ES2576130T3 - Antagonistas de activina para el diagnóstico y la terapia de enfermedades asociadas a fibrosis - Google Patents

Antagonistas de activina para el diagnóstico y la terapia de enfermedades asociadas a fibrosis Download PDF

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Abstract

Una folistatina para su uso en un método de tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado.

Description

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DESCRIPCION
Antagonistas de activina para el diagnostico y la terapia de enfermedades asociadas a fibrosis Campo tecnico
La presente invencion se refiere al tratamiento de la fibrosis pulmonar en un vertebrado por medio de la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista de activina, folistatina.
Tecnica anterior
Varias enfermedades graves de los mamlferos, incluyendo los seres humanos, se asocian a fibrosis. Dichas enfermedades incluyen, cirrosis del hlgado, fibrosis pulmonar, enfermedad intestinal inflamatoria tal como la enfermedad de Crohn.
La cirrosis del hlgado es una enfermedad progresiva del hlgado que se caracteriza por un dano difuso de las celulas del parenquima hepatico con regeneracion nodular, fibrosis y alteracion de la arquitectura normal. Se asocia a fallo de la funcion de las celulas hepaticas y con interferencia del flujo sangulneo lo que da lugar a un fallo hepatico total y carcinoma hepatocelular (HCC). Hay varios agentes que producen danos hepatocelulares incluyendo el alcohol, los virus de la hepatitis, distintos farmacos y la sobrecarga de hierro (Hemocromatosis), entre otros. La exposicion a estos agentes promueve una cascada de eventos que, debido a su exposicion repetida, puede dar como resultado el desarrollo de enfermedad cronica que incluye fibrosis progresiva y cirrosis.
Enfermedad pulmonar intersticial (ILD) es una expresion que incluye varios trastornos pulmonares cronicos. Tambien se hace referencia a la ILD como fibrosis pulmonar intersticial o fibrosis pulmonar. El pulmon se dana habitualmente de alguna manera, dando como resultado una inflamacion en las paredes de los sacos aereos (alveolitis), en las paredes de los bronquiolos (bronquiolitis) o en los capilares (vasculitis). Entonces, comienza a cicatrizar (o fibrosarse) y el pulmon pierde su elasticidad. La fibrosis da como resultado una perdida permanente de la capacidad del tejido pulmonar para transportar oxlgeno.
Hay tambien un grupo de enfermedades pulmonares cronicas, llamado fibrosis pulmonar idiopatica (IPF) que es de origen desconocido.
La enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) es un grupo de trastornos cronicos que producen inflamacion o ulceracion en el intestino delgado y grueso. Mas a menudo la IBD se clasifica como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, pero se puede hacer referencia a esta como colitis, enteritis, ileitis, y proctitis. La colitis ulcerativa produce la inflamacion y ulceracion del revestimiento interno del colon y el recto, mientras que la enfermedad de Crohn es una inflamacion que se extiende a las capas mas profundas de la pared intestinal. La pared intestinal se engrosa y al principio es plegable, pero segun se produce la fibrosis, la pared se vuelve rigida con estrechamiento luminal y estenosis ocasional. La enfermedad de Crohn tambien puede afectar otras partes del tracto digestivo, incluyendo la boca, esofago, estomago, e intestino delgado.
Ohga et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 228:391396 (1996) describen que una caracteristica de la fibrosis pulmonar es un aumento de los fibroblastos y tejido conjuntivo. Se ha demostrado que la activina A tiene efectos potenciales sobre la proliferacion de los fibroblastos pulmonares y su diferenciacion en miofibroblastos, pero que los efectos de la activina A se anulan por la folistatina.
Giri et al., Thorax (1993) 48:959966 describieron como un aumento de la produccion de TGFp tiene un papel importante en la patofisiologia de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y que el tratamiento con anticuerpos contra el TGFp ofrece una nueva manera de intervencion farmacologica en el tratamiento de la fibrosis pulmonar.
Se necesitan nuevos tratamientos antifibroticos para evitar el desarrollo de, o la cura de afecciones asociadas a fibrosis, tales como las que se han identificado anteriormente, ya que estas afecciones son causas importantes de muerte y/o perdida de calidad de vida y son un aumento de carga para los sistemas medicos.
Se desvela ahora en el presente documento que la folistatina se puede utilizar en el tratamiento de la fibrosis pulmonar en un vertebrado.
Divulgacion de la invencion
La presente invencion se refiere al hallazgo de que el antagonista de la activina, la proteina folistatina, es un agente terapeutico util para el tratamiento de la fibrosis pulmonar. Normalmente, la fibrosis puede implicar la expresion anormalmente elevada de la hormona activina A. Los resultados desvelados en el presente documento apoyan la posicion de que la administracion de folistatina, inhibe la hiperproliferacion asociada a la hormona activina.
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. Los objetivos que no estan englobados en el
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ambito de las reivindicaciones no forman parte de la invention que se reivindica actualmente.
1. Composiciones terapeuticas/farmaceuticas para el tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad
Se describe en el presente documento una composition farmaceutica para el tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad asociada a fibrosis en un vertebrado, comprendiendo dicha composicion al menos un antagonista de activina, y opcionalmente un vehlculo, adyuvante y/o diluyente farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describe un proceso para preparar una composicion farmaceutica como se define en la primera realization de la invencion, en el que dicho proceso comprende mezclar homogeneamente al menos un antagonista de activina con un vehlculo, adyuvante y/o diluyente farmaceuticamente aceptable.
En la presente invencion, el vertebrado se selecciona de entre el grupo que se consiste en el ser humano, primates no humanos, ratones, ganado bovino, ovejas, cabras, caballos, conejos, aves, gatos y perros. Mas normalmente, el vertebrado es un ser humano, un primate no humano o un raton. Mas normalmente, el vertebrado es un ser humano.
2. Tratamiento de la enfermedad utilizando folistatina
De acuerdo con la invencion, se proporciona folistatina para su uso en un metodo para el tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado que necesita dicho tratamiento, dicho tratamiento comprende la administration a dicho vertebrado de una cantidad terapeuticamente eficaz de folistatina.
De acuerdo con la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende folistatina para su uso en un metodo para el tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado que tiene necesidad de dicho tratamiento, dicho metodo comprende la administracion a dicho vertebrado, de una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion farmaceutica.
Tambien se describe el uso de la composicion farmaceutica como se ha definido anteriormente para la preparation de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad asociada a fibrosis en un vertebrado que necesita dicho tratamiento.
Como se describe en el presente documento, la enfermedad asociada a fibrosis puede ser una enfermedad fibrotica hiperproliferativa o inflamatoria.
De acuerdo con un aspecto preferido, la fibrosis pulmonar es una fibrosis pulmonar idiopatica o una enfermedad pulmonar intersticial.
Como se describe en el presente documento la enfermedad asociada a fibrosis puede ser una enfermedad intestinal inflamatoria, o una afeccion relacionada tal como la colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, o es una fibrosis hepatica y cirrosis.
Normalmente, el tratamiento de una fibrosis pulmonar por medio de la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de folistatina se administra en conjunto con otros tratamientos de la enfermedad. Por ejemplo, estos otros tratamientos pueden incluir, la cirugla, tratamiento por radiation, o quimioterapia. Por ejemplo, la quimioterapia puede implicar la administracion de farmacos antifibroticos, antitromboticos o antiinflamatorios.
Normalmente, para los fines de la invencion, un experto en la tecnica serla capaz, por experimentation de rutina, determinar cual serla la cantidad de folistatina eficaz, no toxica con fines de tratamiento de la enfermedad.
Normalmente, para los fines de la invencion, la folistatina es una protelna de una cadena sencilla que comprende entre 288 y 315 aminoacidos con un peso molecular de entre 30.000 y 60.000 Daltons como se estima por SDS- PAGE en ausencia de agentes reductores, derivada del fluido folicular y capaz de inhibir la secretion de hormona follculoestimulante (FSH). Mas normalmente, la folistatina es una protelna de cadena sencilla que se clasifica en el NCBI (Centro Nacional de Information Biotecnologica) como protelna XP_003891, AAH04107. Incluso mas normalmente, la folistatina es como la que se describe en la Patente Australiana N° 610858. Mas normalmente, la folistatina es como la que se describe en la Patente Australiana N° 620346 o la Patente de Estados Unidos N° US 5.470.826 o la Patente Europea N° EP 0 299 050.
Normalmente, la folistatina presente en la composicion farmaceutica tambien puede presentarse en una forma que se selecciona de entre el grupo que consiste en: folistatina/quelato, folistatina/farmaco, folistatina/profarmaco, folistatina/toxina, y folistatina/grupo detector y folistatina/marcador de imagen.
4. Terapia genica
De acuerdo con la invencion, se proporciona folistatina para su uso en un metodo de terapia genica para el tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado, en el que dicho metodo comprende:
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(a) insertar una molecula de acido nucleico que codifica folistatina o un vector que comprende una molecula de acido nucleico que codifica folistatina, en una celula huesped;
(b) expresar la molecula de acido nucleico en la celula transformada.
Normalmente, para los fines de cualquiera de estos metodos, la molecula de acido nucleico o el vector se inserta utilizando metodos que se seleccionan de entre el grupo que consiste en microinyeccion, precipitacion en CaPO4, electroporacion, lipofeccion/fusion liposomica, bombardeo de partlculas y acoplamiento del acido nucleico con protelnas modificadas qulmicamente.
Normalmente, la molecula de acido nucleico o el vector se inserta en el nucleo de una celula huesped.
Normalmente, se inserta un vector de expresion que contiene la molecula de acido nucleico en las celulas, las celulas se cultivan in vitro y luego se infunden en grandes cantidades en los pacientes. Mas normalmente, se pueden utilizar los vectores de expresion se derivan de virus tales como adenovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, herpesvirus, varios virus ARN, retrovirus, o virus del papiloma bovino, para el suministro del acido nucleico en las celulas diana. Mas normalmente, las celulas diana comprenden linajes de fibroblastos, por ejemplo celulas hepaticas estrelladas, o celulas de musculo liso, fibroblastos pulmonares, miofibroblastos, celulas renales.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la expresion de activina A (Fig. 1A) y folistatina (Fig. 1B) en una seccion de hlgado normal por inmunohistoqulmica.
La Figura 2 muestra la expresion de activina en una seccion de hlgado cirrotico por inmunohistoqulmica.
La Figura 3 muestra una microscopla confocal de secciones de hlgado de rata que muestra la expresion de activina A y actina alfa del musculo liso.
La Figura 4 muestra la expresion de folistatina en una seccion de hlgado animal fibrotico por inmunohistoqulmica.
La Figura 5 muestra la expresion tanto de ARNm de activina A como de folistatina en extractos de hlgado completo durante el modelo de dano hepatico de rata CCI4.
La Figura 6 muestra el analisis PCR en tiempo real sobre celulas estrelladas hepaticas recien aisladas (HCS) segun se transdiferencian in vitro para determinar el patron de expresion de activina A y folistatina en relacion con otros marcadores clave de la proliferacion HSC y la produccion de matriz extracelular (ECM).
La Figura 7 muestra la secrecion de protelna activina A por cultivos primarios de HSC segun se transforman en el fenotipo activado.
La Figura 8 muestra la disminucion de la proliferacion de celulas MPC11 (recuentos por minuto, incorporacion de 3H timidina) tras la adicion de sobrenadantes que contienen activina A del cultivo de HSC.
La Figura 9 muestra el efecto de varios mediadores exogenos sobre la proliferacion de HSC recien aisladas ( % de proliferacion en comparacion con el control frente a la concentracion del mediador exogeno anadido): La Fig. 9A muestra los resultados de la activina como mediador exogeno; la Fig. 9B muestra los resultados de transformacion del factor de crecimiento p (TGF) como mediador exogeno; La Fig. 9C muestra resultados de la folistatina como mediador exogeno; la Fig. 9D muestra los resultados del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) como mediador exogeno.
La Figura 10 muestra el efecto de varios mediadores sobre la proliferacion de HSC activadas/transdiferenciadas ( % de proliferacion en comparacion con un control frente a la concentracion del mediador exogeno anadido): La Fig. 10A muestra los resultados para la activina como mediador exogeno; la Fig. 10B muestra los resultados de transformacion del factor de crecimiento p (TGF) como mediador exogeno; la Fig. 10C muestra los resultados de la folistatina como mediador exogeno; la Fig. 10D muestra los resultados del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) como mediador exogeno.
La Figura 11 muestra el efecto de la exposicion a distintas cantidades de activina A, folistatina y TGFp de los cultivos de HSC activadas sobre la viabilidad celular (que se evalua por citometrla de flujo por la expresion de anexina V, una marcador temprano de apoptosis celular).
La Figura 12 muestra el cambio de peso corporal de ratas de control en comparacion con ratas expuestas al CCI4 durante 4 semanas y luego co-inyectadas con 1 mg de folistatina 3 veces a la semana durante las 4 primeras semanas y luego sacrificadas. Los animales de control recibieron CCI4 durante la misma cantidad de tiempo.
La Figura 13 muestra el peso remanente del hlgado en las mismas condiciones experimentales que se describen para la Figura 12.
La Figura 14 muestra el contenido intrahepatico de hidroxiprolina en las mismas condiciones experimentales que se describen para la Figura 12.
La Figura 15 muestra el cambio en el peso corporal de ratas de control en comparacion de las ratas expuestas a CCI4 durante 4 semanas y luego co-inyectadas con 1 mg de folistatina 3 veces por semana desde las semanas 8-12 y luego sacrificadas. Los animales de control recibieron CCI4 durante la misma cantidad de tiempo.
La Figura 16 muestra el peso remanente del hlgado en las mismas condiciones experimentales que se describen para la Figura 15.
La Figura 17 muestra el contenido intrahepatico de hidroxiprolina en las mismas condiciones experimentales que se describen para la Figura 15.
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La Figura 18 muestra la activina A serica en sujetos humanos con hepatitis vlrica cronica y controles normales.
La Figura 19 muestra la folistatina serica en sujetos humanos con hepatitis vlrica cronica y controles normales.
La Figura 20 muestra la correlacion de la activina A serica en pacientes con hepatitis B (VHB) con la alanina aminotransferasa serica (ALT, un marcador del dano del hepatocito y dano intrahepatico).
La Figura 21 muestra la correlacion de la activina A serica en pacientes con VHB y replicacion vlrica (ensayada como VHB serico, pg/ml).
La Figura 22 muestra la correlacion negativa de folistatina serica en pacientes con VHB y replicacion vlrica (ensayada como VHB serico, pg/ml).
Definiciones
La expresion “antagonista de activina” engloba las moleculas que inhiben la actividad de activina. La expresion incluye moleculas que se unen a la activina y moleculas que antagonizan con la activina por la union con el receptor de activina (tipo I o II) para bloquear la senalizacion corriente abajo. Por ejemplo, las moleculas que inhiben la actividad activina por union a la activina incluyen la folistatina, la protelna relacionada con la folistatina (numero de registro Genbank NP_005851), y la macroglobulina alfa2, y las moleculas que antagonizan con la activina uniendose al receptor de la activina (tipo I o II) para bloquear la senalizacion corriente abajo incluyen la inhibina. “Antagonistas de activina” puede incluir tambien: moleculas que interfieren con cualquiera de los otros componentes corriente debajo de la ruta de transduccion de la senal de activina, tales como las moleculas inhibidoras de la senalizacion Smad, Smad 6 y 7; mutantes negativos dominantes del receptor de la activina (por ejemplo BAMBI) que si se expresa en una celula interferira la ruta de transduccion de activina en las celulas; las moleculas que inhiben especlficamente los receptores TGFp/activina Tipo I tales como los analogos del triarilimidazol como los que se describen en Callahan, J.F., et al (2002), "Identification of novel Inhibitors of the Transforming Growth Factor p1 (TGFp1) Type I Receptor (ALK5)", J. Med. Chem 45: 9991001.
La expresion “acido nucleico” engloba acidos nucleicos desoxirribonucleotidos mono o bicatenarios (ADN) y/o ribonucleotidos (ARN), incluyendo todos los analogos conocidos de los nucleotidos naturales.
El termino “polinucleotido” engloba el desoxirribopolinucleotido mono o bicatenario y/o ribopolinucleotido, incluyendo todos los analogos conocidos de nucleotidos naturales. Tambien se incluye en su ambito la secuencia relevante como se especifica, junto con la secuencia complementaria de la misma.
Como se utiliza en el presente documento el termino “polipeptido” se refiere a un pollmero compuesto por una pluralidad de aminoacidos unidos entre ellos por enlaces peptldicos.
El termino “anticuerpo” se refiere a una molecula de inmunoglobulina capaz de unirse a un epltopo especlfico en un antlgeno, y que puede estar compuesto por una mezcla policlonal, o ser de naturaleza monoclonal. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas completas derivadas de fuentes naturales, o de fuentes recombinantes. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invention puede existir en varias formas que incluyen, por ejemplo, un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo u otro fragmento inmunologicamente activo del mismo, tal como una region determinante de complementariedad. De manera similar, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo que tenga dominios funcionales de union al antlgeno, es decir, dominios variables de cadena pesada y ligera. El fragmento de anticuerpo puede tambien existir en una forma que se selecciona de entre el grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab)2, scFv (Fv de cadena sencilla), dAb (anticuerpo de dominio unico), anticuerpos biespeclficos, diacuerpos y triacuerpos.
El termino “antisentido” con respecto a las moleculas de acido nucleico, como se hace referencia en el presente documento, significa una molecula de oligo o polinucleotido que es complementaria a una secuencia de nucleotido que codifica un polipeptido diana. La molecula de acido nucleico antisentido puede transcribirse en una celula, y es capaz de hibridarse con el ARNm que codifica el peptido que se produce en la celula. Basandose en que la reaction se produce en condiciones que permiten que la secuencia de nucleotido complementaria se hibride al ARNm del polipeptido, de esta manera la cantidad de polipeptido traducido se altera, es decir, se reduce o elimina.
Una “cantidad terapeuticamente eficaz”, como se hace referencia en el presente documento, incluye una cantidad suficiente, pero no toxica de un compuesto o composition de la invencion para proporcionar el efecto terapeutico que se desee. La “cantidad eficaz” variara de un sujeto a otro dependiendo de uno o mas de varios factores entre, por ejemplo, el agente en particular que se va a administrar, la gravedad de la afeccion que se va a tratar, la especie que se va a tratar, la edad y estado general del sujeto, y el modo de administration. Para cualquier caso determinado, una “cantidad eficaz” adecuada puede determinarla un experto en la tecnica utilizando solo experimentation de rutina. Normalmente, “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para que de como resultado uno o mas de lo siguiente: recesion/reduccion de la extension de la enfermedad, inhibition del desarrollo de la enfermedad o la progresion, cese del desarrollo de la enfermedad, alivio de las molestias impuestas por la enfermedad, o prolongation de la vida del vertebrado que tenga la enfermedad.
El termino “aislado” indica que el material en cuestion se ha separado de su ambiente natural en el que existe, y se han reducido o eliminado las impurezas asociadas. Esencialmente, el material 'aislado' se enriquece con respecto a
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los otros materiales extraldos de la misma fuente (es decir, en una base molar es mas abundante que cualquiera de las otras especies individuales extraldas de una fuente determinada), y preferentemente una fraccion sustancialmente purificada es una composition en la que el material 'aislado' comprende al menos aproximadamente el 30 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composicion sustancialmente pura del material comprendera mas de aproximadamente el 80 a 90 por ciento del total de las especies macromoleculares presentes en la composicion. Mas preferentemente, el material 'aislado' se purifica hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion por los metodos de detection convencionales) en el que la composicion consiste esencialmente en la especie macromolecular del sujeto.
“Sustituciones conservadoras de aminoacidos” se refiere al intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas incluye glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifaticas incluye serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida incluye asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas incluye fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas incluye lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre incluye cistelna y metionina. Normalmente, los grupos de sustitucion conservadora de aminoacidos son; valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.
El termino “fragmento” de un compuesto, en referencia a los polipeptidos, es un compuesto que tiene una actividad biologica cualitativamente en comun con por ejemplo, un polipeptido de longitud completa del cual puede derivarse.
En referencia a los acidos nucleicos, nucleotidos y/o polinucleotidos, el termino “fragmento” se refiere a compuestos que incluyen, por ejemplo: partes de una secuencia de acido nucleico diana que codifica un producto que tiene actividad biologica cualitativamente en comun con por ejemplo, un polipeptido de longitud completa que se deriva de la secuencia de acido nucleico de longitud completa; o fragmentos de una secuencia de acido nucleico que es adecuada para sondas especlficas o cebadores para PCR para la deteccion y/o amplification de la secuencia de acido nucleico, o una parte del mismo que codifique un producto funcional.
El termino “analogo” como se utiliza en el presente documento en referencia a una secuencia de acido nucleico significa una secuencia que es un derivado de una secuencia de acido nucleico diana, comprendiendo el derivado la adicion, elimination o sustitucion (incluyendo sustituciones conservadoras de aminoacidos) de una o mas bases y en el que el polipeptido codificado mantiene sustancialmente la misma funcion que el polipeptido codificado por la molecula de acido nucleico diana. De manera similar, el termino “analogo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un derivado de un polipeptido diana que comprende la adicion, eliminacion, o sustitucion de uno o mas aminoacidos, manteniendo el analogo, sin embargo, sustancialmente la misma funcion que el polipeptido diana.
La expresion “casete de expresion” se refiere a una construction de acido nucleico que comprende los elementos de acido nucleico necesarios (promotores, amplificadores, el acido nucleico a transcribirse, etc.) que permiten la transcription del acido nucleico particular en una celula huesped. La construccion de expresion se puede incorporar en un vector, cromosoma de un huesped, etc.
El termino “promotor” se refiere a secuencias de acido nucleico que tienen influencia sobre y/o promueven el inicio de la transcripcion.
La expresion “unido operativamente” se refiere a una situation en la que, por ejemplo, un acido nucleico se coloca en una relation funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un ADN heterologo, que codifica una protelna, promueve la production de ARNm funcional correspondiente al ADN heterologo.
Como se utiliza en el presente documento “transferencia genica” significa el proceso de introduction de material genetico ajeno en una celula, y se lleva a cabo comunmente para hacer posible la expresion de un producto particular codificado por el gen. El producto puede incluir una protelna, polipeptido, ADN o ARN antisentido, o un ARN enzimaticamente activo. La transferencia genica se puede llevar a cabo en celulas cultivadas o por la administration directa a los animales, y generalmente implica el proceso de poner en contacto una celula diana con un acido nucleico que se desee por interacciones no especlficas o mediadas por receptor, la captation de acido nucleico por la celula a traves de la membrana o por endocitosis y la liberation del acido nucleico en el citoplasma de la membrana plasmatica o un endosoma. Para la expresion satisfactoria, tambien puede ser necesario, el movimiento del acido nucleico en el nucleo de la celula y la union a factores nucleares adecuados para la transcripcion cuando el acido nucleico de interes es parte de una construccion de expresion.
El termino “terapia genica” incluye la transferencia genica y las tecnicas biotecnologicas de antisentido, como se ha hecho referencia anteriormente. “Terapia genica” se refiere especlficamente a cualquier transferencia genica que exprese un producto terapeutico en una celula in vivo o in vitro, o a tecnicas antisentido por las que las secuencias de oligo o polinucleotido complementarias de una secuencia que codifica un polinucleotido diana se inserta en y se
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expresa en celulas in vivo o in vitro de forma que de lugar a la produccion del polipeptido diana. La transferencia genica se puede llevar a cabo: ex vivo en celulas que luego se trasplantan en un paciente; por administracion directa del acido nucleico o el complejo acido nucleico-protelna en el paciente; o por transferencia de celulas modificadas a un paciente. Las tecnicas antisentido se pueden llevar a cabo in vivo utilizando vectores de transfeccion adecuados para suministrar vectores de expresion que comprenden las secuencias que codifican el antisentido a las celulas diana.
Como se utiliza en el presente documento el termino “tratamiento”, se refiere a todos y cada uno de los usos que remedian un estado de enfermedad o los slntomas, o de otra manera previenen, dificultan, retrasan o invierten la progresion de la enfermedad u otros slntomas indeseables cualquiera que estos sean.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresion “que comprende” significa “que incluye principalmente, pero no necesariamente solo”. Las variaciones de la expresion “que comprende” y “comprende”, tienen en consecuencia significados variados.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
La presente invencion describe el uso de la folistatina, para el tratamiento de la fibrosis pulmonar. La folistatina se conoce mejor por su implication en la supresion de la hormona follculoestimulante, con un papel, en consecuencia, en el tratamiento de los trastornos de fertilidad, pero ahora se ha descubierto que es un antagonista eficaz de la activina, capaz de inhibir la hiperproliferacion de celulas asociadas a enfermedades fibroticas.
Los metodos para producir antagonistas de activina, cuando son protelnas tales como la folistatina, o un fragmento o analogo de la misma, se pueden emplear tecnicas convencionales de biologla molecular, microbiologla, ADN recombinante e inmunologla, todas ellas se encuentran en la experiencia de la tecnica y se explican completamente en cualquiera de varias publicaciones bien conocidas, tales como: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Segunda Edition por Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989. Por ejemplo, se puede aislar el gen de la folistatina a partir de celulas o tejidos que expresan folistatina: aislando el ARN mensajero del tejido o las celulas utilizando transcriptasa inversa para generar la secuencia de ADN correspondiente, y finalmente utilizar la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores adecuados para amplificar la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoacidos de folistatina activa. Tambien, se puede clonar un fragmento de polinucleotido que codifica la folistatina en un vector de expresion adecuado, y luego expresarlo en un huesped procariota, vlrico o eucariota adecuado. Los polipeptidos de folistatina que se expresan se pueden purificar de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos en la tecnica, que incluyen uno o mas de los siguientes procedimientos establecidos: precipitation proteica, que incluye precipitation en sulfato amonico, etanol o polietilenglicol e inmunoprecipitacion; tecnicas cromatograficas utilizando intercambio ionico, exclusion por tamano, de fase inversa, interaction hidrofoba, afinidad, o tecnologlas de inmunoafinidad y que se llevan a cabo por ejemplo, por cromatografla, HPLC, o FPLC; tecnicas electroforeticas tales como cromatografla en gel y HPEC; y similares.
Por ejemplo, para producir folistatina recombinante o fragmentos activos de la misma para su uso en la presente invencion, las secuencias de ADN relevantes se insertan en sistemas de expresion adecuados. Preferentemente, se construye una molecula recombinante o un vector en el que la secuencia de polinucleotido que codifica la folistatina esta unido operativamente a la secuencia de control de la expresion heterologa haciendo posible la expresion de la protelna folistatina. Se conocen en la tecnica varios vectores de expresion adecuados para la expresion proteica en mamlferos (incluyendo el ser humano), y que se emplean utilizando tecnicas de biologla molecular convencionales. Dichos vectores se pueden seleccionar de entre los tipos de vectores convencionales que incluyen los de expresion en insectos, tales como baculovirus, o sistemas de expresion en levaduras, fungicos, bacterianos o vlricos.
Las celulas huesped o llneas celulares adecuadas para la transfeccion en dicho metodo incluye celulas de mamlfero, tales como las celulas 293 humanas, celulas de ovario de hamster chino (CHO), la llnea celular COS1 de mono o las celulas 3T3 murinas. De manera similar son utiles como huespedes para la presente invencion las celulas bacterianas tales como las distintas cepas bien conocidas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061), y varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas, otros bacilos y similares. Muchas cepas de celulas de levadura conocidas por los expertos en la tecnica tambien estan disponibles como celulas huesped para la expresion de los polipeptidos de la presente invencion. Tambien se pueden utilizar celulas de insecto tales como celulas de Spodoptera frugiperda (Sf9).
Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interes se pueden transferir en la celula huesped por uno cualquiera de varios metodos bien conocidos, dependiendo del tipo de huesped celular. Por ejemplo, la transfeccion con cloruro calcico y la electroporation se utilizan comunmente en celulas procariotas. El tratamiento con fosfato calcico, electroporaciopn, lipofeccion, biollstica y transfeccion basada en virus se puede utilizar para otros huespedes celulares. Los metodos para transformar celulas de mamlfero pueden incluir tambien el uso de transfeccion, transformation, conjugation, polybrene, liposomas, electroporacion, tecnologla de pistola de partlculas y microinyeccion (vease, en general, Sambrook et al., 1989).
Las celulas huesped recombinantes se cultivan entonces ventajosamente en un medio selectivo, que se selecciona
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inherentemente para el crecimiento de las celulas que contienen el vector introducido. Las condiciones de incubacion se seleccionan idealmente para optimizar la expresion del polipeptido recombinante.
Por lo tanto, para su uso en la presente invencion la folistatina recombinante se puede producir transfectando una celula huesped con al menos un vector de expresion que contiene un polinucleotido recombinante que codifica folistatina, bajo el control de una secuencia reguladora de la transcripcion. La celula transformada se cultiva entonces en condiciones que permiten la expresion de la protelna folistatina. La protelna que se expresa puede recuperarse entonces a partir de la celula o el medio de cultivo, aislarse, y opcionalmente purificarse por medios adecuados conocidos por el experto en la tecnica. Por ejemplo, las protelnas se pueden aislar en forma soluble despues de la lisis celular, o se pueden extraer utilizando tecnicas conocidas, tales como en cloruro de guanidina.
Por ejemplo, las celulas microbianas que contienen el gen exogeno de folistatina se pueden cultivar en reactores de gran volumen, se recolectan por centrifugacion y luego se destruyen, por ejemplo, por homogeneizacion a alta presion. El lisado celular resultante se puede resuspender en un diluyente/tampon adecuado, y filtrarse para obtener una suspension acuosa de la protelna folistatina. La protelna recombinante que se puede administrar en forma bruta, por ejemplo, diluyendola en un tampon fosfato 0,1 M (pH 7,4) a una concentracion de 50-500 pg/ml, y luego se pasa a traves de un filtro esteril de 0,22 micrometres.
La folistatina o los fragmentos de la misma tambien se pueden sintetizar por metodos de qulmica en fase solida bien conocidos por los expertos habituados en la tecnica. Por ejemplo, los fragmentos de folistatina se pueden sintetizar siguiendo los procedimientos de qulmica en fase solida de Steward y Young (Steward, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis. (2a Edn.) Pierce Chemical Co., Illinois, USA (1984). En general, dicho metodo de slntesis comprende la adicion secuencial de uno o mas aminoacidos o aminoacidos protegidos adecuadamente a una cadena peptldica en crecimiento. Normalmente, el(los) grupo(s) funcional(es) distinto(s) del grupo amino o carboxilo del primer aminoacido esta/n protegido(s) por un grupo protector adecuado. El aminoacido protegido entonces se une a un soporte solido inerte o se utiliza en solucion anadiendo el siguiente aminoacido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido y en condiciones adecuadas para formar el enlace amida. El grupo protector se elimina entonces de este nuevo resto de aminoacido que se ha anadido y el siguiente aminoacido (protegido) se anade, y asl. Despues de que se hayan unido todos los aminoacidos deseados, se retira secuencial o concurrentemente cualquier grupo protector remanente, y si es necesario cualquier soporte solido, para producir el polipeptido final.
Los cambios de aminoacidos en el polipeptido folistatina o un fragmento de la misma se pueden efectuar por tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica relevante. Por ejemplo, se pueden efectuar cambios de aminoacidos por adicion, eliminacion o sustitucion de nucleotidos (conservadores o no conservadores), mientras se mantenga la fase de lectura apropiada. Tales modificaciones en el polinucleotido diana se pueden producir por tecnicas que incluyen la mutagenesis aleatoria, la mutagenesis dirigida al sitio, la mutagenesis mediada por oligonucleotidos o polinucleotidos, la eliminacion de regiones seleccionadas por medio del uso de sitios modificados de enzimas de restriccion, y por la reaccion en cadena de la polimerasa.
La folistatina para su uso en la invencion puede producirse alternativamente como una protelna de fusion. Por ejemplo, puede ser deseable producir protelnas de fusion folistatina, para aumentar la expresion de la protelna en una celula huesped seleccionada, para mejorar la purificacion, o para utilizarlas en el control de la presencia de folistatina en tejidos, celulas, o extractos celulares. Las parejas de fusion adecuadas son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen, p-galactosidasa, glutation-S-transferasa, y poli-histidina.
Tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad utilizando antagonistas de activina
En la presente invencion se utiliza folistatina en un metodo de tratamiento de la fibrosis pulmonar, tal como fibrosis pulmonar idiopatica, en un vertebrado.
Normalmente, el vertebrado se selecciona de entre el grupo que consiste en un ser humano, un primate no humano, ratones, ganado bovino, ovejas, cabras, caballos, conejos, aves, gatos y perros. Mas normalmente, el vertebrado es un ser humano, un primate no humano o un raton. Incluso mas normalmente, el vertebrado es un ser humano.
El nivel de dosis terapeuticamente eficaz para cualquier paciente depende de varios factores que incluyen: el trastorno que se va a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del antagonista de activina o un fragmento(s) o analogo del mismo que se emplee; la composicion empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administration; la via de administration, la tasa de excretion del antagonista de activina; la duration del tratamiento; los farmacos que se utilizan en combination o que coinciden con el antagonista de activina o un fragmento(s) o analogo del mismo, junto con otros factores relacionados bien conocidos en medicina. Por ejemplo, es bien conocido en la tecnica que se comienza con dosis de un compuesto terapeutico a niveles mas bajos que los que se esperan para alcanzar un efecto terapeutico deseado, y se aumenta gradualmente la dosificacion, si es necesario, hasta que se consigue el efecto deseado.
Por lo tanto, la determination de una cantidad de folistatina eficaz, no toxica necesaria para tratar un
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trastorno/enfermedad a la que se aplica la folistatina la puede determinar facilmente un experto en la tecnica apropiadamente sin mas que experimentacion de rutina. Normalmente, para la folistatina, una dosificacion eficaz se espera que este en el intervalo de aproximadamente 0,00001 a aproximadamente 100 mg de folistatina por kg de peso corporal cada 24 horas, preferentemente aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg de folistatina por kg de peso corporal cada 24 horas, mas preferentemente aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 mg de folistatina por kg de peso corporal cada 24 horas, incluso mas preferentemente aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,5 mg de folistatina por kg de peso corporal cada 24 horas, incluso mas preferentemente aun aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,20 mg de folistatina por kg de peso corporal cada 24 horas. Ademas, si se desea, la dosis diaria eficaz se puede dividir en multiples dosis para los fines de la administracion.
De manera alternativa, una dosificacion eficaz de folistatina puede ser de hasta aproximadamente 6.500 mg/m2 cada 24 horas. En general, se espera que una dosificacion eficaz este en el intervalo de aproximadamente 0,004 a aproximadamente 400 mg/m2, preferentemente aproximadamente 0,04 a aproximadamente 40 mg/m2, mas preferentemente aproximadamente 0,08 a aproximadamente 20 mg/m2, aun mas preferentemente aproximadamente 0,2 a aproximadamente 8 mg/m2.
Normalmente, el tratamiento serla durante la duracion de la afeccion, y las veces de contacto serlan normalmente durante la duracion de la afeccion.
Claramente, la cantidad y espaciado optimos de las dosificaciones individuales de un compuesto de la presente invencion se determinara por la naturaleza y extension de la afeccion que se va a tratar, la forma, via y sitio de administracion, y la naturaleza del vertebrado en particular que se va a tratar, y estas condiciones optimas se pueden determinar por procedimientos de rutina por los expertos en el campo.
Tambien se describen en el presente documento profarmacos de antagonistas de activina. Normalmente, estos profarmacos son derivados funcionales de la folistatina que se convierten facilmente in vivo en el producto necesario para su uso en la presente invencion. Los procedimientos tlpicos para la seleccion y preparacion de profarmacos se establece y describe en textos disponibles tales como, por ejemplo, H. Bundgaard (Ed), Design of Prodrugs, Elsevier, 1985.
Cuando se utiliza en el tratamiento de la fibrosis pulmonar, la folistatina se puede administrar sola. Sin embargo, es preferible en general que la folistatina se administre en conjuncion con otros tratamientos quimioterapicos que se administran convencionalmente para tratar la enfermedad.
Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion se prepararan normalmente por metodos conocidos por los expertos habituados en la tecnica y por lo tanto incluiran normalmente excipientes tales como un vehlculo, diluyente y/o adyuvante farmaceuticamente aceptables, o combinaciones de los mismos.
Las formulaciones se pueden administrar por las vlas convencionales. Por ejemplo, las formulaciones se pueden administrar por las vlas oral, rectal, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutanea o intramuscular), topica, transdermica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal o, intrauterina.
La folistatina se puede incorporar tambien, opcionalmente junto con otros agentes activos, en pollmeros biodegradables que permitan una liberacion sostenida, los pollmeros se van a implantar en la vecindad de donde se desea el suministro del farmaco (tal como en el sitio de una enfermedad localizada), o se implantan de forma que los agentes activos se liberen lentamente sistemicamente. Tambien se pueden utilizar minibombas osmoticas para proporcionar un suministro controlado de altas concentraciones de los agentes activos por medio de una canula en el sitio de interes, tal como directamente por ejemplo en un desarrollo fibrotico o en el suministro vascular de ese desarrollo.
Composiciones terapeuticas/farmaceuticas para el tratamiento de la enfermedad
Los vehlculos, diluyentes y adyuvantes que se utilizan en las composiciones terapeuticas/farmaceuticas de la invencion deben ser “aceptables” en terminos de que sean compatibles con los otros ingredientes, y no ser perjudiciales para el paciente. Ejemplos de vehlculos o diluyentes farmaceutica y veterinariamente aceptables son el agua desmineralizada o destilada; solucion salina o solucion salina fosfato tamponada (PBS); gelatina, gomas vegetales, tales como gomas de xantano, alginatos, agar, carragenano, goma de tragacanto o goma arabiga; derivados de la celulosa tales como celulosa microcristalina, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa o hidroxipropiletilcelulosa; almidones naturales o modificados y dextrinas; pollmeros basados en acido lactico; alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; citratos, acetonitrilo; alcohol bencllico; dimetilacetamida; dimetilformamida; monometilacetamida; 2-pirrolidonas tal como N-metilpirrolidona; ftalatos tales como dietilftalato; gliceridos poliglucosados; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, o alquileteres o esteres de los mismos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, monometileter de propilenglicol, monoetileter de dietilenglicol y monobutileter de dietilenglicol y esteres de acidos grasos polietilenglicol; esteres grasos y eteres de azucares o alcoholes polihldricos, derivados alcoxilados de los mismos tales como etoxilatos alcoholicos, sorbitan polietileno o esteres de acidos grasos sorbitan, eteres alcohol de
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acidos grasos polioxietileno, y copollmeros de bloque etoxilados propoxilados; glicerol y mono, di o tri esteres de acidos grasos de los mismos; esteres sorbitan tales como monolaurato sorbitan; polisorbatos; acidos grasos; aceites basados en vegetales tales como aceite de man!, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de malz, aceites de sesamo tales como aceite de man!, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, aceite de malz aceite de sesamo, aceite de man! o aceite de coco; ceras o aceites derivados de animales, tales como la cera de abeja o la lanolina, o derivados de los mismos; esteres de acido graso tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo, diisobutil adipato o etil oleato; alcoholes grasos, tales como alcohol cetoestearllico; alcoholes grasos sulfatados; compuestos de amonio cuaternario; esteres grasos sulfato tales como dodecilsulfato sodico; sulfonatos grasos aromaticos tales como sulfonatos de alquil-benceno o sulfonatos de butil- naftaleno; sulfonatos alquil naftaleno; estearatos alcalinos, tales como estearatos de potasio o amonio; alquil y alcaril sulfatos, tales como laurilsulfato sodico, sulfato de cetilo sodico y dodecilbencenosulfonato sodico; aceites de silicona, que incluye polisiloxanos, tales como metil polisiloxano, fenilpolisiloxano y metilfenilpolisopoxano; siliconas volatiles; sllice ahumado, dioxido de sllice coloidal, silicatos aluminomagnesicos; aceites minerales tales como la parafina llquida, parafina blanda o escualeno; polivinilpirrolidona o pollmeros de los mismos, y vaselina. Normalmente, el vehlculo o vehlculos formaran del 10 % al 99,99 % por peso de las composiciones.
En una forma preferida la composition farmaceutica de la invention comprende como agente activo una cantidad eficaz de folistatina, junto con un vehlculo, diluyente y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable como se muestra en el Ejemplo 1.
La composicion farmaceutica para su uso en un metodo de la invencion pude estar: en una forma adecuada para la administration parenteral, es decir, por inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa; una capsula adecuada para su ingestion oral; un unguento, crema o locion adecuados para la administracion topica; en una forma adecuada para el suministro como gotas oftalmicas; o en una forma de aerosol adecuada para la administracion por inhalation, tal como por inhalation intranasal o inhalation oral.
Para la administracion como solution o suspension inyectable, los diluyentes o vehlculos no toxicos parenteralmente adecuados pueden incluir solucion de Ringer, solucion salina isotonica, solucion salina fosfato tamponada, etanol y 1,2-propilenglicol.
Los vehlculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes para el uso oral incluyen, aceite de man!, parafina llquida, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, alginato sodico, goma arabiga, goma de tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitina. Ademas estas formulaciones orales pueden contener agentes saborizantes y colorantes adecuados. Cuando se utilizan en forma de capsula las capsulas pueden revestirse con compuestos tales como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo que retrasan la desintegracion. De manera alternativa, las formulaciones se pueden proporcionar con revestimientos entericos tales como la hidroxipropiletilcelulosa y pollmeros acrllicos y metacrllicos o copollmeros y/o sus esteres, o combinaciones de los mismos, que protegen la formulation, por ejemplo, de los jugos gastricos, hasta el lugar en que se desea la absorcion, tal como el intestino delgado.
Los adyuvantes para las formulaciones orales incluyen normalmente uno o mas de emolientes, emulsionantes, agentes espesantes, conservantes, bactericidas o agentes de tampon.
Las formas solidas para la administracion oral pueden contener aglutinantes aceptables en la practica farmaceutica humana y veterinaria, edulcorantes, agentes colorantes, agentes desintegrantes, diluyentes, saborizantes, agentes de revestimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes de retraso en el tiempo. Los aglutinantes adecuados incluyen goma arabica, gelatina, almidon de malz u otros almidones naturales o modificados y dextrinas, goma de tragacanto, alginato sodico, carboximetilcelulosa o polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, sorbitol, manitol, xilitol, glucosa, aspartamo, o sacarina. Se conocen muchos agentes colorantes adecuados y se seleccionaran segun las propiedades de la formulacion en particular, y pueden incluir ventajosamente agentes colorantes naturales tales como por ejemplo, clorofilas, carotenos, cochinilla. Los agentes desintegrantes adecuados incluyen almidon de malz, derivados de celulosa tales como metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma guar, goma xantano, bentonita, acido alglnico o agar. Los diluyentes adecuados incluyen lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolln, celulosa, carbonato calcico, silicato calcico o sales de citrato o fosfato dicalcico. Los agentes saborizantes adecuados incluyen el aceite de saborizantes de menta, aceite de gaulteria, grosella negra, cereza, naranja, limon o frambuesa. Los agentes de revestimiento adecuados incluyen pollmeros o copollmeros del acido acrllico y/o acido metacrllico y/o sus esteres, derivados de celulosa tales como hidroxipropiletilcelulosa, ceras, alcoholes grasos, celna, goma laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato sodico, vitamina E, alfa-tocoferol, acido ascorbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfito sodico. Los lubricantes adecuados incluyen estearato magnesico, acido estearico, oleato sodico, cloruro sodico o talco. Los agentes de retraso en el tiempo incluyen el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo.
Las formas llquidas para su administracion oral normalmente contendran , ademas de los agentes anteriores, un vehlculo llquido que se selecciona de entre, por ejemplo, agua, aceites vegetales tales como aceite de oliva, acetie de man!, aceite de sesamo, aceite de girasol, aceite de cartamo, aceite de man!, o aceite de coco, parafina llquida, glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol, alcanoles inferiores tales como etanol, propanol, o
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isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, trigliceridos o mezclas de los mismos.
Las suspensiones para la administracion oral pueden comprender ademas agentes dispersantes y/o agentes suspensores que se seleccionan de entre, por ejemplo, derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, o hidroxipropilmetilcelulosa, gomas vegetales tales como goma guar, goma xantano, polivinilpirrolidona, alginato sodico o alcohol cetllico. Los agentes dispersantes adecuados incluyen lecitina, esteres de acidos grasos polioxietileno tales como el acido estearico, mono o dioleato, estearato o laurato de sorbitan polioxietileno, y similares.
Las emulsiones para administracion oral pueden comprender ademas uno o mas agentes emulsionantes. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen agentes dispersantes como se ha ejemplificado anteriormente u otras gomas naturales como la goma arabiga o la goma de tragacanto.
Los metodos para preparar composiciones que se pueden administrar parenteralmente son evidentes para los expertos en la tecnica, y se describen con mas detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., por lo que se incorpora en el presente documento por referencia.
Las formulaciones topicas para su uso en un metodo de la presente invention, comprende la folistatina como principio activo junto con uno o mas vehlculos aceptables, opcionalmente otros ingredientes terapeuticos. Las formulaciones adecuadas para la administracion topica incluyen preparaciones llquidas y semillquidas adecuadas para la penetration a traves de la piel al sitio de donde se necesita el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, unguentos o pastas, y gotas adecuadas para su administracion al ojo, oldo o nariz.
Las gotas para su uso en un metodo de la presente invencion pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas esteriles. Estas se preparan normalmente disolviendo el ingrediente activo en una solution acuosa de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado tales como un antioxidante, y opcionalmente incluyen un agente activo de superficie. La solucion resultante se puede clarificar entonces por filtration, se transfiere a un envase adecuado y se esteriliza. La esterilizacion se puede conseguir, por ejemplo, en un autoclave o manteniendolo a 90° C-100° C durante media hora, o por filtracion, seguido por la transferencia a un envase mediante una tecnica aseptica. Los agentes bactericidas y fungicidas adecuados para su inclusion en las gotas incluyen, por ejemplo, nitrato o acetato fenilmercurico (0,002 %), cloruro de benzalconio (0,01 %). Los disolventes adecuados para la preparation de una solucion oleosa pueden incluir, por ejemplo, glicerol, alcohol diluido o propilenglicol.
Las lociones para su uso en un metodo de la presente invencion incluyen las adecuadas para la piel o el ojo. Una locion ocular puede comprender una solucion acuosa esteril que contiene un fungicida, bactericida y/o un conservante tal como un antioxidante, y se puede preparar por metodos similares a los que se han descrito anteriormente en relation a la preparacion de las gotas. Las lociones, cremas o linimentos para la aplicacion en la piel puede incluir un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tales como un alcohol o acetona, y/o un humectante tal como el glicerol, o aceites tales como el aceite de ricino o el aceite de manl. Las lociones, cremas o linimentos para la aplicacion en la piel tambien pueden incluir agentes colorantes/tintes apropiados y compatibles que son bien conocidos en la tecnica, particularmente en las formulaciones de uncion dorsal continua para aplicaciones en veterinaria de forma que facilite la distincion entre animales tratados y no tratados.
Las cremas, unguentos o pastas de acuerdo con su uso en un metodo de la presente invencion son formulaciones semisolidas del ingrediente activo para la aplicacion externa. Se pueden fabricar mezclando el ingrediente activo en una forma finamente dividida o en polvo, sola o en solucion o suspension en un fluido acuoso o no acuoso, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarbonos tales como parafina dura, blanda o llquida, glicerol o mono, di o triesteres de acidos grasos, cera de abeja, un detergente metalico; un mucllago, un aceite de origen natural tal como aceite de almendras, malz, manl, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados, o acidos grasos tales como el acido estearico u oleico junto con un alcohol tal como macrogoles o glicoles o eteres y/o esteres de los mismos, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, monometileter de propilenglicol, monoetilester de dietilenglicol y monobutileter de dietilenglicol, alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol, aralcanoles inferiores, o 2-pirrolidonas tales como N-metilpirrolidona.
Las formulaciones para las aplicaciones en la piel tambien pueden incorporar ventajosamente cualquier agente activo de superficie que puede ayudar a la difusion sobre, o la absorcion a traves de, la piel. Tales tensioactivos pueden ser un tensioactivo anionico, cationico, no ionico o zwiteronico. Normalmente, el agente activo de superficie sera no ionico, y mas normalmente se seleccionara de entre esteres de acidos grasos y eteres de azucares o alcoholes polihfdricos, y derivados alcoxilados de los mismos tales como alcohol etoxilatos, esteres de acidos grasos polioxietileno sorbitan o sorbitol, alcohol eteres grasos polioxietileno, y copollmeros en bloque propoxilados etoxilados. Tambien se pueden incluir agentes antiespumantes adecuados que se conocen en la tecnica, si es necesario.
Tambien se pueden incluir agentes suspensores y/o modificadores de la viscosidad tales como las gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorganicos tales como sllice silicaceo, y otros ingredientes tales como la
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lanolina.
Los conservantes adecuados para su uso en formulaciones topicas de acuerdo con la invencion pueden incluir, por ejemplo, benzoato sodico, alcohol bencllico, vitamina E, alfa-tocoferol, acido ascorbico, 2,6-ditertbutilo-4-metoxifenol (BHA), metilparabeno, propilparabeno o bisulfito sodico.
Las composiciones farmaceuticas para su uso en los metodos de la invencion se pueden administrar tambien en forma de liposomas. Los liposomas se derivan generalmente de fosfollpidos u otras sustancias lipldicas, y estan formados por cristales llquidos hidratados mono o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier llpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las formulaciones que comprenden liposomas pueden contener tambien estabilizadores, conservantes, excipientes y similares que se conocen en la tecnica. Para la preparacion de liposomas, los llpidos preferidos son fosfollpidos y fosfatidilcolinas (lecitinas) naturales y sinteticos. Los metodos para formar liposomas estan establecidos y publicados en textos tales como: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq.
Terapia genica
La presente invencion tambien se refiere a un metodo de terapia genica para el tratamiento de una fibrosis pulmonar. Como se describe en el presente documento, la terapia genica puede incluir transferencia genica y tecnicas biotecnologicas antisentido.
La transferencia genica se puede llevar a cabo simplemente inyectando cantidades minuto de ADN en el nucleo de una celula por microinyeccion. Los genes producidos pueden reconocerse por mecanismos de transcripcion y traduccion normales en las celulas y se expresara entonces un producto genetico.
Tambien se han intentado varios metodos para introducir ADN en gran cantidad de celulas, que incluyen: transfeccion, que incluye la precipitacion del ADN diana con CaPO4 que entonces es captado por las celulas por pinocitosis; electroporacion, que incluye exponer las celulas a pulsos de alta tension para producir perforaciones en la membrana a traves de las cuales puede pasar el ADN diana; lipofeccion/fusion liposomica, que incluye el empaquetamiento del ADN diana en veslculas lipofilas que entonces se pueden fusionar con una celula diana; y bombardeo de partlculas por el que el ADN unido a pequenos proyectiles se fuerza a entrar en las celulas. El ADN diana tambien puede introducirse en las celulas acoplando el aDn a protelnas modificadas qulmicamente.
Normalmente, en un metodo de transferencia genica de acuerdo con la invencion, se inserta un vector de expresion que contiene una molecula de acido nucleico que codifica la folistatina o un vector que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la folistatina, en las celulas. Las celulas transformadas se multiplican in vitro y luego se infunden en grandes cantidades en los pacientes. Los vectores de expresion adecuados para el suministro de estas secuencias de acido nucleico en la poblacion celular diana (por ejemplo, hepatocitos, otros tipos de celulas hepaticas, tales como celulas hepaticas estrelladas, celulas de musculo liso, fibroblastos pulmonares, fibroblastos, celulas renales (se pueden derivar de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, varios virus ARN, o virus del papiloma bovino. Los vectores vlricos recombinantes que contienen las secuencias de acido nucleico diana se pueden preparar por uno cualquiera de los varios metodos que son conocidos por los expertos en la tecnica. De manera alternativa, las moleculas de acido nucleico recombinante que codifican la folistatina, se pueden utilizar como un ADN desnudo o en un sistema reconstituido, por ejemplo, liposomas u otros sistemas lipldicos para el suministro a celulas diana.
Tambien se ha demostrado que las protelnas de adenovirus son capaces de desestabilizar endosomas y aumentar la captacion del ADN por las celulas. La mezcla de adenovirus con las soluciones que contienen complejos de ADN, o la union de ADN a polilisina unida covalentemente a los adenovirus utilizando agentes de entrecruzamiento proteico mejora sustancialmente la captacion y expresion del gen recombinante.
La invencion se describira ahora con mayor detalle en referencia a los Ejemplos especlficos, los cuales, aunque no cubran las realizaciones de la invencion, son utiles para entender la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1 La inmunorreactividad de activina A y folistatina indica la expresion constitutiva en el hepatocito del higado normal de rata.
Los inventores demostraron la inmunolocalizacion de la folistatina exclusivamente en hepatocitos del hlgado normal (Figura 1).
Se fijaron las muestras de hlgado necesarias para el examen histologico en formalina tamponada con PBS al 10 % durante 24 horas a temperatura ambiente, y luego se lavaron dos veces en alcohol al 70 % y se almacenaron en alcohol al 70 % a temperatura ambiente hasta que su uso era necesario. Las muestras de tejido se procesaron
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entonces utilizando el siguiente programa. Las muestras se deshidrataron en banos secuenciales de etanol al 70 % durante 1 hora, etanol al 90 % durante 2 h y etanol al 100 % durante 2 h y etanol al 100 % durante 1 h. Los tejidos se sumergieron entonces en Histosol durante 1 h 3 veces en banos separados, y se sumergieron en cera durante 1 hora cada uno en 2 banos separados. Los tejidos se embebieron entonces en moldes de cera y una vez fijados, se almacenaron a temperatura ambiente hasta que su uso era necesario.
Para la inmunohistoqulmica, los bloques de tejido fijados con formalina embebidos en parafina se seccionaron a 4 pm y se colocaron en portaobjetos Superfrost Plus™, se incubaron a 60° C durante 30 minutos y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que su uso era necesario. Los portaobjetos se des-parafinaron entonces utilizando tecnicas convencionales y se sometieron a recuperacion por calentamiento en microondas a 400 W durante 10 minutos sumergidos en 0,1 M de tampon de citrato sodico (pH 7,4). La coloracion se desarrollo en todos los procedimientos de tincion utilizando 3'-3-diaminobenzadina (DAB) a menos que se describa otra cosa y los portaobjetos se contra-tineron con hematoxilina.
Para localizar la activina A en el tejido hepatico, se aplico el anticuerpo monoclonal “E4”, que se produce contra la subunidad pA de la activina, con una concentracion final de 18 pg/ml y se incubo durante una noche a 4° C. El “E4” es el mismo anticuerpo monoclonal que se utiliza en el ELISA activina A y se habla validado anteriormente para ambos procedimientos (Jarred, RA, Cancilla B, Richards M, Groome NP, McNatty KP, Risbridger GP. Differential localization of inhibin subunit proteins in the ovine testis during fetal gonadal development. Endocrinology 1999; 140:979-86). Se amplifico la reactividad utilizando el kit de amplificacion de senal CSA (DAKO) segun las instrucciones del fabricante y la coloracion se desarrollo y se contra-tineron las secciones. Se utilizaron secciones de prostata humana como control positivo, mientras que en el control negativo se sustituyo el anticuerpo primario por un anticuerpo irrelevante (inmunoglobulina de raton normal). Como la inhibina no se expresa esencialmente en el hlgado, la deteccion de la subunidad pA representa la protelna activina A y no la inhibina (un heterodlmero de subunidades a y p).
Los anticuerpos monoclonales contra los isoformas principales de la folistatina humana se utilizaron para determinar la inmunorreactividad del tejido. El anticuerpo monoclonal 17/2 (1:150) es especlfico contra la folistatina humana 288, mientras que el clon H10 (1:100) es especlfico de la folistatina humana 315 (McPherson SJ, Mellor SL, Wang H, Evans L.W, Groome NP, and Risbridger GP. Expression of activin A and follistatin core proteins by human prostate tumor cell lines. Endocrinology 1999; 140: 53039). El procedimiento de tincion para cada anticuerpo monoclonal se llevo a cabo como para la subunidad pA de la activina utilizando preparaciones citospin de la llnea celular HepG2 como control positivo, mientras que un anticuerpo irrelevante que sustitula al anticuerpo primario funcionaba como control negativo.
Ejemplo 2 La inmunorreactividad contra la activina A es mas intensa adyacente a los septos fibrosos que en los lobulos hepaticos pero la expresion de folistatina no cambia en cirrosis.
La expresion de activina A en el hlgado fibrotico y cirrotico es menos controvertida que en el hlgado normal.
Se alojaron ratas Wistar macho que pesaban entre 80-100 g con ciclos convencionales de luz y oscuridad de 12 h a temperatura y humedad constantes y se les permitio el acceso ad libitum al agua y al pienso rat chow. Para establecer un modelo de fibrosis y cirrosis, se inyecto a las ratas por via intraperitoneal una mezcla de tetracloruro de carbono/aceite de oliva 1:1, 3 veces por semana durante 12 semanas a una dosis de 0,8 ml/kg. Las inyecciones se aplicaban tres dlas consecutivos. A los animales de control se les inyecto volumenes iguales, pero solo de aceite de oliva. En este modelo de cirrosis los inventores observaron un cambio en la distribucion de la activina A inmunorreactiva de los hepatocitos lobulares a las areas que rodeaban las bandas fibroticas (Figura 2) y la co- localizacion ocasional con marcadores de HSC (Figura 3).
El experimento se llevo a cabo como en el Ejemplo 1 y, para evaluar la expresion de activina por las HSC en los septos fibroticos se utilizo microscopla confocal. Se detecto la actina de musculo liso alfa, un marcador para las celulas hepaticas estrelladas activadas, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra los filamentos de actina presentes en las celulas hepaticas estrelladas activadas. Las celulas que expresan actina de musculo liso a se visualizaron utilizando un anticuerpo primario monoclonal anti-humano de raton aplicado a una concentracion final de x mg/ml (1:100, DAKO Corporation) durante 1 hora a temperatura ambiente. Este anticuerpo se habla validado anteriormente para que presentara reactividad cruzada con el musculo liso a de rata. Para visualizar la reactividad, las secciones se incubaron con conjugado FITC-anti-raton de oveja (1:50, Silenus, Victoria) preabsorbido contra el suero normal de rata durante 1 hora a temperatura ambiente. Para evaluar la expresion de activina por las HSC intrafibroticas, se aplico un conjugado de activina A biotinilado (1:20) durante 1 hora y se visualizo con un conjugado Rojo Texas-estreptavidina (1:50) durante 30 min. Se midio la reactividad en condiciones de fluorescencia con un microscopio confocal BioRad y se analizo utilizando el software BioRad.
Particularmente, no habla un cambio discernible en la inmunorreactividad de folistatina en animales fibroticos y cirroticos cuando se comparaban con normales (Figura 4). Este hallazgo es la primera descripcion de la expresion de folistatina en hlgados fibroticos y cirroticos y sugerirla que el aumento de expresion de activina adyacente a los septos fibrosos no esta en oposicion a un aumento de actividad neutralizante de folistatina.
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Ejemplo 3 La expresion hepatica de ARNm de activina precede a los cambios en ARNm de folistatina durante el desarrollo de la fibrogenesis hepatica.
Como la expresion de activina y folistatina esta ampliamente distribuida entre muchos tejidos, las observaciones a nivel proteico se pueden confundir por acumulacion de la proteina en fuentes extrahepaticas.
Utilizando el analisis PCR en tiempo real de los extractos hepaticos completos, los inventores analizaron la expresion de ARNm tanto de activina A como de folistatina (Figura 5) durante el modelo de fibrosis descrito en el Ejemplo 2.
El ARN total se purifico utilizando Trizol® con modificaciones. En resumen, tras la extraction inicial, se mezclo el sobrenadante con una solution alta en sal de 0,8 M de citrato sodico y 1,2 M de cloruro sodico para permitir que se produjera una precipitation mas eficaz. Para retirar el ADN genomico contaminante, las muestras se trataron entonces con l0 U de DNasa (Roche Biochemicals) a 37° C durante 45 min y la reaction se paro incubando a 95° C durante 3 min. Las muestras se cuantificaron entonces por espectrofotometria A260/A260. Se transcribieron dos microgramos de ARN para cada muestra utilizando Superscript II® y oligo dTi3-i5 (Gibco-BRL).
El analisis de ARNm de la subunidad pA de activina se llevo a cabo utilizando el LightCycler Roche (Roche) que controla fluorimetricamente la formation de productos PCR en tiempo real. Esto se consigue utilizando el marcador Verde SYBR I, que en su forma no unida tiene una fluorescencia baja pero cuando se une al dsADN presenta fluorescencia fuerte de forma que la intensidad de fluorescencia aumenta en proportion con la cantidad de dsADN. La parte logaritmica lineal de la curva de amplification de la PCR se identifica con el umbral o el punto de cruzamiento (representado en numero de ciclos) definido como la intersection de la linea del mejor ajuste con la region logaritmica lineal y la banda de ruido. En estos estudios, se empleo una preparation de ADNc normal de rata como control de calidad y se utilizo en todas las reacciones para asegurar que las condiciones de ciclado permanecian constantes entre las ejecuciones experimentales. Los niveles de expresion de cada ARNm y sus puntos de cruzamiento estimados en cada muestra se determinaron utilizando el software LightCycler. Se calculo entonces la relation de amplificacion ARNm/GAPDH. Los reactivos para la PCR se adquirieron en Roche Biochemicals.
Para la PCR, se diluyeron 2 pl de cada preparacion de ADNc a una concentration final de 1:400 y se anadieron a tubos capilares individuales con dNTP, Mg2+, Verde SYBR y los cebadores relevantes. Las concentraciones de magnesio, las temperaturas de hibridacion, los tiempos de extension y las localizaciones de cebadores especificas del nucleotido y las secuencias se muestran en la Tabla 1. Se programaron cuarenta ciclos de PCR para asegurar que se alcanzara la fase logaritmica lineal. Al completar la reaccion, se llevo a cabo el analisis de la curva de mezclado para establecer la especificidad de los productos de ADN producidos. Los productos de la PCR se retiraron de los tubos capilares y se visualizaron por electroforesis en gel para confirmar el tamano del producto y la integridad de la reaccion PCR. En cada caso, cada grupo de cebadores para los animales individuales se llevaron a cabo en un unico experimento PCR. La variation intra-ensayo era del 4 % para cada grupo de cebadores.
Inmediatamente despues de la intoxication con CCI4 habia una reduction significativa de la expresion de activina A en 1 semana que continuo hasta las 2 semanas. A continuation, los niveles de expresion volvieron a los niveles de la linea base a las 4 semanas y permanecieron constantes a lo largo del resto del modelo.
Por el contrario, la expresion de folistatina estaba elevada inicialmente con respecto a los niveles normales. De manera interesante, este aumento de la expresion de folistatina se correlacionaba con un pico de proliferation de hepatocitos segun se midio por la expresion de PCNA. Despues del aumento inicial, los niveles de expresion de ARNm de folistatina cayeron significativamente a las 2 semanas, y se asemejaban a la expresion de activina a partir de entonces.
Es probable que esta respuesta inicial de folistatina y activina se deba a la agresion aguda del CCI4 que da lugar a una respuesta regenerativa.
Estos resultados resaltan la notion de que incluso cuando los niveles de activina A y de folistatina estan regulados diferencialmente durante la patogenesis de la fibrosis hepatica, esta expresion esta unida indisolublemente.
Ejemplo 4 La expresion de ARNm de activina A aumenta rapidamente durante los estadios tempranos de activacion de HSC con respecto a la expresion de ARNm de folistatina.
Los inventores llevaron a cabo un analisis PCR en tiempo real sobre HSC recien aisladas segun se transdiferenciaban in vitro, para determinar el patron de expresion de la activina A y folistatina con respecto a otros marcadores clave de proliferacion de HSC y production de ECM.
Se establecieron cultivos de HSC por perfusion secuencial de pronasa y colagenasa como se habia descrito anteriormente (Ramm GA. Isolation and culture of rat hepatic stellate cells. J Gastroenterol Hepatol (1998) 13:846851). En resumen, se separaron las celulas en un gradiente discontinuo en dos etapas de Nycodenz (Sigma, Sidney,
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Australia) y se evaluo la pureza por autofluorescencia UV caracterlstica de vitamina A y citometrla de flujo. A continuacion se hizo un exclusion por azul de tripano para determinar la viabilidad, se cultivaron 1 x 106 celulas/ml en medio M199 suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y un 10 % de suero equino normal (Trace Scientific, Victoria) en condiciones convencionales con un 5 % de CO2. Los medios se cambiaron a las 24 horas y cada 48 horas a partir de entonces.
El aislamiento de ARN y la PCR en tiempo real se llevaron a cabo como en el Ejemplo 3.
Como en las HSC transdiferenciadas, la expresion de ARNm de colageno tipo I estaba elevada como se esperaba. Sin embargo, los analisis de los inventores revelaron la induccion de la expresion de ARNm de activina A muy temprano durante la activacion de HSC que continuo hasta el dla 5 (Figura 6). Ademas, esta expresion estaba elevada antes que la expresion de TGFp, sin embargo tras el dla 1, la del TGFp era mayor que la de la activina A.
El hallazgo clave sin embargo era la observacion de que la expresion de ARNm de folistatina tenia un pico alrededor del dla 1 post-aislamiento y permanecia constante hasta el dia 5 de forma que los niveles de expresion de activina A y FS eran marcadamente diferentes. Esto sugeria que la presencia de activina A, sea de una fuente endocrina o autocrina, es capaz de estimular la sintesis de fibronectina y colageno en HSC. Estas observaciones en conjunto con los hallazgos presentados en los ejemplos anteriores, y el conocimiento de que la folistatina neutraliza la bioactividad de la activina A sugeririan que la adicion de folistatina seria capaz de mejorar la produccion de ECM en HSC y por lo tanto la fibrogenesis hepatica.
Ejemplo 5 Las celulas hepaticas estrelladas aisladas producen concentraciones crecientes de activina A bioactiva segun se transforman en el fenotipo tlpico “tipo miofibroblastos”.
Se establecieron los cultivos primarios de HSC a partir de higados normales como en el Ejemplo 4 y el analisis revelo la produccion de cantidades crecientes de activina A segun se transformaban en el fenotipo activado (Figura 7).
La inmunorreactividad de la activina A se midio por ELISA como en Knight PG, Muttukrishna S, Groome NP. Development and application of a twosite enzyme immunoassay for the determination of 'total' activin A concentrations in serum and follicular fluid was based on the method described in J Endocrinol (1996), 148:26779.
El medio acondicionado a partir de cultivos de HSC se evaluo en cuanto a la bioactividad de activina utilizando un bioensayo in vitro previamente validado (Phillips, D.J., Brauman, J.N., Mason, A.J., de Kretser, D.M. & Hedger, M.P. A sensitive and specific in vitro bioassay for activin using a mouse plasmacytoma cell line, MPC11. J Endocrinol (1999), 162:111115). La adicion de activina produce una inhibicion dependiente de la dosis de la proliferacion de las celulas MPC11 en el raton. Estas celulas son refractarias al TGFp e inhibina, pero los efectos de la activina se pueden bloquear por la adicion de un exceso de folistatina.
La adicion de sobrenadantes de los cultivos de HSC a las celulas MPC11 daba como resultado una disminucion, dependiente de la dosis, de la proliferacion (Figura 8). Esta disminucion de la proliferacion se reflejaba en la de rh- activina A.
Se observo que la adicion de sobrenadantes del cultivo era mas potente que la que se observaba para la rh-activina A.
Ejemplo 6 La adicion de activina A exogena y folistatina a cultivos de HSC daba como resultado una disminucion en la proliferacion de HSC.
Los cultivos de HSC recien aisladas y activadas, aisladas como en el Ejemplo 4, se expusieron a activina A exogena y folistatina para determinar sus efectos sobre la proliferacion. La adicion tanto de activina A como de folistatina daba como resultado la disminucion, dependiente de la dosis, de la proliferacion de HSC en ambas condiciones experimentales (Figura 9 y 10) en un perfil similar al que se observaba para el TGFp.
Se evaluo la respuesta proliferativa de las HSC y las HSC transformadas (miofibroblastos) a varios mediadores exogenos in vitro por la incorporacion de 3H-timidina. Tras determinarse la densidad celular optima se sembraron las celulas en placas de 24 pocillos con 0,5 x 105 celulas/pocillo y se las dejo que se adhirieran durante una noche a 37° C. El medio de cultivo celular se retiro y se sustituyo con medio M199 que contenia un 0,1 % de BSA durante 18 horas para permitir que las celulas entraran en la fase G0 del ciclo celular. Las celulas se expusieron entonces a varias concentraciones de activina (0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, 10 y 20 ng/ml), TGFp (0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, 10 ng/ml), Folistatina (1,6, 3,2, 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 ng/ml) y PDGF-BB (1,6, 3,2, 6,25, 12,5, 25, 50 ng/ml) durante 18 horas. Los cultivos se pulsaron entonces con 0,5 pCi de 3H-timidina y se incubaron a 37° C durante 16 h mas. A continuacion, las celulas adherentes y no adherentes se tripsinizaron y luego se recolectaron con un recolector Biorad (Biorad) en un filtro de papel y se anadieron a un tubo de centelleo Wallac. Se anadieron setecientos cincuenta microlitros de fluido de centelleo a cada tubo y se hizo el recuento durante un minuto en un contador beta Wallac (Wallac).
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Estos datos sugieren que la folistatina puede ser un agente terapeutico eficaz para el tratamiento de fibrogenesis hepatica.
Ejemplo 7 La activina tiene efectos divergentes sobre la apoptosis de HSC en comparacion con TGFp
Ya que tanto la activina A como la folistatina reduclan la proliferacion de HSC, se planted la hipotesis de que cualquiera de ellas o ambas produjeran apoptosis.
Los cultivos de HSC activadas, aisladas como en el Ejemplo 4, se expusieron a varias cantidades de activina A, folistatina y TGFp y se evaluo por citometrla de flujo la expresion de anexina V; un marcador precoz de apoptosis celular.
Se midio por citometrla de flujo la apoptosis de las llneas celulares de miofibroblastos que se hablan sometido al menos a 6 subcultivos utilizando la expresion de Anexina V en la superficie celular como marcador. La anexina V es una protelna intracelular que se expresa en la superficie celular de las celulas que sufren apoptosis. En resumen 2 x 105 miofibroblastos HSC se subcultivaron en placas de cultivo de 6 pocillos durante una noche. A continuacion, las celulas se lavaron en HBSS y se trataron con activina (0,1, 1, 10 y 100 ng/ml), TGFp (1 y 5 ng/ml), folistatina (10 y 100 ng/ml), PDGF-BB (50 ng/ml), activina y TGFp simultaneamente (1 y 5 ng/ml respectivamente) y activina y fS simultaneamente (10 y 100 ng/ml respectivamente) durante 16 horas. Como control positivo, se utilizo nitroprusiato sodico (SNP) a una concentracion final de 0,5 pM. El SNP es un farmaco quimioterapico que se utiliza en el tratamiento de varios canceres solidos y leucemias. Las celulas adherentes y no adherentes se recolectaron tras el tratamiento con tripsina-EDTA, se lavaron con 1 ml de PBS y se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min. Se aplico un anticuerpo especlfico de anexina V-FITC durante 30 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche diagnostics) en conjunto con Yoduro de Propidio (PI) para distinguir entre celulas apoptoticas y necroticas. Las celulas se lavaron entonces en PBS y se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min y se resuspendieron en 300 pl de PBS. La suspension unica se analizo entonces con un analizador MoFlo-cytomation.
Al contrario que con el TGFp, la adicion de activina A y folistatina no induclan apoptosis de HSC (Figura 11).
Esto es un hallazgo significativo, que sugiere fuertemente un mecanismo regulador celular diferente para la activina A en comparacion con el TGFp.
Ejemplo 8 Administracion parenteral de folistatina recombinante humana en un modelo a corto plazo y largo plazo de dano hepatico.
Para determinar si la administracion parenteral de folistatina era capaz de reducir la progresion de fibrosis hepatica, las ratas se expusieron a CCI4 durante 4 semanas (a corto plazo) o durante 8 semanas (a largo plazo). Los animales se co-inyectaron entonces con 1 pg de folistatina 3 veces por semana durante las 4 primeras semanas (a corto plazo) o desde la 8-12 semanas (a largo plazo) y luego se sacrificaron. Los animales de control recibieron CCI4 durante la misma cantidad de tiempo.
Se indujo cirrosis en ratas Wistar macho inyectando una mezcla 1:5 vol/vol de tetracloruro de carbono (CCI4) y aceite de oliva con una concentracion final de 0,4 mg/kg 3 veces a la semana durante 4 semanas (modelo a corto plazo) o 12 semanas (modelo a largo plazo). Los animales de control recibieron inyecciones solo de volumenes equivalentes de aceite de oliva. Los hlgados completos se retiraron al final del modelo para el analisis histologico y de ARNm como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 1-3. Adicionalmente, para determinar una estimacion de la fibrosis hepatica total, se midio el contenido en hidroxiprolina como se habla descrito anteriormente (Bergman, I., y R. Loxley, "Two improved and simplified methods for the spectrophotometric determination of hydroxyproline", Anal Chem (1963) 35: 1961-1965). En resumen, las muestras de hlgado congeladas se pesaron y se hidrolizaron en acido HCl 6 N a 110° C durante 16-18 horas en tubo revestidos de teflon. Las muestras se enfriaron y se anadieron 40 mg de Dowex (Sigma)/carbon activado a cada muestra y se removieron. El hidrolizado se filtro a traves de 2 filtros de papel en un tubo nuevo y las muestras se ajustaron a un pH de 7,4. Las muestras se incubaron entonces con isopropanol y cloramina T durante 25 minutos a 60° C. Despues del enfriamiento a temperatura ambiente, se estimo el contenido en hidroxiprolina leyendo la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 570 nm.
Para el modelo de fibrosis a corto plazo, se inyecto por via intramuscular 1 mg de FS288 recombinante humana en la extremidad trasera 3 veces por semana durante la duracion del modelo (4 semanas). Para el modelo de fibrosis y cirrosis a largo plazo, se inyectaron los animales por la misma via entre las semanas 8 y 12 del modelo.
En el modelo a corto plazo, los animales que se trataron con folistatina tenlan un peso corporal mayor (Figura 12) y un peso del hlgado remanente mayor (Figura 13). Ademas, tenlan significativamente menos contenido intrahepatico de hidroxiprolina que los controles a las 2 semanas (Figura 14).
En el modelo a largo plazo, los animales que se trataron con folistatina no mostraban cambios en el peso corporal (Figura 15), el peso del hlgado remanente (Figura 16), ni en el contenido intrahepatico de hidroxiprolina (Figura 17).
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A partir de estos datos, los inventores concluyen que el uso de folistatina puede ser contribuir a la mejora de la funcion hepatica de los hepatocitos remanentes.
Ademas, los inventores concluyen que el uso de folistatina puede ser beneficioso como agente terapeutico para atenuar la fibrogenesis hepatica en nuevos pacientes diagnosticados sea sola o en conjuncion con las actuales terapias convencionales.
Unas aplicaciones terapeuticas adicionales podrlan incluir: 1) ayudar a la regeneracion hepatica y absorcion de colageno en pacientes que han completado satisfactoriamente la terapia convencional; 2) restaurar la funcion hepatica en pacientes que se han sometido a reseccion hepatica y atenuar la fibrosis del hlgado regenerado.
Ejemplo 9 Estudios en seres humanos
Se demostro que la activina A estaba elevada en pacientes con hepatitis vlrica cronica en comparacion con los controles normales (Figura 18) mientras que la folistatina serica permanecla a niveles normales (Figura 19), como se informa tambien en Patella, S., et al. (2001), "Characterization of serum activin A and follistatin and their relation to virological and histological determinants in chronic viral hepatitis", J Hepatol., 34(4): 57683. Este estudio es uno de los pocos estudios que han investigado la activina A en la enfermedad humana y es el unico estudio que ha estudiado la hepatitis vlrica humana con algo de detalle.
En resumen, se analizo el suero de archivo almacenado a -80° C de 15 pacientes normales, 22 con hepatitis B y 47 con hepatitis C. Se llevaron a cabo los ensayos de funcion hepatica, virologla y biopsia hepatica durante el manejo cllnico de rutina. Se midio la activina A serica total por medio de un ELISA sandwich en dos etapas en el que se utilizaba la activina A recombinante humana como referencia como se habla descrito anteriormente (Knight, P.G., Muttukrishna, S. & Groome, N.P. Development and application of a two site enzyme immunoassay for the determination of 'total' activin A concentrations in serum and follicular fluid. J Endocrinol 1996; 148:267279). Se cuantifico la folistatina serica total utilizando un ELISA ultrasensible utilizando anticuerpos monoclonales recombinantes como se habla validado anteriormente (Evans, L.W., Muttukrishna, S. & Groome, N.P. Development, validation and application of an ultrasensitive twosite enzyme immunoassay for human follistatin. J Endocrinol 1998; 156: 275282). La referencia utilizada era la folistatina 288 humana recombinante que se obtuvo del Programa Nacional de Hormonas y Pituitaria (Rockville, MD, USA). Se llevo a cabo la inmunohistoqulmica de la subunidad de activina A y folistatina como se detalla en el Ejemplo 2.
Los analisis adicionales de pacientes infectados con HBV revelaban que la activina A serica se correlacionaba significativamente con la ALT, un marcador del dano del hepatocito y la inflamacion intrahepatica (Figura 20). Tambien se observo que la activina A serica en pacientes con VHB se correlacionaba positivamente con la replicacion vlrica (Figura 21), mientras que la folistatina serica se correlacionaba negativamente (Figura 22). Esto sugerla que la presencia de activina A en este sistema sin oposicion, podia contribuir a la patogenesis de la infeccion de hepatitis cronica por su influencia en la replicacion virica.
Ejemplo 10 Expresion de folistatina recombinante humana en celulas CHO
El gen de la folistatina humana 288 (FS288) se amplifico a partir del ADNc ovarico humano (Clontech) utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa. Se genero un fragmento de 954 pares de bases utilizando cebadores complementarios de los extremos 5' y 3' del gen FS288 humano. Este fragmento se clono en un plasmido pGem7Zf(-) (Promega) utilizando tecnicas convencionales. Despues de determinar que la secuencia de FS288 insertada era el gen FS288 correcto, se subclono en un vector de mamifero, pDSVC, detras del promotor temprano SV40. El vector recombinante se transfecto entonces en una linea celular de mamifero (Ovario de hamster chino, CHO) por el metodo de precipitacion en fosfato calcico. Las celulas transfectadas se cultivaron en un medio selectivo hasta que aparecieron las colonias. Estas colonias se agruparon y se cultivaron en medio selectivo (alfa-MEM sin nucleotidos mas un 5 % de FBS dializado), con metotrexato para amplificar el DHFR de raton y se unio a los genes FS288. Los grupos que secretaban los niveles mas altos de FS288 se seleccionaron y la dilucion se coloco en placas. Tras unos dias, las colonias que se originaban de celulas unicas eran visibles. Estas colonias se transfirieron a pocillos separados de una placa multipocillo. Se determino la cantidad de folistatina secretada por cada clon. Se selecciono una linea celular clonada, cD15, que secretaba aproximadamente 8 pg de FS288/ml/24 horas, y se expandio a ~ 1 x 109 celulas. Estas celulas se utilizaron para inocular un biorreactor Braun de 30 litros que contenia el medio (alfa-MEM, glucosa mas un 5 % de FBS) y perlas microvehiculo (Cytodex 2). El volumen de trabajo del fermentador era de 20-25 litros. Las celulas se cultivaron en el fermentador utilizando el metodo “filldraw”. El cultivo se retiro periodicamente y se remplazo con medio recien preparado y perlas microvehiculo. El medio de cultivo recolectado se separo de las celulas por filtracion sin salida a traves de filtros de 5, 1,2 y 0,2 pm. El filtrado final se concentro ~ 5 veces por filtracion de flujo tangencial en un cartucho de ultracentrifugacion con un corte de 10 kDa (AG technologies). El concentrado, que contenia folistatina secretada por las celulas, se almaceno congelado a -20° C.
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Ejemplo 11 Purificacion de Folistatina recombinante humana 288
Se descongelo el concentrado de medio acondicionado que contenla FS288 recombinante humana y se sometio a cromatografla en sefarosa heparina. El material se cargo en una columna de sefarosa heparina en 50 mM de tampon de fosfato Na (Tampon A), y se eluyo en un gradiente de tampon A y tampon B (tampon A + 2 M de NaCl). Las fracciones que contenlan folistatina se agruparon y se concentraron utilizando una membrana YM10. El agrupamiento se cargo en una columna Sephacryl S200 HR en PBS pH 7,0. Las fracciones que contenlan folistatina se agruparon y se concentraron de nuevo, y se filtraron en esterilidad a traves de un filtro de 0,2 |jm y se almacenaron a -20° C. La concentracion de folistatina en el agrupamiento final se estimo que era ~ 900 jg/ml por el ensayo de Bradford y ELISA especlfico para folistatina (Nigel Groome). Se estimo que la pureza era > 90 % por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Ejemplo 12 Formulaciones y metodos de administracion
La folistatina de las mismas se administrara con o sin vehlculos, adyuvantes o excipientes, pero se administrara preferentemente como una formulacion farmaceutica. Para la administracion parenteral, la formulacion estara normalmente en solucion acuosa, y puede comprender folistatina en una cantidad de desde un 0,001 % a un 5 % p/v, por ejemplo, desde un 0,01 % a un 2 % p/v de la formulacion, aunque puede comprender un 5 % p/v como mucho, preferentemente no excede de un 2 % p/v, y mas preferentemente desde un 0,01 % a un 1 % p/v de la formulacion.
Para la administracion oral, la formulacion puede comprender folistatina, en una cantidad desde un 0,001 % a un 10 % por peso, por ejemplo, desde un 0,01 % a un 5 % por peso de la formulacion, aunque puede comprender un 10 % por peso como mucho, preferentemente no excedera un 5 % por peso, y mas preferentemente desde un 0,1 % a un 2 % por peso de la formulacion.
Para la administracion topica, la formulacion puede comprender folistatina en una cantidad de desde un 0,005 % a un 5 % por peso, por ejemplo, desde un 0,05 % a un 2 % por peso de la formulacion, aunque comprende un 5 % por peso como mucho, preferentemente no excede un 2 % por peso, y mas preferentemente desde un 0,1 % a un 1 % por peso de la formulacion.
De acuerdo con la description de la invention se pueden preparar las composiciones farmaceuticas especlficas preferidas que se proporcionan anteriormente, y se proporcionan ejemplos de las cuales posteriormente. Las siguientes formulaciones especlficas se consideran como ejemplos simplemente ilustrativos de formulaciones.
Ejemplo 12(a) Composicion de crema topica
Se presenta a continuation una composicion tlpica para el suministro como una crema topica:
Folistatina
0,1-1,0 g
Metil hidroxibenzoato
0,2 g
Lanolina (Anhidra)
6,0 g
Cera de abeja blanca
7,5 g
Polawax GP 200
25,0 g
Solucion salina esteril hasta
100,0 g
El Polawax, cera de abeja y lanolina se calientan juntas a 60° C, se anade una solucion de metilhidroxibenzoato y se consigue la homogeneizacion utilizando agitado de alta velocidad. La temperatura se deja caer entonces por debajo de 50° C. Se anade entonces la folistatina y se dispersa concienzudamente, y la composicion se deja enfriar con agitado de baja velocidad.
Ejemplo 12(b) Composicion de locion topica
Se presenta a continuacion una composicion tlpica para el suministro como una locion:
Folistatina 0,1-1,0 g

Metil hidroxibenzoato 0,2 g

Monolaurato sorbitan 1,0 g

Polisorbato 20 1,0 g

Alcohol cetostearllico 1,5 g
Glicerina 10,0 g
Solucion salina isotonica hasta 100,00 ml
El metil hidroxibenzoato y la glicerina se disolvieron en 70 ml de solucion salina isotonica a 75° C. El monolaurato de sorbitan, polisorbato 20 y alcohol cetostearllico se mezclaron juntos a 75° C y se anadio a la solucion acuosa. La emulsion resultante se homogeneizo, se dejo enfriar por debajo de 50° C con agitado continuo y se anadio la
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folistatina como una suspension en el agua restante. Toda la suspension se agito hasta que estaba homogenea. Ejemplo 12(c) Composicion de gotas oftalmicas
Se presenta a continuacion una tlpica composicion para su suministro como gotas oftalmicas.
Folistatina
Metil hidroxibenzoato Propil hidroxibenzoato
Solucion salina isotonica purificada hasta aproximadamente
0,01-0,1 g 0,003 g 0,08 g 100,00 ml
El metil y propil hidroxibenzoato se disolvieron en 70 ml de solucion salina isotonica a 75° C, y la solucion resultante se dejo enfriar hasta por debajo de 50° C. Se anadio entonces la folistatina, y la solucion se esterilizo por filtracion por medio de un filtro de membrana (tamano del poro 0,22 pm), y se envaso asepticamente en envases esteriles.
Ejemplo 12(d) Composicion para la administracion por inhalacion
Para un envase de aerosol con una capacidad de 20-30 ml; se disperso una mezcla de 10-50 mg de folistatina con un 0,5-1,0 % por peso de un agente lubricante, tal como el polisorbato 85 o acido oleico, en un propulsor adecuado, tal como el freon, y se coloco en un envase de aerosol apropiado para la administracion por inhalacion intranasal u oral.
Ejemplo 12(e) Composicion para la administracion parenteral
Se puede preparar una composicion farmaceutica de la presente invencion para inyeccion intramuscular para que contenga 1 ml de solucion salina isotonica esteril, y 0,52 mg de folistatina.
De manera similar, una composicion farmaceutica para infusion intravenosa puede comprender 250 ml de solucion de Ringer esteril y 15 mg de folistatina.
Ejemplo 12(f) Composicion en capsulas
Se puede preparar una composicion de folistatina en forma de una capsula llenando una capsula de gelatina dura de dos piezas convencional con 0,5-5,0 mg de folistatina, en forma de polvo, 180 mg de lactosa, 65 mg de talco y 12 mg de estearato magnesico.
Ejemplo 12(g) Composicion parenteral inyectable
Se puede preparar una composicion farmaceutica de la presente invencion en una forma adecuada para la administracion por inyeccion mezclando un 0,1 % por peso de folistatina en un 12 % por volumen de propilenglicol y solucion salina isotonica. La solucion se esteriliza por filtracion.
Ejemplo 12(h) Composicion de un unguento
Una composicion tlpica para el suministro como un unguento incluye de 0,1-0,5 g de folistatina, junto con parafina blanda blanca hasta 100,0 g dispersada para producir un producto suave, homogeneo.
Ejemplo 12(i) Formulacion de uncion dorsal continua
Una tlpica composicion para el suministro como una formulacion para uncion dorsal continua, por ejemplo, para el ganado bovino, incluye un 0,05-0,1 % por peso de folistatina, como se presenta a continuacion:
Folistatina 0,05-0,10 g
Hidroxitolueno butilado 0,02 g
Azul brillante FCF 0,16 g
Goma xantano 0,4 g
Alcohol bencllico 3,0 g
Monobutileter de dietilenglicol hasta 100 g
Si se desea incluir una agente activo de superficie en la formulacion de forma que ayude a la dispersion de la formulacion sobre la piel y/o el pelo del animal, y/o de forma que ayude a la absorcion de la formulacion a traves de la piel, se puede incluir en la formulacion un tensioactivo adecuado, preferentemente un tensioactivo anionico tal como Ecoteric T80 (monooleato sorbitan polioxietileno (20)) con una concentracion de, por ejemplo, un 20 % por peso.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una folistatina para su uso en un metodo de tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado.
    5 2. La folistatina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la fibrosis pulmonar es fibrosis pulmonar
    idiopatica o una enfermedad pulmonar intersticial.
  2. 3. La folistatina para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde
    la folistatina es una protelna de cadena sencilla de entre 288 y 315 aminoacidos con un peso molecular de entre 10 aproximadamente 30.000 y 60.000 Daltons estimados por SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores y capaz de inhibir la secrecion de hormona follculoestimulante (FSH).
  3. 4. La folistatina para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vertebrado se selecciona de entre el grupo que consiste en el ser humano, un primate no humano, ratones, ganado
    15 bovino, ovejas, cabras, caballos, conejos, aves, gatos y perros.
  4. 5. Una composicion farmaceutica que comprende folistatina para su uso en un metodo de tratamiento de una fibrosis pulmonar en un vertebrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y que comprende opcionalmente un vehlculo, un adyuvante y/o un diluyente farmaceuticamente aceptables.
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