-esencial para la vascularización.
Recientemente se ha demostrado que los ratones que carecen de la subunidad {l de la proteína heterotrimérica Ga 13 de unión al GTP presentan anomalías, tales como la no formación un sistema vascular en el saco vitelina y una expansión de los pequeños vasos embrionarios. Aunque los fenotipos son diferentes de los de los ratones que carecen de CXCR4, es necesario examinar la posibilidad de que los CXCR4 se acoplen a la Ga13.
Se sabe que CXCR4 y CCR5 son COfreceptOfes esenciales cuando cepas de VIH-1 tróficas de linfocitos T y de macrófagos infectan respectivamente a sus células huésped. (Feng, Y. y col., Science 272, 872-877 (1996); Fauci, A. S., Nature 884, 529-584 (1996». Entre los dos han descubierto la población homocigota para la deleción CCR5; y son resistentes a la infección por VIH-1 y no tienen problemas de salud evidentes. (liu, R. y col., Cell 86, 367-377 (1996); Samson, M. y col., Nature 382, 722-725 (1996); Y Dean, M. Y col., Science 273,1856-1861)
Con respecto al otro CXCR4, se ha sugendo fuertemente, sin embargo, que es poco probable que se produzca la deleción CXCR4 homóloga en seres humanos, dado que los ratones que carecen de CXCR4 tienden a morir en el útero. Todavía queda la posibilidad de que puedan existir factores genétiros adicionales o mutaciones homólogas viables en supervivientes a largo plazo que sean resistentes al VIH-1 trófico de linfocitos T.
Aplicabilidad industrial
Basándose en el descubrimiento de esta invención, de que se suprime la vascularización en ratones con genes CXCR4 inactivados, puede prepararse un inhibidor de la vascularización que comprende como ingrediente eficaz una sustancia que inhibe la acción del CXCR4: dado que la vascularización es esencial para el mantenimiento y la expansión de los tejidos cancerosos, el descubrimiento es utilizado en la preparación de un agente antineoplásico que comprende como ingrediente eficaz una sustancia que inhibe la acción del CXCR4
Lista de secuencias
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSIKI KAISHA
<120> Inhibidores de vascularización
<130> CGS 98-06 PCT
<140> PCT/JP99f01448
<141> 23-9-1999
<150> JP10195448
<151 >24-3-1998
<160> 12
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un cáncer sólido, que comprende una sustancia que inhibe la acción debida al CXCR4, en el que la sustancia se selecciona del grupo que consiste en
- (1)
- una sustancia que inhibe la unión entre el SDF-1 y el CXCR4;
- (2)
- una sustancia que inhibe la señalizaciórJ desde el CXCR4 hacia los núcleos;
- (3)
- una sustancia que inhibe la expresión del CXCR4; y
- (4)
- una sustancia que inhibe la expresión del SDF-1,
en la que la sustancia es un anticuerpo anti-SOF-1, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-SDF-1, o un anticuerpo anti-CXCR4, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-CXCR4 - 2. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la sustancia inhibe el SDF-1.3 Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la sustancia inhibe el CXCR4.4 Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, en la que la sustancia inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el SOF-1.5 Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, en la que la sustancia inhibe que el SOF-1 se una al CXCR4 uniéndose al SOF-16 ComposiciórJ farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la sustancia es una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo anti-SOF-1 y un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-SDF-1.
-
- 7.
- Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que la sustancia inhibe el CXCR4 en competición antagonista con el CXCR4 para uniórJ al SDF-1.
-
- 8.
- Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que la sustancia inhibe que el SDF-1 se una al CXCR4 uniéndose al CXCR4.
-
- 9.
- ComposiciórJ farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que la sustancia es una seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CXCR4 y un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad de anticuerpo anti-CXCR4
-
- 10.
- Composición farmacéutica para su uso según la reivindicaciórJ 1, en la que la sustancia es una sustancia que inhibe la expresiórJ misma de CXCR4 y es un inhibidOf contra el sitio de control de expresiórJ de CXCR4
11 Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que la sustancia muestra inhibición contra el sitio de control de expresión del SOF-1 -
- 12.
- Un procedimiento para rastrear una sustancia que trata un cáncer sólido en base a la inhibición de la acciórJ debida al CXCR4, en el que la sustancia es un anticuerpo anti-SDF-1, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-SDF1, o un anticuerpo anti-CXCR4, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-CXCR4.
-
- 13.
- Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende una etapa de identificar una sustancia que inhibe la acciórJ debida al CXCR4 como una sustancia que trata un cáncer sólido.
-
- 14.
- Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende una etapa de identificar una sustancia que inhibe (1) la uniórJ entre el SDF-1 y el CXCR4, (2) la señalización desde el CXCR4 a los núcleos, (3) la expresiórJ del CXCR4, o (4) la expresión del SOF-1 como una sustancia que trata un cáncer sólido
-
- 15.
- Un procedimiento para evaluar la actividad anti-tumores sólidos de una sustancia, en base a la inhibición de la acción debida al CXCR4, en el que la sustancia es un anticuerpo anti-SDF-1, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-SOF-1, o un anticuerpo anti-CXCR4, o un fragmento de dicho anticuerpo que posee la actividad del anticuerpo anti-CXCR4.
16 Procedimiento :según la reivindicación 15, que comprende una etapa de medir la actividad inhibidora de la acciórJ debida al CXCR4. - 17. Procedimiento según la reivindicación 15, que comprende una etapa de medir la actividad inhibidora de (1) la uniórJ entre el SDF-1 y el CXCR4, (2) la señalización desde el CXCR4 hasta los núcleos, (3) la expresión del CXCR4, o (4)22E10181992 09-12·2014la expresión del SDF·1.23
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