JP2005187408A - 血管新生調節剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 Ovo2の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有する血管新生調節剤;Ovo2の発現又は活性を調節する物質をスクリーニングすることによる、血管新生が関連する疾患に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法;Ovo2遺伝子に変異を導入させてなるOvo2機能欠損非ヒト動物;並びに新規Ovo2遺伝子。
【選択図】 なし
Description
Robbら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7075-7019 (1995) Shivdasaniら, Nature 373: 432-434 (1995) Visvaderら, Genes Dev. 12: 128-142 (1998) Sanchezら, Development 126: 3891-3904 (1999) Sinclairら, Dev. Biol. 209: 128-142 (1999)
以下、マウスを例に挙げ、Ovo2機能欠損動物の作出の一例を詳述する。
Ovo2の機能をインビボで解析するため、Ovo2ノックアウトマウスを作製した。
先ず、Ovo2遺伝子を、129/SvJゲノミックライブラリー (stratagene) より単離し、DNA結合ドメインであるジンクフィンガーモチーフの一部をコードするOvo2遺伝子エクソン5付近の10kb EcoRI-SacIフラグメントを使用してターゲティングベクターを構築した。FRT部位 (Nakanoら, Nucleic Acid Res., 29: e40 (2001)) をPGKneobpAカセット (Sorianoら, Cell, 64; 693-702 (1991)) の各末端に連結し、このFRT-neoカセットを、ポジティブ選択のために、Ovo2遺伝子エクソン5の下流のPstI部位に挿入した。LoxP部位を、Ovo2遺伝子エクソン5の上流のApaLI部位、FRT-neoカセットが挿入されているPstI部位に挿入した。DT-Aカセット (Yagiら, Anal. Biochem. 214; 77-86 (1993)) を、ネガティブ選択のために、ターゲティングベクターの5’端に連結した。構築したターゲティングベクターの概要を、図1Aに示す。
次いで、線状にしたターゲティングベクター (20 μg) を107のE14.1 ES細胞(Nakaeら, Immunity, 17(3): 375-87 (2002); Kuhnら, Science, 254(5032): 707-10 (1991); Hooperら, Nature, 326(6110): 292-5 (1987)に従い作製)にエレクトロポレーションし、G418 250 μg/mlと共に7〜10日間インキュベートして選択を行なった。G418耐性クローンを、下記のサザンブロット解析によりスクリーニングした。Ovo2領域を欠失させるため、Creリコンビナーゼを一過的に発現する組換えアデノウイルスを、G418耐性ES細胞に感染させた (Kanegaeら, Nucleic Acid Res. 23: 3816-3821 (1995))。相同組換えを生じたES細胞をPCRによりスクリーニングし、下記のPCR及びサザンブロット解析により確認した(図1B)。2種のES細胞クローン、3D2及び4D3をC57BL/6J×BDF1 8細胞と凝集させ、数種のキメラを作製した。2種のES細胞クローン由来の雄性キメラを雌性C57BL/6Jマウスと交配させ、作製したヘテロ接合体を交雑させ、次いでホモ接合体を作製した。いずれの子孫も同一の表現型を示したので、3D2クローン由来の子孫を以後の解析に用いた。
ゲノミックDNAをES細胞及びマウス尾より単離した。DNAを制限酵素 (PvuII、XhoI+HindIII) で消化し、5’端及び3’端プローブを用いて標準的な手順に従ってサザンブロット解析を行なった。一方、PCR解析については、DNAを血液から単離し、卵黄嚢及び胚セグメントをプロテイナーゼKにより溶解した。DNA及びライセートを、下記プライマーを用いてPCRで解析した。
5’-CATAGCCCATGTGTGGCTGCTG-3’ (イントロン4)
5’-GCCGGCCTTAAAACATCCCAC-3’ (イントロン5)
次いで、実施例1で作製したOvo2ノックアウトマウスを解析した。
ヘテロ接合マウスは雄、雌のいずれもが健康で生殖力があり、異常な表現型は観察されなかった。また、ヘテロ接合マウス同士の交配から産まれた子孫266匹として野生型80匹、ヘテロ接合体181匹が確認されたが、ホモ接合変異体は見出せなかった(表1)。このことは、Ovo2変異が劣性且つ胚致死であることを示す。
以上より、Ovo2が胚の発達に必須であることが明らかとなった。
胚発生におけるOvo2の役割を明らかにするために、RT-PCR、ノザンブロット解析、in situハイブリダイゼーションによって、マウス発生初期段階でのOvo2発現パターンを解析した。
その結果、Ovo2-/-胚の死亡が確認されたE9.5、E10.5において、Ovo2が野生型マウスの胎盤では高発現しており、胚と卵黄嚢では発現が低いことが確認された(図2A)。Ovo2 mRNA発現は、E7.5受胎物全体のノザンブロット解析によって検出できなかった(図2B)。胎盤におけるmRNA発現は、ノザンブロット解析によりE8.5で検出され、その後も持続した(図2B)。mRNAのサイズは、成体マウスの精巣に特異的に発現しているmRNAのサイズと同一であった。野生型胚のin situハイブリダイゼーションにより、Ovo2 mRNAがE8.5絨毛膜板で発現すること(図2C及びD)、次いで、E9.5(図2F)、E11.5(図2G)において、伸長した絨毛膜栄養胞と尿嚢中胚葉を含む迷路層でOvo2が発現することが示された。巨大栄養胞細胞の一部は、E8.5にポジティブシグナルを示した(図2E)。
以上より、Ovo2-/-胚の死亡が確認されたE9.5、E10.5では、野生型胚においてOvo2が胎盤やその他の特定領域で特異的に発現していることが明らかになった。
total RNAは、製造業者の使用説明書に従いTRIZOL (Invitrogen) を用いて抽出した。RT-PCR解析は、total RNAをDNase Iで処理し、次いでp(dN)6 ランダムプライマーを用いて逆転写し、適切なプライマーを用いて行なった。ノザンブロット解析は、全長Ovo2 cDNA及びGAPDH cDNAをプローブとして用いてtotal RNA 10 μgで行なった。
胚及び組織を4%パラホルムアルデヒド/PBSで4℃にて一晩固定し、パラフィンに包埋し、3〜5 μmに切断し、次いでヘマトキシリン・エオジンで染色した。既報 (Schlaegerら, Development 121: 1089-1098 (1995)) に従い抗PECAM-1 (CD31) 抗体 (MEC13.3, BD Biosciences) を用いることによりwhole-mount免疫染色を行なった。in site解析については、固定したサンプルを冷却器中で凍結し、10〜15 μmに切断し、製造業者のプロトコルに従いハイブリダイゼーションに供した。cRNAプローブは、全長MOVO-A cDNA、並びにPCRにより増幅したcDNA、PL-1 (1-816)、4311 (1-678)、Gcm1 (215-1541) 、Flk1 (233-2813)、SCL (1775-2916) からジゴキシゲニン標識システムを用いて合成した。
胚発生におけるOvo2の役割を明らかにするために、マウス発生初期段階でのOvo2発現パターンに続き、Ovo2-/-胚を形態学的・組織学的に解析し、野生型胚と比較した。
その結果、E8.5では、いずれの遺伝子型の胚も8-13対の体節を有していた(図3A)。Ovo2-/-胚はほぼ正常であったが、心臓が小さい徴候を示した(図3B)。野生型胚とOvo2-/-胚との間における発達の差異は、E9.5に明白になった。具体的には、血液細胞が、E9.5野生型胚の心臓と血管で容易に検出された。また、E9.5野生型胚では、心臓が強く拍動し、3個の鰓弓を介する血液循環が確認された(図3L)。一方、Ovo2-/-胚(図3M)は、E9.5で発達が阻害された。具体的には、Ovo2-/-胚はサイズが小さく、異常な構造を有していた(例えば、非常に小さい心臓など)。心臓は小さいながらも拍動していたが、心臓と血管には血液細胞が存在しなかった。また、頭と尾の両方の領域で出血が観察された。
また、E8.5での組織学的解析より、E8.5 Ovo2-/-胚では、主要器官系(神経管、前腸、背側大動脈など)の構造と大きさが正常であることが示された(図3C−F)。正常な胚では心臓管が形成され、心筋と心内膜が管内に存在した(図3E)。Ovo2-/-胚でも心臓管が形成され、心筋と心内膜が管内に認識できたが、心臓の発達は僅かに遅延しているようであった(図3F)。次いで、内皮細胞を可視化するためPECAM-1免疫染色を行なった。その結果、E8.5 Ovo2-/-胚における心臓発達の欠陥は、PECAM-1免疫染色によって明瞭に示された(図3H−K)。具体的には、野生型胚では、十分に発達した心内膜がループ状心臓で観察され、大動脈嚢は明らかに厚かった(図3H及びI)。また、背側大動脈が明瞭に染色され、頭部では組織化した血管構造が観察された。一方、Ovo2-/-胚では、心臓が小さく、ループ形成は明瞭ではなかった(図3J及びK)。背側大動脈は野生型胚、Ovo2-/-胚で形成されたが、血管構造リモデリングはOvo2-/-胚の頭部では起こらなかった。
さらに、E9.5での組織学的解析では、心筋層、心内膜層、正常な小柱形成が野生型胚の心室で観察されたが(図3N及びP)、Ovo2-/-心臓では、心内膜組織の減少と異常な心室形成が生じ、心筋の小柱形成は観察されなかった(図3O及びQ)。PECAM-1免疫染色によれば、心臓・血管形成の欠陥は、E8.5よりもE9.5胚でより明らかであった。野生型胚では、分岐した血管が頭部で観察され、また、血管新生により形成された体節間血管が確認された(図3R)。一方、Ovo2-/-胚では、血管は体全体に無秩序に広がり、また、心臓には小さな組織塊、頭部には数個の非連結血管が認められた(図3T)。野生型胚では体節に配置され、且つ体節間境界の間に位置する典型的な体節間血管(図3R、▲)はOvo2-/-尾領域に存在せず、また、Ovo2-/-胚では多数の無秩序な血管が見出された(図3S、▲)。
ところで、心内膜、背側大動脈は脈管形成により形成され、脳血管、腎血管、体幹間血管は血管新生により形成されることが知られている(Drakeら, Blood 95; 1671-1679 (2000))。野生型胚では、心内膜は正常であった(図3N及びP)。一方、Ovo2-/-マウスでは、E8.5に心内膜形成の減少が観察された(図3O及びQ)。また、Ovo2-/-胚では背側大動脈が正常に形成されたが(図3D、J、K)、E8.5では一部の血管形成は減少しているようであった。さらに、E9.5では、頭部領域、体幹間血管における血管形成は明らかに異常であった(図3S−U)。これらの事実は、Ovo2-/-胚において血管新生の欠陥が生じていることを示す。
以上より、Ovo2-/-胚は、脈管形成ではなく血管新生に重大な欠陥を有していること、従ってOvo2は血管新生に関与する重要な因子であることが明らかとなった。
次いで、Ovo2-/-胚の卵黄嚢を形態学的・組織学的に解析し、野生型胚と比較した。
その結果、E8.5 Ovo2-/-卵黄嚢は、ミツバチ巣状の1次血管叢を呈し(図4B)、血管は、野生型胚で観察される(図4A、C)ように血液細胞を含んでいた(図4D)。野生型とOvo2-/-卵黄嚢との間で血管のネットワーク及び構造に明白な違いは認められなかった。しかし、E9.5では、野生型卵黄嚢は血管ネットワークの広範なリモデリングを示し、大きな卵黄血管を形成した(図4E、G)。一方、Ovo2-/-卵黄嚢は、このような卵黄血管を発達させることができず、胚外体腔液量は増加した(図4F、H)。E9.5卵黄嚢の1次血管叢(図4H)は、依然としてE8.5卵黄嚢の1次血管叢(図4B)と同一であった。E9.5卵黄嚢の組織学的解析より、野生型胚では、血管は中胚葉層と内胚葉層の間で密接に連結し、多数の血液細胞を含んでいたが、Ovo2-/-胚では、血管は異常に肥大し、僅かな血液細胞しか含んでいなかった(それぞれ、図4I、J)。
ところで、Scl-/-卵黄嚢は、卵黄血管への血管ネットワークの血管新生リモデリングが欠損していることが報告されている(Robbら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7075-7079 (1995); Shivdasaniら, Nature373, 432-434 (1995); Visvaderら, Genes Dev. 12; 473-479 (1998))。従って、Ovo2-/-卵黄嚢の表現型は、卵黄血管への血管ネットワークの血管新生リモデリングを欠損するという点で、Scl-/-卵黄嚢の表現型と一致していた。また、E8.0 Scl-/-胚では、脈管形成が正常であることの報告があり(Elefantyら, Blood 94: 3754-3763 (1999))、この点でも、参考例3に示した通り、Ovo2-/-胚の表現型はScl-/-胚と一致していた。
以上より、Ovo2-/-胚は、Scl-/-胚と同様の表現型を示すことが明らかとなった。
続いて、Ovo2-/-胚の胎盤を形態学的・組織学的に解析し、野生型胚と比較した。
その結果、Ovo2-/-胚では、胎盤発生の第1段階である絨毛膜に対する尿膜の融合は、E9.0において影響を受けなかった(データ示さず)。E9.0-E9.5では、野生型胎盤の尿膜血管は迷路層に延び、母体の血液洞と胎児血管が非常に入り混じっていた(図5A)。この迷路層の形成はまた、Ovo2-/-胎盤でも観察されたが(図5B)、野生型胎盤よりもOvo2-/-胎盤において、尿膜血管の侵入の程度がより低く、胎児血液細胞の数はより少なかった。E10.5野生型胎盤では、胎児血管は枝分かれし、迷路層に広範に侵入し、この層自体が拡大していた(図5C)。Ovo2-/-胎盤では、この侵入プロセスはE10.5で停止し、僅かな血液細胞のみが絨毛膜に存在していた(図5D)。
次いで、胎盤における欠陥を明らかにするために、Ovo2-/-胎盤と正常胎盤との間において幾つかの栄養芽細胞マーカーと内皮細胞マーカーとの発現を比較した。
その結果、巨大細胞層と海綿芽細胞層は見かけ上正常であり、栄養芽細胞特異的遺伝子である胎盤ラクトゲン-1と4311がE9.5 Ovo2-/-胎盤で発現していた(データ示さず)。Gcm1は、絨毛膜栄養芽細胞で発現し、合胞体栄養細胞の分化と迷路層の形成に必要であることが以前に示されている(Anson-Cartwrightら, Nat. Genet. 25: 311-314 (2000);Schreiberら, Mol. Cell Biol.20: 2466-2474 (2000))。Ovo2+/-胎盤では、Gcm1発現はE9.5(図5E)、E10.5(図5G)にて広がり、迷路層に拡大した。しかし、Ovo2-/-胎盤では、E9.5におけるGcm1発現は迷路層の狭い範囲に限定され(図5F)、E10.5で顕著に減少した(図5H)。既報 (Breierら, Dev. Dyn. 204: 228-239 (1995)) の通り、VEGF 2型レセプターであるFlk1は内皮細胞で発現し、正常胎盤の迷路層全体に見出すことができた(図5I及びK)。Ovo2-/-胎盤ではFlk1は尿膜で発現し、E9.5ではその発現は迷路層に拡大したが(図5J)、E10.5ではその発現は尿膜に限定された(図5L)。Ovo2-/-胚の血管は見かけ上迷路層に侵入していたが、胎盤にさらに侵入せず、また分岐しないようであった。このことは、Ovo2が血管新生による胎盤血管系の正常な分岐又は存続に必要であるが、脈管形成による尿膜血管の初期形成に本質的に必要ではないことを示す。
以上より、Ovo2が脈管形成ではなく血管新生に重要な因子であることが再度確認された。
Ovo2変異体における欠陥を引き起こすOvo2標的遺伝子を同定するために、RT-PCRを用い、脈管形成、血管新生、及び心臓発生に関与することが知られている遺伝子の発現レベルを測定した。
その結果、E9.5では、Scl mRNAの発現が胎盤、胚で顕著に減少するが、卵黄嚢では緩やかに減少することを見出した(図6A下段)。一方、脈管形成、血管新生に関与する他の遺伝子の発現レベルは、コントロールの同腹仔と同一であった。血管内皮増殖因子 (VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) は、内皮細胞増殖及び遊走に直接関与しており、内皮系列の発生と分化に関する適切なマーカーであると考えられている(Risau, W., Nature 386; 671-674, 1997)。Ovo2-/-マウスで見出された正常な脈管形成と一致して、野生型とOvo2-/-マウスとの間では、VEGF及びそのレセプターであるFlt1、Flk1の発現に差異は無かった(図6A)。Ovo2-/-マウスの胎盤では、bFGF mRNAの発現レベルは減少せず、むしろ増加した。また、野生型とOvo2-/-マウスとの間では、アンジオポエチン1 (Ang1)、Ang2、それらのレセプターであるTie1、Tie2、及び血小板由来増殖因子B (PDGFB) などの血管新生に関与する遺伝子の発現にも差異は無かった。さらに、両方のマウスにおけるα-平滑筋アクチン (αSMA) の同様の発現は、Ovo2-/-マウス血管壁の血管平滑筋細胞が正常に分化することを示す。
更に、Scl、心臓の形態形成に関与する遺伝子であるNkx2.5、Hand1、Hand2、MEF2C、心室心内膜の発生、小柱形成に関与する遺伝子であるFlk1、Flt1、Flt4、Ang1、Tie2、血管内皮−カドヘリン (VE-Cad)、及びVEGFの発現をRT-PCRで解析した。図6Bに示すように、Scl以外の遺伝子は、E8.5の野生型胚、Ovo2-/-胚において、及びE9.5の野生型心臓、Ovo2-/-心臓において同様の発現レベルを示した。一方、E8.5の野生型胚とOvo2-/-胚との間で、Scl mRNAの発現に有意差は認められなかったが、E9.5では、Scl mRNAの発現はOvo2-/-心臓で顕著に減少した。
ここで、(a) 表現型に特に差異が認められなかったE8.5の野生型胚とOvo2-/-胚との間では、Scl mRNAの発現でも同様に有意差が認められず、表現型に明確に差異が認められたE9.5の野生型心臓とOvo2-/-心臓との間では、Scl mRNAの発現において有意差が認められたこと(参考例3参照)、(b) E9.5 Ovo2-/-心臓では、Scl mRNAの発現が顕著に低下していたこと、(c) Ovo2-/-胚がScl-/-胚と同様の表現型を示し(参考例4参照)、また、Ovo2が脈管形成ではなく血管新生に重要な因子であるという点でSclと一致すること(参考例3、5参照)、の3つの事実は、E9.5 Ovo2-/-心臓における異常がScl mRNAの発現不全に起因し、また、Scl mRNAの発現不全がOvo2の発現不全に起因し得ることを示す。
以上より、Ovo2がScl発現の制御を介して血管新生を調節することが示唆された。
Ovo2は、配列5’-G(G/T/C)GGGGG-3’(配列番号17)に結合し、転写因子として働くことを我々は最近示した(Unezakiら,投稿中)。図6Cに示すように、Scl遺伝子は、3個のプロモーター、即ち、オルタネート5’エキソンにおけるプロモーター1a、1b (Bockampら, Blood 86: 1502-1514 (1995)) 及びエキソン4に含まれるプロモーター4 (Courtesら, J. Biol. Chem. 275; 949-958 (2000)) により駆動され、また、上記Ovo2結合コンセンサス配列がこれらプロモーター領域に幾つか見出される。
そこで、初めに、マウス卵黄嚢内皮細胞株C166(ATCCより入手)、マウス赤白血病細胞株F4N(ECACCより入手)、COS-7細胞におけるScl、Ovo2の発現をRT-PCRにより解析した。
その結果、F4N細胞はScl mRNAを高発現していたが、Ovo2 mRNAを発現していなかった(図6D)。一方、C166細胞はScl mRNA、Ovo2 mRNAのいずれをも低発現していた。
次いで、種々のコンストラクトを作製し、C166細胞、F4N細胞、COS-7細胞にトランスフェクトして、それらのプロモーター活性を検討した。その結果、F4N細胞では、-2E1a-Luc、-2E1b-Lucコンストラクトで生じたルシフェラーゼ活性は、pGV-Bで得られたバックグラウンド値よりも、それぞれ9倍、14倍高い値を示した(図6D)。C166細胞では、-2E1a-Luc、-4E1b-Luc、-2E1b-Lucコンストラクトはルシフェラーゼ活性を僅かに増加させ、-2E1b-Lucコンストラクトは約30倍増加させた。また、4E-Luc、4E-Luc-E6+4コンストラクトはルシフェラーゼ活性をそれぞれ324倍、75倍増加させた。COS-7細胞では、いずれのコンストラクトもルシフェラーゼ活性を増加させた。
次いで、Ovo2によるScl発現制御を解析するために、Ovo2-A発現プラスミド、種々のコンストラクトを、C166細胞、F4N細胞、COS-7細胞にトランスフェクトして、それらのプロモーター活性を検討した。その結果、プロモーター活性はOvo2-Aによって強く抑制された(図6E)。
以上より、Ovo2はSclの発現を直接制御する転写調節因子であることが明らかとなった。また、参考例1〜7より、Ovo2がScl発現を直接制御することで血管新生を調節していることが示された。
マウスScl遺伝子フラグメントは、マウスゲノムDNAを用いてPCR増幅した。得られたPCR産物をpGV-Bベクター (TOYO B-Net製) にサブクローニングして、以下のコンストラクトを作製した。
-4E1a-Luc (エクソン1aの-4 kb〜エクソン1aの4.1 kb領域)
-2E1a-Luc (エクソン1aの-2 kb〜エクソン1aの2.7 kb領域)
-4E1b-Luc (エクソン1aの-4 kb〜エクソン1bの4.8 kb領域)
-2E1b-Luc (エクソン1aの-2 kb〜エクソン1bの2.7 kb領域)、
E4-Luc (エクソン4の-0.2kb〜エクソン4の0.6kb領域)
E4-Luc-E6+4は、エクソン6から3’-UTR 4.1kbまでをカバーする4.8kbをE4-Lucの下流に付加することで構築した。Ovo2発現ベクター (pEF- Ovo2) は、Ovo2-A (Masuら, FEBS Lett. 421: 224-228 (1998)) をコードするcDNAを、pEF-BOSベクターに由来し、EFプロモーターにより駆動されるpEF0Aベクターに挿入することで構築した。
トランスフェクションアッセイ、ルシフェラーゼ・β-ガラクトシダーゼアッセイは、既報 (Sakitaniら, Genes Cells 3; 321-330 (1998)) に従い行なった。ルシフェラーゼレポータープラスミド 10 μg、Ovo2-A発現プラスミド (pEF- Ovo2) 又は空のpEF0Aプラスミド 2 μg、内部コントロールのβ-ガラクドシダーゼ発現プラスミド (pEF-LacZ) 50 ngを、F4N細胞 (4×106/チューブ) にエレクトロポレーションした。FuGENE 6トランスフェクション試薬 (Roche製) を用いてルシフェラーゼレポータープラスミド 2 μg、pEF- Ovo2又はpEF0A 0.4 μg、pEF-LacZ 20 ngをC166細胞 (1×105/ディッシュ) にトランスフェクトした。Relative light unit (RLU) は、β-ガラクトシダーゼ活性に対してノーマライズした。トランスフェクション実験は3連で行なった。
マウス卵黄嚢内皮細胞株C166(ATCCより入手)を、被検物質の存在下、非存在下で、37℃、48時間培養後、細胞からtotal RNAを抽出する。抽出したtotal RNA、Platinum (登録商標) 定量RT-PCR ThermoScriptTM One-Stepシステム (Invitrogen製) を用いて、抽出したtotal RNAを増幅し、Ovo2プライマー各200nM、6-FAM-標識TaqMan (登録商標) プローブを用いてABI PRISM (登録商標) 7700で検出する。被検物質の存在下で培養された細胞におけるレポーターシグナル(ΔR)を、被検物質の非存在下で培養された細胞におけるレポーターシグナルと比較し、被検物質がOvo2の発現を調節するか否かを評価する。
3.1.Ovo2-GST融合蛋白質の調製
Ovo2をコードするcDNAをpGEX4T-1ベクター (Amersham Bioscience製) にサブクローニングし、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) 融合蛋白質をE.coliで発現させ、グルタチオン−アガロースビーズ (Sigma-Aldrich製) により精製する。純度は、SDS-PAGE、CBB染色により決定する。
3.2.BIACORE(登録商標)での結合活性の測定
文献 [Anal Biochem. 1998 Dec 15; 265(2):340-50] に記載されている一般的な方法を用いる。上記手順で調製したOvo2-GST融合蛋白質 (例えば1〜10μg) を10mMの酢酸バッファー(pH 4)に溶解し、BIACORE(登録商標)のセンサーチップCM5の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。HBSバッファー(アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製)をセンサーチップに20μl/分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中からHBSバッファーに10nM〜10μMの濃度で溶解した被検化合物に切り替えて1分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。再び、薬剤を含まないHBSバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変化を記録する。また、GST及び被検物質を用いて同様の実験を行い、コントロールとする。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から被検化合物とOvo2との親和性を計算する。
上述のルシフェラーゼレポータープラスミド 2 μg、上述のOvo2発現プラスミド (pEF- Ovo2) 又は空のpEF0Aプラスミド 0.4 μg、内部コントロールのβ-ガラクドシダーゼ発現プラスミド (pEF-LacZ) 20 ngを、FuGENE 6トランスフェクション試薬 (Roche製) を用いてC166細胞 (1×105/ディッシュ) にトランスフェクトする。次いで、プラスミドが導入された細胞を、それぞれ、被検物質の存在下、非存在下で、37℃、48時間培養する。トランスフェクション実験は3連で行ない、また、Relative light unit (RLU) は、β-ガラクトシダーゼ活性に対してノーマライズする。被検物質の存在下で培養された細胞におけるRLUを、被検物質の非存在下で培養された細胞におけるRLUと比較し、被検物質がOvo2の活性を調節するか否かを評価する。
Claims (31)
- Ovo2の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有する血管新生調節剤。
- Ovo2の発現又は機能を促進する物質を有効成分として含有する、請求項1記載の剤。
- Ovo2又はその均等物を有効成分として含有する、請求項1記載の剤。
- Ovo2又はその均等物をコードする塩基配列を含有する核酸を含む発現ベクターを有効成分として含有する、請求項1記載の剤。
- 虚血性疾患または動脈疾患の予防・治療剤である、請求項2〜4いずれか記載の剤。
- 虚血性疾患または動脈疾患が虚血性心疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Buerger病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞または動脈瘤である、請求項5記載の剤。
- Ovo2の発現または機能を抑制する物質を有効成分として含有する、請求項1記載の剤。
- 以下の(a)又は(b)の核酸:
(a)Ovo2をコードする塩基配列に相補的な塩基配列を含有する核酸、
(b)Ovo2をコードする塩基配列からなる核酸もしくは転写後プロセッシングにより該塩基配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、且つハイブリダイズした状態でOvo2の転写又は翻訳を抑制する核酸、
を有効成分として含有する、請求項1記載の剤。 - 核酸が発現ベクターに含まれる、請求項8記載の剤。
- Ovo2に特異的親和性を有し、且つOvo2の機能を抑制する抗体を有効成分として含有する、請求項1記載の剤。
- 腫瘍、白血病、眼内血管新生性疾患、慢性関節リウマチ、血管腫、Basedow病または乾癬の予防・治療剤である、請求項7〜10いずれか記載の剤。
- 下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む、血管新生を調節し得る物質のスクリーニング方法:
(a)被検物質とOvo2遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
(b)被検物質を接触させた細胞におけるOvo2遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における上記遺伝子の発現量と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、Ovo2遺伝子の発現量を調節する被検物質を選択する工程。 - 下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む、血管新生を調節し得る物質のスクリーニング方法:
(a)被検物質をOvo2結合性物質に接触させる工程、
(b)上記(a)の工程に起因して生じるOvo2の活性を測定し、該活性を被検物質を接触させない場合のOvo2の活性と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、Ovo2の活性の調節をもたらす被検物質を選択する工程。 - Ovo2結合性物質が5’-G(G/C/T)GGGGG-3’を含有する核酸である、請求項13記載の方法。
- Ovo2結合性物質がSclのプロモーター領域を含有する核酸である、請求項13記載の方法。
- 核酸がレポーター遺伝子をさらに含有するものである、請求項15記載の方法。
- Ovo2の活性の上昇をもたらす被検物質を選択する血管新生促進剤を探索するための方法である、請求項13〜16いずれか記載の方法。
- 血管新生促進剤が虚血性疾患または動脈疾患の予防・治療剤である、請求項17記載の方法。
- 虚血性疾患または動脈疾患が虚血性心疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Buerger病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞または動脈瘤である、請求項18記載の方法。
- Ovo2の活性の低下をもたらす被検物質を選択する血管新生抑制剤を探索するための方法である、請求項13〜16いずれか記載の方法。
- 血管新生抑制剤が腫瘍、白血病、眼内血管新生性疾患、慢性関節リウマチ、血管腫、Basedow病または乾癬の予防・治療剤である、請求項20記載の方法。
- 請求項17記載の方法により得られる血管新生促進剤。
- 請求項18記載の方法により得られる虚血性疾患または動脈疾患の予防・治療剤。
- 虚血性疾患または動脈疾患が虚血性心疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Buerger病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞または動脈瘤である、請求項23記載の剤。
- 請求項20記載の方法により得られる血管新生抑制剤。
- 請求項21記載の方法により得られる腫瘍、眼内血管新生性疾患、慢性関節リウマチ、血管腫、Basedow病または乾癬の予防・治療剤。
- Ovo2遺伝子に変異を導入させてなるOvo2機能欠損非ヒト動物。
- ヘテロ変異動物である、請求項27記載の非ヒト動物。
- 血管新生の異常を伴う疾患のモデル動物である、請求項27又は28記載の非ヒト動物。
- 配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
- 配列番号15で示される塩基配列、又は配列番号16で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
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- 2003-12-25 JP JP2003431624A patent/JP2005187408A/ja active Pending
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WO2020223674A3 (en) * | 2019-05-01 | 2020-12-10 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for regulating adipogenesis |
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