JP6143015B2 - 肝疾患の予防または治療剤 - Google Patents
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Description
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤;
[2]AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤;
[3]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である[1]または[2]に記載の予防・治療剤;
[4]AIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法;
[5]以下の工程を含むことを特徴とする、[4]に記載のスクリーニング方法
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝線維、
(iv)肝臓癌、
(v)肝臓における炎症反応、
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程;
[6]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である[4]または[5]に記載のスクリーニング方法;
[7]AIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法;
[8]以下の工程を含むことを特徴とする、[7]に記載の評価方法
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
(2)肝疾患予防・治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝線維、
(iv)肝臓癌、
(v)肝臓における炎症反応、
(3)前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程;
[9]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である[7]または[8]に記載の評価方法;
[10]以下の工程を含むことを特徴とする、肝疾患の診断方法
(1)被検者の試料中のAIM濃度を測定する工程、
(2)前記被検者の試料中のAIM濃度と健常者の試料中のAIM濃度とを比較する工程、
(3)前記被検者の試料中のAIM濃度が健常者の試料中のAIM濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程;
[11]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である[10]に記載の診断方法;
[12]AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法;
[13]AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法;
[14]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、[12]または[13]に記載の予防・治療方法;
[15]肝疾患の予防・治療に用いるための、AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[16]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、[15]に記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[17]肝疾患の予防・治療に用いるための、AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[18]肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、[17]に記載の薬剤;
を提供する。
AIMは、例えば、温血動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど)の免疫細胞であるマクロファージから単離・精製される蛋白質であってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873−5877(1993)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら,Nucleic Acids Res.,25:3389−3402(1997))]、Needlemanら,J.Mol.Biol.,48:444−453(1970)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、MyersおよびMiller,CABIOS,4:11−17(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている]、Pearsonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号:2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号:2で表されるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
前記活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基;例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基;例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基;例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基;α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基;ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のAIMがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のAIMには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
AIMは、システインを多く含む3つのSRCR(Scavenger−Receptor Cysteine−Rich)ドメインを含んでいることから、それぞれのSRCRドメインを本発明の部分ペプチドとして使用できる。具体的には、例えば、配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、SRCR1ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号24〜125)、SRCR2ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号138〜239)、SRCR3ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号244〜346)をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やSRCRドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記の機能ドメインを含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは50個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは100個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、さらに好ましくは200個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したAIMと同様に、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。AIMを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1)M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti,Peptide Synthesis,Interscience Publishers,New York (1966年)
(2)SchroederおよびLuebke,The Peptide,Academic Press,New York(1965年)
上記方法で得られるAIMが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にAIMが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
AIMまたはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、温血動物(例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリなど)のマクロファージ由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。AIMまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAであれば、前記動物のあらゆる細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など]もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織[例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織(例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]より調製したゲノムDNA画分を鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction(以下、「PCR法」と略称する)によって直接増幅することができ、AIMまたはその部分ペプチドをコードするcDNAであれば、マクロファージより調製した全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、PCR法およびReverse Transcriptase−PCR(以下、「RT−PCR法」と略称する)によって直接増幅することもできる。あるいは、AIMまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
配列番号:1の塩基番号64から1107で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むDNAとしては、例えば、配列番号:1の塩基番号64から1107で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したAIMと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0.1%SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);動物細胞発現プラスミド(例:pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV−TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列(シグナルコドン)を、AIMまたはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加(またはネイティブなシグナルコドンと置換)してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが;宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60巻,160(1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120巻,517(1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが用いられる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of the American Medical Association),199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にAIMを製造せしめることができる。
例えば、AIMまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX−100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、AIMまたはその部分ペプチドが菌体(細胞)外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれるAIMまたはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法;などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊(ICM)に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ICMの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ES細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法(ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年)に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスES細胞の場合、現在、一般的には129系マウス由来のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で、例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)から樹立されるES細胞なども良好に用いることができる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これ由来のES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、C57BL/6マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.J.Evans及びM.H.Kaufman,ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G.R.Martin,プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T.C.Doetschmanら,ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のターゲッティングベクターを導入されたES細胞を分化させて得られるAIM発現不全非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるAIMの細胞生物学的検討において有用である。
AIMをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスDNAとしては、AIMをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスDNAであってもよい。
特に、AIMをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、(a)翻訳阻害を指向したアンチセンスDNAの場合は、AIMのN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAが、(b)RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスDNAの場合は、イントロンを含むAIMをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAがそれぞれ好適である。
さらに、本発明のアンチセンスDNAは、AIMのmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるAIMと結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはDNA:RNAハイブリッドを形成してRNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。
通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に発現ベクターを有するホモ接合体を得るためには、F0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してF1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
(1)肝臓重量が増大する、
(2)脂肪肝が亢進する、
(3)肝臓癌を発症する、および/または
(4)肝臓において炎症反応が抑制される、
を有する。また、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物は、野生型動物と同様に、高脂肪食負荷条件下において肝線維化が亢進する特徴を有する。これらの表現型は、従来公知のAIM KOマウスにおいては、少なくとも報告されていない。特に、脂肪肝、肝線維化、肝臓癌への変遷が、NASHの病態と近似したものであることは新たな発見である。
(2)脂肪肝が亢進するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と比較して、早期に肝臓に脂肪の蓄積が認められることをいう。肝臓における脂肪の蓄積は、例えば、肝組織片をオイルレッドO染色することによって確認することができる。あるいは、肝臓組織中の中性脂肪量を測定することによっても確認できる。後述する実施例においては、AIMノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷6週目から野生型マウスと比べて有意な差が認められた。
(3)肝臓癌を発症するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、肝臓癌の発症が認められることをいう。肝臓癌は、例えば、肝組織片を抗AFP(α−fetoprotein)染色すること、肝組織中のAFP発現量を測定すること、または血中AFP濃度を測定することによって確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスでは高脂肪食負荷1年後も肝臓癌はほぼ確認できないが、AIMノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷1年後には全てのマウスに肝臓癌が認められた。
(4)肝臓において炎症反応が抑制されるとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷しても、野生型動物と比較して、肝臓において炎症反応が抑制されることをいう。炎症反応は、例えば、F4/80(マクロファージのマーカー)、TNFα、IL−6、IL−1βの発現によって確認することができる。後述する実施例においては、AIMノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷12週目から野生型マウスに比較して肝臓における炎症が有意に抑制されていた。
また、肝線維化が亢進するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と同様に、肝線維化が認められることをいう。肝線維化は、例えば、肝組織片をシリウスレッド染色することによって確認することができる。あるいは、肝線維化には、肝星細胞によるコラーゲン合成が関与していることが知られているが、肝星細胞のマーカーであるαSMAの発現によっても確認することができる。また、肝臓におけるTGFβ1、Collagen4A1の発現によっても確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスおよびAIMノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷20週目から肝線維化が認められた。また、野生型マウスおよびAIMノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷20週目からαSMAの高発現が認められた。TGFβ1は、高脂肪食負荷期間の長さに比例して、発現量が増加する傾向があった。しかしながら、野生型マウスとAIMノックアウトマウスの間に、線維化の程度、αSMAやTGFβ1の発現量について有意な差は認められなかった。
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝線維、
(iv)肝臓癌、
(v)肝臓における炎症反応、
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
(2)肝疾患予防・治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝線維、
(iv)肝臓癌、
(v)肝臓における炎症反応、
(3)前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
(1)被検者の試料中のAIM濃度を測定する工程、
(2)前記被検者の試料中のAIM濃度と健常者の試料中のAIM濃度とを比較する工程、
(3)前記被検者の試料中のAIM濃度が健常者の試料中のAIM濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程。
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、AIM遺伝子転写産物のセンス鎖(コード鎖)およびアンチセンス鎖(非コード鎖)とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜1kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。より具体的には、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、配列番号:1に示される塩基配列を含む核酸(センス鎖)とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、及び前記の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸(アンチセンス鎖)とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ここでハイストリンジェントな条件とは前記と同義である。
尚、AIMに対する抗体は、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含む蛋白質を感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。
〔配列番号:1〕
ヒトAIMの塩基配列を示す。
〔配列番号:2〕
ヒトAIMのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:3〕
F4/80に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:4〕
F4/80に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:5〕
TNFαに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:6〕
TNFαに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:7〕
IL−6に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:8〕
IL−6に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:9〕
IL−1βに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:10〕
IL−1βに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:11〕
αSMAに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:12〕
αSMAに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
TGFβ1に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:14〕
TGFβ1に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:15〕
AFPに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:16〕
AFPに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:17〕
GAPDHに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号:18〕
GAPDHに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
AIMノックアウトマウスおよびにWTマウスに高脂肪食(HFD)を負荷することにより、肝臓重量、体重に対する肝臓の重量、肝臓中の中性脂肪重量、およびヘマトキシリン・エオジン組織染色による肝脂肪の蓄積について検討した。その結果、WTマウスにHFDを付加しても、20週目まで肝臓重量/体重は明確な変化は示さなかったが、AIMノックアウトマウスにHFDを付加することにより、6週目からWTに比較し有意な肝臓重量/体重の増加が認められた(図1A)。また、肝臓中の中性脂肪重量の結果から、AIMノックアウトマウスにHFDを付加することにより、6週目から肝臓での脂肪の蓄積が認められ、WTと比較して脂肪肝が亢進していることが明らかとなった(図1B)。
野生型マウス(オス、10匹、12週齢)とAIMノックアウトマウス(オス、10匹、12週齢)に高脂肪食(HFD)を負荷し、0、6、12、20、45、55週間後に肝臓をフォルマリン固定し、切片をシリウスレッドで染色し、染色された線維化部分(図2A)をNIH−J imageにて定量化した。各マウスにつき3枚の非連続切片で解析し、その平均値(切片全体における線維化の割合)を示している(図2B)。その結果、線維化領域はHFD負荷期間が長いほど増加するが、野生型マウスとAIMノックアウトマウスで有意な差は認められなかった。また、固定前に一部の肝組織からRNAを抽出し、量的RT−PCRによって、肝線維化に関与する代表的な遺伝子であるαSMAとTGFβについてmRNA発現量を解析した(図2C)。高脂肪食(HFD)負荷後45、55週のAIMノックアウトマウスでは、癌が多発し、正常肝部での正確な発現量が解析できにくいため、RNA解析は、0、6、12、20週間負荷したマウスのみで行った。その結果、αSMAとTGFβのmRNA発現量は、HFD負荷と共に上昇したが、両者に有意な差はなかった。
WTマウスにHFDを52週間負荷しても、脂肪肝は見られるものの、肝細胞癌はほぼ発症しなかったのに対し、AIMノックアウトマウスでは全例に肝細胞癌が観察され、観察された腫瘍のほとんどが、高分化型肝細胞癌(HCC)であった(図3A、B、C)。肝細胞癌はHoechst/AFP染色でAIMノックアウトマウスの肝臓に確認され(図4)、肝臓でのAFPの発現亢進も確認できた。
AIMノックアウトマウスに高脂肪食(HFD)を負荷することにより肝臓での炎症反応は抑制されていた(図5)。WTマウスにHFDを付加すると、12−20週目で肝臓でのマクロファージの集積、TNFα、IL−6、IL−1βの発現亢進といった炎症反応の亢進が見られた。一方、AIMノックアウトマウスではWTと比較してこれらの炎症反応は抑制されていた(図5)。
Bリンパ球が欠損しているため血中にIgMが存在しないRAG(Recombination−activating gene)KOマウスの血清中AIMをウエスタンブロットにより解析した。WTに比べ、RAG KOマウスでは血清中AIM量が極めて少なく、またAIM−IgM複合体は検出されなかった(図6A)。そこでin vitroにおいて、AIMとIgMの結合を調べたところ、AIMとIgMの結合が確認された(図6A)。さらにRAG KOマウスに200μgのIgMを静脈内投与したところ、血中のAIMが増加した(図6B)。さらに、マウスおよびヒト血清中のAIM濃度とIgM濃度をELISA法により測定したところ、ヒトにおいても血中のAIM濃度とIgM濃度は、マウスと同様に相関していることが判明した(図7)。以上より、AIMは血中でIgMと複合体を形成し、安定化していることが示唆された。
in vitroにおけるAIMの肝細胞に対する作用を検討した。マウス初代培養肝細胞にAIMを5時間作用した後、細胞を抗AIM抗体で染色及びウエスタンブロットしたところ、細胞がAIMを取り込んでいることが確認された(図8)。さらにマウス初代培養肝細胞に800μMオレイン酸(OA)を添加し、24時間培養することにより脂肪肝化させた後、AIM添加またはAIM非添加で24時間培養した。オイルレッドO染色およびFSP27(Fat−Specific protein 27)のmRNA発現量から脂肪肝化を測定した。AIM非添加(OA→DMEM)では、OA非添加に比べオイルレッドO染色の程度およびfsp27発現量が増加し、脂肪肝化が確認された(図9)。一方、AIM添加(OA→AIM)では、オイルレッドO染色の程度およびfsp27発現量の増加は見られず(図9)、AIMの脂肪肝改善効果が確認された。
組換えヒトSRCRドメイン(SRCR1、SRCR2、SRCR3)タンパクは、HEK293T細胞を用いて、それぞれHA(hemagglutinin)タグを付加したヒトSRCRドメインを発現させ、抗HA抗体カラムにより精製することにより得た。3T3−L1脂肪前駆細胞を、1μg/mLインスリン、1μMデキサメタゾン(DEX)、0.5mMイソブチルメチルキサンチン(IBMX)存在下で48時間培養することにより脂肪細胞への分化を誘導し、それに対するSRCRドメインおよびAIMの分化抑制作用を検討した。添加したAIMとしては、ヒト全長AIM(hAIM)、前記の3種のSRCRドメイン蛋白質を20μg/mlで用いた。脂肪細胞への分化は、オイルレッドO染色の程度を無添加の場合を100%として定量化した。すべてのSRCRドメインにAIMと同じ脂肪細胞分化抑制作用が見られた(図10)。
NASH患者3例(うち2例は肝細胞癌に進行)および非NASH患者3例の血清中AIM濃度を測定した。測定は、抗AIM抗体を用いたウエスタンブロットで行い、シグナルの強さを定量化した。非NASH患者に比べ、NASH患者では血清中のAIM濃度が低下していた(図11)。また、肝細胞癌に進行しているNASH患者では、血清中AIM濃度がより低下していた(図11)。
8週齢のAIM KOマウスに高脂肪食(HFD)を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られる前のHFD負荷2〜3週目よりAIMまたはvehicleを連日投与する。投与4〜6週後に肝臓をオイルレッドO染色すると、vehicle投与群では脂肪の蓄積が見られるのに対し、AIM投与群では脂肪の蓄積が見られない。従って、AIMが脂肪肝の予防に有用であることがわかる。また、8週齢のAIM KOマウスに高脂肪食(HFD)を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られるHFD負荷6〜8週目よりAIMまたはvehicleを連日投与する。投与4〜8週後に肝臓をオイルレッドO染色すると、vehicle投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が増加するのに対し、AIM投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が減少する。従って、AIMが脂肪肝の改善又は治療に有用であることがわかる。また、AIMの代わりに、AIMの機能をアゴニスティックに調節できる薬剤(AIM活性を有するAIMの部分ペプチドを含む)やAIMの発現を誘導する薬剤を使用しても同様の結果が得られる。同様にして、肝線維化および肝癌の発症時期に合わせてAIMを投与することにより、肝硬変および肝癌に対するAIMの予防、改善又は治療効果も確認できる。
AIMノックアウトマウス(オス10匹、12週齢)に高脂肪食(HFD)を43週間負荷し、30週目から43週目まで組換えAIM(rAIM)(20mg/Kg(体重);5匹)またはPBS(5匹)を週一回腹腔内注射にて投与した。HFD43週目にマウスを屠殺し、摘出した肝臓をフォルマリン固定した後、肝組織切片を作製した。得られた肝組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、癌の状況と脂肪肝の状況について解析した。肝組織切片は各マウスにつき10枚非連続切片で作製し、癌の有無、大きさ、個数について解析した。また、肝臓(非癌部)の一部は固定前に切除し中性脂肪の含有量を測定した。その結果、rAIM投与群の体重は有意に減少した。一方PBS投与群の体重は増加した(図12A)。また、rAIM投与群には明らかな癌部は認められなかった。一方、PBS投与群では、全てのマウスに複数個の癌結節が見られた。組織学的にも多発性の肝癌が認められた。巨視的な写真とヘマトキシリン・エオジン染色像を示す(図12B)。さらに、脂肪肝についてはrAIM投与群では組織学的に明らかな改善が認められた。また肝(非癌部)の中性脂肪含有量も、PBS投与群に比して有意に減少した(図12B)。
本出願は、日本で出願された特願2012−103958(出願日:平成24年4月27日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (6)
- AIM、AIMのSRCR1ドメイン、AIMのSRCR2ドメインもしくはAIMのSRCR3ドメインまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌の予防・治療剤。
- AIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項2記載のスクリーニング方法
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝臓癌、
(iv)肝臓における炎症反応
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。 - AIM発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌予防・治療剤の予防治療効果の評価方法。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項4記載の評価方法
(1)高脂肪食負荷条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌予防・治療剤を投与する工程、
(2)脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌予防・治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)肝臓重量、
(ii)肝脂肪量、
(iii)肝臓癌、
(iv)肝臓における炎症反応、
(3)前記特性を脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌予防・治療剤非投与の場合と比較して、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌予防・治療剤の効果を評価する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎または肝臓癌の検査方法
(1)被検者の試料中のAIM濃度を測定する工程、
(2)前記被検者の試料中のAIM濃度と健常者の試料中のAIM濃度とを比較する工程、
(3)前記被検者の試料中のAIM濃度が健常者の試料中のAIM濃度に比べて低値であることを確認する工程。
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