KR20160110538A - 신질환의 예방 또는 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제, 또는 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용한, 신질환의 예방ㆍ치료제의 스크리닝 방법 등을 제공한다.

Description

신질환의 예방 또는 치료제{PREVENTIVE OR THERAPEUTIC AGENT FOR KIDNEY DISEASE}
본 발명은 신질환 (腎疾患) 의 예방 또는 치료제 등에 관한 것이다.
최근의 생활 환경의 변화로 인한 고혈압, 당뇨병, 지질 이상 등 생활 습관병이나 메타볼릭 신드롬의 증가에 수반하여 신장질환 환자수는 증가하고 있어, 일본에서의 성인의 약 8 명중 1 명이 만성 신장병 환자인 것으로 생각되고 있다. 신장질환의 진행에 의해 신장의 기능이 저하되어 신부전이 되면, 머지않아 신장 투석이나 신장 이식이 필요하게 되어, 환자의 QOL 의 관점 또는 의료 경제상의 큰 문제가 되고 있다. 또한, 급성 신부전 (또는 급성 신장해 (腎障害)) 은 신장의 허혈이나 신독성 (腎毒性) 이 있는 톡신, 패혈증 등 여러 가지 원인에 의해서 생기는 질환으로, 장기 입원이 될 확률이나 사망율은 높고, 그 발증률은 최근 증가 경향에 있다. 급성 신부전이 충분히 치유되지 않고 만성화되어, 만성 신부전이 되는 경우도 적지 않게 존재하는 것이 알려져 있다.
만성 신장질환의 치료법으로는, 약물 요법, 식사 요법, 안정 요법이 행해지지고 있다. 예를 들어, 약물 요법으로는, 강압약, 이뇨약, 활성형 비타민 D 제제, 경구 흡착 탄소 제제, 칼륨 흡착약, 인 흡착약 등이 사용되어, 질환의 진행을 늦추는 것 또는 신장 기능의 저하에 수반되는 증상의 개선을 목적으로 하고 있다. 그러나, 어떤 치료법에 있어서도 질환의 진행을 충분히 멈추는 것은 불가능하여, 새로운 치료법이 요구되고 있다. 또한, 급성 신부전에 대한 확실한 치료법은 존재하지 않아, 조속한 치료법의 개발이 희구되고 있다.
또한, 고양이에 있어서도 신장질환은 큰 과제가 되고 있다. 만성 신부전은 고령의 고양이에게서 가장 발증하기 쉬운 병으로, 신부전이 고령의 고양이의 사인 (死因) 의 1위라고 말해지고 있다. 거의 모든 고양이가 6-7 세 정도에 요로 결석이나 요로 감염증을 계기로 신기능 (腎機能) 이 악화되어, 급성 신부전 (또는 급성 신장해) 을 발증하고, 다수가 만성 신부전이 되어 15 세 정도에는 사망한다. 고양이에 있어서도 신장질환에 대하여 만족스런 치료법이 없어, 새로운 치료법이 요구되고 있다.
AIM (apoptosis inhibitor of macrophage) 은, 본 발명자가 동정한 마크로파지가 특이적으로 생성하는 인자로 (비특허문헌 1), 지금까지 몇 가지 질환과의 관련이 시사되어 있다. 예를 들어, AIM 은, 비만에 따라 혈중 농도가 상승하고, CD36 을 통한 엔도사이토시스에 의해 지방 세포에 도입되어, 축적되어 있는 중성지방의 분해 (lipolysis) 를 유도하는 점에서, 항비만과의 관계가 시사되어 있다 (비특허문헌 2). 또한, AIM 은, 중성지방의 분해에 의해 지방 세포로부터 유리지방산을 방출시키고, 방출된 지방산이 toll 유사 수용체의 자극을 통해서 지방 조직에 만성 염증을 야기ㆍ유지한다. 메타볼릭 신드롬은, 비만에 수반되는 인슐린 저항성 획득이 그 기반이 되지만, 지방 조직에 있어서의 만성 염증이 중요하다는 점에서, AIM 이 메타볼릭 신드롬과 관계가 있는 것으로 되어 있다 (비특허문헌 3). 그리고 본 발명자는, 고칼로리식을 부하한 비만 AIM KO 마우스가, 비만, 지방간, 간실질의 섬유화, 발암이라는 인간 NASH 병태에 가까운 병태를 나타내는 것을 밝혀, AIM 의 간장질환에 대한 적용 가능성을 보고하고 있다 (특허문헌 1). 그러나, AIM 과 신장질환과의 관계는 지금까지 알려져 있지 않다.
특허문헌 1 : WO2013/162021
비특허문헌 1 : Miyazaki, J Exp Med 189 : 413-422, 1999 비특허문헌 2 : Kurokawa, Cell Metab 11 : 479-492, 2010 비특허문헌 3 : Kurokawa, PNAS 108 : 12072-12077, 2011
본 발명의 목적은 신질환의 예방 또는 치료약을 제공하는 것이다. 또한, 새로운 신질환의 모델 마우스를 사용한 신질환의 예방 또는 치료약의 평가 방법 및 스크리닝 방법 등을 제공하는 것이다. 그리고, 본 발명의 별도의 목적은, 신질환의 예후의 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 편측 요관 결찰 (UUO ; unilateral ureteral obstruction), 또는 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 (IR ; ischemia/reperfusion) 를 실시한 AIM 녹아웃 마우스에 대해서 신장의 경과를 관찰한 결과, 최초에 급성 신부전이 생기고, 일수 (日數) 의 경과에 따라 괴사한 요세관 세포의 축적 및 신실질 (腎實質) 의 섬유화, 사구체 구조의 붕괴 및 섬유화라는 만성 신질환에서 관찰되는 증상이 생긴다고 하는 매우 흥미로운 지견을 얻었다. 또한, 양측성의 일과성 신허혈 재관류 (IR ; ischemia/reperfusion) 를 실시한 AIM 녹아웃 마우스에 있어서도, 급성 신부전이 생기고, 괴사한 요세관 세포의 축적과 그것에 수반되는 신장해의 급속한 진행, 전신 상태의 악화와 높은 비율의 사망이 확인되었다. 또한, 그 AIM 녹아웃 마우스에게 AIM 을 투여한 결과, BUN 값이 개선되고, 신기능의 급속한 개선이 인정되어, 그에 따른 전신 증상과 사망율의 개선이 인정되었다. 이 점으로부터, AIM 을 보충하는 것은, 급성 신부전의 치료 및 만성 신질환의 예방 또는 치료가 될 것으로 생각되었다.
본 발명자는 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은,
[1] AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제 ;
[2] AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제 ;
[3] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염 (腎炎), 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증 (腎症), 신경화증 (腎硬化症), IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[4] 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[5] 예방ㆍ치료의 대상이 인간인 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[6] 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[7] AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 상기 [6] 에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[8] 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드가, 마우스 유래 AIM 의 SRCR3 도메인을 포함하는, 상기 [7] 에 기재된 예방ㆍ치료제 ;
[9] AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용하는, 신질환의 예방ㆍ치료제의 스크리닝 방법 ;
[10] 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 [9] 에 기재된 스크리닝 방법
(1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 피검물질을 투여하는 공정,
(2) 피검물질이 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
(i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
(ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
(iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
(iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
(v) BUN 값,
(vi) 생존율,
(3) 피검물질 비투여의 경우와 비교하여, 상기 특성 중 어느 1 항목 이상이 개선되는 피검물질을 선택하는 공정 ;
[11] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 상기 [9] 또는 [10] 에 기재된 스크리닝 방법 ;
[12] AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용하는, 신질환 예방ㆍ치료제의 예방ㆍ치료 효과의 평가 방법 ;
[13] 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 [12] 에 기재된 평가 방법
(1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 신질환 예방ㆍ치료제를 투여하는 공정,
(2) 신질환 예방ㆍ치료제가 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
(i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
(ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
(iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
(iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
(v) BUN 값,
(vi) 생존율,
(3) 상기 특성 중 어느 1 항목 이상을 신질환 예방ㆍ치료제 비투여의 경우와 비교하여, 신질환 예방ㆍ치료제의 효과를 평가하는 공정 ;
[14] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 상기 [12] 또는 [13] 에 기재된 평가 방법 ;
[15] 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 신질환 환자의 예후의 예측 방법 ;
[16] 시료가 혈액 또는 혈청인, 상기 [15] 에 기재된 예측 방법 ;
[17] AIM 농도의 측정 방법이 항 AIM 항체를 사용한 면역학적 방법인, 상기 [15] 또는 [16] 에 기재된 예측 방법 ;
[18] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 상기 [15]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 예측 방법 ;
[19] 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 급성 신부전의 검사 방법 ;
[20] 시료가 요(尿) 인, [19] 에 기재된 검사 방법 ;
[21] AIM 농도의 측정 방법이 항 AIM 항체를 사용한 면역학적 방법인, [19] 또는 [20] 에 기재된 검사 방법 ;
[22] 이하의 (a) 또는 (b) 를 포함하는, 신질환의 진단 또는 예후의 예측 키트 :
(a) AIM 유전자의 전사 산물과 혼성화(hybridize)할 수 있는 핵산 프로브 또는 핵산 프라이머, 및/또는
(b) AIM 에 대한 항체 ;
[23] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 [22] 에 기재된 키트 ;
[24] AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 신질환의 예방ㆍ치료 방법 ;
[25] AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 신질환의 예방ㆍ치료 방법 ;
[26] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 상기 [24] 또는 [25] 에 기재된 예방ㆍ치료 방법 ;
[27] 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 상기 [24]∼[26] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료 방법 ;
[28] 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 상기 [24]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료 방법 ;
[29] 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 상기 [24]∼[27] 중 어느 하나에 기재된 예방ㆍ치료 방법 ;
[30] AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 상기 [29] 에 기재된 예방ㆍ치료 방법 ;
[31] 신질환의 예방ㆍ치료에 사용하기 위한, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[32] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 상기 [31] 에 기재된 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[33] 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 상기 [31] 또는 [32] 에 기재된 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[34] 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 상기 [31]∼[33] 중 어느 하나에 기재된 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[35] 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 상기 [31]∼[33] 중 어느 하나에 기재된 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[36] AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 상기 [35] 에 기재된 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 ;
[37] 신질환의 예방ㆍ치료에 사용하기 위한, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[38] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 상기 [37] 에 기재된 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[39] 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 상기 [37] 또는 [38] 에 기재된 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[40] 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 상기 [37]∼[39] 중 어느 하나에 기재된 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[41] 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 상기 [37]∼[39] 중 어느 하나에 기재된 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[42] AIM 또는 그 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 상기 [41] 에 기재된 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 ;
[43] 신질환의 예방ㆍ치료제를 제조하기 위한, AIM 또는 그 부분 펩티드 또는 그들을 코딩하는 염기 서열을 함유하는 핵산 또는 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제의 사용 ;
[44] 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 상기 [43] 에 기재된 사용.
[45] 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 상기 [43] 또는 [44] 에 기재된 사용 ;
[46] 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 상기 [43]∼[45] 중 어느 하나에 기재된 사용 ;
[47] 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 상기 [43]∼[45] 중 어느 하나에 기재된 사용 ;
[48] AIM 또는 그 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 상기 [47] 에 기재된 사용 ;
을 제공한다.
본 발명은 유효 성분으로서 AIM 등을 포함하는, 신질환의 예방ㆍ치료제를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 신질환 모델 마우스를 사용한 스크리닝 방법에 의하면, 신질환에 대한 예방ㆍ치료에 유효한 물질을 탐색할 수 있다. 또한, 본 발명의 신질환 모델 마우스를 사용하여, 신질환의 공지된 예방ㆍ치료제의 효과를 평가할 수 있다. 그리고, 본 발명은 피험자의 시료 중의 AIM 농도를 측정함으로써, 신질환의 예후의 예측 방법이나 신질환의 검사 방법을 제공할 수 있다.
[도 1] A : 편측 요관 결찰을 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 정상 신장 조직편 및 UUO 후의 신장 조직편의 Azan 및 헤마톡실린 동시 염색상(像)이다. B : 편측 요관 결찰을 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 정상 신장 조직편 및 UUO 후의 신장 조직편의 Azan, PAS 및 헤마톡실린 동시 염색상이다.
[도 2] 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 헤마톡실린ㆍ에오진 염색상이다.
[도 3] A : 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 F4/80 에 대한 면역 염색상이다. B : 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 MCP-1 발현량을 나타내는 그래프이다. * : P<0.05, ** : P<0.01
[도 4] A : 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시하고, rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 신장 조직편의 헤마톡실린ㆍ에오진 염색상이다. B : 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시하고, rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 BUN 값을 나타내는 그래프이다.
[도 5] 일측성 신적출 후에 일과성 신허혈 재관류를 실시하고, rAIM 을 투여한 AIM KO 마우스의 신장 조직편의 위상차(phase-contrast) 상 및 AIM 에 대한 면역 염색상이다. N : 괴사된 병소를 나타낸다. 화살표 : AIM 을 나타낸다.
[도 6] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 WT 마우스의 요중 AIM 값을 나타내는 그래프이다. * : p<0.05
[도 7] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 8] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 임상 스코어를 나타내는 그래프이다. ** : p<0.01
[도 9] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 BUN 값을 나타내는 그래프이다. 각각의 날에 사망한 마우스의 수를 ＋ 로 기재한다. * : P<0.05, ** : P<0.01
[도 10] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 PAS 염색상이다.
[도 11] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 근위 요세관 중의 죽은 세포괴 (細胞塊) 의 면적을, 1 절편당 전체 면적에 대한 비율로 나타낸 그래프이다. * : p<0.05, ** : p<0.01
[도 12] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 IL-1b 및 IL-6 에 대해서 정량적 RT-PCR 에 의한 mRNA 발현 비율을 나타내는 그래프이다. * : p<0.05
[도 13] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 IR 후 7 일째의 신장 유래 세포의 유세포 분석기(flow cytometer) 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 14] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 WT 마우스의 신장 조직편의 PAS 염색상 및 항 AIM 항체에 의한 면역 염색상이다.
[도 15] 신경색 (腎梗塞) 에 의한 급성 신부전으로 사망한 인간의 신장 조직편의 PAS 염색상 및 항 AIM 항체에 의한 면역 염색상이다.
[도 16] 인간 급성 신부전 (AKI) 으로 병원에 반송된 환자 및 건강한 정상인을 3 명씩, 또한 양측성의 IR 을 실시한 WT 마우스 5 마리에 대해서, IR 전, IR 1 일후, 및 7 일후의 소변에 대해서, ELISA 로 측정한 AIM 농도를 나타내는 그래프이다. N.D. : 검출되지 않음(not detected)
[도 17] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스의 신장 조직편의 계시적 (繼時的) 인 PAS 염색상 및 항 AIM 항체에 의한 면역 염색상이다.
[도 18] AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, IR 후 3 일째의 신장을 콜라게나아제 처리하여, F4/80 양성의 마크로파지를 FACS 소터를 사용하여 단리한 후, 그 탐식능을 나타낸 그래프이다.
[도 19] AIM-KO 유래의 골수 세포를 M-CSF 에 의해 분화시킨 마크로파지를 FACS 소터를 사용하여 단리한 후, 그 탐식능을 나타낸 그래프이다.
[도 20] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 21] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 임상 스코어를 나타내는 그래프이다. * : P<0.05, ** : P<0.01
[도 22] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 BUN 값을 나타내는 그래프이다. 각각의 날에 사망한 마우스의 수를 ＋ 로 기재하고 있다. * : P<0.05, ** : P<0.01
[도 23] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 신장 조직편의 PAS 염색상이다.
[도 24] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 IR 후 7 일째의 신장 조직편의 근위 요세관 중의 죽은 세포괴의 면적을, 1 절편당 전체 면적에 대한 비율로 나타낸 그래프이다. * : p<0.05
[도 25] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 IL-1b 및 IL-6 에 대해서 정량적 RT-PCR 에 의한 mRNA 발현 비율을 나타내는 그래프이다. * : p<0.05
[도 26] 양측성의 비치사성 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 AIM KO 마우스의 BUN 값을 나타내는 그래프이다. * : p<0.05
[도 27] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 투여한 WT 마우스의 BUN 값을 나타내는 그래프이다.
[도 28] 양측성의 비치사성 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 신장 조직편의 PAS 염색상 및 Azan 염색상이다.
[도 29] 양측성의 비치사성 일과성 신허혈 재관류를 실시한 AIM KO 마우스 및 WT 마우스의 4 종류의 섬유화 마커에 대해서 정량적 RT-PCR 에 의한 mRNA 발현 비율을 나타내는 그래프이다.
[도 30] 건강한 정상인, 신장해가 없는 당뇨병 환자, 당뇨병성의 만성 신부전 환자에 대해서 남녀별 혈중 AIM 농도를 나타내는 그래프이다. * : p<0.05, ** : p<0.01
[도 31] A : 만성 신부전 환자 (n=55) 에 있어서의, eGFR (사구체 여과량 ;㎖/min/1.73㎡) 또는 혈중 크레아티닌값 (㎎/㎗) 과 혈중 AIM 농도의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. B : 혈중 AIM 농도와 그 농도 측정으로부터 2∼3 년 후에 있어서의 만성 신부전 환자의 신기능 변화의 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
[도 32] A : 개 (n=3), 고양이 (n=3) 및 마우스의 혈청중에 존재하는 AIM 의 웨스턴 블롯상이다. B : 고양이 및 마우스의 rAIM 의 웨스턴 블롯상이다.
[도 33] A : 재조합 고양이 AIM (1㎎) 을 정맥 주사한 고양이 유래 혈청의 각 사이즈 분획에 대한 AIM 과 IgM 의 웨스턴 블롯상이다. B : 마우스 유래 혈청의 각 사이즈 분획에 대한 AIM 과 IgM 의 웨스턴 블롯상이다.
[도 34] 재조합 마우스 AIM (1㎎) 을 정맥 주사한 고양이 유래 혈청의 각 사이즈 분획에 대한 AIM 과 IgM 의 웨스턴 블롯상이다.
[도 35] 고양이 AIM cDNA 서열 (서열 번호 : 5) 을 나타내는 도면이다. 번역 개시점 (atg) 과 번역 정지점 (tga) 을 굵은 글씨체(bold)로 표시한다. 또한, 비암호화 서열(non-coding sequence) 을 이탤릭체로 표시한다. 또한, 리더 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 실선의 밑줄로 표시한다. 그리고, SRCR1 과 SRCR2 사이의 힌지 부분, SRCR2 와 SRCR3 사이의 힌지 부분 및 SRCR3 과 번역 정지점 사이의 펩티드 서열을 코딩하는 염기 서열을 파선의 밑줄로 표시한다.
[도 36] 고양이의 AIM 단백질의 리더 펩티드 서열의 소수성을 나타내는 도면이다.
[도 37] 인간의 AIM 단백질의 리더 펩티드 서열의 소수성을 나타내는 도면이다.
[도 38] 마우스의 AIM 단백질의 리더 펩티드 서열의 소수성을 나타내는 도면이다.
[도 39] 개의 AIM 단백질의 리더 펩티드 서열의 소수성을 나타내는 도면이다.
[도 40] 인간 (서열 번호 : 2), 고양이 (서열 번호 : 4) 및 마우스 (서열 번호 : 6) 사이의 리더 펩티드 (LS), 각 SRCR 및 힌지 부분의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다.
[도 41] 항 고양이 AIM 모노클로날 항체를 사용한, 고양이의 혈청중 AIM 에 대한 환원형의 웨스턴 블롯팅상을 나타낸다. 개체 1∼4 는 AIM 이 검출된 개체이고, 대조군의 rcAIM 시그널과의 강도 비교에 의해서 산정한 AIM 값을 산출하였다. 개체 5∼7 은 AIM 시그널을 검출할 수 없었던 개체이다 (N.D. : not detectable).
[도 42] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 고양이의 BUN 값 및 Cre 값을 나타내는 그래프이다. ● : Cre, ○ : BUN
[도 43] 항 고양이 AIM 모노클로날 항체를 사용한, IR 전 또는 후의 고양이의 혈청중 또는 요중 AIM 에 대한 환원형의 웨스턴 블롯팅상을 나타낸다.
[도 44] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 고양이의 신장 조직편의 항 AIM 항체에 의한 면역 염색상이다.
[도 45] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, rAIM 또는 PBS 를 투여한 고양이의 eGFR (사구체 여과량 ; ㎖/min/㎡) 을 나타내는 그래프이다. 각각 n=1
[도 46] 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, rAIM 또는 PBS 를 투여한 고양이의 신장 조직편의 PAS 염색상이다.
본 발명은, AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서의 AIM 은, 서열 번호 : 2 (인간 유래 AIM 단백질의 아미노산 서열) 또는 서열 번호 : 4 (고양이 유래 AIM 단백질의 아미노산 서열) 로 나타내는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다.
AIM 은, 예를 들어, 온혈동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지, 닭 등) 의 면역 세포인 마크로파지로부터 단리ㆍ정제되는 단백질이어도 된다. 또한, 화학 합성 혹은 무세포 번역계에서 생화학적으로 합성된 단백질이어도 되고, 또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이 도입된 형질 전환체로부터 생성되는 재조합 단백질이어도 된다.
서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 여기에서, 「상동성」이란, 해당 기술 분야에 있어서 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 2 개의 아미노산 서열을 정렬(align)시킨 경우의, 최적의 정렬 (바람직하게는, 그 알고리즘은 최적의 정렬을 위해 서열의 한쪽 방향 또는 양쪽 방향에의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것이다) 에 있어서의, 오버랩하는 전체 아미노산 잔기에 대한 동일 아미노산 및 유사 아미노산 잔기의 비율 (％) 을 의미한다. 「유사 아미노산」이란 물리 화학적 성질에 있어서 유사한 아미노산을 의미하고, 예를 들어, 방향족 아미노산 (Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산 (Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산 (Gln, Asn), 염기성 아미노산 (Lys, Arg, His), 산성 아미노산 (Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산 (Ser, Thr), 측쇄가 작은 아미노산 (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 등의 같은 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 유사 아미노산에 의한 치환은 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않는 (즉, 보존적 아미노산 치환이다) 것이 예측된다. 보존적 아미노산 치환의 구체예는 해당 기술 분야에서 주지이며, 여러 가지 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, Bowie 등, Science, 247 : 1306-1310 (1990) 를 참조).
본 명세서에 있어서의 아미노산 서열의 상동성은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) 를 사용하여, 이하의 조건 (기대치=10 ; 갭을 허용한다 ; 매트릭스=BLOSUM62 ; 필터링=OFF) 으로 계산할 수 있다. 아미노산 서열의 상동성을 결정하기 위한 다른 알고리즘으로는, 예를 들어, Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993) 에 기재된 알고리즘 [그 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2.0) 에 편입되어 있다 (Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (1997))], Needleman 등, J. Mol. Biol., 48 : 444-453 (1970) 에 기재된 알고리즘 [그 알고리즘은 GCG 소프트웨어 팩키지 중의 GAP 프로그램에 편입되어 있다], Myers 및 Miller, CABIOS, 4 : 11-17 (1988) 에 기재된 알고리즘 [그 알고리즘은 CGC 서열 얼라인먼트 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (version 2.0) 에 편입되어 있다], Pearson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 2444-2448 (1988) 에 기재된 알고리즘 [그 알고리즘은 GCG 소프트웨어 팩키지 중의 FASTA 프로그램에 편입되어 있다] 등을 들 수 있고, 그것들도 마찬가지로 바람직하게 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질로는, 예를 들어, 상기 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다. 여기에서 「활성」이란, 예를 들어, 동맥경화소 마크로파지의 아포토시스 억제 활성, 동맥경화의 유지ㆍ촉진 활성, 지방 세포 분화 억제 활성, 지방 세포의 지방적(滴) 융해 활성, 지방 세포 축소 활성, CD36 결합 활성, 지방 세포로의 엔도사이토시스 활성, FAS 결합 활성, FAS 기능 억제 활성, 항비만 활성 등을 말한다. 「실질적으로 동질」이란, 그러한 활성들이 정성적 (예를 들어, 생리학적 또는 약리학적) 으로 같은 것을 나타낸다. 따라서, 상기 활성은 동등한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도 (예를 들어, 약 0.1∼약 10 배, 바람직하게는 약 0.5∼약 2 배) 나 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 달라도 된다.
상기 활성의 측정은, 자체 공지된 방법에 준하여 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 AIM 에는, 예를 들어, (1) 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는, 1∼100 개 정도, 바람직하게는 1∼50 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼10 개 정도, 특히 바람직하게는 1∼수 (2, 3, 4 또는 5) 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, (2) 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는, 1∼100 개 정도, 바람직하게는 1∼50 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼10 개 정도, 특히 바람직하게는 1∼수 (2, 3, 4 또는 5) 개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, (3) 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는, 1∼50 개 정도, 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼수 (2, 3, 4 또는 5) 개) 의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, (4) 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는, 1∼50 개 정도, 바람직하게는 1∼10 개 정도, 더욱 바람직하게는 1∼수 (2, 3, 4 또는 5) 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 (5) 그것들을 조합한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 등도 포함된다.
상기한 바와 같이 아미노산 서열이 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 단백질의 활성이 유지되는 한 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 AIM 은, 바람직하게는 서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 인간 AIM 단백질 (GenBank 수납 번호 : AAD01446) 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 고양이 AIM 단백질, 혹은 다른 포유동물에 있어서의 그 동족체(homologue) [예를 들어, GenBank 에 수납 번호 : AAD01445 로서 등록되어 있는 마우스 동족체 등] 이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 AIM 단백질 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 고양이 AIM 단백질이다.
본 명세서에 있어서 단백질 및 펩티드는, 펩티드 표기의 관례에 따라서 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실 말단) 으로 기재된다. 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 비롯한, 본 발명의 AIM 은, C 말단이 카르복실기 (-COOH), 카르복실레이트 (-COO-), 아미드 (-CONH2) 또는 에스테르 (-COOR) 중 어느 것이어도 된다.
여기서 에스테르에 있어서의 R 로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등의 C1-6 알킬기 ; 예를 들어, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3-8 시클로알킬기 ; 예를 들어, 페닐, α-나프틸 등의 C6-12 아릴기 ; 예를 들어, 벤질, 페네틸 등의 페닐-C1-2 알킬기 ; α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1-2 알킬기 등의 C7-14 아랄킬기 ; 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다.
본 발명의 AIM 이 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 단백질에 포함된다. 이 경우의 에스테르로는, 예를 들어 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다.
그리고, 본 발명의 AIM 에는, N 말단의 아미노산 잔기의 아미노기가 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C1-6 알카노일 등의 C1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성될 수 있는 N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루탐산화한 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기 (예를 들어, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C1-6 알카노일기 등의 C1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 또는 당사슬이 결합한 이른바 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.
AIM 의 부분 펩티드 (이하, 간단히 「본 발명의 부분 펩티드」라고 약칭하는 경우도 있다) 는, 상기한 AIM 의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 또한 AIM 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 한, 어느 것이어도 된다. 여기서「실질적으로 동질의 활성」이란 상기와 동일한 의미를 나타낸다. 또한, 「실질적으로 동질의 활성」의 측정은 AIM 의 경우와 동일하게 실시할 수 있다.
AIM 은, 시스테인을 많이 포함하는 3개의 SRCR (Scavenger-Receptor Cysteine-Rich) 도메인을 포함하고 있다는 점에서, 각각의 SRCR 도메인을 본 발명의 부분 펩티드로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열 중, SRCR1 도메인 (서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 24∼125), SRCR2 도메인 (서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 138∼239), SRCR3 도메인 (서열 번호 : 2 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 244∼346) 을 각각 포함하는 부분 아미노산 서열이나 SRCR 도메인의 임의의 조합을 포함하는 부분 아미노산 서열을 갖는 것 등이 사용된다. 또한, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, SRCR1 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 24∼125), SRCR2 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 139∼239), SRCR3 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 244∼346) 을 각각 포함하는 부분 아미노산 서열이나 SRCR 도메인의 임의의 조합을 포함하는 부분 아미노산 서열을 갖는 것 등도 사용된다. 본 발명의 부분 펩티드는, 상기한 기능 도메인을 포함하는 한 그 사이즈에 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 50 개 이상의 부분 아미노산 서열을 포함하는 것, 보다 바람직하게는 100 개 이상의 부분 아미노산 서열을 포함하는 것, 더욱 바람직하게는 200 개 이상의 부분 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 그 부분 아미노산 서열은 한 개의 연속된 부분 아미노산 서열이어도 되고, 또는 불연속한 복수의 부분 아미노산 서열이 연결된 것이어도 된다.
또한, 본 발명의 부분 펩티드는 C 말단이 카르복실기 (-COOH), 카르복실레이트 (-COO-), 아미드 (-CONH2) 또는 에스테르 (-COOR) 중 어느 것이어도 된다. 여기서 에스테르에 있어서의 R 로는, AIM 에 대해서 상기한 것과 동일한 것을 들 수 있다. 본 발명의 부분 펩티드가 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 부분 펩티드에 포함된다. 이 경우의 에스테르로는, 예를 들어, C 말단의 에스테르와 동일한 것 등이 사용된다.
그리고 본 발명의 부분 펩티드에는, 상기한 AIM 과 마찬가지로, N 말단의 아미노산 잔기의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루탐산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당사슬이 결합한 이른바 당펩티드 등의 복합펩티드 등도 포함된다.
본 발명에서 사용되는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드는 염의 형태여도 된다. 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 산 (예 : 무기산, 유기산) 이나 염기 (예 : 알칼리 금속염) 등의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는, 예를 들어, 무기산 (예를 들어, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과 같은 염, 또는 유기산 (예를 들어, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과 같은 염 등이 사용된다.
AIM 은, 전술한 포유동물의 마크로파지로부터 자체 공지된 단백질의 정제 방법에 의해서 제조할 수 있다. 구체적으로는, 포유동물의 마크로파지를 균질화(homogenize)하여, 저속 원심에 의해 세포 잔해들(debris)를 제거한 후, 상청을 고속 원심하여 세포막 함유 분획을 침전시키고, 그 상청을 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티-크로마토그래피 등의 크로마토그래피 등에 제공함으로써 AIM 또는 그것의 염을 조제할 수 있다.
AIM 또는 그것의 부분 펩티드는, 공지된 펩티드 합성법에 따라서 제조할 수도 있다 (이하, 이들 화학 합성의 설명에 있어서는, 특별히 언급하지 않는 한, 전장 (全長) AIM 및 그것의 부분 펩티드를 포괄하여 간단히 AIM 이라고 한다).
펩티드 합성법은, 예를 들어, 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 것이어도 된다. AIM 을 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 나머지 부분을 축합하고, 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적으로 하는 단백질을 제조할 수 있다.
여기서, 축합이나 보호기의 탈리는 자체 공지된 방법, 예를 들어, 이하의 (1) 및 (2) 에 기재된 방법에 따라서 실시된다.
(1) M. Bodanszky 및 M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966년)
(2) Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965년)
이렇게 해서 얻어진 AIM 은, 공지된 정제법에 의해 정제 단리할 수 있다. 여기서 정제법으로는, 예를 들어, 용매 추출, 증류, 컬럼 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 재결정, 이것들의 조합 등을 들 수 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 AIM 이 유리체인 경우에는, 그 유리체를 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 AIM 이 염으로서 얻어진 경우에는, 그 염을 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.
또한 AIM 은, 그것을 코딩하는 핵산을 함유하는 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 AIM 을 분리 정제함으로써 제조할 수도 있다. AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 핵산은 DNA 여도 되고 RNA 여도 되며, 혹은 DNA/RNA 키메라여도 된다. 바람직하게는 DNA 를 들 수 있다. 또한, 그 핵산은 이중 가닥이어도 되고, 외가닥이어도 된다. 이중 가닥의 경우에는, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA : RNA 의 하이브리드여도 된다. 외가닥의 경우에는, 센스사슬 (즉, 코딩 사슬) 이어도 되고, 안티센스사슬 (즉, 논코딩 사슬) 이어도 된다.
AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 게놈 DNA, 온혈동물 (예를 들어, 인간, 소, 원숭이, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 몰모트, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 닭 등) 의 마크로파지 유래의 cDNA, 합성 DNA 등을 들 수 있다. AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 게놈 DNA면, 상기 동물의 모든 세포 [예를 들어, 간 세포, 지라 세포, 신경 세포, 신경교 세포, 췌장 β 세포, 골수 세포, 메산지움 세포, 랑겔한스 세포, 표피 세포, 상피 세포, 배 (杯) 세포, 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아 세포, 섬유 세포, 근 세포, 지방 세포, 면역 세포 (예, 마크로파지, T 세포, B 세포, 내츄럴 킬러 세포, 비만 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 활막 세포, 연골 세포, 골 세포, 골아 세포, 파골 세포, 유선 (乳腺) 세포, 간 세포 혹은 간질 세포, 또는 이들 세포의 전구 세포, 줄기 세포 또는 암 세포 등] 혹은 이들 세포가 존재하는 모든 조직 [예를 들어, 뇌, 뇌의 각 부위 (예, 후구 (嗅球), 편도핵, 대뇌기저구, 해마, 시상, 시상하부, 대뇌피질, 연수, 소뇌), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 폐, 소화관 (예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 골, 관절, 지방 조직 (예, 갈색 지방 조직, 백색 지방 조직), 골격근 등] 로부터 조제한 게놈 DNA 분획을 주형으로 사용하여, 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction) (이하, 「PCR 법」이라고 약칭한다) 에 의해서 직접 증폭할 수 있고, AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 cDNA 라면, 마크로파지로부터 조제한 전 (全) RNA 또는 mRNA 분획을 각각 주형으로 사용하여, PCR 법 및 역전사 효소 (Reverse Transcriptase)-PCR (이하, 「RT-PCR 법」이라고 약칭한다) 에 의해서 직접 증폭할 수도 있다. 또는, AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 게놈 DNA 및 cDNA 는, 상기한 게놈 DNA 및 전 RNA 또는 mRNA 의 단편을 적당한 벡터 중에 삽입하여 조제되는 게놈 DNA 라이브러리 및 cDNA 라이브러리로부터, 콜로니 또는 용균반 혼성화법 (plaque hybridization method) 또는 PCR 법 등에 의해, 각각 클로닝할 수도 있다. 라이브러리에 사용하는 벡터는, 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느 것이어도 된다.
AIM 을 코딩하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 : 1 또는 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있다.
서열 번호 : 1 또는 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열을 포함하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 : 1 로 나타내는 염기 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유하고, 상기한 AIM 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등이 사용된다.
본 명세서에 있어서의 염기 서열의 상동성은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) 를 사용하여, 이하의 조건 (기대치=10; 갭을 허용한다; 필터링( filtering)=ON ; 매치 스코어=1 ; 미스매치 스코어=-3) 으로 계산할 수 있다. 염기 서열의 상동성을 결정하기 위한 다른 알고리즘으로는, 상기한 아미노산 서열의 상동성 계산 알고리즘이 마찬가지로 바람직하게 예시된다.
AIM 을 코딩하는 DNA 는, 바람직하게는 서열 번호 : 1 로 나타내는 염기 서열로 나타내는 인간 AIM 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA (GenBank 수납 번호 : AF011429), 또는 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열로 나타내는 고양이 AIM 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 혹은 다른 포유동물에 있어서의 그것의 동족체 [예를 들어, GenBank 에 수납 번호 : AF011428 로서 등록되어 있는 마우스 동족체 등] 이다.
본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 는, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열의 일부와 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 구체적으로는, 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 예를 들어, (1) 서열 번호 : 1 또는 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열의 부분 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는 (2) 서열 번호 : 1 또는 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열의 부분 염기 서열을 포함하는 DNA 와 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 상기한 AIM 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등이 사용된다.
AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 는, 그 AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 염기 서열의 일부분을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하거나, 또는 적당한 발현 벡터에 집어 넣은 DNA 를, AIM 의 일부 또는 전체 영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 표지한 것과 혼성화시킴으로써 클로닝할 수 있다. 혼성화는, 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예를 들어, 몰레큘러ㆍ클로닝 (Molecular Cloning) 제2판 (J. Sambrook 등., Cold Spring HarborLab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라서 실시할 수 있다. 또한, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 혼성화는, 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 혼성화는, 바람직하게는 엄격한(stringent) 조건에 따라서 실시할 수 있다.
매우 엄격한 조건으로는, 예를 들어, 6×SSC (sodium chloride/sodium citrate) 중 45℃ 에서의 혼성화 반응 후, 0.2×SSC/0.1％ SDS 중 65℃ 에서의 1 회 이상의 세정 등을 들 수 있다. 당업자는, 혼성화 용액의 염 농도, 혼성화 반응의 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 미스매치의 수, 혼성화 반응의 시간, 세정액의 염 농도, 세정의 온도 등을 적절히 변경함으로써, 원하는 엄격한 조건을 용이하게 조절할 수 있다. 또한, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 혼성화는, 그 라이브러리에 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터는, 예를 들어, AIM 을 코딩하는 DNA 로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 잘라내고, 그 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.
발현 벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13) ; 동물 세포 발현 플라스미드 (예 : pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) ; 레트로바이러스, 우두바이러스, 아데노바이러스 등의 동물 바이러스 벡터 등이 사용된다.
프로모터로는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다.
예를 들어, 숙주가 동물 세포인 경우, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (라우스육종바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK (단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제) 프로모터 등이 사용된다. 그 중에서도, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 바람직하다.
숙주가 에세리키아속균인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이 바람직하다.
발현 벡터로는, 상기 외에, 원한다면 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 기점 (이하, SV40 ori 라고 약칭하는 경우가 있다) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 마커로는, 예를 들어, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 (이하, dhfr 로 약칭하는 경우가 있다, 메토트렉세이트 (MTX) 내성), 암피실린 내성 유전자 (이하, ampr 로 약칭하는 경우가 있다), 네오마이신 내성 유전자 (이하, neor 로 약칭하는 경우가 있다, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, dhfr 유전자 결손 차이니즈햄스터 세포를 사용하여, dhfr 유전자를 선택 마커로서 사용하는 경우, 티미딘을 함유하지 않은 배지에 의해 목적 유전자를 선택할 수도 있다.
또한, 필요에 따라서, 숙주에 맞는 시그널 서열을 코딩하는 염기 서열 (시그널 코돈) 을, AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 의 5' 말단측에 부가 (또는 네이티브 시그널 코돈과 치환) 해도 된다. 예를 들어, 숙주가 에세리키아속균인 경우, PhoAㆍ시그널 서열, OmpAㆍ시그널 서열 등이 ; 숙주가 동물 세포인 경우, 인슐린ㆍ시그널 서열, α-인터페론ㆍ시그널 서열, 항체 분자ㆍ시그널 서열 등이 각각 사용된다.
상기한 AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 의해 숙주를 형질 전환하고, 얻어지는 형질 전환체를 배양함으로써, AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 제조할 수 있다.
숙주로는, 예를 들어, 에세리키아속균, 동물 세포 등이 사용된다.
에세리키아속균로는, 예를 들어, 에세리키아ㆍ콜리 (Escherichia coli) K12ㆍDH1〔프로시딩스ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이엔시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60권, 160 (1968)〕, 에세리키아ㆍ콜리 JM103〔뉴클레익ㆍ애시드ㆍ리서치 (Nucleic Acids Research), 9권, 309 (1981)〕,에세리키아ㆍ콜리 JA221〔저널ㆍ오브ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지 (Journal of Molecular Biology), 120권, 517 (1978)〕, 에세리키아ㆍ콜리 HB101〔저널ㆍ오브ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지, 41권, 459 (1969)〕, 에세리키아ㆍ콜리 C600〔제네틱스 (Genetics), 39권, 440 (1954)〕 등이 사용된다.
동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이 COS-7 세포, 원숭이 Vero 세포, 차이니즈햄스터 난소 세포 (이하, CHO 세포로 약기), dhfr 유전자 결손 CHO 세포 (이하, CHO (dhfr-) 세포로 약기), 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 미엘로마 세포, 래트 GH3 세포, 인간 FL 세포 등이 사용된다.
형질 전환은, 숙주의 종류에 따라, 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
에세리키아속균은, 예를 들어, 프로시딩스ㆍ오브ㆍ더ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이엔시즈ㆍ오브ㆍ더ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69권, 2110 (1972) 이나 진 (Gene), 17권, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라서 형질 전환할 수 있다.
동물 세포는, 예를 들어, 세포 공학 별책 8 신세포 공학 실험 프로토콜, 263-267 (1995) (슈쥰샤 (秀潤社) 발행), 바이롤로지 (Virology), 52권, 456 (1973) 에 기재된 방법에 따라서 형질 전환할 수 있다.
형질 전환체의 배양은, 숙주의 종류에 따라, 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
숙주가 에세리키아속균인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배지로는, 예를 들어, 글루코스, 카사미노산을 포함하는 M9 배지〔밀러 (Miller), 저널ㆍ오브ㆍ익스페리먼트ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ제네틱스 (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕가 바람직하다. 필요에 따라, 프로모터를 효율적으로 기능시키기 위해, 예를 들어, 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 배지에 첨가해도 된다.
숙주가 에세리키아속균인 형질 전환체의 배양은, 통상 약 15∼약 43℃ 에서, 약 3∼약 24 시간 실시된다. 필요에 따라, 통기나 교반을 실시해도 된다.
숙주가 동물 세포인 형질 전환체를 배양하는 경우의 배지로는, 예를 들어, 약 5∼약 20％ 의 태아 소혈청을 포함하는 최소 필수 배지 (MEM) 〔사이언스 (Science), 122권, 501 (1952)〕, 둘베코 개변 이글 배지 (DMEM) 〔바이롤로지 (Virology), 8권, 396 (1959)〕, RPMI1640 배지〔저널ㆍ오브ㆍ더ㆍ아메리칸ㆍ메디컬ㆍ어소시에이션 (The Journal of the American Medical Association), 199권, 519 (1967)〕, 199 배지〔프로시딩ㆍ오브ㆍ더ㆍ소사이어티ㆍ포ㆍ더ㆍ바이올로지컬ㆍ메디슨 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73권, 1 (1950)〕등이 사용된다. 배지의 pH 는, 바람직하게는 약 6∼약 8 이다. 배양은, 통상 약 30℃∼약 40℃ 에서, 약 15∼약 60 시간 실시된다. 필요에 따라 통기나 교반을 실시해도 된다.
이상과 같이 하여, 형질 전환체의 세포내 또는 세포외에 AIM 을 제조시킬 수 있다.
상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 자체 공지된 방법에 따라서 분리 정제할 수 있다.
예를 들어, AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 배양균체 또는 세포의 세포질로부터 추출하는 경우, 배양물로부터 공지된 방법으로 모은 균체 또는 세포를 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리소자임 및/또는 동결융해 등에 의해서 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 가용성 단백질의 조추출액을 얻는 방법 등이 적절히 사용된다. 그 완충액은, 우레아나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤 X-100TM 등의 계면 활성제를 포함하고 있어도 된다. 또, AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 균체 (세포) 외에 분비되는 경우에는, 배양물로부터 원심분리 또는 여과 등에 의해 배양 상청을 분취하는 등의 방법이 사용된다.
이렇게 해서 얻어진 가용성 분획, 배양 상청 중에 포함되는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드의 단리 정제는, 자체 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 이러한 방법으로는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법 ; 투석법, 한외여과법, 겔 여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법 ; 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법 ; 어피니티-크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법 ; 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법 ; 등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 ; 등이 사용된다. 이들 방법은, 적절히 조합할 수도 있다.
이렇게 해서 얻어지는 AIM 또는 그 부분 펩티드의 존재는, AIM 에 대한 항체를 사용한 엔자임 이뮤노어세이나 웨스턴 블롯팅 등에 의해 확인할 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드 혹은 그것의 염, 또는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 (여기서는, AIM 류로 표현하는 경우도 있다) 은, 신질환의 발증의 예방ㆍ치료제로서 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, AIM 류를 대신하여, AIM 의 발현을 유도하는 약제나 AIM 을 안정화시키는 약제도 사용할 수 있다.
AIM 의 발현을 유도하는 약제로는, 예를 들어, AIM 전사 활성 작용을 갖는 화합물 등을 들 수 있고, 그 화합물로는, AIM 유전자의 프로모터 영역에 결합할 수 있는 전사 인자 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명자는, AIM 이 마크로파지에서 발현하는 것을 알아내었다. 따라서, AIM 의 발현을 유도하는 약제로서, 마크로파지 분화 유도제를 들 수 있다. 마크로파지 분화 유도제로는, 과립구 마크로파지 콜로니 형성 세포 (CFU-GM) 나 마크로파지 콜로니 형성 세포 (CFU-M) 등의 전구 세포로부터 마크로파지를 분화 유도할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor : GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (macrophage colony stimulating factor : M-CSF) 등을 사용할 수 있다. 전사 인자, GM-CSF, M-CSF 는, 상기한 공지 수단에 의해서 포유동물의 조직ㆍ세포로부터 단리ㆍ정제되는 단백질이어도 되고, 화학 합성 또는 무세포 번역계에서 생화학적으로 합성된 단백질이어도 된다. 또는, 상기 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이 도입된 형질 전환체로부터 생성되는 재조합 단백질이어도 된다.
AIM 을 안정화시키는 약제로는, AIM 분해를 저해하는 화합물, 또는 요중으로의 배설을 저해하는 화합물 등을 들 수 있다. 분해를 저해하는 화합물로는, 프로테아제 저해제, 프로테아좀 저해제 등을 들 수 있다. 프로테아제 저해제로는, 예를 들어, 세린프로테아제 저해제 (플루오르화4(2-아미노에틸)벤젠술포닐염산염 (AEBSGF), 아프로티닌, 트립신 인히비터 등), 시스테인 프로테아제 저해제 (E-64, 로이펩틴 등) 등을 들 수 있다. 프로테아좀 저해제로는, 락타시스틴, MG-115, MG-132, 프로테아좀 인히비터 I 등을 들 수 있다. 요중으로의 배설을 저해하는 화합물로는, 예를 들어, 사구체의 기저막을 통과할 수 없는 분자량을 AIM 에 부여하는 화합물을 들 수 있다. IgM 은 AIM 과 결합한다는 점에서 (WO2013/162021 ; Arai 등., Cell Reports 3 : 1187-1198, 2013), 요중으로의 배설을 저해하는 화합물로서 IgM 을 들 수 있다. 그러나, IgM 자체를 투여하면 면역계의 부작용이 우려되는 점에서, AIM 과의 결합 부위인 IgM 의 Fc 부분과 요세관에서 여과되어 요중으로 배출되지 않을 정도의 분자량의 단백질을 융합시킨 융합 단백질이 바람직하게 사용된다. 융합시키는 단백질은 한정되지 않지만, 부작용의 우려가 적은 단백질이 바람직하고, 예를 들어 알부민을 사용할 수 있다. 결합은 직접 연결해도 상관없고, 힌지 부분을 사용하여 연결해도 상관없다. 힌지 부분으로는 FLAG tag 를 병렬한 것을 예시할 수 있다. 이러한 분자는, 각각을 코딩하는 유전자를 연결하여, 하나의 재조합 단백으로서 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, IgM 과 결합하는 AIM 은 임의의 온혈동물 유래의 AIM 이어도 되지만, 고양이 유래의 AIM 은 제외하여도 된다.
본 발명의 후술하는 실시예에 있어서는, AIM 의 녹아웃 마우스는, 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, 신질환의 증상을 나타내었다. 이상과 같은 점에서, AIM 류(類), AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제, 혹은, 후술하는 스크리닝 방법으로 탐색할 수 있는 AIM 의 기능을 대체할 수 있는 화합물은, 신질환의 발증, 진행을 예방ㆍ치료할 수 있음이 시사된다.
본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는 의약 조성물의 투여 대상은, 인간 또는 다른 온혈동물 (예, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이, 닭, 바람직하게는 고양이 등)을 들 수 있다.
본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는 의약 조성물의 적용 대상이 되는 신질환은, 예를 들어, 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증을 들 수 있고, 바람직하게는 급성 신부전 또는 만성 신부전을 들 수 있다. 교원병에 수반되는 신증으로는, 대표적인 것은 루푸스 신장염을 들 수 있다.
본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는 의약 조성물은 저독성으로, 그대로 액제로서, 또는 적당한 제형의 의약 조성물로서 인간 또는 다른 온혈동물 (예, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이, 닭, 바람직하게는 고양이 등) 에 대하여 경구적 또는 비경구적 (예, 혈관내 투여, 피하 투여 등) 으로 투여할 수 있다.
비경구 투여를 위한 조성물로는, 예를 들어, 주사제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피부내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함해도 된다. 이러한 주사제는 공지된 방법에 따라서 조제할 수 있다. 주사제의 조제 방법으로는, 예를 들어, 상기 본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성액, 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제할 수 있다. 주사용의 수성액으로는, 예를 들어, 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어, 알코올 (예, 에탄올), 폴리알코올 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면 활성제〔예, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)〕등과 병용해도 된다. 유성액으로는, 예를 들어, 참깨유, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은, 적당한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 통상의 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제되어도 된다.
경구 투여를 위한 조성물로는, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름 코팅정을 포함한다), 환제, 과립제, 산제, 캡슐제 (소프트 캡슐제를 포함한다), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 공지된 방법에 의해 제조되고, 제제 분야에서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하고 있어도 된다. 정제용의 담체, 부형제로는, 예를 들어, 유당, 전분, 자당, 스테아르산마그네슘이 사용된다.
상기 비경구용 또는 경구용 의약 조성물은, 활성 성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이러한 투약 단위의 제형으로는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제를 들 수 있다. 본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제는, 예를 들어, 투약 단위 제형당 통상 5∼500㎎, 특히 주사제에서는 5∼100㎎, 그 밖의 제형에서는 10∼250㎎ 함유되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는 상기 예방ㆍ치료제의 투여량은, 투여 대상, 대상 질환, 증상, 투여 루트 등에 따라서도 달라지지만, 예를 들어, 성인의 신질환의 치료ㆍ예방을 위해 사용하는 경우에는, 본 발명의 AIM 류를 1 회량으로서 통상 0.01∼20㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 0.1∼10㎎/㎏ 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1∼5㎎/㎏ 체중 정도를 1 일 1∼5 회 정도, 바람직하게는 1 일 1∼3 회 정도, 정맥 주사에 의해 1 일∼21 일 정도, 바람직하게는 1 일∼14 일 정도 투여하는 것이 좋다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 위중한 경우에는, 그 증상에 따라서 증량해도 된다.
또, 상기한 각 조성물은, 본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제와의 배합에 의해 바람직하지 못한 상호 작용을 일으키지 않는 한 다른 활성 성분을 함유해도 된다.
그리고, 본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제는, 신질환의 치료에 유용한 다른 약제, 예를 들어, 강압약 (예, 안지오텐신 변환 효소 저해약, 안지오텐신 II 수용체 길항약, 칼슘 길항약, 레닌 저해약, α 차단약, β 차단약 등) ; 이뇨약 (예, 탄산 탈수소 효소 저해약, 루프 이뇨제, 싸이아자이드계 이뇨약, 항알도스테론약, 칼륨 보존 이뇨약 등) ; 활성형 비타민 D3 제제 (예, 칼시트리올, 알파카실돌, 막사칼시톨, 팔레칼시트리올 등) ; 경구 흡착 탄소 제제 (예, 활성탄 등) ; 칼륨 보정약 (예, 폴리스티렌술폰산나트륨 등) ; 인 흡착약 (예, 탄산칼슘, 아세트산칼슘, 염산 세벨라머, 탄산란탄 등), 적혈구 조혈 자극 인자 제제 (erythropoiesis stimulating agent ; ESA) (예, 에리스로포이에틴 제제), 아미노산 수액 제제 등과 병용해도 된다. 본 발명의 AIM 류, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제 및 상기 약제는, 동시 또는 상이한 시간에 환자에게 투여하면 된다.
또한, 후술하는 실시예와 같이, 혈중에 있어서 AIM 을 검출할 수 없었던 고양이에 대해서는, 혈중에 있어서 고양이 AIM 이 고양이 IgM 과 결합하지 못하고, 용이하게 사구체의 기저막을 통하여 요중에 배설되는 것이 시사된다. 결과적으로, 고양이 AIM 은 안정적으로 혈중에 존재할 수 없어, 신장질환의 원인이 되는 것으로 생각된다. 또, 마우스 AIM 은 고양이 IgM 과 고양이 혈중에 있어서 결합할 수 있음이 분명해지고, 특히 마우스 AIM 의 SRCR3 도메인이 고양이 IgM 과의 결합에 있어서 중요함이 시사되었다. 따라서, 본 발명은 또한 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는, 고양이에게 투여하기 위한 신질환의 예방ㆍ치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서의 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 은, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 또한 고양이 IgM 과 결합할 수 있는 단백질이다.
그와 같은 단백질은 예를 들어, 화학 합성 또는 무세포 번역계에서 생화학적으로 합성된 단백질이어도 되고, 또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이 도입된 형질 전환체로부터 생성되는 재조합 단백질이어도 된다.
서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 「상동성」에 관해서는, 상기와 동일하면 된다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 또한, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질로는, 예를 들어, 상기한 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다. 여기서 「실질적으로 동질의 활성」이란 상기와 동일한 의미를 나타낸다.
고양이 IgM 과 결합할 수 있는 AIM 단백질로는, 고양이 혈중에 있어서 고양이 IgM 과 결합하는 한, 어떠한 AIM 단백질이어도 되지만, 예를 들어, 마우스 유래 AIM 의 SRCR3 도메인을 함유하는 단백질인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어, 서열 번호 : 6 으로 나타내는 아미노산 서열 중 아미노산 번호 246∼348 을 함유하는 AIM 단백질을 들 수 있다. 또한, 마우스 유래 AIM 의 SRCR3 도메인을 포함하는 단백질은, AIM 이 원래 갖고 있는 SRCR3 도메인을 마우스 유래 AIM 의 SRCR3 도메인으로 치환한 단백질이어도 된다.
고양이 IgM 과 결합하는 AIM 의 부분 펩티드는, 상기한 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 의 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 또한 AIM 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 한, 어떤 것이어도 된다. 여기서 「실질적으로 동질의 활성」이란 상기와 동일한 의미를 나타낸다.
구체적으로는, 예를 들어, 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, SRCR1 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 24∼125), SRCR2 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 139∼239), SRCR3 도메인 (서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 244∼346) 을 각각 포함하는 부분 아미노산 서열이나 SRCR 도메인의 임의의 조합을 포함하는 부분 아미노산 서열을 갖는 것 등도 사용된다. 상기한 부분 펩티드는, 상기한 기능 도메인을 포함하는 한 그 사이즈에 특별히 제한은 없다.
고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있다.
서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열을 포함하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 : 3 으로 나타내는 염기 서열과 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상, 특히 바람직하게는 약 90％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유하고, 상기한 AIM 과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등이 사용된다. 「상동성」에 관해서는, 상기와 동일하면 된다. 그 DNA 는, 상기한 방법과 동일하게 조제된다.
본 발명의 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 의약 조성물의 투여 대상으로는, 고양이를 들 수 있다.
본 발명의 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 의약 조성물의 적용 대상이 되는 신질환은, 예를 들어, 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증을 들 수 있고, 바람직하게는 급성 신부전 또는 만성 신부전을 들 수 있다. 교원병에 수반되는 신증으로는, 대표적인 것은 루푸스 신장염을 들 수 있다.
본 발명의 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 의약 조성물은 저독성으로, 상기와 동일하게 경구적 또는 비경구적으로 대상에 투여할 수 있다. 제형, 투여량 등은 상기와 동일하면 된다.
또한, 상기와 같이, AIM 의 녹아웃 마우스는, 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, 신질환의 증상을 나타내었다. 이것은, 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에 놓인 AIM 의 녹아웃 마우스는, 신질환의 새로운 모델 마우스로서 제공할 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명은, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용한, 신질환의 예방ㆍ치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
AIM 발현 부전 비인간 포유동물이란, 내재성 AIM 의 발현이 불활성화된 비인간 포유동물을 의미하고, AIM 이 녹아웃 (KO) 된 ES 세포로부터 제작되는 AIM KO 동물 외에, 안티센스 또는 RNAi 기술에 의해 AIM 의 발현이 불활성화된 녹다운 (KD) 동물 등도 포함된다. 여기서 「녹아웃 (KO)」이란, 내재성 유전자를 파괴하거나, 제거하거나 함으로써 완전한 mRNA 를 생성 불능으로 하는 것을 의미하고, 한편, 「녹다운 (KD)」이란, mRNA 로부터 단백질로의 번역을 저해함으로써, 결과적으로 내재성 유전자의 발현을 불활성화하는 것을 의미한다. 이하, 본 발명의 AIM KO/KD 동물을, 간단하게 「본 발명의 KO/KD 동물」이라고 하는 경우가 있다. 본 발명의 AIM KO 동물로는, 예를 들어, Miyazaki T. 등. (J. Exp. Med., 189, 413-422, 1999, 또는 WO2013/162021) 에 개시되어 있다.
본 발명에서 대상으로 할 수 있는 「비인간 포유동물」은, 트랜스제닉계가 확립된 인간 이외의 포유동물이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 마우스, 래트, 소, 원숭이, 돼지, 양, 염소, 토끼, 개, 고양이, 몰모트, 햄스터, 래트, 마우스 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 토끼, 개, 고양이, 몰모트, 햄스터 등이고, 그 중에서도 질환 모델 동물 제작의 면에서 개체 발생 및 생물 사이클이 비교적 짧고, 번식이 용이한 설치동물이 보다 바람직하고, 특히 마우스 (예를 들어, 순계로서 C57BL/6 계통, BALB/c 계통, DBA2 계통 등, 교잡계로서 B6C3F1 계통, BDF1 계통, B6D2F1 계통, ICR 계통 등) 및 래트 (예를 들어, Wistar, SD 등) 가 바람직하다.
또한, 포유동물 이외에도 닭 등의 조류를 본 발명에서 대상으로 하는 「비인간 포유동물」과 동일한 목적으로 사용할 수 있다.
AIM 을 녹아웃하는 구체적인 수단으로는, 상기 Miyazaki T. 등. (J. Exp. Med., 189, 413-422, 1999, 또는 WO2013/162021) 에도 개시되어 있지만, 그 밖의 공지된 일반적인 수법으로는, 대상 비인간 포유동물 유래의 AIM (게놈 DNA) 을 통상적인 방법에 따라서 단리하고, 예를 들어, (1) 그것의 엑손 부분이나 프로모터 영역에 다른 DNA 단편 (예를 들어, 약제 내성 유전자나 리포터 유전자 등) 을 삽입함으로써 엑손 또는 프로모터의 기능을 파괴하거나, (2) Cre-loxP 계나 Flp-frt 계를 사용하여 AIM 의 전부 또는 일부를 잘라내어 그 유전자를 결실시키거나, (3) 단백질 코딩 영역 내에 종지 코돈을 삽입하여 완전한 단백질의 번역을 불능으로 하거나, 혹은 (4) 전사 영역 내부에 유전자의 전사를 종결시키는 DNA 서열 (예를 들어, poly A 부가 시그널 등) 을 삽입하여, 완전한 mRNA 의 합성을 불능으로 하는 것에 의해서, 결과적으로 유전자를 불활성화하도록 구축한 DNA 서열을 갖는 DNA 사슬 (이하, 타겟팅 벡터로 약기한다) 을, 상동 재조합에 의해 대상 비인간 포유동물의 AIM 유전자좌에 집어넣는 방법 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
그 상동 재조합체는, 예를 들어, 배성 줄기세포 (ES 세포) 로의 상기 타겟팅 벡터의 도입에 의해 취득할 수 있다.
ES 세포는 배반포기의 수정란의 내부 세포괴 (ICM) 에서 유래하고, 시험관 내(in vitro)에서 미분화 상태를 유지한 채로 배양 유지할 수 있는 세포를 말한다. ICM 의 세포는 장래, 배 본체를 형성하는 세포로, 생식 세포를 포함하는 모든 조직의 기초가 되는 줄기 세포이다. ES 세포로는, 이미 수립된 세포주를 사용해도 되고, 또한, Evans 와 Kaufman 의 방법 (네이처 (Nature) 제292권, 154페이지, 1981년) 에 준하여 새롭게 수립한 것이어도 된다. 예를 들어, 마우스 ES 세포의 경우, 현재, 일반적으로는 129 계 마우스 유래의 ES 세포가 사용되고 있지만, 면역학적 배경이 명확치 않기 때문에, 이것을 대신할 순계이면서 면역학적으로 유전적 배경이 분명한 ES 세포를 취득하는 등의 목적으로, 예를 들어, C57BL/6 마우스나 C57BL/6 의 채란수의 적음을 DBA/2 와의 교잡에 의해 개선한 BDF1 마우스 (C57BL/6 과 DBA/2 의 F1) 로부터 수립되는 ES 세포 등도 양호하게 사용할 수 있다. BDF1 마우스는, 채란수가 많고 또한 난자가 건강하다는 이점에 더하여, C57BL/6 마우스를 배경으로 갖기 때문에, 이것 유래의 ES 세포는 질환 모델 마우스를 제작했을 때, C57BL/6 마우스와 되돌려 교잡함으로써 그 유전적 배경을 C57BL/6 마우스로 바꾸는 것이 가능하다는 점에서 유리하게 사용할 수 있다. ES 세포는, 적당한 조건에 의해, 고밀도에 도달할 때까지 단층 배양하거나, 또는 세포 집괴를 형성할 때까지 부유 배양함으로써, 두정근, 내장근, 심근 등의 여러 가지 타입의 세포로 분화시키는 것이 가능하고 〔M. J. Evans 및 M. H. Kaufman, 네이처 (Nature) 제292권, 154페이지, 1981년 ; G. R. Martin, 프로시딩스ㆍ오브ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이엔시즈ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 제78권, 7634페이지, 1981년 ; T. C. Doetschman 등, 저널ㆍ오브ㆍ엠브리올로지ㆍ앤드ㆍ익스페리멘탈ㆍ모폴로지, 제87권, 27페이지, 1985년〕, 본 발명의 타겟팅 벡터가 도입된 ES 세포를 분화시켜 얻어지는 AIM 발현 부전 비인간 포유동물 세포는, 시험관 내에서의 AIM 의 세포 생물학적 검토에 있어서 유용하다.
예를 들어, 타겟팅 벡터가, AIM 의 엑손 부분이나 프로모터 영역에 다른 DNA 단편을 삽입함으로써 그 엑손 또는 프로모터의 기능을 파괴하기 위해 설계된 것인 경우, 해당 벡터는, 예를 들어, 다음과 같은 구성을 취할 수 있다.
먼저, 상동 재조합에 의해 AIM 의 엑손 또는 프로모터 부분에 다른 DNA 단편이 삽입되기 때문에, 타겟팅 벡터는, 해당 다른 DNA 단편의 5' 상류 및 3' 하류에, 각각 표적 부위와 상동인 서열 (5' 아암 및 3' 아암) 을 포함할 필요가 있다.
삽입되는 다른 DNA 단편은 특별히 제한은 없지만, 약제 내성 유전자나 리포터 유전자를 사용하면, 타겟팅 벡터가 염색체로 도입된 ES 세포를, 약제 내성 또는 리포터 활성을 지표로 하여 선택할 수 있다. 여기서 약제 내성 유전자로는, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스페라아제 II (nptII) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스페라아제 (hpt) 유전자 등을, 리포터 유전자로는, 예를 들어, β-갈락토시다아제 (lacZ) 유전자, 클로람페니콜아세틸 트랜스페라아제 (cat) 유전자 등을 각각 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.
약제 내성 또는 리포터 유전자는, 포유동물 세포 내에서 기능할 수 있는 임의의 프로모터의 제어하에 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, SV40 유래 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 롱터미널리피트 (LTR), 라우스육종바이러스 (RSV) LTR, 마우스 백혈병 바이러스 (MoMuLV) LTR, 아데노바이러스 (AdV) 유래 초기 프로모터 등의 바이러스 프로모터, 및 β-액틴 유전자 프로모터, PGK 유전자 프로모터, 트랜스페린 유전자 프로모터 등의 포유동물의 구성 단백질 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다. 그러나, 약제 내성 또는 리포터 유전자가 AIM 의 내재성 프로모터의 제어하에 놓이도록 AIM 내에 삽입되는 경우에는, 타겟팅 벡터 중에 그 유전자의 전사를 제어하는 프로모터는 필요하지 않다.
또한, 타겟팅 벡터는, 약제 내성 또는 리포터 유전자의 하류에, 그 유전자로부터의 mRNA 의 전사를 종결시키는 서열 (폴리아데닐레이션 (polyA) 시그널, 터미네이터로도 불린다) 을 갖고 있는 것이 바람직하고, 예를 들어, 바이러스 유전자 유래, 또는 각종 포유동물 또는 조류의 유전자 유래의 터미네이터 서열을 사용할 수 있다. 바람직하게는, SV40 유래의 터미네이터 등이 사용된다.
통상, 포유동물에 있어서의 유전자 재조합은 대부분이 비상동적이고, 도입된 DNA 는 염색체의 임의의 위치에 랜덤하게 삽입된다. 따라서, 약제 내성이나 리포터 유전자의 발현을 검출하는 등의 선택 (포지티브 선택) 에 의해서는 상동 재조합에 의해 표적이 되는 내재성 AIM 으로 타겟팅된 클론만을 효율적으로 선택할 수 없고, 선택된 모든 클론에 대해서 서던 혼성화법 또는 PCR 법에 의한 편입 부위의 확인이 필요하게 된다. 그래서, 타겟팅 벡터의 표적 서열에 상동인 영역의 외측에, 예를 들어, 간사이클로비르 감수성을 부여하는 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제 (HSV-tk) 유전자를 연결해 두면, 그 벡터가 랜덤하게 삽입된 세포는 HSV-tk 유전자를 갖기 때문에, 간사이클로비르 함유 배지에서는 생육할 수 없지만, 상동 재조합에 의해 내재성 AIM 유전자좌로 타겟팅된 세포는 HSV-tk 유전자를 갖지 않기 때문에, 간사이클로비르 내성이 되어 선택된다 (네거티브 선택). 또는, HSV-tk 유전자 대신에, 예를 들어 디프테리아 독소 유전자를 연결하면, 그 벡터가 랜덤하게 삽입된 세포는 자신이 생성하는 그 독소에 의해 사멸하기 때문에, 약제 비존재하에서 상동 재조합체를 선택할 수도 있다.
ES 세포로의 타겟팅 벡터의 도입에는, 인산 칼슘 공침전법, 전기 천공 (일렉트로포레이션) 법, 리포펙션법, 레트로바이러스 감염법, 응집법, 현미 주입 (마이크로인젝션) 법, 유전자 총 (파티클 건) 법, DEAE-덱스트란법 등 중 어느 것도 사용할 수 있지만, 전술한 바와 같이, 포유동물에 있어서의 유전자 재조합은 대부분이 비상동적이고, 상동 재조합체가 얻어지는 빈도는 낮기 때문에, 간편하게 다수의 세포를 처리할 수 있는 것 등의 점에서 일렉트로포레이션법이 일반적으로 선택된다. 일렉트로포레이션에는 통상의 동물 세포에 대한 유전자 도입에 사용되고 있는 조건을 그대로 사용하면 되고, 예를 들어, 대수 증식기에 있는 ES 세포를 트립신 처리하여 단일 세포로 분산시킨 후, 106∼108 세포/㎖ 가 되도록 배지에 현탁하여 큐벳으로 옮기고, 타겟팅 벡터를 10∼100㎍ 첨가하여, 200∼600V/㎝ 의 전기 펄스를 인가함으로써 실시할 수 있다.
타겟팅 벡터가 편입된 ES 세포는, 단일 세포를 피더 세포 상에서 배양하여 얻어지는 콜로니로부터 분리 추출한 염색체 DNA 를 서던 혼성화 또는 PCR 법에 의해 스크리닝함으로써도 검정할 수 있지만, 다른 DNA 단편으로서 약제 내성 유전자나 리포터 유전자를 사용한 경우에는, 그것들의 발현을 지표로 하여 세포 단계에서 형질 전환체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 포지티브 선택용 마커 유전자로서 nptII 유전자를 포함하는 벡터를 사용한 경우, 유전자 도입 처리 후의 ES 세포를 G418 등의 네오마이신계 항생 물질을 함유하는 배지 중에서 배양하고, 출현된 내성 콜로니를 형질전환체의 후보로서 선택한다. 또한, 네거티브 선택용 마커 유전자로서, HSV-tk 유전자를 포함하는 벡터를 사용한 경우, 간사이클로비르를 함유하는 배지 중에서 배양하고, 출현된 내성 콜로니를 상동 재조합체의 후보로서 선택한다. 얻어진 콜로니를 각각 배양 플레이트로 옮겨 트립신 처리, 배지 교환을 반복한 후, 일부를 배양용으로서 남기고, 나머지를 PCR 또는 서던 혼성화를 실시하여 도입 DNA 의 존재를 확인한다.
도입 DNA 의 편입이 확인된 ES 세포를 동종의 비인간 포유동물 유래의 배내로 되돌리면, 숙주 배의 ICM 에 편입된 키메라배가 형성된다. 이것을 임시 부모 (수배 (受胚) 용 암컷) 에 이식하고 추가로 발생을 계속시킴으로써해, 키메라 KO 동물이 얻어진다. 키메라 동물 중에서 ES 세포가 장래 난자나 정자로 분화되는 시원 생식세포의 형성에 기여한 경우에는, 생식 계열 키메라가 얻어지게 되고, 이것을 교배함으로써 AIM 발현 부전이 유전적으로 고정된 KO 동물을 제작할 수 있다.
키메라배의 제작 방법으로는, 상실배기까지의 초기배 끼리를 접착시켜 집합시키는 방법 (집합 키메라법) 과, 배반포의 할강 내에 세포를 현미 주입하는 방법 (주입 키메라법) 이 있다. ES 세포에 의한 키메라배의 제작에 있어서는 종래부터 후자가 널리 실시되고 있지만, 최근에는, 8 세포기배의 투명대(帶) 안으로의 ES 세포의 주입에 의해 집합 키메라를 만드는 방법이나, 마이크로 머니퓰레이터(micromanipulator)가 불필요하며 조작이 용이한 방법으로서, ES 세포괴와 투명대를 제거한 8 세포기배를 공배양하여 응집시킴으로싸 집합 키메라를 제작하는 방법도 실시되고 있다.
어느 경우에도 숙주배는, 후술하는 수정란으로의 유전자 도입에 있어서, 채란용 암컷으로서 사용될 수 있는 비인간 포유동물로부터 동일하게 하여 채취할 수 있는데, 예를 들어 마우스의 경우, 키메라 마우스 형성에 대한 ES 세포의 기여율을 모색 (毛色) (코트 컬러) 으로 판정할 수 있도록, ES 세포가 유래하는 계통과는 모색이 상이한 계통의 마우스로부터 숙주배를 채취하는 것이 바람직하다. 예를 들어, ES 세포가 129 계 마우스 (모색 : 아구티) 유래이면, 채란용 암컷으로서 C57BL/6 마우스 (모색 : 블랙) 이나 ICR 마우스 (모색 : 알비노) 를 사용하고, ES 세포가 C57BL/6 또는 DBF1 마우스 (모색 : 블랙) 유래나 TT2 세포 (C57BL/6 과 CBA 의 F1 (모색 아구티) 유래) 면, 채란용 암컷으로서 ICR 마우스나 BALB/c 마우스 (모색 : 알비노) 를 사용할 수 있다.
또한, 생식 계열 키메라 형성능은 ES 세포와 숙주배의 조합에 크게 의존하기 때문에, 생식 계열 키메라 형성능이 높은 조합을 선택하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어 마우스의 경우, 129 계통 유래의 ES 세포에 대해서는 C57BL/6 계통 유래의 숙주배 등을 사용하는 것이 바람직하고, C57BL/6 계통 유래의 ES 세포에 대해서는 BALB/c 계통 유래의 숙주배 등이 바람직하다.
채란용 암컷 마우스는 약 4∼약 6 주령 정도가 바람직하고, 교배용의 수컷 마우스로는 약 2∼약 8 개월령 정도의 동 계통의 것이 바람직하다. 교배는 자연 교배에 의해서도 되지만, 바람직하게는 성선 자극 호르몬 (난포 자극 호르몬, 이어서 황체 형성 호르몬) 을 투여하여 과잉 배란을 유발시킨 후에 실시된다.
배반 주입법에 의한 경우에는, 배반포기의 배 (예를 들어 마우스의 경우, 교배 후 약 3.5 일) 를 채란용 암컷의 자궁으로부터 채취하고 (또는 상실배기 이전의 초기배를 난관으로부터 채취한 후, 배 배양용 배지 (후술) 중에서 배반포기까지 배양해도 된다), 마이크로 머니퓰레이터를 사용하여 배반포의 할강 내에 타겟팅 벡터가 도입된 ES 세포 (약 10∼약 15 개) 를 주입한 후, 가짜 임신시킨 수배용 암컷 비인간 포유동물의 자궁 내에 이식한다. 수배용 암컷 비인간 포유동물은 수정란으로의 유전자 도입에 있어서의 수배용 암컷으로서 사용될 수 있는 비인간 포유동물을 동일하게 사용할 수 있다.
공배양법에 의한 경우에는, 8 세포기배 및 상실배 (예를 들어 마우스의 경우, 교배 후 약 2.5 일) 를 채란용 암컷의 난관 및 자궁으로부터 채취하여 (또는 8 세포기 이전의 초기배를 난관으로부터 채취한 후, 배 배양용 배지 (후술) 중에서 8 세포기 또는 상실배기까지 배양해도 된다) 산성 타이로드액 중에서 투명대를 용해시킨 후, 미네랄 오일을 중층한 배 배양용 배지의 미세액적(microdrop)에 타겟팅 벡터가 도입된 ES 세포괴 (세포수 약 10∼약 15 개) 를 넣고, 다시 상기 8 세포기배 또는 상실배 (바람직하게는 2 개) 를 넣고 하룻밤 공배양한다. 얻어진 상실배 또는 배반포를 상기와 동일하게 하여 수배용 암컷 비인간 포유동물의 자궁 내에 이식한다.
이식배가 수미 양호하게 착상하여 수배 암컷이 임신하면, 자연 분만 또는 제왕절개술에 의해 키메라 비인간 포유동물이 얻어진다. 자연 분만한 수배 암컷에는 그대로 포유를 계속시키면 되고, 제왕절개술에 의해 출산한 경우에는, 산자 (産仔) 는 별도 준비한 포유용 암컷 (통상적으로 교배ㆍ분만한 암컷 비인간 포유동물) 에 포유시킬 수 있다.
생식 계열 키메라의 선택은, 우선 ES 세포의 자웅이 미리 판별되어 있는 경우에는 ES 세포와 같은 성별의 키메라 마우스를 선택하고 (통상은 웅성 ES 세포가 사용되기 때문에, 수컷 키메라 마우스가 선택된다), 이어서 모색 등의 표현형으로부터 ES 세포의 기여율이 높은 키메라 마우스 (예를 들어, 50％ 이상) 를 선택한다. 예를 들어, 129 계 마우스 유래의 웅성 ES 세포인 D3 세포와 C57BL/6 마우스 유래의 숙주배와의 키메라배로부터 얻어지는 키메라 마우스의 경우, 아구티의 모색이 차지하는 비율이 높은 수컷 마우스를 선택하는 것이 바람직하다. 선택된 키메라 비인간 포유동물이 생식 계열 키메라인지 여부의 확인은, 적당한 계통의 동종 동물과의 교잡에 의해 얻어지는 F1 동물의 표현형에 기초하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 키메라 마우스의 경우, 아구티는 블랙에 대하여 우성이기 때문에, 암컷 C57BL/6 마우스와 교잡하면, 선택된 수컷 마우스가 생식 계열 키메라이면 얻어지는 F1 의 모색은 아구티가 된다.
상기한 바와 같이 하여 얻어지는 타겟팅 벡터가 도입된 생식 계열 키메라 비인간 포유동물 (파운더) 은, 통상, 상동 염색체의 일방향의 AIM 만이 KO 된 헤테로 접합체로서 얻어진다. 상동 염색체의 양방향의 AIM 이 KO 된 호모 접합체를 얻기 위해서는, 상기한 바와 같이 하여 얻어지는 F1 동물 중 헤테로 접합체의 형제끼리를 교잡하면 된다. 헤테로 접합체의 선택은, 예를 들어 F1 동물의 꼬리부로부터 분리 추출한 염색체 DNA 를 서던 혼성화 또는 PCR 법에 의해 스크리닝함으로써 검정할 수 있다. 얻어지는 F2 동물의 1/4 이 호모 접합체가 된다.
타겟팅 벡터로서 바이러스를 사용하는 경우의 별도의 바람직한 일 실시양태로서, 포지티브 선택용 마커 유전자가 5' 및 3' 아암 사이에 삽입되고, 그 아암의 외측에 네거티브 선택용 마커 유전자를 포함하는 DNA 를 포함하는 바이러스로, 비인간 포유동물의 ES 세포를 감염시키는 방법을 들 수 있다 (예를 들어, 프로시딩스ㆍ오브ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이엔시즈ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 제99권, 제4호, 제2140-2145페이지, 2002년 참조). 예를 들어, 레트로바이러스나 렌티바이러스를 사용하는 경우, 디쉬 등의 적당한 배양기에 세포를 뿌리고, 배양액에 바이러스 벡터를 첨가하여 (원한다면 폴리브렌을 공존시켜도 된다), 1∼2 일간 배양 후, 전술한 바와 같이 선택 약제를 첨가하고 배양을 계속하여, 벡터가 편입된 세포를 선택한다.
AIM 을 녹다운하는 구체적인 수단으로는, AIM 의 안티센스 RNA 또는 siRNA (shRNA 를 포함한다) 를 코딩하는 DNA 를, 자체 공지된 트랜스제닉 제작 기술을 사용하여 도입하고, 대상 비인간 포유동물 세포 내에서 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드의 표적 영역과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA, 즉, 목적하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 DNA 는, 그 목적하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 「안티센스」라고 말할 수 있다.
AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에, 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그것의 일부를 갖는 안티센스 DNA 로는, AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그것의 일부를 함유하고, 그 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있는 작용을 갖는 것이면, 어떤 안티센스 DNA 여도 된다.
AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 염기 서열이란, 예를 들어, 그 폴리뉴클레오티드의 상보 사슬의 염기 서열과, 오버랩하는 영역에 관해서 약 70％ 이상, 바람직하게는 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열이다. 본 명세서에 있어서의 염기 서열의 상동성은, 예를 들어, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) 를 사용하여, 이하의 조건 (기대치=10 ; 갭을 허용한다 ; 필터링=ON ; 매치 스코어=1 ; 미스매치 스코어=-3) 으로 계산할 수 있다.
특히, AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보 사슬의 전체 염기 서열 중, (a) 번역 저해를 지향한 안티센스 DNA 의 경우에는, AIM 의 N 말단 부위를 코딩하는 부분의 염기 서열 (예를 들어, 개시 코돈 부근의 염기 서열 등) 의 상보 사슬과 약 70％ 이상, 바람직하게는 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 갖는 안티센스 DNA 가, (b) RNaseH 에 의한 RNA 분해를 지향하는 안티센스 DNA 인 경우에는, 인트론을 포함하는 AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전체 염기 서열의 상보 사슬과 약 70％ 이상, 바람직하게는 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 상동성을 갖는 안티센스 DNA 가 각각 바람직하다.
구체적으로는, 대상 비인간 포유동물이 마우스인 경우, GenBank accession No. AF011428 로서 등록되어 있는 염기 서열에 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열, 또는 그것의 일부를 포함하는 안티센스 DNA, 바람직하게는, 그 염기 서열에 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 포함하는 안티센스 DNA 등을 들 수 있다.
AIM 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그것의 일부를 갖는 안티센스 DNA (이하, 「본 발명의 안티센스 DNA」라고도 한다) 는, 클론화한, 또는 결정된 AIM 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 정보에 기초하여 설계하고, 합성할 수 있다. 이러한 안티센스 DNA 는, AIM 의 복제 또는 발현을 저해할 수 있다. 즉, 본 발명의 안티센스 DNA 는 AIM 으로부터 전사되는 RNA (mRNA 또는 초기 전사 산물) 와 혼성화할 수 있어, mRNA 의 합성 (프로세싱) 또는 기능 (단백질로의 번역) 을 저해할 수 있다.
본 발명의 안티센스 DNA 의 표적 영역은, 안티센스 DNA 가 혼성화함으로써, 결과적으로 AIM 으로의 번역이 저해되는 것이면 그 길이에 특별히 제한은 없고, 그 단백질을 코딩하는 mRNA 의 전체 서열이어도 되고 부분 서열이어도 되며, 짧은 것으로 약 10 염기 정도, 긴 것으로 mRNA 또는 초기 전사 산물의 전체 서열을 들 수 있다. 구체적으로는, AIM 의 5' 말단(端) 헤어핀 루프, 5' 말단 6-베이스 페어ㆍ리피트, 5' 말단 비번역 영역, 번역 개시 코돈, 단백질 코딩 영역, ORF 번역 종지 코돈, 3' 말단 비번역 영역, 3' 말단 팔린드롬 영역 또는 3' 말단 헤어핀 루프 등을 안티센스 DNA 의 바람직한 표적 영역으로서 선택할 수 있는데, AIM 내의 어떠한 영역도 대상으로서 선택할 수 있다. 예를 들어, 그 유전자의 인트론 부분을 표적 영역으로 할 수 있다.
그리고, 본 발명의 안티센스 DNA 는, AIM 의 mRNA 또는 초기 전사 산물과 혼성화하여 단백질로의 번역을 저해할 뿐만 아니라, 이중 가닥 DNA 인 AIM 과 결합하여 3 중 가닥 (트리플렉스) 을 형성하여, RNA 의 전사를 저해할 수 있는 것이어도 된다. 혹은 DNA : RNA 하이브리드를 형성하여 RNaseH 에 의한 분해를 유도하는 것이어도 된다.
AIM 을 코딩하는 mRNA 또는 초기 전사 산물을, 코딩 영역의 내부 (초기 전사 산물의 경우에는 인트론 부분을 포함한다) 에서 특이적으로 절단할 수 있는 리보자임을 코딩하는 DNA 도 또한, 본 발명의 안티센스 DNA 에 포함될 수 있다. 리보자임으로서 가장 범용성이 높은 것으로는, 비로이드나 비루소이드 등의 감염성 RNA에서 보이는 셀프스플라이싱 RNA 가 있고, 해머 헤드형이나 헤어핀형 등이 알려져 있다. 해머 헤드형은 약 40 염기 정도로 효소 활성을 발휘하고, 해머 헤드 구조를 취하는 부분에 인접하는 양 말단의 수 염기씩 (합해서 약 10 염기 정도) 을 mRNA 의 원하는 절단 부위와 상보적인 서열로 함으로써, 표적 mRNA 만을 특이적으로 절단하는 것이 가능하다. 이 타입의 리보자임은 RNA 만을 기질로 하기 때문에, 게놈 DNA 를 공격하는 일이 없다는 추가 이점을 갖는다. AIM mRNA 가 자신이 이중 가닥 구조를 취하는 경우에는, RNA 헬리카제와 특이적으로 결합할 수 있는 바이러스 핵산 유래의 RNA 모티브를 연결한 하이브리드 리보자임을 사용함으로써, 표적 서열을 외가닥으로 할 수 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10) : 5572-5577 (2001)]. 그리고, 전사 산물의 세포질로의 이행을 촉진하기 위해서, tRNA 를 개변한 서열을 추가로 연결한 하이브리드 리보자임으로 할 수도 있다 [Nucleic Acids Res., 29 (13) : 2780-2788 (2001)].
본 명세서에 있어서는, AIM 의 mRNA 또는 초기 전사 산물의 코딩 영역 내의 부분 서열 (초기 전사 산물의 경우에는 인트론 부분을 포함한다) 에 상동인 올리고 RNA 와 그것의 상보 사슬로 이루어지는 이중 가닥 RNA, 이른바 단쇄 간섭 RNA (siRNA) 도 또한, 본 발명의 KD 동물 제작을 위해 사용할 수 있다. siRNA 를 세포 내에 도입하면 그 RNA 에 상동인 mRNA 가 분해되는, 이른바 RNA 간섭 (RNAi) 으로 불리는 현상은 이전부터 선충, 곤충, 식물 등에서 알려져 있었지만, 이 현상이 동물 세포에서도 광범위하게 일어나는 것이 확인된 이래로 [Nature, 411 (6836) : 494-498 (2001)], 리보자임의 대체 기술로서 범용되고 있다. siRNA 는 표적이 되는 mRNA 의 염기 서열 정보에 기초하여, 시판되는 소프트웨어 (예 : RNAi Designer ; Invitrogen) 를 사용하여 적절히 설계할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고 DNA 및 리보자임은, AIM 의 cDNA 서열 또는 게노믹 DNA 서열에 기초하여 mRNA 또는 초기 전사 산물의 표적 서열을 결정하고, 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기 (어플라이드ㆍ바이오시스템즈사, 벡크만사 등) 를 사용하여, 이것에 상보적인 서열을 합성함으로써 조제할 수 있다. 합성된 안티센스 올리고 DNA 또는 리보자임은, 필요에 따라서 적당한 링커 (어댑터) 서열을 통해 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 안티센스 올리고 RNA 또는 리보자임을 코딩하는 DNA 발현 벡터를 조제할 수 있다. 여기서 사용될 수 있는 발현 벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드, 고초균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드, λ 파아지 등의 박테리오파지, 모로니 백혈병 바이러스 등의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노수반바이러스, 우두바이러스 또는 바큘로바이러스 등의 동물 또는 곤충 바이러스 등이 사용된다. 그 중에서도, 플라스미드 (바람직하게는 대장균 유래, 고초균 유래 또는 효모 유래, 특히 대장균 유래의 플라스미드) 나, 동물 바이러스 (바람직하게는 레트로바이러스, 렌티바이러스) 가 바람직하게 예시된다. 또한, 프로모터로는, 예를 들어, SV40 유래 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 롱터미널리피트 (LTR), 라우스육종바이러스 (RSV) LTR, 마우스 백혈병 바이러스 (MoMuLV) LTR, 아데노바이러스 (AdV) 유래 초기 프로모터 등의 바이러스 프로모터, 및 β-액틴 유전자 프로모터, PGK 유전자 프로모터, 트랜스페린 유전자 프로모터 등의 포유동물의 구성 단백질 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다.
보다 긴 안티센스 RNA (예를 들어, AIM mRNA 의 상보 사슬 전장 등) 를 코딩하는 DNA 발현 벡터는, 통상적인 방법에 의해 클로닝한 AIM cDNA 를, 필요에 따라서 적당한 링커 (어댑터) 서열을 통해 발현 벡터의 프로모터의 하류에 역방향으로 삽입함으로써 조제할 수 있다.
한편, siRNA 를 코딩하는 DNA 는, 센스사슬 또는 안티센스사슬을 코딩하는 DNA 로서 별개로 합성하고, 각각을 적당한 발현 벡터 중에 삽입함으로써 조제할 수 있다. siRNA 의 발현 벡터로는, U6 이나 H1 등의 Pol III 계 프로모터를 갖는 것이 사용될 수 있다. 이 경우, 그 벡터가 도입된 동물 세포 내에서, 센스사슬과 안티센스사슬이 각각 전사되어 어닐링함으로써, siRNA 가 형성된다. shRNA 는 센스사슬 및 안티센스사슬을 적당한 루프 구조를 형성할 수 있는 길이 (예를 들어 15 내지 25 염기 정도) 를 사이에 삽입한 유닛을 적당한 발현 벡터 중에 삽입함으로써 조제할 수 있다. shRNA 의 발현 벡터로는 U6 이나 H1 등의 Pol III 계 프로모터를 갖는 것이 사용될 수 있다. 이 경우, 그 발현 벡터가 도입된 동물 세포 내에서 전사된 shRNA 는, 자신이 루프를 형성한 후에, 내재된 효소 다이서 (dicer) 등에 의해서 프로세싱됨으로써 성숙 siRNA 가 형성된다. 또는, Pol II 계 프로모터로, 타겟의 siRNA 서열을 포함하는 마이크로 RNA (miRNA) 를 발현시켜 RNAi 에 의해 녹다운을 달성하는 것도 가능하다. 이 경우에는 조직 특이적 발현을 나타내는 프로모터에 의해, 조직 특이적 녹다운도 가능해진다.
AIM 의 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터를 세포에 도입하는 방법으로는, 표적 세포에 따라 자체 공지된 방법이 적절히 사용된다. 예를 들어, 수정란 등의 초기배로의 도입에 관해서는, 마이크로인젝션법이 사용된다. 또한, ES 세포로의 도입에 관해서는, 인산칼슘 공침전법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 레트로바이러스 감염법, 응집법, 마이크로인젝션법, 입자총법, DEAE-덱스트란법 등이 사용될 수 있다. 또는, 벡터로서 레트로바이러스나 렌티바이러스 등을 사용하는 경우에는, 초기배나 ES 세포에 바이러스를 첨가하고 1∼2 일 배양하여, 그 세포를 그 바이러스에 감염시킴으로써 간편하게 유전자 도입을 달성할 수 있는 경우가 있다. ES 세포로부터의 개체 재생 (파운더의 수립), 계대 (호모 접합체의 제작) 등은, 본 발명의 KO 동물에 있어서 상기한 것과 동일한 방법에 의해 실시할 수 있다.
바람직한 일 실시양태에 있어서는, AIM 의 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터는, 마이크로인젝션법에 의해 대상이 되는 비인간 포유동물의 초기배 (수정란) 에 도입된다.
수정란으로의 DNA 의 현미 주입은, 마이크로머니퓰레이터 등의 공지된 장치를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다. 간단하게 말하면, 배 배양용 배지의 미세액적 중에 넣은 수정란을 홀딩 피펫으로 흡인하여 고정시키고, 인젝션 피펫을 사용하여 DNA 용액을 수컷 또는 암컷성 전핵, 바람직하게는 수컷성 전핵 내에 직접 주입한다. 도입 DNA 는 CsCl 밀도 구배 초원심 또는 음이온 교환 수지 컬럼 등으로 고도로 정제한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 도입 DNA 는 제한 효소를 사용하여 벡터 부분을 절단하고, 직쇄상으로 해 두는 것이 바람직하다.
DNA 도입 후의 수정란은 배 배양용 배지 중에서 미세액적 배양법 등에 의해 5％ 탄산 가스/95％ 대기 하에서 1세포기∼배반포기까지 배양한 후, 가짜 임신시킨 수배용 암컷 비인간 포유동물의 난관 또는 자궁 내에 이식된다. 수배용 암컷 비인간 포유동물은 이식되는 초기배가 유래하는 동물과 동종의 것이면 되고, 예를 들어, 마우스 초기배를 이식하는 경우에는, ICR 계의 암컷 마우스 (바람직하게는 약 8∼약 10 주령) 등이 바람직하게 사용된다. 수배용 암컷 비인간 포유동물을 가짜 임신 상태로 하는 방법으로는, 예를 들어, 동종의 정관 절제 (결찰) 수컷 비인간 포유동물 (예를 들어, 마우스의 경우, ICR 계의 수컷 마우스 (바람직하게는 약 2 개월령 이상)) 과 교배시켜, 질전 (vaginal plug) 의 존재가 확인된 것을 선택하는 방법이 알려져 있다.
수배용 암컷은 자연 배란의 것을 사용해도 되고, 또는 정관 절제 (결찰) 수컷과의 교배에 앞서, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (일반적으로 LHRH 로 약기한다) 또는 그것의 유사체(analogue)를 투여하여, 수정능을 유도시킨 것을 사용해도 된다. LHRH 유사체로는, 예를 들어, [3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH, [Gln8]-LH-RH, [D-Ala6]-LH-RH, [des-Gly10]-LH-RH, [D-His(Bzl)6]-LH-RH 및 그것들의 에틸아미드 등을 들 수 있다. LHRH 또는 그것의 유사체의 투여량, 및 그 투여 후에 수컷 비인간 포유동물과 교배시키는 시기는, 비인간 포유동물의 종류에 따라서 각각 다르다. 예를 들어, 비인간 포유동물이 마우스 (바람직하게는 ICR 계의 마우스 등) 인 경우에는, 통상, LHRH 또는 그것의 유사체를 투여한 후, 약 4 일째에 수컷 마우스와 교배시키는 것이 바람직하고, LHRH 또는 그것의 유사체의 투여량은, 통상 약 10∼60㎍/개체, 바람직하게는 약 40㎍/개체이다.
통상, 이식되는 초기배가 상실배기 이후인 경우에는 수배용 암컷의 자궁에, 그보다 전 (예를 들어, 1 세포기∼8 세포기배) 이면 난관에 배 이식된다. 수배용 암컷은, 이식배의 발생 단계에 따라서 가짜 임신으로부터 임의의 일수가 경과한 것이 적절히 사용된다. 예를 들어 마우스의 경우, 2 세포기배를 이식하기 위해서는 가짜 임신 후 약 0.5 일의 암컷 마우스가, 배반포기 배를 이식하기 위해서는 가짜 임신 후 약 2.5 일의 암컷 마우스가 바람직하다. 수배용 암컷을 마취 (바람직하게는 아베르틴(Avertin), 넴부탈 등이 사용된다) 후, 절개하여 난소를 꺼내고, 배 배양용 배지에 현탁한 초기배 (약 5∼약 10 개) 를 배 이식용 피펫을 사용하여, 난관 복강구 또는 자궁각(uterine horn)의 난관 접합부 부근에 주입한다.
이식배가 수미 양호하게 착상되어 수배 암컷이 임신하면, 자연 분만 또는 제왕절개술에 의해 새끼 비인간 포유동물이 얻어진다. 자연 분만한 수배 암컷에는 그대로 포유를 계속시키면 되고, 제왕절개에 의해 출산한 경우에는, 산자는 별도 준비한 포유용 암컷 (예를 들어 마우스의 경우, 통상적으로 교배ㆍ분만한 암컷 마우스 (바람직하게는 ICR 계의 암컷 마우스 등)) 에 포유시킬 수 있다.
수정란 세포 단계에서 AIM 의 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 를 코딩하는 DNA 의 도입은, 도입 DNA 가 대상 비인간 포유동물의 생식 계열 세포 및 체세포의 전부에 존재하도록 확보된다. 도입 DNA 가 염색체 DNA 에 편입되어 있는지 여부는, 예를 들어, 산자의 꼬리 부분으로부터 분리 추출한 염색체 DNA 를 서던 혼성화 또는 PCR 법에 의해 스크리닝함으로써 검정할 수 있다. 상기한 바와 같이 하여 얻어지는 새끼 비인간 포유동물 (F0) 의 생식 계열 세포에 있어서 발현 벡터가 존재하는 것은, 그 후대 (F1) 의 동물 모두가 그 생식 계열 세포 및 체세포의 전부에 발현 벡터가 존재하는 것을 의미한다.
통상, F0 동물은 상동 염색체의 일방향에만 도입 DNA 를 갖는 헤테로 접합체로서 얻어진다. 또한, 개개의 F0 개체는 상동 재조합에 의하지 않는 한 상이한 염색체 상에 랜덤하게 삽입된다. 상동 염색체의 양방향에 발현 벡터를 갖는 호모 접합체를 얻기 위해서는, F0 동물과 비트랜스제닉 동물을 교잡하여 F1 동물을 제작하고, 상동 염색체의 일방향에만 도입 DNA 를 갖는 헤테로 접합체의 형제끼리를 교잡 하면 된다. 1 유전자 자리에만 도입 DNA 가 편입되어 있으면, 얻어지는 F2 동물의 1/4 이 호모 접합체가 된다.
벡터로서 바이러스를 사용하는 경우의 별도의 바람직한 일 실시양태로서, 상기 KO 동물의 경우와 동일하게, AIM 의 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 바이러스로, 비인간 포유동물의 초기배 또는 ES 세포를 감염시키는 방법을 들 수 있다. 세포로서 수정란을 사용하는 경우에는, 감염에 앞서 투명대를 제거해 두는 것이 바람직하다. 바이러스 벡터를 감염시키고 1∼2 일간 배양 후, 초기배라면 전술한 바와 같이 가짜 임신시킨 수배용 암컷 비인간 포유동물의 난관 또는 자궁 내에 이식하고, ES 세포라면 전술한 바와 같이 선택 약제를 첨가하여 배양을 계속하고, 벡터가 편입된 세포를 선택한다.
그리고, 프로시딩스ㆍ오브ㆍ내셔널ㆍ아카데미ㆍ오브ㆍ사이엔시즈ㆍ유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 제98권, 제13090-13095페이지, 2001년에 기재되어 있는 바와 같이, 수컷 비인간 포유동물로부터 채취한 정원 세포(spermatogonium)를 STO 배양보조세포와 공배양하는 사이에 바이러스 벡터에 감염시킨 후, 수컷성 불임 비인간 포유동물의 정세관(seminiferous tube)에 주입하여 암컷 비인간 포유동물과 교배시키는 것에 의해, 효율적으로 AIM 의 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 를 코딩하는 DNA 의 헤테로 Tg (＋/－) 산자를 얻을 수 있다.
Miyazaki T. 등. (J. Exp. Med., 189, 413-422, 1999, 또는 WO2013/162021) 에 기재된 또는 상기 수법에 의해서 취득될 수 있는 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물은, 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, 이하의 특성 :
(1) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 괴사한 요세관 세포가 축적되어, 신실질이 섬유화된다,
(2) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 사구체 구조가 붕괴되어, 사구체가 섬유화된다,
(3) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 염증성 사이토카인의 발현이 항진된다,
(4) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 마크로파지의 침윤이 항진된다,
(5) 대조 비인간 포유동물과 비교하여, AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 혈중 BUN 값이 높다,
(6) 대조 비인간 포유동물과 비교하여, AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 생존율이 낮다,
(7) AIM 투여에 의해서, 상기 (1)∼(6) 이 개선된다,
을 갖는다. 이들의 표현형은, 종래 공지된 AIM KO 마우스에 있어서는, 적어도 보고되어 있지 않다. 특히, 요관 결석, 상행성 요로 감염증, 또는 종양 등에 의한 요관의 압박ㆍ폐색을 계기로 한 급성 신장해 (급성 신부전) 에 수반되는 만성적인 신장해, 및, 종기 (tumor mass), 혈전, 또는 당뇨병, 고혈압 등에 의한 신혈관 협착ㆍ폐색에 의한 허혈성 신장해에 수반되는 만성적인 신장해의 병태와 근사한 것임은 새로운 발견이다.
(1) 대조 신장 (정상 신장, 혹은 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시하지 않은 신장을 말한다. 이하 동일) 과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 괴사한 요세관 세포가 축적되어, 신실질이 섬유화하는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서, 괴사한 요세관 세포의 축적, 및 신실질의 광범한 섬유화가 인정되는 것을 말한다. 괴사한 요세관 세포의 축적은, 예를 들어, 신조직편을 헤마톡실린ㆍ에오진 염색에 의해 확인할 수 있고, 신실질의 섬유화는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색의 동시 염색에 의해서 확인할 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, AIM 녹아웃 마우스에서는, 요관 결찰 후 14 일째에서 대조 신장과 비교하여 유의한 차가 인정되었다. 또한, 일과성 신허혈 재관류 후 7 일째로부터 대조 신장과 비교하여 유의한 차가 인정되었다.
(2) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 사구체 구조가 붕괴하여, 사구체가 섬유화하는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 사구체 구조의 붕괴와 사구체의 섬유화가 인정되는 것을 말한다. 사구체 구조의 붕괴는, 예를 들어, 신조직편을 헤마톡실린ㆍ에오진 염색에 의해서 확인할 수 있고, 사구체의 섬유화는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색의 동시 염색에 의해서 확인할 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, AIM 녹아웃 마우스에서는, 요관 결찰후 14 일째로부터 정상 신장과 비교하여 유의한 차가 인정되었다. 또한, AIM 녹아웃 마우스에서는, 일과성 신허혈 재관류 후 7 일째로부터 정상 신장과 비교하여 유의한 차가 인정되었다.
(3) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 염증성 사이토카인의 발현이 항진된다는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 MCP-1, IL-1β 및 IL-6 의 발현이 항진되는 것을 말한다. 발현의 항진은, 예를 들어, 정량적 RT-PCR 이나 노던 블로팅법 등에 의해서 확인할 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, AIM 녹아웃 마우스에서는, MCP-1 및 IL-6 는 정상 신장과 비교하여 유의한 차가 인정되고, IL-1β 에 대해서도, 발현이 높은 경향이 인정되었다.
(4) 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 마크로파지의 침윤이 항진된다는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 신장과 비교하여, 요관 결찰 또는 일과성 신허혈 재관류를 실시한 신장에 있어서 마크로파지 (Mac-1 양성 세포) 의 수가 많은 것을 말한다. 세포수의 카운트는, 예를 들어, 유세포 분석기 등에 의해서 Mac-1 양성 세포를 식별함으로써 확인할 수 있다. 후술하는 실시예에 있어서는, AIM 녹아웃 마우스에서는, 정상 신장과 비교하여 마크로파지의 비율이 높은 것이 확인되었다.
(5) 대조 비인간 포유동물과 비교하여, AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 혈중 BUN 값이 높은 값이다란, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 비인간 포유동물과 비교하여, AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 혈중 BUN 값이 높은 것을 말한다.
(6) 대조 비인간 포유동물과 비교하여, AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 생존율이 낮다는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 대조 비인간 포유동물과 비교하여, 생존율이 낮아지는 것을 말한다.
(7) AIM 투여에 의해서, 상기 (1)∼(6) 이 개선된다는 것은, 본 발명의 AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 후, AIM 투여에 의해서 BUN 값에 유의한 저하가 인정되는 것과, 괴사한 요세관 세포의 축적과 사구체 구조의 붕괴, 또한 그것들에 수반되는 신실질 및 사구체의 섬유화가 명료하게 개선되는 것, 염증성 사이토카인의 발현이 저하되는 것, 생존율이 개선되는 것, 마크로파지의 침윤을 억제하는 것을 말한다.
이러한 지견들은, AIM 발현 부전 비인간 포유동물을 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써, 신질환의 모델 동물로서 유용한 것을 나타내고, 나아가 신질환의 예방ㆍ치료약의 스크리닝에 사용할 수 있는 것을 나타낸다. 구체적으로는, 본 발명의 스크리닝 방법은 이하의 공정을 포함한다.
(1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 피검물질을 투여하는 공정,
(2) 피검물질이 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
(i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
(ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
(iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
(iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
(v) BUN 값,
(vi) 생존율,
(3) 피검물질 비투여의 경우와 비교하여, 상기 특성 중 어느 1 항목 이상이 개선되는 피검물질을 선택하는 공정.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 편측 요관 결찰이란, 편측의 신장의 요관을 결찰하는 것을 말한다. 요관 결찰에 의해, 결찰을 실시한 신장의 신실질의 요세관 및 사구체의 괴사를 유도하고, 그것에 이어 염증이나 섬유화를 발생시켜, 최종적으로 그 신장을 기능 부전으로 할 수 있다. 또한, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류란, 미리 한쪽 신장을 적출하고, 2 주 후에 남은 신장측의 신동맥을 결찰함으로써 허혈을 유도하고, 30 분후 결찰을 해제하여 혈류의 재관류를 실시하는 것을 말한다. 이 일과성의 허혈을 위해 요세관의 괴사가 경도의 섬유화를 동반하여 3 일 정도 진행되고, 그것에 따라서 신기능이 악화된다. 또한, 양측성의 일과성 신허혈 재관류란, 한쪽의 신장을 적출하지 않고서, 양쪽 신장의 신동맥을 결찰함으로써 허혈을 유도하고, 30 분후 결찰을 해제하여 혈류의 재관류를 실시하는 것을 말한다.
AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 투여되는 피검물질로는, 단백질, 펩티드, 항체, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액, 혈장 등이 사용되어도 된다. 피검물질을 투여하는 시기는, 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류의 전이어도 되고, 동시여도 되며, 또는 AIM 발현 부전 비인간 포유동물이 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류가 실시되어, 상기한 특성이 관찰되게 된 다음부터라도 된다. 투여의 방법으로는, 경구적이거나 비경구적이어도 된다. 경구적 투여로는 사료나 음료수에 섞어 투여할 수 있다. 비경구적 투여로는, 복강내 투여, 정맥 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 주사, 점적 주사 등에 의한 투여, 좌제에 의한 직장 투여 등을 들 수 있다. 또한, 투여는 1 회 투여여도 되고 복수회 투여여도 된다.
피검물질이 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 특성은, 피검물질의 투여 후, 통상 3 또는 4 일째 이후, 바람직하게는 7 일째 이후, 보다 바람직하게는 14 일째 이후에 관찰한다. 괴사한 요세관 세포의 축적 및 그것에 따르는 신실질의 섬유화에 대해서는, 상기 포유동물로부터 적출한 신장의 신조직편을 헤마톡실린ㆍ에오진 염색, 또는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색하고, 그 염색 정도를 수치화함으로써 관찰할 수 있다. 사구체 구조의 붕괴 및 사구체의 섬유화의 정도에 대해서는, 상기와 동일하게 상기 적출한 신장의 신조직편을 헤마톡실린ㆍ에오진 염색 또는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색하고, 그 염색 정도를 수치화함으로써 관찰할 수 있다. 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량에 대해서는, 정량적 RT-PCR 등으로 측정할 수 있다. 여기서, 측정하는 염증성 사이토카인으로는, 예를 들어, MCP-1, IL-1β 및 IL-6 를 들 수 있다. 신장에 있어서의 마크로파지의 비율에 대해서는, 유세포 분석기 등에 의해서 Mac-1 양성 세포를 식별함으로써 확인할 수 있다. BUN 값에 대해서는, 혈중 우레아 질소 (blood urea nitrogen) 농도를 측정함으로써 관찰할 수 있다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 상기 특성의 관찰 결과에 관해서, 피검물질 비투여의 경우와 비교한다. 또는, 상기 특성에 관해서 신질환의 유무와의 상관도를 미리 작성해 두고, 얻어진 상기 특성의 관찰 결과를 그 상관도와 비교해도 된다. 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 실시된다.
그리고, 얻어진 상기 특성의 관찰 결과가 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 개선되는 경우에는, 그 피검물질을 신질환의 예방ㆍ치료제로서 선택할 수 있다. 여기서 개선된다는 것은, (i) 괴사한 요세관 세포의 축적의 정도 (헤마톡실린ㆍ에오진 염색, 또는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색의 정도) 가 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 낮은 것, (ii) 사구체 구조의 붕괴의 정도 (헤마톡실린ㆍ에오진 염색, 또는 Azan 염색 및 헤마톡실린 염색의 정도) 가 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 낮은 것, (iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량이 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 낮은 것, (iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율이 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 낮은 것, (v) BUN 값이 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 낮은 것, (vi) 생존율이 피검물질 비투여의 경우와 비교하여 유의하게 높은 것을 말한다.
상기 선택된 피검물질을 신질환의 예방ㆍ치료제로서 사용하는 경우, 본 발명의 AIM 류와 동일하게 제제화되고, 동일한 투여 경로ㆍ용량으로 투여할 수 있다. 그 예방ㆍ치료제의 대상이 되는 신질환에 대해서도, 상기와 동일할 수 있다.
또한, AIM 발현 부전 비인간 포유동물은 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, 신질환의 모델 동물로서 유용하다는 점에서, 그 포유동물은 신질환의 예방ㆍ치료약의 평가 방법에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용하는, 신질환 예방ㆍ치료제의 예방 치료 효과의 평가 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 평가 방법은, 이하의 공정을 포함한다.
(1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하에서, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 신질환 예방ㆍ치료제를 투여하는 공정,
(2) 신질환 예방ㆍ치료제가 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
(i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
(ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
(iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
(iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
(v) BUN 값,
(vi) 생존율,
(3) 상기 특성 중 어느 1 항목 이상을 신질환 예방ㆍ치료제 비투여의 경우와 비교하여, 신질환 예방ㆍ치료제의 효과를 평가하는 공정.
본 발명의 평가 방법에서, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 투여되는 신질환 예방ㆍ치료제로는, 공지된 신질환 예방ㆍ치료제이면 되고, 예를 들어, 강압약 (예, 안지오텐신 변환 효소 저해약, 안지오텐신 II 수용체 길항약, 칼슘 길항약, 레닌 저해약, α 차단약, β 차단약 등) ; 이뇨약 (예, 탄산 탈수소 효소 저해약, 루프 이뇨제, 싸이아자이드계 이뇨약, 항알도스테론약, 칼륨 보존 이뇨약 등) ; 활성형 비타민 D3 제제 (예, 칼시트리올, 알파칼시돌, 막사칼시톨, 팔레칼시트리올 등) ; 경구 흡착 탄소 제제 (예, 활성탄 등) ; 칼륨 보정약 (예, 폴리스티렌술폰산나트륨 등) ; 인 흡착약 (예, 탄산칼슘, 아세트산칼슘, 염산 세벨라머, 탄산란탄 등), 적혈구 조혈 자극 인자 제제 (erythropoiesis stimulating agent ; ESA) (예, 에리스로포이에틴 제제), 아미노산 수액 제제 등을 들 수 있지만, 그것들로 제한되지 않는다. 신질환 예방ㆍ치료제의 투여 시기, 투여 방법, 투여 횟수 등은 상기한 스크리닝 방법과 동일하면 된다.
본 발명의 평가 방법에서 관찰되는 특성의 관찰 방법은, 상기 스크리닝 방법에 있어서의 기재에 따라서 실시하면 된다. 또한, 그 평가 방법에 대해서, 얻어진 상기 특성의 관찰 결과가 신질환 예방ㆍ치료제 비투여의 경우와 비교하여 개선되는 정도가 클수록, 그 피검물질을 신질환의 예방ㆍ치료제로서 예방ㆍ치료 효과가 높다고 평가할 수 있다. 여기서 개선된다는 것은 상기와 동일하면 된다.
또한, 본 발명의 후술하는 실시예에 있어서, 만성 신질환 환자의 혈중 AIM 농도가 신기능 (eGFR : 사구체 여과량) 과 상관되어 있음이 확인되었다. 특히, 혈중 AIM 농도가 일정량보다 낮은 만성 신질환 환자는, 2∼3 년 후에 있어서 신기능의 악화가 확인되었다. 이상의 사실로부터, 피험자의 혈중 AIM 농도를 측정함으로써, 만성 신질환 환자의 예후를 예측할 수 있는 것이 시사된다. 따라서, 본 발명은 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 신질환 환자의 예후의 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 예측 방법을 적용할 수 있는 피험자는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 급성 신부전 또는 만성 신질환의 발증 우려가 있거나, 또는 발증되어 있는 것이 의심되는 피험자를 들 수 있다. 만성 신질환으로는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증 등이 포함된다.
본 발명의 예측 방법에 사용되는 시료로는, 상기 피험자로부터 채취되는 것으로서, 측정 대상인 AIM 유전자 산물 (예, RNA, 단백질, 그 분해 산물 등) 을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 요(尿), 땀, 타액, 관절액 등의 체액 혹은 그것들의 단편, 또는 그것들에 함유되는 세포, 특히 마크로파지 등을 들 수 있고, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청을 들 수 있다.
피험자로부터 채취한 시료에 있어서의 AIM 농도의 측정은, 상기 시료로부터 RNA (예 : 전 RNA, mRNA) 분획을 조제하고, 그 분획 중에 포함되는 AIM 유전자의 전사 산물을 측정함으로써 조사할 수 있다. RNA 분획의 조제는, 구아니딘-CsCl 초원심법, AGPC 법 등 공지된 수법을 사용하여 실시할 수 있지만, 시판되는 RNA 추출용 키트 (예 : RNeasy Mini Kit ; QIAGEN 제 등) 를 사용하여, 미량의 마크로파지로부터 신속하면서 간편하게 고순도의 전 RNA 를 조제할 수 있다. RNA 분획 중의 AIM 유전자의 전사 산물을 검출하는 수단으로는, 예를 들어, 혼성화 (노던 블롯, 도트 블롯, DNA 칩 해석 등) 을 사용하는 방법, 또는 PCR (RT-PCR, 경합 PCR, 리얼타임 PCR 등) 을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 미량의 마크로파지로부터 신속하면서 간편하게 양호한 정량성으로 AIM 유전자의 발현 변동을 검출할 수 있다는 점에서 경합 PCR 이나 리얼타임 PCR 등의 정량적 PCR 법이 바람직하다.
노던 블롯 또는 도트 블롯 혼성화에 의한 경우, AIM 유전자의 전사 산물의 측정은, 그 유전자의 전사 산물과 혼성화할 수 있는 핵산 (프로브) 을 사용하여 실시할 수 있다. 그와 같은 핵산으로는, AIM 유전자의 전사 산물에 나타내는 염기 서열 (예를 들어, 서열 번호 : 1 로 표시되는 염기 서열) 을 포함하는 핵산과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 핵산을 들 수 있다. 매우 엄격한 조건이란, 상기한 조건 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, AIM 유전자의 전사 산물에 나타내는 염기 서열 (예를 들어, 서열 번호 : 1 로 표시되는 염기 서열) 과 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.
프로브로서 사용되는 핵산은, 이중 가닥이어도 되고 외가닥이어도 된다. 이중 가닥의 경우에는, 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA : RNA 의 하이브리드여도 된다. 외가닥의 경우에는, 안티센스사슬을 사용할 수 있다. 그 핵산의 길이는 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있는 한 특별히 제한은 없고, 예를 들어 약 15 염기 이상, 바람직하게는 약 30 염기 이상이다. 그 핵산은, 표적 핵산의 검출ㆍ정량을 가능하게 하기 위해서, 표지제에 의해 표지되어 있는 것이 바람직하다. 표지제로는, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성 동위 원소로는, 예를 들어, 〔32P〕,〔3H〕,〔14C〕 등이 사용된다. 효소로는, 안정적이고 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예를 들어, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소 효소 등이 사용된다. 형광물질로는, 예를 들어, 플루오레스카민, 플루오레신 이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광물질로는, 예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 프로브와 표지제의 결합에 비오틴-(스트렙트)아비딘을 사용할 수도 있다.
노던 혼성화에 의한 경우에는, 상기한 바와 같이 하여 조제한 RNA 분획을 겔 전기 영동으로 분리한 후, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴디플루오라이드 등의 멤브레인에 전사하고, 상기한 바와 같이 하여 조제된 표지 프로브를 포함하는 혼성화 완충액 중, 상기 매우 엄격한 조건하에서 혼성화시킨 후, 적당한 방법으로 멤브레인에 결합한 표지량을 밴드마다 측정함으로써, AIM 유전자의 발현량을 측정할 수 있다. 도트 블롯의 경우에도, RNA 분획을 스폿한 멤브레인을 마찬가지로 혼성화 반응에 사용하여, 스폿의 표지량을 측정함으로써, AIM 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.
별도의 바람직한 실시양태에 의하면, AIM 농도를 측정하는 방법으로서 정량적 PCR 법이 사용된다. 정량적 PCR 로는, 예를 들어, 경합 PCR 이나 리얼타임 PCR 등이 있다.
PCR 에 있어서 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 세트로는, AIM 유전자 전사 산물의 센스사슬 (코딩사슬) 및 안티센스사슬 (논코딩사슬) 과 각각 특이적으로 혼성화할 수 있고, 그들 사이에 끼워지는 DNA 단편을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없으며, 예를 들어, 각각 약 15∼약 100 염기, 바람직하게는 각각 약 15∼약 50 염기의 길이를 갖고, 약 100 bp∼1 kbp 의 DNA 단편을 증폭하도록 디자인된 올리고 DNA 의 세트를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 세트로는, 서열 번호 : 1 에 나타내는 염기 서열을 포함하는 핵산 (센스사슬) 과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 핵산, 및 상기한 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산 (안티센스사슬) 과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 핵산을 들 수 있다. 여기서 매우 엄격한 조건이란 상기와 동일한 의미이다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 : 1 에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 그 핵산의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.
경합 RT-PCR 이란, 원하는 DNA 를 증폭할 수 있는 프라이머의 세트에 의해 증폭될 수 있는 양을 이미 알고 있는 다른 주형 핵산을 경쟁자(competitor) 로서 반응액 중에 공존시켜 경합적으로 증폭 반응을 일으키고, 증폭 산물의 양을 비교함으로써, 목적 DNA 의 양을 산출하는 방법을 말한다. 따라서, 경합 RT-PCR 에 의한 경우, 상기한 프라이머 세트에 추가하여 그 프라이머 세트에 의해 증폭시킬 수 있고, 증폭 후에 표적 핵산 (즉, AIM 유전자의 전사 산물) 의 증폭 산물과 구별할 수 있는 (예를 들어, 증폭사이즈가 다르거나, 제한 효소 처리 단편의 영동 패턴이 다른 것 등) 양을 이미 알고 있는 경쟁자 핵산이 사용된다. 표적 핵산과 경쟁자 핵산은 프라이머를 서로 빼앗아 증폭이 경합적으로 일어나기 때문에, 증폭 산물의 양비(quantitative ratio)가 원래의 주형의 양비를 반영하게 된다. 경쟁자 핵산은 DNA 여도 되고 RNA 여도 된다. DNA 의 경우, 상기한 바와 같이 하여 조제되는 RNA 분획으로부터 역전사 반응에 의해 cDNA 를 합성한 후에, 상기 프라이머 세트 및 경쟁자의 공존하에서 PCR 을 실시하면 되고, RNA 의 경우에는, RNA 분획에 경쟁자를 첨가하여 역전사 반응을 실시하고, 또한 상기 프라이머 세트를 첨가하여 PCR 을 실시하면 된다. 후자의 경우, 역전사 반응의 효율도 고려에 넣고 있기 때문에, 원래의 mRNA 의 절대량을 추정할 수 있다.
한편, 리얼타임 PCR 은, 형광 시약을 사용하여 증폭량을 리얼타임으로 모니터링하는 방법으로, 써멀 사이클러와 분광 형광 광도계를 일체화한 장치를 필요로 한다. 이러한 장치는 시판되고 있다. 사용하는 형광 시약에 따라 몇가지 방법이 있고, 예를 들어, 인터칼레이터법, TaqManTM 프로브법, Molecular Beacon 법 등을 들 수 있다. 모두, 상기한 바와 같이 하여 조제되는 RNA 분획으로부터 역전사 반응에 의해 cDNA 를 합성한 후에, 상기 프라이머 세트와 SYBR Green I, 에티듐브로마이드 등의 이중 가닥 DNA 에 결합함으로써 형광을 발하는 시약 (인터칼레이터), 상기 프로브로서 사용할 수 있는 핵산 (단, 그 핵산은 증폭 영역 내에서 표적 핵산에 하이브리다이즈한다) 의 양단을 각각 형광물질 (예 : FAM, HEX, TET, FITC 등) 및 소광물질 (예 : TAMRA, DABCYL 등) 로 수식한 것 (TaqManTM 프로브 또는 Molecular Beacon 프로브) 등의 형광 시약 (프로브) 을, 각각 PCR 반응계에 첨가한다고 하는 것이다. 인터칼레이터는 합성된 이중 가닥 DNA 에 결합하여 여기광의 조사에 의해 형광을 발하기 때문에, 형광 강도를 측정함으로써 증폭 산물의 생성량을 모니터링할 수 있고, 그것에 의해 원래의 주형 cDNA 양을 추정할 수 있다. TaqManTM 프로브는 양단을 형광물질과 소광물질로 각각 수식한 표적 핵산의 증폭 영역에 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드이고, 어닐링시에 표적 핵산에 하이브리다이즈하지만 소광물질의 존재에 의해 형광을 발하지 않고, 신장 반응시에 DNA 폴리메라아제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해되어 형광물질이 유리됨으로써 형광을 발한다. 따라서, 형광 강도를 측정함으로써 증폭 산물의 생성량을 모니터링할 수 있고, 그것에 의해 원래의 주형 cDNA 양을 추정할 수 있다. Molecular Beacon 프로브는 양단을 형광물질과 소광물질 각각으로 수식한, 표적 핵산의 증폭 영역에 하이브리다이즈할 수 있음과 함께 헤어핀형 2 차 구조를 취할 수 있는 올리고뉴클레오티드로, 헤어핀 구조를 취하고 있을 때에는 소광물질의 존재에 의해 형광을 발하지 않고, 어닐링시에 표적 핵산에 하이브리다이즈하여 형광물질과 소광물질의 거리가 넓어짐으로써 형광을 발한다. 따라서, 형광 강도를 측정함으로써 증폭 산물의 생성량을 모니터링할 수 있고, 그것에 의해 원래의 주형 cDNA 양을 추정할 수 있다. 리얼타임 RT-PCR 은, PCR 의 증폭량을 리얼타임으로 모니터링할 수 있기 때문에, 전기영동이 불필요하여, 보다 신속하게 AIM 유전자의 발현 해석이 가능하다.
별도의 양태로는, 피험자로부터 채취한 시료에 있어서의 AIM 농도의 측정은, 그 시료로부터 단백질 분획을 조제하고, 그 분획 중에 포함되는 AIM 을 검출함으로써 조사할 수 있다. AIM 의 검출은, AIM 에 대한 항체를 사용하여, 면역학적 측정법 (예 : ELISA, FIA, RIA, 웨스턴 블롯 등) 에 의해서 실시할 수 있다. 또는, AIM 의 검출은, MALDI-TOFMS 등의 질량 분석법을 사용해도 실시할 수 있다.
한편, AIM 에 대한 항체는, 서열 번호 : 2 또는 서열 번호 : 4 로 나타내는 아미노산 서열과, 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 부분 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 감작 항원으로 하여, 통상 사용되는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 제작 기술에 따라서 취득할 수 있다.
개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 진단 방법에 적용하는 데 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 더하여 AIM 의 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술 수단의 상세에 관해서는, 총설, 성서 (成書) 등을 참조할 수 있다. 예를 들어, 이리에히로시 편 「래디오이뮤노어세이」 (강담사, 1974년 발행), 이리에히로시 편 「속래디오이뮤노어세이」 (강담사, 1979년 발행), 이시카와에이지 외 편「효소 면역 측정법」 (의학서원, 1978년 발행), 이시카와에이지 외 편「효소 면역 측정법」 (제2판) (의학서원, 1982년 발행), 이시카와에이지 외 편「효소 면역 측정법」 (제3판) (의학서원, 1987년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 동서 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 동서 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays)), 동서 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹프레스사 발행) 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 예측 방법에 있어서, 구체적으로는, 이하의 공정을 포함하는 방법이어도 된다.
(1) 건강한 정상인 및 피험자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 공정,
(2) 건강한 정상인에서 측정된 AIM 농도와 피험자에서 측정된 AIM 농도를 비교하는 공정.
전술한 바와 같이, 본 발명의 AIM 은, 만성 신질환 환자에 있어서 혈중 농도가 일정 수준보다 낮은 만성 신질환 환자는, 2∼3년 후에 있어서 신기능이 악화된다. 따라서, 상기한 바와 같이 하여 AIM 농도를 측정한 결과, 건강한 정상인 또는 일정 수준과 비교하여 저하되어 있는 경우, 피험자의 만성 신질환이 장래적으로 악화될 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 또는, 만성 신질환의 악화와 AIM 농도의 상관도를 미리 작성해 두고, 얻어진 측정 결과를 그 상관도와 비교해도 된다. 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 실시된다.
또한, 본 발명의 예측 방법은, 상기 (1), (2) 의 공정에 추가하여, (3) 피험자에 있어서 AIM 농도가 건강한 정상인과 비교하여 유의하게 높았던 경우에는, 피험자의 만성 신질환이 장래적으로 악화될 가능성이 높은 것으로 판단하는 공정을 포함해도 된다.
그리고, 본 발명의 후술하는 실시예에 있어서, 급성 신부전나 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시한 마우스에 있어서, 건강한 정상 개체와 비교하여, 요중에 유의하게 높은 농도의 AIM 이 인정되었다. 이상의 사실로부터, 피험자의 요중 AIM 농도를 측정함으로써, 급성 신부전을 검사할 수 있음이 시사된다. 따라서, 본 발명은, 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 급성 신부전의 검사 방법을 제공한다.
본 발명의 검사 방법을 적용할 수 있는 피험자는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 급성 신부전을 발증할 우려가 있거나, 또는 발증되어 있는 것이 의심되는 피험자를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 검사 방법에 사용되는 시료로는, 본 발명의 신질환 환자의 예후의 예측 방법에 있어서 기재된 바와 같지만, 바람직하게는, 요를 들 수 있다. 또한, 피험자로부터 채취한 시료에 있어서의 AIM 농도의 측정은, 본 발명의 신질환 환자의 예후의 예측 방법에 있어서 기재된 바와 같다.
본 발명의 검사 방법에 있어서, 구체적으로는, 이하의 공정을 포함하는 방법이어도 된다.
(1) 건강한 정상인 및 피험자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 공정,
(2) 건강한 정상인에서 측정된 AIM 농도와 피험자에서 측정된 AIM 농도를 비교하는 공정.
전술한 바와 같이, 본 발명의 AIM 은, 급성 신부전 환자에 있어서 요중 농도가 건강한 정상인보다 유의하게 높다. 따라서, 상기한 바와 같이 하여, AIM 농도를 측정한 결과, 건강한 정상인과 비교하여 유의하게 높은 경우, 피험자가 급성 신부전을 앓고 있다고 판정할 수 있다. 또는, 급성 신부전과 AIM 농도의 상관도를 미리 작성해 두고, 얻어진 측정 결과를 그 상관도와 비교해도 된다. 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 실시된다.
또한, 본 발명의 검사 방법은, 상기 (1), (2) 의 공정에 추가하여, (3) 피험자에 있어서 AIM 농도가 건강한 정상인과 비교하여 유의하게 높았던 경우에는, 피험자가 급성 신부전을 앓고 있다고 판단하는 공정을 포함해도 된다.
나아가 본 발명은, 신질환의 진단 또는 예후의 예측 키트에도 미친다. 그 키트는, 상기 서술한 본 발명의 검사 방법 또는 예측 방법을 간편하게 실시하기 위한 키트이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 그 키트는,
(a) AIM 유전자의 전사 산물과 혼성화할 수 있는 핵산 프로브 또는 핵산 프라이머, 및/또는
(b) AIM 에 대한 항체
를 함유하여 이루어진다. 그 키트가 2 이상의 상기 핵산 및/또는 항체를 포함하는 경우, 각 핵산 또는 항체는 서로 AIM 유전자의 염기 서열 상의 다른 부분을 특이적으로 인식, 또는 AIM 유전자의 번역 산물이 다른 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 것이다.
본 발명의 키트가 상기 (a) 의 핵산을 함유하는 시약을 구성으로서 포함하는 경우, 그 핵산으로는, 본 발명의 검사 방법 또는 예측 방법에 있어서 상기한 프로브용 핵산 또는 프라이머용 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
AIM 유전자의 발현을 검출할 수 있는 핵산은, 건조한 상태 또는 알코올 침전의 상태로, 고체로서 제공할 수도 있고, 물 또는 적당한 완충액 (예 : TE 완충액 등) 중에 용해된 상태로 제공할 수도 있다. 표지 프로브로서 사용되는 경우, 그 핵산은 미리 상기 중 어느 것의 표지 물질에 의해 표지된 상태로 제공할 수도 있고, 표지 물질과 각각 별개로 제공되어, 사용시 표지하여 사용할 수도 있다.
또는, 그 핵산은 적당한 고상으로 고정화된 상태로 제공할 수도 있다. 고상으로는, 예를 들어, 유리, 규소, 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리비닐리덴디플루오라이드 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 고정화 수단으로는, 미리 핵산에 아미노기, 알데히드기, SH 기, 비오틴 등의 관능기를 도입해 두고, 한편, 고상 상에도 그 핵산과 반응할 수 있는 관능기 (예 : 알데히드기, 아미노기, SH 기, 스트렙토아비딘 등) 를 도입하여, 양 관능기 사이의 공유 결합으로 고상과 핵산을 가교하거나, 폴리아니온성의 핵산에 대하여, 고상을 폴리카티온 코팅하여 정전 결합을 이용해서 핵산을 고정화하는 등의 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
그 키트에 함유되는 핵산은, 동일 방법 (예 : 노던 블롯, 도트 블롯, DNA 어레이 기술, 정량 RT-PCR 등) 에 의해 AIM 유전자의 발현을 검출할 수 있도록 구축되어 있는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 키트가 상기 (b) 의 항체를 함유하는 시약을 구성으로서 포함하는 경우, 그 항체로는, 본 발명의 검사 방법 또는 예측 방법에 있어서 상기한 항체를 들 수 있다.
본 발명의 키트를 구성하는 시약은, AIM 유전자의 발현을 검출할 수 있는 핵산이나 항체에 더하여, 그 유전자의 발현을 검출하기 위한 반응에 있어서 필요한 다른 물질로서, 공존 상태로 보존함으로써 반응에 악영향을 미치지 않는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 또는, 그 시약은, AIM 유전자의 발현을 검출하기 위한 반응에 있어서 필요한 다른 물질을 함유하는 별개의 시약과 동시에 제공되어도 된다. 예를 들어, AIM 유전자의 발현을 검출하기 위한 반응이 PCR 인 경우, 해당 다른 물질로는, 예를 들어, 반응 완충액, dNTPs, 내열성 DNA 폴리메라아제 등을 들 수 있다. 경합 PCR 이나 리얼타임 PCR 을 사용하는 경우에는, 경쟁자(competitor) 핵산이나 형광 시약 (상기 인터칼레이터나 형광 프로브 등) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, AIM 유전자의 발현을 검출하기 위한 반응이 항원 항체 반응인 경우, 해당 다른 물질로는, 예를 들어, 반응 완충액, 경쟁자(competitor) 항체, 표지된 이차 항체 (예를 들어, 일차 항체가 토끼 항인간 AIM 항체인 경우, 퍼옥시다아제나 알칼리포스파타아제 등으로 표지된 마우스 항토끼 IgG 등), 블로킹액 등을 들 수 있다.
본원 명세서의 서열표의 서열 번호는, 이하의 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 1〕
인간 AIM 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 2〕
인간 AIM 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 3〕
고양이 AIM 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 4〕
고양이 AIM 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 5〕
고양이 AIM 의 전사 산물의 상보적 서열을 나타낸다.
〔서열 번호 : 6〕
마우스 AIM 의 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예
이하에 있어서, 실시예 및 참고예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : AIM 에 의한 만성 신부전 또는 신섬유화의 진행 억제
동물을 사용한, 다용되는 신질환 모델의 하나로 편측 요관 결찰술 (UUO) 모델이 있다. 이것은, 편측의 요관을 결찰함으로써, 결찰을 실시한 신실질의 요세관 및 사구체가 서서히 괴사되고, 그것에 계속해서 염증이나 섬유화가 일어나, 최종적으로는 그 신장은 기능 부전이 된다. AIM 결손 마우스 (AIM-KO) 와 야생형 마우스 (WT) 에 각각 UUO 를 시술하고, 경과를 관찰하였다 (n=6 for each) (도 1A). 정상 콩팥의 구조는 WT, AIM-KO 모두 전혀 차이는 없었다. 그러나, 14 일째의 UUO 콩팥에 있어서, 섬유를 염색하는 Azan 염색과 헤마톡실린 염색을 동시에 실시하면, WT 에서는 섬유화의 확산이 보이지만, 상당수의 사구체 및 요세관은 아직 정상 구조를 유지하고, 괴사에 이르지 않은 요세관도 많이 볼 수 있었다. 그에 반하여 AIM-KO 에서는, 괴사한 요세관 세포가 광범위하게 축적되고, 사구체 구조도 파괴되어 있고, 신실질의 구조가 어느새 붕괴되어 있었다. 관찰한 모든 마우스에서 동일한 결과가 얻어졌다.
또한 동일하게, AIM-KO 와 WT 마우스에게 각각 UUO 를 시술하여, 14 일째에서 HE, PAS, Azan 염색에 의해서 신장을 관찰하였다 (n=6 for each) (도 1B). WT 에서는 섬유화의 확산이 보이지만, 상당수의 사구체 및 요세관은 아직 정상 구조를 유지하고 있었다 (HE, Azan 염색). 한편 AIM-KO 에서는, 섬유화가 진행되고, 사구체 구조는 파괴되어 있고, 신실질의 구조가 어느새 붕괴되어 있었다. PAS 염색에서는, AIM-KO 마우스에서 요세관 내외로 괴사한 세포괴 (PAS 양성) 가 광범위하게 축적되어 있었다. 관찰한 모든 마우스에서 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 2 : AIM 에 의한 급성 신부전 (day7 까지) 으로부터 신장해의 만성화 (만성 신부전화) (day14) 의 진행 억제
별도의 신질환 모델로 일과성 신허혈 재관류 (IR) 모델이 있다. 일과성 신허혈 재관류에서는, 미리 일방의 신장을 적출해 두고, 남은 신장측의 신동맥을 결찰하여 허혈로 한다. 30 분후 결찰을 해제하여 혈류의 재관류를 실시하는데, 이 일과성의 허혈로 인해 요세관의 괴사가 경도의 섬유화를 동반하여 3 일간 정도 진행되고, 그것에 따라서 신기능이 악화된다. AIM 결손 마우스 (AIM-KO) 와 야생형 마우스 (WT) 에 각각 IR 을 시술하여, 경과를 관찰하였다 (도 2). WT 에서는, 신기능의 악화 후, 괴사한 세포가 제거되고, 괴사되지 않은 요세관이 급속히 분열하여, 14일후에는 거의 정상의 요세관 구조를 회복하였다. 그것과 병행하여, 신기능도 정상화되었다. 그런데, AIM-KO 에서는, 초기의 요세관의 데미지의 정도는 WT 와 차이가 보이지 않지만, 괴사한 세포의 제거가 진행되지 않아, 괴사 세포가 축적되었다. 괴사 세포의 제거가 진행되지 않기 때문에, 새로운 요세관 세포의 분열은 억제되고, 2차적인 염증이나 섬유화가 진행되었다. N=6 으로 실험을 실시하였는데, 모든 마우스에서 동일한 결과가 얻어졌다. 즉, 실시예 1 과 실시예 2 의 결과로부터, AIM 이 없으면 괴사한 요세관 세포가 축적되어, 신장의 구조ㆍ기능 수복이 현저히 손상되는 것이 분명해졌다.
실시예 3 : AIM 에 의한 급성 신부전 후의 염증의 지연 (신장해의 만성화) 억제
실시예 2에서 실시한 일과성 신허혈 재관류 (IR) 를 야생형 마우스 (WT) 및 AIM 결손 마우스 (AIM-KO) 에 시술하고, 시술 후의 염증성 마크로파지의 침윤을 마크로파지 마커인 F4/80 의 면역 염색에 의해서 관찰하였다 (도 3A). 시술 후 3 일째에서는 WT 와 비교하여 AIM KO 마우스에서는, F4/80 양성의 마크로파지의 침윤이 명확하게 항진되었다. 또한, 시술 후 14 일째에서 WT 에서는 마크로파지의 침윤은 경감되었지만, AIM KO 마우스에서는 더욱 증악되었다. 이 마크로파지 침윤의 경과에 수반하여, 염증성 사이토카인의 하나인 MCP-1 의 발현도 동일하게 AIM KO 마우스 신장에서 유의하게 증가하고 있는 것이, 정량적(quantitative) RT-PCR 의 실험에 의해 분명해졌다 (도 3B). N=6 으로 실험을 하였는데, 모든 마우스에서 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 4 : AIM 에 의한 급성 신부전의 회복
AIM-KO 마우스에게 실시예 2 에서 실시한 IR 을 시술하고, 신기능이 일과성으로 가장 악화되는 3 일째 및 4 일째, 7 일째에 각각 재조합 AIM (rAIM) 또는 PBS 를 100㎍ 복강내 투여하여 (n=6 for each), 경과를 관찰하였다 (도 4). PBS 를 투여한 군에서는, 실시예 2 의 결과와 동일하게 그 후 괴사 세포의 축적이나 사구체의 파괴 등 진행되고, 신기능 (BUN 값) 도 3 일째부터는 어느 정도 개선되지만 정상치로 복구되지는 않고, 후반에 서서히 악화의 경향을 보였다. 그러나, rAIM 을 투여한 군에서는, 3 일째의 rAIM 투여 후에 BUN 값은 유의하게 개선되고, 7 일째에는 이미 정상 범위로 되돌아가며, 그 후에도 더욱 저하되었다. 조직학적으로도, 7 일째에는 괴사한 요세관 세포는 제거되어 있고, 신실질의 구조도 정상화되었다. 즉, AIM 투여는 괴사 세포의 제거를 항진시키고, 요세관의 재생을 재촉하여, 신기능을 회복할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 5 : 급성 신부전에 의해 괴사한 요세관 상피 세포괴에 대한 AIM 의 부착과 괴사소의 제거
AIM-KO 마우스에게 실시예 2 에서 실시한 IR 을 시술하고, 시술 후 rAIM (100㎍) 을 정맥 투여하고, 3, 6, 12 시간 후에 신장의 절편을 항 AIM 항체로 염색하였다. AIM 투여 후 3 시간에서, 요세관의 괴사 부분에 AIM 이 강하게 부착되어 있는 것이 확인되었다 (도 5 상단 : phase-contrast 에 의한 사진 중, 괴사소를 N 으로 가리키고 있다. 도 5 하단 : AIM 시그널 (화살 머리) 은 괴사소와 겹쳐서 관찰되었다). 또한, 시간 경과와 함께, 괴사소 부분은 축소되고, 12 시간 후에는 거의 흔적 정도밖에 확인되지 않았다. 즉, AIM 에 의한 IR 후의 신기능 회복 (실시예 4) 은, 괴사소에 AIM 이 부착됨으로써 그 제거를 재촉하고, 그것에 수반하여 염증의 억제 나아가서는 조직 재생이 진행되고 있던 것으로 생각된다.
실시예 6 : 급성 신부전 후의 요중 AIM 의 출현
일방의 신장을 적출하지 않고, 양방의 신장의 신동맥을 결찰하여 허혈로 한, 양측성의 일과성 신허혈 재관류 (IR) 를 실시한 야생형 마우스 (WT) 의 요를 IR 후 1 일째, 7 일째에 ELISA 법에 의해서 검출하였다 (도 6). 통상 상태의 마우스의 요에는 AIM 은 거의 검출되지 않았지만 (IR 전), 신장해가 가장 심한 IR 후 1 일째에서는 요중에 다량의 AIM 이 검출되었다. 신장해의 회복과 함께 요중 AIM 은 감소하였다 (IR 후 7 일째). 또, IR 에 의한 신장해시에는 배출되는 요는 희석뇨가 되기 때문에, 요중 AIM 값은 요중 크레아티닌값으로 정규화(normalization) 하였다.
실시예 7 : AIM 결손에 의한 급성 신부전의 증악 (생존율)
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하여, 생존율을 보았다 (n=8 each) (도 7). IR 후 7 일째에서, WT 는 80％ 이상 생존되어 있는 조건에서 AIM-KO 는 30％ 이하의 생존율로, 사망한 마우스의 대부분은 IR 후 3 일째까지 사망하고 있었다.
실시예 8 : 임상 스코어
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, 경시적으로 임상 스코어를 해석하였다 (도 8). 임상 스코어는, 움직임의 기민함의 결여, 눈의 혼탁, 꼬리에 있어서의 통증 자극에 대한 반응성의 저하, 털모양의 나빠짐에 관해서 각각 가점 (0 : 이상 없음, 1 : 가벼운 정도의 증상 있음, 2 : 중간 정도의 증상 있음, 3 : 무거운 정도의 증상 있음) 하여, 그 합계를 그래프화하였다. WT 에서는 IR 후 1 일째에 스코어가 최대치를 나타내고 서서히 경감되었지만, AIM-KO 에서는 스코어는 높은 값인 채로 있었다.
실시예 9 : 급성 신부전에 수반되는 신기능 장해 (BUN 값)
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, 신기능의 마커인 BUN 을 계시적으로 계측하였다 (n=8) (도 9). 실시예 8 의 임상 스코어와 동일하게, BUN 은 WT 에서는 1 일째가 피크이고 그 후 저하되지만, AIM-KO 에서는 2 일째까지 상승하고 그 후에도 뚜렷한 저하는 인정되지 않았다.
실시예 10 : 급성 신부전에 수반되는 신기능 장해 (신조직 : PAS 염색)
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, 신조직을 계시적으로 PAS 염색에 의해 해석하였다 (도 10). 실시예 8 의 임상 스코어나 실시예 9 의 BUN 값과 동일하게, 신기능 장해는, WT 에서는 1 일째가 피크이고 그 후 회복되고, 7 일째에는 정상인 요세관 구조와 brush border (솔 가장자리 ; 화살 머리) 를 가진 근위 요세관 상피가 재생되었다. 그러나 AIM-KO 에서는, 장해는 계속되고, 근위 요세관 중에 PAS 양성의 죽은 세포괴가 축적되어 있어 7 일째에 이르러도 제거되지 않았다.
실시예 11 : 급성 신부전에 의해 괴사한 요세관 상피 세포괴의 정량화
도 10 에서 인정되는 근위 요세관 중의 상피 세포의 죽은 세포괴의 면적을, 1 절편당 전체 면적에 대한 비율로서 산출함으로써 정량화하였다 (n=3∼5) (도 11). 실시예 8∼10 에서 얻어지는 지견과 동일한 추이를 나타내고 있어, AIM-KO 에서는 죽은 세포괴의 축적ㆍ잔류가 분명하였다.
실시예 12 : AIM 에 의한 급성 신부전 후의 염증의 지연 (염증성 사이토카인)
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, IR 전 및 IR 후 7 일째의 신장으로부터 RNA 를 추출하여, 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 IL-6 에 대해서 정량적 RT-PCR 로 해석을 실시하였다 (n=3 each) (도 12). 양방의 마커에 대해서 AIM-KO 에서는 WT 와 비교하여 높은 값으로, IR 에 의한 신조직 파괴에 수반되는 염증의 지연이 시사되었다.
실시예 13 : AIM 에 의한 급성 신부전 후의 염증의 지연 (침윤 마크로파지)
WT 및 AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, IR 후 7 일째의 신장을 콜라게나아제 처리한 후 유세포 분석기로 해석함으로써, 마크로파지 (Mac-1 양성 세포) 의 비율을 조사하였다 (도 13). 실시예 12 의 결과와 동일하게, AIM-KO 에서는 신장내의 마크로파지의 비율이 WT 와 비교하여 높았다. 각각 3 마리의 마우스에 대해서 해석을 실시하여, 동일한 결과를 얻었다. 도 13 은, 대표적 결과 (representative result) 를 제시하고 있다.
실시예 14 : 급성 신부전에 의해 괴사한 마우스 요세관 내 상피 세포괴에 대한 AIM 의 집적
양측성의 IR 을 실시한 WT 마우스의 신장 연속 절편에 대해서, PAS 염색 (좌) 과 항 AIM 항체에 의한 면역 염색 (우) 을 실시하였다 (도 14). 다수의 죽은 세포괴에 AIM (흰색) 이 집적되어 있는 것이 인정되었다.
실시예 15 : 급성 신부전 환자의 괴사한 요세관 내 상피 세포괴에 대한 AIM 의 집적
신경색에 의한 급성 신부전으로 사망한 인간 환자의 신장 연속 절편에 대해서, PAS 염색 (좌) 과 항 AIM 항체에 의한 면역 염색 (우) 을 실시하였다 (도 15). 실시예 14 의 IR 마우스와 마찬가지로, 많은 죽은 세포괴에 AIM (흰색) 이 집적되어 있는 것이 인정된다.
실시예 16 : 급성 신부전 환자 및 급성 신부전 마우스에 있어서의 요중 AIM 의 검출
급성 신부전 (AKI) 으로 병원으로 반송된 환자 및 건강한 정상인을 3 명씩, 또한 양측성의 IR 을 실시한 WT 마우스 5 마리에 대해서, IR 전, IR 1 일후, 및 7 일후의 요에 관해서, AIM 농도를 ELISA 에 의해 해석하였다 (도 16). 건강한 정상인의 요에는 AIM 은 거의 인정되지 않지만, AKI 환자의 요에는 인정되었다. 마우스에 있어서도, IR 이전에는 인정되지 않지만, 신장해가 현저한 IR 1 일후에서는 유의한 양의 AIM 이 요중에 인정되고, 신장해가 개선된 7 일째에서는 AIM 의 양이 감소되어 있었다.
실시예 17 : AIM 집적에 의한 요세관 내 상피 세포괴의 축소
AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, IR 후 3 일째에 200㎍ 의 rAIM 을 투여하여 경시적으로 취득한 신장 절편에 대해서, PAS 염색 및 항 AIM 항체에 의한 면역 염색을 실시하였다 (도 17). AIM 이 집적된 죽은 세포괴는 빠르게 축소되었다.
실시예 18 : in vitro phagocytosis assay (콩팥 유래 마크로파지를 사용한 실험)
AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시하고, IR 후 3 일째의 신장을 콜라게나아제 처리하여, F4/80 양성의 마크로파지를 FACS 소터를 사용하여 단리한 후, 그 탐식능을 해석하였다 (도 18). 탐식의 표적으로서, 인간 요세관 세포주인 HK2 세포를 열처리로 괴사시켜 FITC 로 라벨한 후, 리콤비넌트 AIM (rAIM) 또는 bovine serum albumin (BSA) 으로 코트한 HK2 사세포 (死細胞) 를 사용하였다. None 으로는, rAIM 로도 BSA 로도 코트하지 않은 HK2 사세포를 사용하였다. 마크로파지와 상기 3 종류의 HK2 사세포를 incubate 하여, 마크로파지 내에 받아들인 FITC 양성의 HK2 사세포를 유세포 분석기 (FACS) 에 의해 경시적으로 해석하였다. BSA 로 코트한 HK2 사세포, 또는 코트하지 않은 HK2 사세포에 대하여 rAIM 로 코트한 HK2 사세포는 보다 고효율로 마크로파지에 탐식되는 것이 나타났다.
실시예 19 : in vitro phagocytosis assay (골수 유래 마크로파지를 사용한 실험)
실시예 18 과 동일한 실험을, 탐식 세포로서 AIM-KO 유래의 골수 세포를 M-CSF 에 의해 분화시킨 마크로파지를 사용하여 실시하였다 (도 19). 실시예 18 에서는, BSA 로 코트한 HK2 사세포와 코트하지 않은 HK2 사세포에서는 탐식되는 방식에 차이가 없기 때문에, 본 실시예에서는 코트하지 않은 HK2 사세포는 사용하지 않았다. 실시예 18 의 결과와 동일하게, rAIM 으로 코트한 HK2 사세포의 탐식이 상승하였다.
실시예 20 : AIM 투여에 의한 AIM-KO 마우스의 급성 신부전 치료
AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 200㎍/마우스 또는 등용량의 PBS 를 정맥 주사하였다 (n=5 - 6). PBS 를 주사한 마우스의 생존율은 7 일째에서 40％ 이하이지만, rAIM 을 투여한 마우스에서는 100％ 로 회복되었다 (도 20).
실시예 21 : AIM 투여에 의한 임상 스코어의 회복
실시예 20의 마우스에 대해서, 실시예 8 과 동일하게 임상 스코어를 검토하였다 (도 21). rAIM 투여 후로부터 임상 스코어의 현저한 회복이 인정되었다.
실시예 22 : AIM 투여에 의한 신기능 회복
실시예 20 의 마우스에 대해서, 실시예 9 와 동일하게 경시적으로 BUN 을 측정하였다 (도 22). rAIM 투여에 의해 BUN 값의 유의한 저하가 인정되었다.
실시예 23 : AIM 투여에 의한 괴사한 요세관 내 상피 세포괴의 제거
AIM-KO 마우스에게 양측성의 IR 을 실시한 후, 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 200㎍/마우스 또는 등용량의 PBS 를 정맥 주사하여, 3 일째와 7 일째의 신장의 상태를 PAS 염색에 의해 해석하였다 (도 23). PBS 투여에서서는 근위 요세관 내 사세포가 축적되어 있지만, rAIM 을 투여한 마우스에서는 현저한 제거가 인정되고, 7 일째에는 brush border (솔 가장자리) 를 갖는 요세관 세포가 회복되었다.
실시예 24 : AIM 투여 후의 괴사한 요세관 내 상피 세포괴의 정량화
IR 후 7 일째의 신장에서, 도 23 에서 인정되는 것과 같은 근위 요세관 중의 죽은 세포괴의 면적을, 1 절편당 전체 면적에 대한 비율로서 산출함으로써 정량화하였다 (n=3 each) (도 24). rAIM 투여군에서는 죽은 세포괴의 현저한 감소가 인정되었다.
실시예 25 : AIM 투여에 의한 염증 반응의 저하 (염증성 사이토카인)
실시예 20 의 마우스에 대해서, IR 후 7 일째의 신장으로부터 RNA 를 추출하고, 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 IL-6 에 대해서 정량적 RT-PCR 로 해석을 실시하였다 (도 25). rAIM 투여군에서는 IL-1β, IL-6 모두 PBS 투여군과 비교하여 저하되어 있고, 급성 신부전에 수반되는 염증 반응도 rAIM 투여에 의해서 억제된 것이 시사되었다.
실시예 26 : 비치사성 (마일드) 의 IR 에 의한 급성 신부전에 대한 AIM 의 효과
실시예 6∼25 에서 실시한 양측성의 IR 에서는 허혈을 30 분간 실시하여, AIM-KO 에 대하여 치사율이 높은 정도의 급성 신부전을 유도하였다. 본 실시예에서는 허혈 시간을 짧게 하여 (30 분 → 25분), AIM-KO 에서도 7 일째에서의 생존율이 100％ 인 정도의 신부전을 AIM-KO 마우스에게 유도하여, 실시예 20 과 동일하게 1 일째에서 3 일째까지 rAIM 또는 PBS 를 경정맥에 주사 투여하였다. 이러한 마일드한 조건의 IR 에 있어서도, rAIM 투여에 의해서 BUN의 개선을 보다 가속시킬 수 있었다 (n=5 each) (도 26).
실시예 27 : WT 마우스에 대한 AIM 의 치료 효과
본래 내인성의 AIM 을 가지고 있는 WT 마우스에 대하여 양측성의 IR (허혈 30 분간) 을 실시하고, 실시예 20 과 동일하게 rAIM 또는 PBS 를 투여하였다 (n=5∼6). WT 에서는 본래 내인성의 AIM 에 의해 신장해는 회복되지만, rAIM 에 의해서 그 개선을 더욱 가속할 수 있었다 (도 27). rAIM 투여에 의해, 2 일째까지 상승되어 있던 BUN 값이 이미 저하되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 28 : AIM 결손에 의한 신부전의 만성화
실시예 26 과 동일한 마일드한 IR 을 WT 및 AIM-KO 마우스에게 실시하고, IR 후 28 일째의 신장의 상태를 PAS 염색 (죽은 세포괴를 보기 위해) 과 Azan 염색 (섬유화를 보기 위해) 에 의해 해석하였다 (도 28). 28 일째에서도 AIM-KO 에서는 PAS 양성의 죽은 세포괴가 WT 와 비교하여 다소 남아 있었다. 또한 AIM-KO 에서는 뚜렷한 섬유화 (Azan 양성) 가 인정되고, 요세관의 구조도 WT 와 비교하여 찌그러졌다.
실시예 29 : AIM 결손에 의한 신섬유화의 항진
실시예 28 의 마우스에 대해서, IR 후 28 일후의 신장으로부터 RNA 를 추출하고, 정량적 RT-PCR 로 4 종류의 섬유화 마커에 대해서 해석하였다 (n=4 each) (도 29). AIM-KO 에서는 WT 와 비교하여, 섬유화 마커가 모두 상승하였다.
실시예 30 : 인간 당뇨병성 만성 신부전 환자에서의 혈중 AIM 값
연령이 거의 같은, (1) 건강한 정상인 (남자 142, 여자 : 54), (2) 신장해가 없는 (Cre<1.0㎎/㎗) 당뇨병 환자 (남자 : 70, 여자 : 57), (3) 당뇨병성의 만성 신부전 환자 (남자 : 146, 여자 : 54) 에 대해서 남녀 나누어 혈중 AIM 농도를 계측하였다 (도 30). 남녀 모두, (1) 와 (2) 에서는 AIM 값에 유의차는 없지만, (3) 에서는 유의하게 낮았다.
실시예 31 : 인간 만성 신장병 환자에 있어서의 신기능와 혈중 AIM 의 상관
만성 신장질환 (CKD) 환자의 혈중 AIM 값을 해석하여, 개개의 신기능의 마커인 eGFR (사구체 여과량) 및 혈중 크레아티닌값의 상관을 조사하였다 (n=55). CKD 의 원인 질환으로는, 당뇨병성 신증, 사구체 신염, 고혈압성 신증, IgA 신증 등을 들 수 있다. 또한 남녀 혼합으로 환자 연령은 60세 이하이다. 도 31A 와 같이, 혈중 AIM 값과 신기능은 유의한 상관 관계를 나타내었다. 또, 이 해석의 시점에서 비교적 AIM 값이 높은 사람은, 2-3 년후의 추적 조사에서 신기능이 개선되어 있고, 반대로 AIM 이 낮은 값이었던 환자는 신기능이 악화되어 있었다 (도 31B). 즉, AIM 은 CKD 환자에 있어서, 현재의 신기능뿐만 아니라 예후를 예측하는 유용한 마커가 될 수 있다.
실시예 32 : 고양이에 있어서의 혈중 AIM 의 결손 (또는 현저한 저하)
개 (3 마리), 고양이 (3 마리) 및 마우스의 각각의 혈청을 항 AIM 항체 (Rab2 : 마우스 rAIM 을 토끼에게 면역하여 제작한 폴리클로날 항체. 지금까지 마우스 및 인간 AIM 을 검출하는 것이 알려져 있다) 를 사용하여, 환원 조건으로 면역 블롯을 실시하였다 (도 32A). 그 결과, 개 혈청에는 시그널을 확인할 수 있었지만, 고양이에서는 3 마리 모두 거의 시그널을 검출할 수 없었다. 이것은 항체의 문제는 아니고, 고양이 AIM cDNA 를 클로닝하여 (실시예 36 참조), pCAGGS 발현 벡터에 C 말단에 HA 태그를 붙인 형태로 편입시켜, HEK293T 세포에 발현시킨 배양 상청으로부터 항 HA 항체 칼럼을 사용하여 정제한 고양이 rAIM 단백질은, 마우스 rAIM 과 같은 정도로 본 항체를 사용한 환원 조건에서의 면역 블롯으로 검출할 수 있었다 (도 32B). 이들 결과로부터, 본 실시예에서 검토를 실시한 고양이는 기능적인 AIM mRNA 를 발현하고 있지만, 혈중에 AIM 단백질로서 거의 존재하고 있지 않음을 알 수 있었다.
실시예 33 : 고양이 혈중에 있어서의 고양이 AIM 과 IgM 의 결합성
도 35 에 나타내는 고양이 AIM cDNA 를 발현 벡터에 삽입한 플라스미드를, HEK293T 세포에 트랜스펙션하고, 그 배양 상청으로부터 정제한 재조합 고양이 AIM (1㎎) 를 고양이 (잡종, 수컷 2세 3월령) 에 정맥 주사하여 1 시간 후에 채혈하고, 혈청 분리하였다. 혈청을, 겔에 의한 사이즈 분획을 실시하고, 각 분획에 대해서 AIM 과 IgM 에 관하여 웨스턴 블롯법에 의해 해석하였다. 도 33A 에 나타내는 바와 같이, AIM 이 존재하는 분획과 IgM 이 존재하는 분획은 명백히 달랐다. 이 결과는, 마우스 AIM 을 AIM KO 마우스에게 정맥 주사한 혈청을 동일하게 분획 해석한 결과 (도 33B, 비교예) (IgM 과 AIM 의 분획이 완전히 일치하고 있다) 와는 달랐다. 즉, 원래 AIM 은 혈액 중에서 IgM 과 결합하여, 그 안정성이 유지되는 (선행 문헌 : Arai 등., Cell Reports 3 : 1187-1198, 2013) 결과, AIM 의 혈중 농도가 유지된다. 그러나, 고양이에서는 AIM 이 IgM 과 결합할 수 없기 때문에, 혈중에 있어서의 AIM 의 안정성이 보전되지 못하고, 그 결과, AIM 의 혈중 농도를 유지할 수 없는 것으로 생각된다.
실시예 34 : 고양이 혈중에 있어서의 마우스 AIM 과 IgM 의 결합성
마우스 AIM 을 사용하여, 실시예 33 과 동일한 시험을 실시하였다. 재조합 마우스 AIM (1㎎) 을 고양이 (잡종, 수컷 2세 3월령) 에 정맥 주사하고 1 시간 후에 채혈하여, 혈청 분리하였다. 혈청을, 겔에 의한 사이즈 분획을 실시하고, 각 분획에 대해서 AIM 과 IgM 에 관하여 웨스턴 블롯법에 의해 해석하였다. 도 34 에 나타내는 바와 같이, 마우스 AIM 이 존재하는 분획과 고양이 IgM 이 존재하는 분획은 완전히 일치하였다. 따라서, 고양이 AIM 과 달리 마우스 AIM 은 IgM 과 결합하여, 혈중에서 안정되는 것으로 생각된다.
실시예 35 : 마우스 AIM 의 IgM 에 대한 결합 부위
C 말단을 결손시킨 재조합 개변 마우스 AIM 을 복수 제작하였다. 이들 개변 마우스 AIM 과 IgM 의 결합을 in vitro 에서 확인하였다. 그 결과, SRCR3 도메인의 일부를 결손시킨 개변 마우스 AIM 은, IgM 과의 결합이 현저히 저하되었다. 따라서, 마우스 AIM 의 SRCR3 도메인이 IgM 과의 결합에 중요함을 알 수 있었다.
실시예 36 : 고양이 AIM cDNA 서열
NCBI Resources 에 공개되어 있는 고양이 CD5L (=AIM) 의 예상 서열 (GenBank Accession No. : XM_003999688.1) 을 바탕으로 프라이머를 복수 설계하고, 고양이 비장의 cDNA 풀에서 고양이 AIM cDNA 의 전장 (서열 번호 : 5) 을 단리하였다 (도 35). 서열 상, 특히 리더 펩티드를 코딩하는 서열이, 공개되어 있는 서열과 크게 달랐다.
실시예 37 : 리더 펩티드의 소수성
고양이, 인간, 마우스, 개, 각각의 AIM 단백질의 리더 펩티드 서열의 소수성을 나타낸다 (도 36∼39). 모두 충분한 소수성을 가져, 분비 단백질로서의 조건을 만족하였다. 또, 고양이는 우리들이 단리한 cDNA 로부터, 개 AIM 에 관해서는, NCBI Resources 에 공개되어 있는 예상 서열 (GenBank Accession No. : XM_846487.2) 로부터 리더 펩티드에 대해서 해석하였다.
실시예 38 : 인간, 고양이, 마우스의 AIM 아미노산 서열의 비교
리더 펩티드 (LS), 각 SRCR, 및 힌지 부분에 대해서 3 자에서 아미노산 서열의 비교를 나타낸다 (도 40). 도면 중, 3 자에서 공통되어 있는 아미노산을 “*”로, 인간과 고양이에서만 공통되어 있는 것은 “.” 로, 인간과 마우스에서만 공통되어 있는 것은 “:”로 나타내었다.
실시예 39 : 고양이의 혈중 AIM 의 해석
실시예 32 에 있어서는, 항 마우스 AIM 항체를 사용하여 고양이 AIM 의 검출을 시도하였지만, 본 실시예에 있어서는, 고양이 AIM 의 cDNA 에 HA 태그를 연결한 DNA 를 발현 벡터에 편입하고, HEK293T 세포에 유전자 도입함으로써 C 말단에 HA 펩티드를 부하한 리콤비넌트ㆍ고양이 AIM 단백질 (rcAIM-HA) 을 생성하였다. 그것을 마우스에게 면역하여, 항 고양이 AIM 모노클로날 항체를 수립하였다. 그 항체를 사용하여, 다양한 계통의 고양이 (48 개체) 에 대해서 혈중 AIM 농도를 환원형의 웨스턴 블롯팅법에 의해 해석하였다 (도 41). 농도의 컨트롤로서 rcAIM-HA 를 사용하였다. 그 결과, 계통에 관계없이, AIM 이 검출되는 개체와, AIM 이 검출되지 않는 개체가 있는 것을 알 수 있었다. AIM 이 검출되는 개체중, 대표적인 4 개체의 혈중 AIM 농도의 평균치는 16.8㎍/㎖ 이고, 이것은 마우스나 인간의 약 5㎍/㎖ 보다 현저히 높은 값이었다.
실시예 40 : 고양이에 대한 IR 법의 확립
혈중 AIM 농도가 높은 고양이로 IR 에 의한 급성 신부전 유도법을 확립하였다. 전신 마취하 복강경 하에서 양측 신동맥을 클램프로 1 시간 결찰한 후 개방하였다. 그 후 혈액 및 요를 경시적으로 채취하여, 신기능을 검토하였다. 도 42 에 혈중 BUN 값과 Cre 값의 추이를 나타낸다. IR 후 12 시간에서 BUN 값, Cre 값은 모두 피크가 되었지만, 그 후 7 일째까지 개선되지 않았다. 즉 AIM-KO 마우스와 같이 급성 신부전으로부터의 회복에 장애가 있을 가능성이 높음이 시사되었다.
실시예 41 : IR 후의 고양이에 있어서의 혈중 및 요중 AIM 의 해석
마우스에서는 IR 후 요중에 AIM 이 검출되고, 그것이 요세관 중에 쌓인 죽은 세포괴에 집적되는 것으로 생각된다. IR 후의 고양이의 혈청 및 요를 항 고양이 AIM 항체를 사용하여 환원형 웨스턴 블롯팅법에 의해서 해석한 결과, 고양이에서는 IR 후 요중에 AIM 은 검출되지 않았다 (도 43). 또한 혈중 AIM 의 양에도 분명한 변화는 일어나지 않았다.
실시예 42 : 급성 신부전이 유도된 고양이의 근위 요세관 내의 죽은 세포괴에 있어서의 AIM 집적의 유무
고양이에게 양측성의 IR 을 실시하고 3 일째의 신장에 대해서, 요세관 내 괴사 세포괴에 AIM 이 집적되었는지에 관해서 면역 염색에 의해 해석하였다 (도 44). 근위 요세관 내에 괴사 세포괴는 검출되었지만 (흰색 화살표부), 같은 지점에 AIM 의 집적은 인정되지 않았다. 실시예 41 에 있어서, IR 후 요중에 AIM 은 검출되지 않았음을 나타내었지만, 그 결과, 요세관 중의 죽은 세포괴에 AIM 이 도달하지 않았음이 시사되었다.
실시예 43 : 급성 신부전이 유도된 고양이에 대한 AIM 투여의 효과
실시예 40 에 기재된 방법과 동일하게, 고양이 (암컷 5 세) 에게 양측성의 IR 을 실시하고, 24 시간 후에 마취하에 동맥 카테터를 서혜부 동맥으로부터 삽입하여, 신동맥까지 카테터 선단을 진행시키고, rAIM 50㎎ 을 PBS 50㎖ 에 용해한 용액을 편측 신동맥에 각각 25㎖ (rAIM : 25㎎) 씩 주입하였다. 별도의 고양이 (마찬가지로 암컷 5 세) 에게 동일하게 IR 및 카테터 삽입을 실시하고, PBS 만을 편측 신동맥에 각각 25㎖ 씩 주입하였다. IR 전과 rAIM 또는 PBS 주입 후 24 시간 (IR 후 48 시간) 에서의 체표면적으로 표준화한 GFR (Glomerular Filtration Rate ; 사구체 여과량) 을 나타내다 (도 45). PBS 만 주입한 고양이에서는, GFR 이 저하되어 신기능이 저하되었지만, rAIM 을 주입한 고양이에서는 GFR 의 저하는 보이지 않고, 신기능의 저하가 일어나지 않았다.
실시예 44 : 급성 신부전이 유도된 고양이에 대한 AIM 투여의 효과
실시예 43 에 기재된 방법과 동일하게 양측성의 IR 을 실시하고, rAIM 또는 PBS 주입 후 24 시간 (IR 후 48 시간) 에서 신조직을 PAS 염색에 의해 해석하였다 (도 46). PBS 를 주입한 고양이에서는 요세관 상피 세포의 괴사와 탈락, 요세관 구조의 파괴 및 간질의 증식이 인정되었지만, rAIM 주입한 고양이에서는 요세관 상피 세포는 이미 회복되고 있고 솔 가장자리도 부활되고, 구조도 복원되어 있었다. 또한 간질도 PBS 를 주입한 고양이와 비교하여 얇으며, 증식은 인정되지 않았다. 조직학적으로도 rAIM 에 의한 신부전의 치유는 분명하다.
실시예 45 : 고양이에 대한 AIM 투여의 효과
6∼8 세의 고양이에게, AIM 또는 vehicle 을 연일 투여한다. 투여 2∼4 주후에 신기능 (BUN 값) 을 측정한다. AIM 투여군에서는, vehicle 투여군에서 관찰되는 신기능의 악화가 억제된다. 따라서, AIM 이 고양이의 신기능 악화, 신부전의 예방에 유용함을 알 수 있다. 또한, AIM 대신에, AIM 의 기능을 아고니스트하게 조절할 수 있는 약제 (AIM 활성을 갖는 AIM 의 부분 펩티드를 포함한다) 나 AIM 의 발현을 유도하는 약제를 사용해도 동일한 결과가 얻어진다.
실시예 46 : 고양이에 대한 개변 AIM 투여의 효과
고양이 AIM 의 SRCR3 도메인을 마우스 AIM 의 SRCR3 도메인으로 개변하여, IgM 과 결합하는 개변 고양이 AIM 을 제작한다. 6∼8 세의 고양이에게, 개변 AIM 또는 vehicle 을 연일 투여한다. 투여 2∼4 주후에 신기능 (BUN 값) 을 측정한다. 개변 AIM 투여군에서는, vehicle 투여군에서 관찰되는 신기능의 악화가 억제된다. 따라서, AIM 이 고양이의 신기능 악화, 신부전의 예방에 유용함을 알 수 있다. 또한, 개변 고양이 AIM 은 혈중의 IgM 과 결합하여 안정화되는 점에서, 고양이 AIM 을 투여하는 것보다 저용량의 개변 고양이 AIM 투여에 의해 유효성이 얻어진다. 개변 고양이 AIM 은 고양이 IgM 과 결합하기만 하면 되고, 한정되지 않는다.
산업상 이용가능성
본 발명은, 유효 성분으로서 AIM 을 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 신질환 모델 마우스는, 신질환의 발증 메카니즘의 해명에 기여하고, 나아가 그 모델 마우스를 사용한 스크리닝 방법에 의하면, 신질환에 대한 예방ㆍ치료에 유효한 물질을 탐색할 수 있다. 또한 본 발명의 신질환 모델 마우스를 사용하여, 신질환의 공지된 예방ㆍ치료제의 효과를 평가할 수 있다. 그리고 본 발명은, 신질환의 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2014-022041 (출원일 : 2014년 2월 7일) 에 기초하고 있고, 그 내용은 전부 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> MIYAZAKI, Toru <120> prophylactic or therapeutic agent for kidney disease <130> 092272 <150> JP 2014-022041 <151> 2014-02-07 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1044 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctctgc tattctcctt gatccttgcc atttgcacca gacctggatt cctagcgtct 60 ccatctggag tgcggctggt ggggggcctc caccgctgtg aagggcgggt ggaggtggaa 120 cagaaaggcc agtggggcac cgtgtgtgat gacggctggg acattaagga cgtggctgtg 180 ttgtgccggg agctgggctg tggagctgcc agcggaaccc ctagtggtat tttgtatgag 240 ccaccagcag aaaaagagca aaaggtcctc atccaatcag tcagttgcac aggaacagaa 300 gatacattgg ctcagtgtga gcaagaagaa gtttatgatt gttcacatga tgaagatgct 360 ggggcatcgt gtgagaaccc agagagctct ttctccccag tcccagaggg tgtcaggctg 420 gctgacggcc ctgggcattg caagggacgc gtggaagtga agcaccagaa ccagtggtat 480 accgtgtgcc agacaggctg gagcctccgg gccgcaaagg tggtgtgccg gcagctggga 540 tgtgggaggg ctgtactgac tcaaaaacgc tgcaacaagc atgcctatgg ccgaaaaccc 600 atctggctga gccagatgtc atgctcagga cgagaagcaa cccttcagga ttgcccttct 660 gggccttggg ggaagaacac ctgcaaccat gatgaagaca cgtgggtcga atgtgaagat 720 ccctttgact tgagactagt aggaggagac aacctctgct ctgggcgact ggaggtgctg 780 cacaagggcg tatggggctc tgtctgtgat gacaactggg gagaaaagga ggaccaggtg 840 gtatgcaagc aactgggctg tgggaagtcc ctctctccct ccttcagaga ccggaaatgc 900 tatggccctg gggttggccg catctggctg gataatgttc gttgctcagg ggaggagcag 960 tccctggagc agtgccagca cagattttgg gggtttcacg actgcaccca ccaggaagat 1020 gtggctgtca tctgctcagg atag 1044 <210> 2 <211> 347 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ile Leu Ala Ile Cys Thr Arg Pro Gly 1 5 10 15 Phe Leu Ala Ser Pro Ser Gly Val Arg Leu Val Gly Gly Leu His Arg 20 25 30 Cys Glu Gly Arg Val Glu Val Glu Gln Lys Gly Gln Trp Gly Thr Val 35 40 45 Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ile Lys Asp Val Ala Val Leu Cys Arg Glu 50 55 60 Leu Gly Cys Gly Ala Ala Ser Gly Thr Pro Ser Gly Ile Leu Tyr Glu 65 70 75 80 Pro Pro Ala Glu Lys Glu Gln Lys Val Leu Ile Gln Ser Val Ser Cys 85 90 95 Thr Gly Thr Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Gln Glu Glu Val Tyr 100 105 110 Asp Cys Ser His Asp Glu Asp Ala Gly Ala Ser Cys Glu Asn Pro Glu 115 120 125 Ser Ser Phe Ser Pro Val Pro Glu Gly Val Arg Leu Ala Asp Gly Pro 130 135 140 Gly His Cys Lys Gly Arg Val Glu Val Lys His Gln Asn Gln Trp Tyr 145 150 155 160 Thr Val Cys Gln Thr Gly Trp Ser Leu Arg Ala Ala Lys Val Val Cys 165 170 175 Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Arg Cys Asn 180 185 190 Lys His Ala Tyr Gly Arg Lys Pro Ile Trp Leu Ser Gln Met Ser Cys 195 200 205 Ser Gly Arg Glu Ala Thr Leu Gln Asp Cys Pro Ser Gly Pro Trp Gly 210 215 220 Lys Asn Thr Cys Asn His Asp Glu Asp Thr Trp Val Glu Cys Glu Asp 225 230 235 240 Pro Phe Asp Leu Arg Leu Val Gly Gly Asp Asn Leu Cys Ser Gly Arg 245 250 255 Leu Glu Val Leu His Lys Gly Val Trp Gly Ser Val Cys Asp Asp Asn 260 265 270 Trp Gly Glu Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly 275 280 285 Lys Ser Leu Ser Pro Ser Phe Arg Asp Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly 290 295 300 Val Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asn Val Arg Cys Ser Gly Glu Glu Gln 305 310 315 320 Ser Leu Glu Gln Cys Gln His Arg Phe Trp Gly Phe His Asp Cys Thr 325 330 335 His Gln Glu Asp Val Ala Val Ile Cys Ser Gly 340 345 <210> 3 <211> 1068 <212> DNA <213> Felis catus <400> 3 atggcgctac tcttctccct aatcctcgcc atttacactg gacctggcat tttagggtct 60 ttttccagag tgcggctagt gggaggcgac caccgctgtg aaggtcgtgt ggagttgcag 120 caggatgacg agtgggtcac cgtgtgtgat gactactgga acatggactc tgtggccgtg 180 ctgtgccggg agctgggctg tggggcggcc aggaagacca tgagtggcac cgtgtatgga 240 ccagtgacac caaaggacca aaaagtcttc atccacctgt tcagatgcaa tgggatcgaa 300 gaaagcctgt ctcagtgcga gagggaagat gcaatcggat gctcccatgt tgaggatgcg 360 ggagccgtgt gcgagcccat ttacactgga cctggcattt tagggccgga gagtgtgagg 420 ctggccgatg gccccgggcg ctgccagggc cgagtggagg tgaagttccg aggggagtgg 480 agctctgtgt gccaagcagg ctggagcttt gcagccgcca aggtggtgtg ccggcagctg 540 gggtgtggac gggccaccct gacccggaga ggctgcaaca aagcgaccca gggccaaggg 600 gccatctggc agagaaaggc gtcatgctca ggacaagaag tgagccttca agattgcctt 660 tctgaagttt gggaacacaa ctgtacccac aatgaggacg tgtgggtcga atgtgaagat 720 ccctttgcct tgaagctggt aggaggacgc agccactgtg aggggaggct ggaggtgctg 780 cacaagggcg agtggggctc tgtctgcgac gacggctggg gacaagacgc agaccgggtg 840 gtgtgcaggc agctgggctg cgggcagccc ctgtctccgc ctgtcaaagt ccggagaagg 900 ttcggccccg gggtcggccg catctggctg gacgacgtca agtgctcggg gaaggagccg 960 tccctggagc agtgcctgca caggtcctgg ggctaccaca actgtaacca cagagaggat 1020 gtggctgtgg tctgtgaaga acagcagtct ggcctacctg atgcttga 1068 <210> 4 <211> 355 <212> PRT <213> Felis catus <400> 4 Met Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ile Leu Ala Ile Tyr Thr Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ile Leu Gly Ser Phe Ser Arg Val Arg Leu Val Gly Gly Asp His Arg 20 25 30 Cys Glu Gly Arg Val Glu Leu Gln Gln Asp Asp Glu Trp Val Thr Val 35 40 45 Cys Asp Asp Tyr Trp Asn Met Asp Ser Val Ala Val Leu Cys Arg Glu 50 55 60 Leu Gly Cys Gly Ala Ala Arg Lys Thr Met Ser Gly Thr Val Tyr Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Pro Lys Asp Gln Lys Val Phe Ile His Leu Phe Arg Cys 85 90 95 Asn Gly Ile Glu Glu Ser Leu Ser Gln Cys Glu Arg Glu Asp Ala Ile 100 105 110 Gly Cys Ser His Val Glu Asp Ala Gly Ala Val Cys Glu Pro Ile Tyr 115 120 125 Thr Gly Pro Gly Ile Leu Gly Pro Glu Ser Val Arg Leu Ala Asp Gly 130 135 140 Pro Gly Arg Cys Gln Gly Arg Val Glu Val Lys Phe Arg Gly Glu Trp 145 150 155 160 Ser Ser Val Cys Gln Ala Gly Trp Ser Phe Ala Ala Ala Lys Val Val 165 170 175 Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Arg Arg Gly Cys 180 185 190 Asn Lys Ala Thr Gln Gly Gln Gly Ala Ile Trp Gln Arg Lys Ala Ser 195 200 205 Cys Ser Gly Gln Glu Val Ser Leu Gln Asp Cys Leu Ser Glu Val Trp 210 215 220 Glu His Asn Cys Thr His Asn Glu Asp Val Trp Val Glu Cys Glu Asp 225 230 235 240 Pro Phe Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Arg Ser His Cys Glu Gly Arg 245 250 255 Leu Glu Val Leu His Lys Gly Glu Trp Gly Ser Val Cys Asp Asp Gly 260 265 270 Trp Gly Gln Asp Ala Asp Arg Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Pro Pro Val Lys Val Arg Arg Arg Phe Gly Pro Gly 290 295 300 Val Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asp Val Lys Cys Ser Gly Lys Glu Pro 305 310 315 320 Ser Leu Glu Gln Cys Leu His Arg Ser Trp Gly Tyr His Asn Cys Asn 325 330 335 His Arg Glu Asp Val Ala Val Val Cys Glu Glu Gln Gln Ser Gly Leu 340 345 350 Pro Asp Ala 355 <210> 5 <211> 1196 <212> DNA <213> Felis catus <400> 5 agaactctcc gttgctgccc tggggcctcc tcgcggcctc ggattccagc tcagcctctc 60 ccgtcgcctg gctcatggcg ctactcttct ccctaatcct cgccatttac actggacctg 120 gcattttagg gtctttttcc agagtgcggc tagtgggagg cgaccaccgc tgtgaaggtc 180 gtgtggagtt gcagcaggat gacgagtggg tcaccgtgtg tgatgactac tggaacatgg 240 actctgtggc cgtgctgtgc cgggagctgg gctgtggggc ggccaggaag accatgagtg 300 gcaccgtgta tggaccagtg acaccaaagg accaaaaagt cttcatccac ctgttcagat 360 gcaatgggat cgaagaaagc ctgtctcagt gcgagaggga agatgcaatc ggatgctccc 420 atgttgagga tgcgggagcc gtgtgcgagc ccatttacac tggacctggc attttagggc 480 cggagagtgt gaggctggcc gatggccccg ggcgctgcca gggccgagtg gaggtgaagt 540 tccgagggga gtggagctct gtgtgccaag caggctggag ctttgcagcc gccaaggtgg 600 tgtgccggca gctggggtgt ggacgggcca ccctgacccg gagaggctgc aacaaagcga 660 cccagggcca aggggccatc tggcagagaa aggcgtcatg ctcaggacaa gaagtgagcc 720 ttcaagattg cctttctgaa gtttgggaac acaactgtac ccacaatgag gacgtgtggg 780 tcgaatgtga agatcccttt gccttgaagc tggtaggagg acgcagccac tgtgagggga 840 ggctggaggt gctgcacaag ggcgagtggg gctctgtctg cgacgacggc tggggacaag 900 acgcagaccg ggtggtgtgc aggcagctgg gctgcgggca gcccctgtct ccgcctgtca 960 aagtccggag aaggttcggc cccggggtcg gccgcatctg gctggacgac gtcaagtgct 1020 cggggaagga gccgtccctg gagcagtgcc tgcacaggtc ctggggctac cacaactgta 1080 accacagaga ggatgtggct gtggtctgtg aagaacagca gtctggccta cctgatgctt 1140 gacccacagg ccccaagcgc tcttacttct cctgggccct gatcggcccg gcctga 1196 <210> 6 <211> 352 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ala Pro Leu Phe Asn Leu Met Leu Ala Ile Leu Ser Ile Phe Val 1 5 10 15 Gly Ser Cys Phe Ser Glu Ser Pro Thr Lys Val Gln Leu Val Gly Gly 20 25 30 Ala His Arg Cys Glu Gly Arg Val Glu Val Glu His Asn Gly Gln Trp 35 40 45 Gly Thr Val Cys Asp Asp Gly Trp Asp Arg Arg Asp Val Ala Val Val 50 55 60 Cys Arg Glu Leu Asn Cys Gly Ala Val Ile Gln Thr Pro Arg Gly Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Pro Pro Ala Ser Glu Gln Arg Val Leu Ile Gln Gly Val 85 90 95 Asp Cys Asn Gly Thr Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Leu Asn Tyr 100 105 110 Tyr Val Phe Asp Cys Ser His Glu Glu Asp Ala Gly Ala Gln Cys Glu 115 120 125 Asn Pro Asp Ser Asp Leu Leu Phe Ile Pro Glu Asp Val Arg Leu Val 130 135 140 Asp Gly Pro Gly His Cys Gln Gly Arg Val Glu Val Leu His Gln Ser 145 150 155 160 Gln Trp Ser Thr Val Cys Lys Ala Gly Trp Asn Leu Gln Val Ser Lys 165 170 175 Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Leu Leu Thr Tyr Gly 180 185 190 Ser Cys Asn Lys Asn Thr Gln Gly Lys Gly Pro Ile Trp Met Gly Lys 195 200 205 Met Ser Cys Ser Gly Gln Glu Ala Asn Leu Arg Ser Cys Leu Leu Ser 210 215 220 Arg Leu Glu Asn Asn Cys Thr His Gly Glu Asp Thr Trp Met Glu Cys 225 230 235 240 Glu Asp Pro Phe Glu Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Thr Pro Cys Ser 245 250 255 Gly Arg Leu Glu Val Leu His Lys Gly Ser Trp Gly Ser Val Cys Asp 260 265 270 Asp Asn Trp Gly Glu Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly 275 280 285 Cys Gly Lys Ser Leu His Pro Ser Pro Lys Thr Arg Lys Ile Tyr Gly 290 295 300 Pro Gly Ala Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asp Val Asn Cys Ser Gly Lys 305 310 315 320 Glu Gln Ser Leu Glu Phe Cys Arg His Arg Leu Trp Gly Tyr His Asp 325 330 335 Cys Thr His Lys Glu Asp Val Glu Val Ile Cys Thr Asp Phe Asp Val 340 345 350

Claims (48)

  1. AIM 또는 그것의 부분 펩티드, 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제.
  2. AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 함유하는, 신질환의 예방ㆍ치료제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 예방ㆍ치료제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인 예방ㆍ치료제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 인간인 예방ㆍ치료제.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인 예방ㆍ치료제.
  7. 제 6 항에 있어서, AIM 또는 그 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 예방ㆍ치료제.
  8. 제 7 항에 있어서, 고양이 IgM 과 결합하는 AIM 또는 그 부분 펩티드가, 마우스 유래 AIM 의 SRCR3 도메인을 포함하는, 예방ㆍ치료제.
  9. AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용하는, 신질환의 예방ㆍ치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법 :
    (1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 피검물질을 투여하는 공정,
    (2) 피검물질이 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
    (i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
    (ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
    (iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
    (iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
    (v) BUN 값,
    (vi) 생존율,
    (3) 피검물질 비투여의 경우와 비교하여, 상기 특성 중 어느 1 항목 이상이 개선되는 피검물질을 선택하는 공정.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 스크리닝 방법.
  12. AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시함으로써 얻어지는 동물을 사용하는, 신질환 예방ㆍ치료제의 예방ㆍ치료 효과의 평가 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법 :
    (1) 편측 요관 결찰, 일측성 신적출 후의 일과성 신허혈 재관류 또는 양측성의 일과성 신허혈 재관류를 실시하는 조건하, AIM 발현 부전 비인간 포유동물에게 신질환 예방ㆍ치료제를 투여하는 공정,
    (2) 신질환 예방ㆍ치료제가 투여된 AIM 발현 부전 비인간 포유동물의 하기 특성 중 어느 1 항목 이상을 관찰하는 공정 :
    (i) 괴사한 요세관 세포의 축적과 신실질의 섬유화,
    (ii) 사구체 구조의 붕괴와 섬유화,
    (iii) 신장에 있어서의 염증성 사이토카인의 발현량,
    (iv) 신장에 있어서의 마크로파지의 비율,
    (v) BUN 값,
    (vi) 생존율,
    (3) 상기 특성 중 어느 1 항목 이상을 신질환 예방ㆍ치료제 비투여의 경우와 비교하여, 신질환 예방ㆍ치료제의 효과를 평가하는 공정.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 평가 방법.
  15. 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 신질환 환자의 예후의 예측 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 시료가 혈액 또는 혈청인, 예측 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, AIM 농도의 측정 방법이 항 AIM 항체를 사용한 면역학적 방법인, 예측 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 예측 방법.
  19. 피검자의 시료 중의 AIM 농도를 측정하는 것을 포함하는, 급성 신부전의 검사 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 시료가 요 (尿) 인, 검사 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, AIM 농도의 측정 방법이 항 AIM 항체를 사용한 면역학적 방법인, 검사 방법.
  22. 이하의 (a) 또는 (b) 를 포함하는, 신질환의 진단 또는 예후의 예측 키트 :
    (a) AIM 유전자의 전사 산물과 혼성화할 수 있는 핵산 프로브 또는 핵산 프라이머, 및/또는
    (b) AIM 에 대한 항체.
  23. 제 22 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인 키트.
  24. AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 신질환의 예방ㆍ치료 방법.
  25. AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제를 대상에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 신질환의 예방ㆍ치료 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 예방ㆍ치료 방법.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 예방ㆍ치료 방법.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 예방ㆍ치료 방법.
  29. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 예방ㆍ치료 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 예방ㆍ치료 방법.
  31. 신질환의 예방ㆍ치료에 사용하기 위한, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  32. 제 31 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  35. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  36. 제 35 항에 있어서, AIM 또는 그것의 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산.
  37. 신질환의 예방ㆍ치료에 사용하기 위한, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  38. 제 37 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  40. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  41. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  42. 제 41 항에 있어서, AIM 또는 그 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제.
  43. 신질환의 예방ㆍ치료제를 제조하기 위한, AIM 또는 그것의 부분 펩티드 또는 그것들을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 또는 AIM 의 발현을 유도하는 약제 또는 AIM 을 안정화시키는 약제의 사용.
  44. 제 43 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전, 만성 신염, 만성 신부전, 네프로제 증후군, 당뇨병성 신증, 신경화증, IgA 신증, 고혈압성 신증, 교원병에 수반되는 신증 또는 IgM 신증인, 사용.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서, 신질환이 급성 신부전 또는 만성 신부전인, 사용.
  46. 제 43 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 인간인, 사용.
  47. 제 43 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 예방ㆍ치료의 대상이 고양이인, 사용.
  48. 제 47 항에 있어서, AIM 또는 그 부분 펩티드가 고양이 IgM 과 결합하는 것을 특징으로 하는, 사용.
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