JP4312599B2 - 女性の不妊治療のための長いペントラキシンｐｔｘ３の使用 - Google Patents

Description

（発明の背景）
本発明は、女性の受胎能のためのＰＴＸ３活性の必要性に関する。ＰＴＸ３活性を低下させる遺伝的突然変異の結果女性の不妊が起こる。

ペントラキシンは、環状多量体構造によって特徴付けられるタンパク質のスーパーファミリーである［１］。古典的な短いペントラキシンＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）はそれぞれヒトおよびマウスにおける急性期タンパク質であり、炎症性介在物質に応答して肝臓において産生される；特にこれらはインターロイキン−６によって直接的に誘導される［２−３］。

長いペントラキシンは古典的な短いペントラキシンと類似性を共有するが、Ｃ−末端ペントラキシンドメインに結合した非関連性の長いＮ−末端ドメインが存在すること、および遺伝子組成、染色体局在、細胞源、誘導性刺激、および認識されるリガンドに関して異なっている。長いペントラキシン３（ＰＴＸ３）は、内皮細胞においてインターロイキン−１（ＩＬ−１）誘導性遺伝子として同定された最初の長いペントラキシンであり［４］、線維芽細胞において壊死因子−α（ＴＮＦα）誘導性遺伝子としても同定された［５］。ＰＴＸ３は主要な炎症性介在物質（ＬＰＳ、ＩＬ−１、ＴＮＦα）による刺激によってマクロファージおよびその他の細胞タイプおよび組織によっても産生される［６−８］。ＰＴＸ３は、Ｃ−末端の２０３−アミノ酸のペントラキシン−様ドメインおよびＮ−末端の１７８−アミノ酸の非関連ドメインからなる。分泌された場合、グリコシル化されたＰＴＸ３プロトマー（４５ｋＤａ）がアセンブリーして１０−２０の多量体を形成する［９］。ＰＴＸ３は古典的なペントラキシンリガンド（例えば、ホスホエタノールアミン、ホスホコリン、高ピルビン酸アガロース、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、またはゼラチン）とは結合しない。対照的に、ＰＴＸ３は高いアフィニティーでペントラキシンドメインによってＣ１ｑに特異的に結合する［９］。ＰＴＸ３血漿レベルは正常条件では非常に低いが（２ｎｇ／ｍｌ以下）、感染を含むいくつかの病的条件では上昇する（１０−１００ｎｇ／ｍｌ）［１０］。

ＰＴＸ３より後にクローニングされたその他の長いペントラキシンには、精子先体において発現するモルモットアペキシン［１１、１２］、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）からのＸＬ−ＰＸＮ１［１３］、ラット神経細胞ペントラキシン１（ＮＰ１）［１４］、ヒトＮＰ１およびＮＰ２［１５、１６］、マウスＮＰ１およびＮＰ２［１５］、Ｎａｒｐ［１７］、および推定膜内在性ペントラキシンである神経細胞ペントラキシン受容体（ＮＲＰ）［１８−９］が含まれる。長いペントラキシンのインビボの機能は明白にはわかっていない。

ＰＴＸ３は２つの構造ドメインからなる：既知の分子のいずれとも関連性を有さないＮ−末端ドメインおよび短いペントラキシン（例えばＣ−反応性タンパク質）と類似のＣ−末端ドメインからなる（Breviario et al.、J. Biol. Chem.、267:22190-22197、1992）。ヒトＰＴＸ３（ｈＰＴＸ３）とマウスＰＴＸ３（ｍＰＴＸ３）の間には有意な類似性は見出されていない。ヒトおよびマウスＰＴＸ３遺伝子の間の同一性の程度は８２％であり、同類置換を考慮すると９０％に達する（Introna et al.、Blood、87:1862-1872、1996）。これら遺伝子はシンテニーの染色体部位に位置する。ｈＰＴＸ３とｍＰＴＸ３配列の間の高度な類似性は進化の過程でのペントラキシン類の高度な保存の徴である（Pepys & Baltz、Adv. Immunol.、34:141-212、1983）。ペントラキシン類についてはGewurz et al. (Curr. Opin. Immunol.、7:54-64、1995）によって概説されている。

国際特許出願第ＷＯ９９／３２５１６号には、癌、炎症および感染性疾患の治療のためのＰＴＸ３の使用が記載されている。

米国特許第５７６７２５２号には、ペントラキシンファミリーに属する神経細胞のための成長因子が記載されている。

国際特許出願第ＷＯ０２／３６１５１号には、自己免疫疾患の治療薬および予防薬の調製のためのＰＴＸ３の使用が記載されている。

上記に対して、胚幹細胞における相同的組換えによって作成したＰＴＸ３遺伝子座において遺伝的に改変されたマウスおよびその効果の研究により、女性の受胎能におけるＰＴＸ３活性の関与が明かとなった。

ＰＴＸ３活性を操作して、それによって女性の受胎能を調節することが本発明の目的である。女性の不妊の効果を回復させることができ、所望により生殖能力を上昇または低下させることができ、女性の受胎能を高めることができ、またはそれらの組合せが可能となる。試験管内受精などのその他の治療には、侵入型の手順および複雑な技術が要求される。したがって女性の受胎能に影響を与える治療法の必要性が示される。その他の利点および改良点は以下に記載され、本明細書の記載から明かであろう。

医薬組成物、それらの使用および調製方法およびさらなる目的を以下に記載する。

（発明の概要）
本発明の目的は、女性の生殖能力に影響を与えるのに十分な量のＰＴＸ３活性を変化させる薬剤を含む医薬組成物を提供することである。ＰＴＸ３活性が必要とされるという発見は、生殖に関して欠陥がある女性患者または雌の動物の治療のため、または女性の生殖能力の診断のために利用できる。

そのような薬剤の例には、ＰＴＸ３遺伝子に対応するポリヌクレオチド、それによってコードされるＰＴＸ３タンパク質に対応するポリペプチド、および、その他のＰＴＸ３遺伝子発現を上昇または低下させるものが含まれる。これには、本明細書においてリストされるヌクレオチドおよびアミノ酸配列、突然変異または多型を含むそのアナログ、およびその他のその変異体（例えば、部分長オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチド）が含まれる。少なくとも１つのＰＴＸ３部分および異種部分（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）とのハイブリッドもそれぞれキメラ遺伝子または融合タンパク質変異体と考えられる。遺伝子ベクターを用いて少なくとも１つのＰＴＸ３部分を宿主に運ぶことができ、あるいは少なくとも1つのＰＴＸ３部分を宿主において転写および／または翻訳させることによって、もしくは少なくとも部分的に精製された成分を利用することによって発現させることができる。活性化剤（例えば、インターロイキン−６、ＮＦ−κＢ、受容体アゴニスト）または阻害剤（例えば、抗体、ＩκＢ、受容体アンタゴニスト）もＰＴＸ３活性を調節する薬剤として用いることができる。該薬剤はヒト由来のものでも非ヒト動物（例えば哺乳類）由来のものでもよい。

対象は女性患者または雌の動物であればよい。組成物は全身投与に適したものでも局所投与（即ち女性の生殖器官内またはその周辺）に適したものでもよい。組成物は不妊治療に用いてもよいし、避妊薬として用いてもよい。

本発明の別の目的は、女性の不妊治療または女性の避妊を必要とする対象に、それぞれ対象の生殖能力を上昇または低下させるのに十分な量の医薬組成物を投与する方法を提供することである。

女性対象におけるＰＴＸ３を検出し、この量をその女性の生殖能力と相関させることが、本発明のさらなる目的である。ヒトＰＴＸ３遺伝子座における突然変異により染色体３ｑ２４−ｑ２８にマッピングされた；相互作用する遺伝子の突然変異により、それらはＰＴＸ３遺伝子座の外側にマッピングされた。ＰＴＸ３変異体の機能は、既知のＰＴＸ３配列またはその他のペントラキシン配列との比較により決定することができる；フォールディング、グリコシル化、分泌、または多量体の形成；受容体結合またはシグナル伝達；生殖能力に対する効果、受胎能、または不妊；あるいはそれらの組合せなどがある。

本発明のさらなる目的は、ＰＴＸ３活性を変化させる少なくとも１つの薬剤をスクリーニングすることであり、それによって女性の生殖能力に影響を与え、また、そのような方法によって薬剤を得ることである。そのような薬剤のいくつかの例が開示される。

本発明のさらなる別の目的は、ＰＴＸ３活性が低下するように遺伝的に改変された哺乳類細胞および非ヒト哺乳類を提供することである。これらにより生殖能力に関する欠陥（例えば、不妊）に対するインビトロおよびインビボのモデルが提供される。これらを用いてスクリーニングすることができ、また、治療薬候補を試験することができる。

本発明のさらなる側面は以下の記載および特許請求の範囲およびその要約から当業者に明かであろう。

（図面および配列表の簡単な説明）
図１Ａ−１Ｆは、ＰＴＸ３−／−マウスからの卵丘（Cumuli oophori)の異常な形態を図示する。卵丘をｈＣＧ処理の１４−１６時間後に収集した。これらの収集後（ＡおよびＢ）または４時間後（ＣおよびＤ）を示す。ＰＴＸ３＋／＋マウス（ＡおよびＣ）において、顆粒膜細胞が、緻密で安定な卵丘を卵母細胞のまわりに形成している（矢印で示す）。ＰＴＸ３−／−マウス（ＢおよびＤ）において、これらは卵母細胞にゆるく結合しており、卵丘は４時間の間に完全に消失した。ＰＴＸ３＋／＋（Ｅ）およびＰＴＸ３−／−（Ｆ）マウスの卵巣の組織学的検査は、正常な胞状濾胞を示す。

図２Ａ−２Ｄは、卵巣組織におけるＰＴＸ３ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す。（Ａ）ホルモンにより誘導した過剰排卵（ＰＭＳ処理および４８時間後のｈＣＧ処理）の後の卵巣におけるＰＴＸ３発現の動力学をｍＲＮＡレベルにおいて示した。卵巣をＰＭＳ処理の０、６、１６、２４または４８時間後、そしてｈＣＧ処理の２、６、１６、２４または４８時間後に収集した。１０μｇのトータルＲＮＡを各レーンにロードした。ゲルの臭化エチジウム染色を下のパネルに示す。（Ｂ）卵巣のインサイチュハイブリダイゼーション：顆粒膜細胞は成熟した濾胞においてのみＰＴＸ３ｍＲＮＡを発現する。（Ｃ）卵丘（Ｃ．Ｏ．）、卵丘細胞（Ｃ．Ｏ．細胞）および卵母細胞によるＰＴＸ３発現を、ウェスタンブロッティングにより検出した。卵丘を４匹のＰＴＸ３＋／＋およびＰＴＸ３−／−の過排卵した雌から収集した；卵丘細胞および卵母細胞を７および１４匹のＰＴＸ３＋／＋の過排卵した雌からそれぞれ得た。（Ｄ）ＰＴＸ３−／−（下パネル）およびＰＴＸ３＋／＋（上パネル）マウスからの卵丘の位相差（右パネル）および免疫蛍光分析（左パネル）を示す。

ヒトｃＤＮＡおよびその翻訳されたオープンリーディングフレーム（それぞれ配列番号：１−２）、マウスｃＤＮＡおよびその翻訳されたオープンリーディングフレーム（それぞれ配列番号：３−４）、ヒトおよびマウス上流調節領域（それぞれ配列番号：５−６）、およびＰＣＲプライマー（配列番号：７−１０）の配列を配列表に示す。ヒトおよびマウスのアミノ酸配列アラインメントは、３８１残基のうち３１２残基が同一であることを示し（８２％）、３５１残基が少なくとも類似であることを示す（９２％）。両方の遺伝子は３つのエキソンを含む：１つめは４３アミノ酸残基をコードし、２つめは既知の配列モチーフと高い類似性を有さない１３５アミノ酸残基をコードし、３つめはペントラキシンと類似性を有する２０３アミノ酸残基をコードする。ペントラキシン−様ドメインは２つのＣｙｓ残基を位置１６２および２５４において含み、コンセンサス「ペントラキシン−様」配列、Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｘａａ−Ｓｅｒ（配列番号：１１）を含む。

（本発明の特定の態様の記載）
ＰＴＸ３核酸の全部または一部に対応するポリヌクレオチド（例えば、転写産物または遺伝子）には、突然変異体およびその他のその変異体が含まれるが、ＰＴＸ３活性を上昇させること（例えば、ＰＴＸ３ポリペプチドのインビボまたはインビトロの発現）、遺伝的欠陥を補うかあるいは正しくすること（例えば、トランスフェクション、感染）、ＰＴＸ３活性を低下させること（例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）、または相補的ポリヌクレオチドを検出することに利用することができる。同様にＰＴＸ３タンパク質に対応するポリペプチドには、突然変異体およびその他のその変異体が含まれるが、機能的であれば直接ＰＴＸ３活性を提供すること、阻害性抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストを作成すること、相互作用タンパク質を結合アッセイによって同定、単離または検出すること（例えば、抗体、受容体アゴニストまたはアンタゴニスト）に利用することができる。

自然の(native)ＰＴＸ３はグリコシル化されている（位置２０３における潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位）。多量体ＰＴＸ３複合体は相対分子量約９００ｋＤａでゲル濾過において溶出された。それは、非変性および非還元条件下でのゲル電気泳動において約４４０ｋＤａの主なバンド（例えば、約４５ｋＤａのプロトマーが、９−または１０−マー）として移動し、５４０−６００ｋＤａの範囲の２つのマイナーバンドを伴った。円二色性分析により、ＰＴＸ３はおもにβ−シート構造を含み、いくつかのα−ヘリックス構造をともなうことが示された。ＰＴＸ３ポリペプチドまたはその複合体は、ＰＴＸ３遺伝子産物に対する結合分子（例えば、抗体、天然または非天然のペプチド擬似体）を介して間接的に同定、単離または検出することができる。

生殖能力に影響を与えるのに有用な候補化合物は、代表的なＰＴＸ３ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと相互作用することができ、診断または治療方法を提供する能力についてスクリーニングされ得る。これらの化合物はアッセイに用いることができ（例えば、診断）、あるいは治療に用いることができる；便宜に、これらをアッセイキットとしてパッケージに入れるか、医薬形態とすればよい。Ｃ１ｑに対する結合は特異的かつ飽和性であり（１つのＰＴＸ３プロトマーが１つのＣ１ｑ受容体に結合した）、Ｋｄが７．４ｘ１０^−８Ｍであった。動力学的分析により、Ｋ_ｏｎが２．６ｘ１０^５Ｍ^−１ｓ^−１でありＫ_ｏｆｆが４ｘ１０^−４ｓ^−１であることが算出された。Ｃ１ｑ結合に対するリガンドはＰＴＸ３のペントラキシン−様ドメインであり、結合には多量体化が必要である（おそらく分子内システイン結合による）。その他のＰＴＸ３に対する受容体を特徴付けることもできる。

本発明の別の態様は、ハイブリッドＰＴＸ３ポリヌクレオチドまたはポリペプチド：例えば、転写キメラまたは翻訳融合体(translational fusion)である。転写キメラにおいては、少なくとも１つの異種遺伝子の転写調節領域がＰＴＸ３ポリヌクレオチドに連結されるか、あるいはＰＴＸ３遺伝子の転写調節領域が少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドに連結される。ＰＴＸ３ポリペプチドのリーディングフレームと少なくとも１つの異種アミノ酸ドメインを翻訳融合体のために正しく連結する。異種領域またはドメインとしてレポーターまたは選抜マーカーを用いると、ＰＴＸ３ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の突然変異のＰＴＸ３機能に対する効果を簡単にアッセイすることができる。特に、転写キメラを用いてＰＴＸ３遺伝子の調節プロモーターの位置を決定することができ、翻訳融合体を用いて細胞内でのＰＴＸ３タンパク質の局在を決定することができる。例えば、ＰＴＸ３からの転写調節領域、リガンド結合ドメイン、または多量体化ドメインをハイブリッド分子に含めるとよい。

「ＰＴＸ３」とは、天然に見られるヒトおよびマウス遺伝子およびタンパク質、突然変異体および多型、およびその変異体形態（例えば天然には見られない、突然変異体およびアナログ）そしてそのアナログをいう。ＰＴＸ３の化学構造は、天然または非天然の共有結合によって連結した天然または非天然のヌクレオチドのポリマー（即ち、ポリヌクレオチド）であってもよく、あるいは、天然または非天然の共有結合によって連結した天然または非天然のアミノ酸のポリマー（即ち、ポリペプチド）であってもよい。天然および非天然のヌクレオチドおよびアミノ酸の非限定的なリストとして、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）の表１−４を参照されたい。

「突然変異体」は、より高活性または低活性の、少なくとも１つの機能を有するＰＴＸ３ポリヌクレオチドおよびポリペプチドであり、その機能は、変更されたか欠失した既知の機能、天然には存在しない新規な機能、またはその組合せである。「多型」は、遺伝的に変化しているが、その変化が必ずしも機能的結果を示さないＰＴＸ３ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。「アナログ」は、異なる化学構造を有するが、自然の遺伝子またはタンパク質と比較して実質的に同等の機能を有するＰＴＸ３ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。ＰＴＸ３機能については本明細書において詳細に記載する。突然変異体、多型、およびアナログは、遺伝子工学または化学合成によって作ることができるが、後者の方が非天然ヌクレオチド、アミノ酸、または結合に好適である。

「オリゴヌクレオチド」および「オリゴペプチド」は、短いポリヌクレオチドおよびポリペプチドである（例えば、３０、６０、９０または１８０未満のヌクレオチドまたはアミノ酸）。これらは本明細書に記載するＰＴＸ３ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の断片であってよい。一般に、これらは化学合成によって作ることができるが、より長いポリヌクレオチドまたはポリペプチドの切断によって作ることもできる。電気泳動および／または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、短い産物を精製するために好適な生化学的技術である。

ＰＴＸ３遺伝子はストリンジェントなハイブリダイゼーションを用いて同定することができる：例えば、オリゴヌクレオチドについては４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃；５０塩基以上のポリヌクレオチドについては５００ｍＭ ＮａＨＰＯ_４ ｐＨ７．２、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４５℃または６５。ＰＴＸ３タンパク質は、ストリンジェントな結合を用いてプローブとして抗体またはその他の結合タンパク質を用いて同定することができる：例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０界面活性剤、１％ＢＳＡ、室温。洗浄条件は、塩濃度および温度をシグナル対ノイズ比が特異的ハイブリダイゼーションまたは結合に十分になるように調整することによって変化させうる。そのような単離方法により、既知のＰＴＸ３核酸またはタンパク質を検出するプローブを用いて、それぞれ未知のＰＴＸ３−関連核酸またはタンパク質を同定することができる。例えば、核酸またはタンパク質の混合物を１または複数の物理的、化学的、および／または生物学的特性によって分離し、次いでＰＴＸ３核酸またはタンパク質の存否をプローブの特異的結合によって検出することができる。プローブは、既知のＰＴＸ３遺伝子またはタンパク質の有無を検出するため、またはいまだ知られていないＰＴＸ３遺伝子またはタンパク質を同定するために利用することができる。ブロッキングおよび洗浄条件を変化させて標的特異的および／またはバックグラウンドが少ない核酸ハイブリダイゼーションまたはタンパク質結合シグナルを得ることができる。

「単離」された産物は少なくとも部分的にその起源の細胞（例えば、ヒト、その他の哺乳類、細菌、酵母）または製造源から精製されているものである。例えば、起源の細胞の溶解液と比べて、単離された産物は少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または９８％、その他の化学的に類似な溶質（例えば、ポリヌクレオチドについては全核酸またはポリペプチドについては全タンパク質）から精製されたものである。ヌクレオチドまたはアミノ酸の化学的に合成されたポリマーについては、純度は早期に終結または阻害された産物との比較によって決定することができるが、実践的には、精製せずに単離されたものとみなされる。精製は、例えば細胞分画、遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、沈降、特異的結合、またはその組合せなどの生化学的技術によって達成できる。一般に、溶媒（例えば、水）および機能的に不活性な化学物質（例えば、塩および緩衝液）は純度の決定においては無視される。所望の産物を単離するために、クローニングがよく用いられる。それゆえ、医薬組成物はＰＴＸ３活性の全てではないにしろほとんどの原因である薬剤を含んでいてもよい。

「異種」の意味は文脈によって異なる。例えば、異種ヌクレオチド領域をライゲーションしてキメラを形成するという場合、該領域が天然には同一線上に並んでは見られない（例えば、ヒト−由来ＰＴＸ３ポリヌクレオチドがヒト非−ＰＴＸ３転写調節領域に連結している）ということを意味する。もう１つの例は、ヒトにおいて同一線上に並んでは見られないアミノ酸ドメインの融合である（例えば、ヒト非−ＰＴＸ３多量体化ドメインにヒト−由来ＰＴＸ３ポリペプチドが連結している）。ヌクレオチド領域のライゲーションまたはアミノ酸ドメインの連結であって、一方がヒト由来であり、他方が動物由来の場合、これらは異なる種に由来するために異種である。さらに別の例において、ベクターまたは発現コンストラクトの異種宿主細胞へのトランスフェクションまたは、異種非−ヒト生物のトランスジェネシス(transgenesis)とは、ベクターまたは発現コンストラクトが天然にはその細胞または生物のゲノムに見られないということを意味する。「組換え」産物は、組換えポリヌクレオチドのための異種領域のライゲーションまたは組換えポリヌクレオチドのための異種ドメインの融合の結果である。組換えは、精製された酵素を用いて遺伝子操作でインビトロで行なってもよく、培養細胞を用いてインビボで行なってもよい。

本発明の１つの態様によると、ＰＴＸ３遺伝子およびその転写産物に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖）をプローブまたはプライマーとして用いることができる。そのようなポリヌクレオチドは全体の遺伝子または転写されたメッセンジャーを含む全長のものであってもよく（例えば、ファージミド、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体すなわちＹＡＣ、細菌人工染色体すなわちＢＡＣ、またはその他のベクター中の組換えクローン）、Ｎ−末端「ＰＴＸ３−特有」またはＣ−末端「ペントラキシン−様」ドメイン、エキソンまたは特定のコード領域、あるいはＰＴＸ３遺伝子またはその転写産物に独特のより短い配列であるがその一部しか含まないものでもよい。プローブは安定にその標的に結合し、ＰＴＸ３ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的なハイブリダイゼーションシグナルを生じるものであるが、プライマーは、重合またはライゲーションの反復サイクルにより特異的な増幅シグナルが生じるため、その標的にそれほど安定に結合するものでなくてもよい。ポリヌクレオチドは少なくとも１５、３０、４５、６０、９０、１２０、２４０、３６０、４８０、６００、７２０、１２００、２４００、５０００、１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ、１００Ｋ、２５０Ｋ、または５００Ｋヌクレオチド長（その中間の範囲を含む）のものがよい。

典型的には、ヌクレオチド配列は、配列番号：１または３のコード領域と比較して、少なくとも８５％の配列同一性を示すものがよく、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示すものがよい。この場合、存在し得る欠失または挿入は排除し、これらは関連を有するものとして考慮する。アミノ酸配列は、配列番号：２または４と比較して少なくとも９０％の配列同一性で関連するものが考慮される。しかし９５％またはそれ以上の配列同一性が好ましく、９８％またはそれ以上の配列同一性がより好ましい。

複雑な数学的アルゴリズムの使用は、配列が多くのギャップを導入することなくアラインされる場合は必要ない。しかしそのようなアルゴリズムは当該技術分野で知られており、市販のソフトウェアパッケージにおけるデフォールトパラメーターを用いて実行される。Doolittle、Of URFS and ORFS、University Science Books、1986; Gribskov and Devereux、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、1991；およびそこで引用される文献を参照されたい。配列ペアの間のパーセンテージ同一性はＢＥＳＴＦＩＴコンピュータプログラムにおいて実行されるアルゴリズムを用いて計算することができる（Smith and Water-man、J. Mol. Biol.、147:195-197、1981; Pearson、Genomics、11:635-650、1991）。配列相違を計算するもう１つのアルゴリズムは、迅速なデータベースサーチに好適であり、ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムにおいて実行される（Altschul et al.、Nucl. Acids Res.、25:3389-3402、1997）。

保存的アミノ酸置換（例えば、以下のペア、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｒｇ／ＬｙｓまたはＧｌｎ／Ａｓｎ）も比較を行なうときに考慮される。というのはこれらのアミノ酸残基に対の化学的類似性により多くの場合機能的に同等となることが予期されるからである。ポリペプチドの生物学的機能を保存することが予測されるアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸残基の化学特性（例えば、疎水性、親水性、側鎖電荷、またはサイズ）を保存するであろう。生物学的機能の機能的同等性または保存は、本明細書に記載する構造決定方法およびバイオアッセイにより評価することができる。したがって、アミノ酸配列は、２つのポリペプチドの間で少なくとも９０％の配列類似性をもって関連していると考えられる；しかし、９５％またはそれ以上の配列類似性が好ましく、９８％またはそれ以上の配列類似性が最も好ましい。

自然のヌクレオチド配列において用いられるコドンは、宿主に好適なコドンを適用することによって異種宿主における翻訳に利用され得る。これによりポリペプチドに化学構造に実質的に変更をともなわずに、異種宿主の翻訳機構をが収容されることになる。

ＰＴＸ３ポリペプチドおよびその変異体（即ち、デリーション、ドメインシャッフリングまたは重複、挿入、置換、またはその組合せ）は、構造と機能の関係を決定するのに有用である（例えば、アラニンスキャニング、保存的または非保存的アミノ酸置換）。例えば、ＰＴＸ３タンパク質のフォールディングおよびプロセシング、ＰＴＸ３プロトマーの分泌および多量体の形成、受容体に対するリガンド結合、シグナル伝達、またはその組合せである。Wells (Bio/ Technology、13:647-651、1995）および米国特許第５５３４６１７号を参照されたい。ＰＴＸ３を用いたランダム突然変異誘発または遺伝子シャッフリングによる定方向進化を利用して選択の原則にしたがって新規かつ向上した機能を獲得することができる可能性がある。突然変異体、多型、およびアナログＰＴＸ３ポリペプチドは、好適な突然変異体、多型、およびアナログＰＴＸ３ポリヌクレオチドによってコードされる。ＰＴＸ３の構造と活性の関係は、内因性ＰＴＸ３を有するかあるいは有さない宿主細胞にトランスフェクトされた発現コンストラクトによって産生される変異体ポリペプチドを用いて研究することができる（即ち、ＳＡＲ研究）。したがって、ＰＴＸ３ポリペプチドの別々のドメインにおける突然変異は、タンパク質機能の活性の上昇または低下に関連付けることができる。

ＰＴＸ３ヌクレオチド配列を用いて少なくとも１つの異種ペプチドドメイン（例えば、アフィニティーまたはエピトープタグ）を有する融合ポリペプチドを産生させることが出来る。オリゴペプチドは特異的抗体の生成およびＰＴＸ３−特異的抗体のエピトープマッピングに有用である。ポリペプチドは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、あるいはそれ以上のアミノ酸長（その中間の範囲を含む）のものがよい。オリゴペプチドを特異的結合ペア（例えば、抗体−ジゴキシゲニン（digoxygenin）／ハプテン／ペプチド、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−グルタチオン、マルトース結合タンパク質−マルトース、タンパク質ＡまたはＧ／免疫グロブリン、ポリヒスチジン−ニッケル）の１つのアフィニティータグに結合させてもよい。全長ＰＴＸ３ポリペプチド（例えば、配列番号：２または４）あるいはより短い断片（例えば、Ｎ−末端またはＣ−末端ドメイン）のいずれを産生してもよい；任意に異種ペプチドドメインを含んでいてもよい。ＰＴＸ３ポリペプチドは化学的手段によって合成してもよく、天然源から精製してもよく、トランスフェクトされた宿主細胞において合成してもよく、またはその組合せによって得てもよい。

ＰＴＸ３ヌクレオチド配列またはその部分を用いてＰＴＸ３発現をモニターすることができ、ＰＴＸ３配列を決定することができ、および／または、ＰＴＸ３変異体を検出することができる。本発明はまた、ハイブリダイゼーションプローブおよび増幅プライマー（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション連鎖反応、その他の等温増幅反応）を提供する。そのようなプライマーのペアを用いて、細胞内のＰＴＸ３転写産物存在量を定量するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを行なうことができる。増幅プライマーは、１５から３０ヌクレオチド長であり（好ましくは約２５ヌクレオチド）、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかにアニーリングし（好ましくはペアは、それぞれの鎖に相補的である）、配列番号：１、３および５−６またはその相補鎖内の３’末端で終結する。それゆえ本発明は、細胞内の同族のＲＮＡおよびＤＮＡを定量するためのＰＴＸ３プライマーおよびその他のオリゴヌクレオチドの開発および利用に有用である。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合は、溶液中で起こってもよいし、基体上で起こってもよい。アッセイフォーマットは、結合形態と非結合形態の分離を要求するものであってもしないものであってもよい。検出可能なシグナルは直接的または間接的に結合した複合体のどこかに付着するものでもよく、競合的に測定されるものでもよく、増幅されるものでもよく、またはその組合せであってもよい。ブロッキングまたは洗浄工程を介在させて感受性および／または特異性を向上させてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、相互作用タンパク質、または結合分子の基体への、結合の前、後、あるいは結合中での付着により、付着しなかった種を捕捉することができる。そのような固定化は、洗浄条件下で安定に基体に結合するものである。米国特許第５１４３８５４号および第５４１２０８７号を参照されたい。

転写開始、転写産物の安定性、転写産物のタンパク質産物への翻訳、タンパク質安定性、糖タンパク質プロセシング、フォールディングまたは分泌の速度、またはその組合せに影響を与えることによって、遺伝子発現における変化が細胞内に現れることがある。遺伝子、転写産物、またはポリペプチドは、インビトロ転写、インビトロ翻訳、ノザンハイブリダイゼーション、核酸ハイブリダイゼーション、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ラン・オン（run-on）転写、サザンハイブリダイゼーション、代謝的タンパク質標識、抗体結合、免疫沈降（ＩＰ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標識または組織化学的染色、顕微鏡およびデジタル画像解析、および蛍光標識細胞分析またはソーティングのような技術によってアッセイすることもできる。

その産物を簡単にアッセイできるレポーターまたは選抜マーカー遺伝子を用いて簡便な検出を行なうことができる。レポーター遺伝子には、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色および赤色蛍光タンパク質（それぞれＧＦＰおよびＲＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ラクタマーゼ、およびその誘導体（例えば、青色ＥＢＦＰ、シアンＥＣＦＰ、黄緑色ＥＹＦＰ、脱安定化ＧＦＰ変異体、安定化ＧＦＰ変異体、またはClontechによってLIVING COLORS蛍光タンパク質として販売されている融合変異体）が含まれる。レポーター遺伝子は、好ましくは色素原、蛍光、または発光シグナルによってアッセイされる同族の基質を用いることがある。あるいは、アッセイ産物に、その同族の抗体またはアフィニティー樹脂が入手できる異種エピトープをタグ付加してもよい（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＳＶ４０Ｔ抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、マルトース結合タンパク質）。耐性を与える選抜マーカー遺伝子が存在する薬剤の例は、アンピシリン、ジェネティシン／カナマイシン／ネオマイシン、ハイグロマイシン、プロマイシン、およびテトラサイクリンである。代謝酵素（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ）を感受性宿主細胞、または栄養要求株において選抜マーカーとして用いることができる。例えば、メトトレキサートは、ＤＨＦＲ選抜マーカーに連結するポリヌクレオチドのコピー数を増やすことができ、あるいはガンシクロビル（gancyclovir）はウイルス性チミジンキナーゼ選抜マーカーを負に選抜することができる。

ポリヌクレオチドをリンカーオリゴヌクレオチドに連結させてもよいし、特異的結合ペア（例えば、抗体−ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチドエピトープ、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼまたはＧＳＴ−グルタチオン、レクチン−糖、マルトース結合タンパク質−マルトース、ポリヒスチジン−ニッケル、タンパク質Ａ／Ｇ−免疫グロブリン）の一方のメンバーに結合させてもよい。ポリヌクレオチドを結合メンバーをコードするヌクレオチド配列とのライゲーションによって結合させてもよい。ポリペプチドを特異的結合ペアの一方に結合させてもよく、これはそのような連結または結合されたポリヌクレオチドによってコードされる融合体を産生することにより、あるいは、化学的クロスリンキングにより結合メンバー上の反応性部分に直接化学的結合させることによって行なうことができる。そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアフィニティー試薬として用いて、転写産物または発現ベクターのタンパク質産物の特異的結合を含む相互作用を同定、単離および検出することができる。転写産物またはタンパク質産物のアフィニティー結合の前または後に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに付着したメンバーはその同族の結合メンバーに結合することができる。これによって溶液中または担体に固定化された複合体を産生することができる。プロテアーゼ認識部位（例えば、エンテロキナーゼについては、因子Ｘａ、ＩＣＥ、セクレターゼ、トロンビン）を隣接するドメインの間に含めて、このようなドメインを分離する、および／またはタンパク質活性を不活性化する部位特異的タンパク質分解を行なってもよい。

プローブおよびプライマーを用いてＰＴＸ３遺伝子またはその変異体を同定することができる。例えば、本明細書において同定されたヒトＰＴＸ３遺伝子に対して特異的なプローブまたはプライマーを用いて該遺伝子の有無を検出することができ、それによりそれぞれ該遺伝子のソースの存否を推測することができる。ＰＴＸ３遺伝子における遺伝子の多型および突然変異は、プローブの中間の位置またはプライマーの３’末端における潜在的にミスマッチする１または複数の塩基（これはその部位における標的配列がその塩基に相補的であるか否かに応じて、それぞれその標的に対するプローブまたはプライマーの結合を安定化または脱安定化させる）を位置付けることによって、特異的に検出することができる。

遺伝子の多型および突然変異は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ヌクレアーゼに保護された断片（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、ＨまたはＴ１）、あるいは増幅産物によっても検出することができる。複雑な遺伝子のフィンガープリントについて、各成分の同定は必要ではない。というのは、隣り同士の目視比較により、簡単に差を検出することができるからである（例えば、ＲＡＰＤ）。差はまた、ＰＴＸ３タンパク質の、ゲル電気泳動または等電点電気泳動による分子量（ＭＷ）または等電点（ｐＩ）の変化によってもそれぞれ検出することができる。

ＰＴＸ３タンパク質の存在を、ヒトまたは動物の体液または組織におけるＰＴＸ３活性の同定として利用することができる。体液は血液、血液産物（例えば、血漿、血清）、洗浄液、痰、などであってよい。組織の例としては、上皮（例えば、肺）または粘膜（例えば、口、膣）が挙げられるが、感染は全身的なものでもよく、その他のタイプの組織を含むものでもよい。シグナルは固形組織については生体内原位置で検出してもよく、分散したまたは破砕された組織については溶液中で検出してもよく（例えば、希釈または非希釈体液、洗浄液）、または細胞塗沫標本またはタッチプレップ（touch prep）において検出してもよい。受精可能な卵母細胞をＰＴＸ３発現によって選択することができる。

シャトルベクターまたは発現ベクターの構築
シャトルベクターまたは発現ベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれかのキメラ形態の組換えポリヌクレオチドである。ベクターの物理的形態は、一本鎖でも二本鎖でもよい；そのトポロジーは、直鎖状でも環状でもよい。ベクターは好ましくは二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）または細胞への導入後にｄｓＤＮＡへと変換されるものである（例えば、プロウイルスとしての宿主ゲノムへのレトロウイルスの挿入）。ベクターは１または複数の哺乳類、昆虫、植物または菌類の遺伝子またはウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、サイトメガロウイルス、フォウルポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、モロニー白血病ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス）からの領域を含んでいてもよく、遺伝子操作に好適な領域（例えば、選抜マーカー、制限エンドヌクレアーゼのための複数の認識部位を有するリンカー、インビトロ転写のためのプロモーター、インビトロ複製のためのプライマーにアニーリングする部位）を含んでいてもよい。ベクターはタンパク質およびその他の核酸と担体中で（例えば、ウイルス粒子へのパッケージング）または化学物質中に凝縮して（例えば、カチオン性ポリマー）結合して細胞または組織を標的として入ることができるものであってもよい。ベクターポリヌクレオチドおよびそれらを女性の生殖系（例えば、子宮内膜、卵巣）に導入する方法の選択は当業者に可能な範囲である。

発現ベクターはさらに遺伝子発現のための調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライス供与または受容部位、ポリアデニル化シグナル、細胞局在化配列）を含んでいてもよい。様々なレベルの転写が、薬剤（例えば、テトラサイクリン／ｔｅｔＲまたはＦＫ５０６／ＦＫＢＰ）に応答する調節システムを有する薬剤を用いて達成することができる。ベクターはさらに１または複数のスプライス供与および受容部位を発現領域中に含んでいてもよい；翻訳開始のための発現領域の上流のＫｏｚａｋコンセンサス配列を含んでいてもよい；そして発現領域の下流に、翻訳の停止を確保するための３つのフォワードリーディングフレームにおける複数の停止コドン、１または複数のｍＲＮＡ分解シグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、および切断シグナルを含んでいてもよい。イントロンを含まない発現領域については（例えば、ｃＤＮＡからのコード領域）、スプライス供与および受容部位のペアは有っても無くてもよい。しかしそれは、誘導条件下においてのみ１または複数の下流領域の発現が望ましい場合、１または複数のｍＲＮＡ分解シグナルを含めるために有用である。

シャトルベクターはさらに、宿主ゲノムに組み込まれたベクターの複製を可能にするために複製起点（ＡＲＳ）を含んでいてもよいし自己複製エピソームとして存在してもよい。セントロメアおよびテロメア配列を、それぞれ染色体分離および染色体末端保護の目的で含めてもよい。宿主ゲノムへのランダムまたは標的化した組み込みにより、よりいっそうベクターの維持が確実となるが、エピソームは選択圧によって維持されることができ、あるいはベクターが一過性にのみ存在するような用途ではより好ましい。

ベクターはシャトルベクターであってかつ発現ベクターであるものがよい。

発現領域は、問題とするいずれの遺伝子に由来するものであってもよく、プロモーターに対していずれの方向で提供してもよい。アンチセンス方向での発現領域は、アンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを作るのに有用である。遺伝子は宿主細胞または生物由来のものであってもよく、その同じ種からのものであってよいし、新たに設計されたものでもよい。ＰＴＸ３の機能を共有する遺伝子の１または複数のドメインの融合体をアッセイして、機能を付与する１または複数のドメインを決定してもよいし、多機能融合タンパク質を提供してもよい。融合体は、エピトープタグ（例えば、ＧＦＰ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＭＹＣ）によって作ることもできる。遺伝子のなかにはオルターナティブな転写産物を生じるものもあり、ホモ多量体またはヘテロ多量体としてアセンブリーするサブユニットをコードするものもあり、プロテアーゼによる切断によって活性化されるプロペプチドを作るものもある。発現領域は翻訳融合体をコードしてもよい；ポリペプチドをコードする領域と少なくとも１つの異種ドメインをコードする領域のオープンリーディングフレームが正しく連結されるとよい。レポーターまたは選抜マーカーが異種ドメインとして用いられる場合、融合タンパク質の発現を簡単にアッセイまたは局在化することができる。異種ドメインはアフィニティーまたはエピトープタグであってもよい。

候補化合物のスクリーニング
本発明の別の態様は、不妊治療または避妊に有効な化学物質または遺伝的化合物、その誘導体およびそれらを含む組成物である。治療を必要とする対象に投与される量、その剤形、そして投与時期および送達経路は受胎能の低下、生殖能力の上昇または低下、または受胎能の向上に効果的なものとする。そのような量、剤形および投与時期および薬剤送達経路の決定は、当業者に決定可能な範囲である。

スクリーニング方法は、候補化合物の生物体への投与、または候補化合物の細胞とのインキュベーション、および遺伝子発現の調節の有無を決定する工程を含んでいるとよい。そのような調節は、受胎能または不妊に関連するかそれを引きおこす変化を部分的または完全に補償する活性の上昇または低下であろう。遺伝子発現は、転写開始または伸長の速度；転写産物の安定性；翻訳開始または伸長の速度；タンパク質の安定性；タンパク質プロセシング、フィールディングまたは分泌の速度；活性なコンフォメーションのタンパク質の割合；多量体の形成；受容体への結合；またはその組合せのレベルで上昇または低下するであろう。例えば、米国特許第５０７１７７３号および第５２６２３００号を参照されたい。ハイスループットスクリーニングアッセイが可能である（例えば、並行処理および／またはロボット工学の使用による）。

スクリーニング方法は、レポーターコンストラクトを含む細胞と共に候補化合物をインキュベートする工程（該レポーターコンストラクトは、アッセイ可能な産物をコードする下流遺伝子にシス配置で共有結合したＰＴＸ３の転写調節領域を含むものである）；および該アッセイ可能な産物の産生を測定する工程を含むものとしてもよい。ＰＴＸ３遺伝子の上流領域とのキメラまたは開始ＡＴＧコドンとのインフレームでの翻訳融合体を用いて転写調節領域を提供すればよい。例えば、配列番号：５または６のいずれの領域を用いてもよい。アッセイ可能な産物の産生を増加させる候補化合物を遺伝子発現を活性化させる薬剤として同定できるが、アッセイ可能な産物の産生を低下させる候補化合物を遺伝子発現を阻害させる薬剤として同定することもできる。例えば、米国特許第５８４９４９３号および第５８６３７３３号を参照されたい。

ＰＴＸ３転写の調節（例えば、転写調節領域および同族転写因子）はマウスおよびヒト遺伝子について特徴づけされている（Altmeyer et al.、J. Biol. Chem.、270:25584-25590、1995; Basile et al.、J. Biol. Chem.、272:8172-8178、1997）。ＰＴＸ３転写は特定の細胞タイプに特異的である。ＰＴＸ３転写のサイトカイン刺激に対する応答は、ＮＦκＢおよびＩκＢ転写因子および細胞特異的因子との相互作用に媒介されているようである。

スクリーニング方法は、候補化合物の存在下または不在下でレポーターコンストラクトからのインビトロ転写を測定する工程（該レポーターコンストラクトは転写調節領域を含む）、および候補化合物の存在によって転写が変化したか否かを判定する工程を含むものであってもよい。インビトロ転写は、セルフリー抽出物、細胞の部分的に精製された画分、精製された転写因子またはＲＮＡポリメラーゼ、またはその組合せを用いてアッセイすることができる。例えば、米国特許第５４５３３６２号；第５５３４４１０号；第５５６３０３６号；第５６３７６８６号；第５７０８１５８号；および第５７１００２５号を参照されたい。

インビボでの転写または翻訳活性の測定技術は当該技術分野で知られている。例えば、核ラン・オンアッセイを用いてレポーター遺伝子の転写を測定することができる。レポーター遺伝子の翻訳は、翻訳産物の活性を判定することにより測定することができる。レポーター遺伝子の活性は、１または複数のポリヌクレオチド産物の転写（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは転写産物）、ポリペプチド産物の翻訳（例えば、タンパク質のイムノアッセイ）、レポータータンパク質自体の生物学的活性を判定することにより測定することができる。

ＰＴＸ３遺伝子発現またはタンパク質活性を上昇または低下させる化合物について、その生殖能力に対する効果、受胎能を低下させるか、あるいは受胎能を向上させるかについてアッセイすればよい。

エピトープ−タグ付加されたＰＴＸ３タンパク質またはＰＴＸ３タンパク質に特異的な抗体を用いて、多量体またはＰＴＸ３−含有複合体をアフィニティー精製することができる。候補化合物は、その存在量（即ち複合体の定常状態レベル）、アセンブリー、分泌の速度、複合体の生物活性を低下させる能力についてスクリーニングしてもよい。例えば、ＰＴＸ３タンパク質とその受容体の結合を増強または阻害する化合物を同定してもよい。ＰＴＸ３タンパク質を前記のように基体に結合させてもよい。候補化合物を、少なくとも部分的に精製された形態において、あるいは粗混合物として、複合体の少なくとも１つのその他の成分の存在下で固定化したＰＴＸ３タンパク質とインキュベートする。さらに、複合体の１または複数の成分を基体に結合させ、候補化合物を、少なくとも部分的に精製された形態か、または粗混合物としての複合体のさらなる成分の存在下または非存在下でＰＴＸ３タンパク質の存在下で固定化された成分と共にインキュベートすればよい。結合条件の例は、以下に示す。インキュベーションの後、すべての非−結合成分を洗い流し、基体に結合した複合体の１または複数の成分を残すとよい。ＰＴＸ３タンパク質を含む複合体形成は、溶液中で起こるものでもよく、ＰＴＸ３−含有複合体は固定化していてもしていなくてもよい。還元はＰＴＸ３多量体を脱アセンブリーさせる可逆反応である。複合体の各成分の量は、洗浄およびその他のタンパク質からの複合体の分離後に定量することができるし（例えば、異種アッセイ）、分離せずに定量することもできる（例えば、同種アッセイ）。例えば、それは免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはウェスタンブロッティング、を用いて決定することができる。複合体形成は、形成依存的なエピトープまたは形成後にマスクされるエピトープに対する抗体の結合によって判定することもできる。複合体を、複合体の少なくとも１つの成分の基体への結合によって形成の前または後に固定化すればよい。複合体の基体への結合は、近接検出、例えば、ＳＰＡまたはＢｉａＣｏｒｅによって分離せずに検出することができる。複合体の１または複数の結合成分の量を、候補化合物を用いて、また、用いずに決定する。所望の化合物は、ＰＴＸ３存在量、アセンブリー、分泌、多量体形成、生物活性、またはその組合せを上昇または低下させるものである。

治療用の遺伝的化合物
活性化は、ＰＴＸ３活性を有するか、ＰＴＸ３活性を上方制御するタンパク質をコードする発現領域（例えば、ＰＴＸ３遺伝子の全長コード領域またはその機能的部分；そのハイパーモルフィック（hypermorphic）突然変異体、ホモログ、オルソログまたはパラログ；急性期誘導物質；ＰＴＸ３遺伝子に作用する正の転写因子）またはＰＴＸ３活性の抑制を解除するタンパク質をコードする発現領域（例えば、少なくとも部分的にＰＴＸ３遺伝子の負の調節因子の発現を阻害するもの）を含有する発現ベクターに誘導をかけることにより達成することができる。転写または翻訳の過剰発現、および過剰発現するタンパク質機能は、遺伝子活性化のより直接的なアプローチである。あるいは、下流発現領域は、ゲノムの遺伝子座への直接の相同的組換えを導くことができ、それにより遺伝子の内因性転写調節領域を発現カセットまたは特定の遺伝子突然変異と置換することができる。

発現ベクターを宿主細胞または非ヒト動物にトランスフェクションまたはトランスジェネシス技術によって導入してもよい。例えば、１または複数の化学物質（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、脂質、ポリマー）、遺伝子銃、エレクトロポレーション、裸の（naked）ＤＮＡ技術、マイクロインジェクション、またはウイルス感染を用いればよい。導入された発現ベクターは細胞または動物の宿主ゲノムに組み込まれるか、あるいはエピソームとして維持される。脂質担体を作るための多くの中性および荷電脂質、ステロール、およびその他のリン脂質が知られている。例えば、中性脂質としては、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；アニオン性脂質としては、ジオレオイルフォスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）；カチオン性脂質としては、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルジアミド−グリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、および１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミドテトラアセテート（ＤＯＳＰＥＲ）が挙げられる。ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を組み込むと送達の効率および／または安定性を向上させることができる。ＦＵＧＥＮＥ６、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ、ＰＦＸ−１、ＰＦＸ−２、ＰＦＸ−３、ＰＦＸ−４、ＰＦＸ−５、ＰＦＸ−６、ＰＦＸ−７、ＰＦＸ−８、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０、およびＬＩＰＯＴＡＸＩ脂質は特許製剤である。ポリマーはカチオン性のデンドリマー、ポリアミド、ポリアミドアミン、ポリエチレンまたはポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン、またはその組合せとすることができる；あるいは、ポリマー物質を成形してナノ粒子またはマイクロ粒子としてもよい。裸のＤＮＡ技術においては、ベクター（通常はプラスミド）は細胞または組織に送達され、そこでそれは宿主ゲノムに組み込まれても組み込まれなくてもよく、その細胞または組織への取りこみに先立ってベクターに結合する化学トランスフェクション剤（例えば、脂質、ポリマー）を用いなくてもよい。

動物、昆虫、菌類、または細菌細胞のいずれにトランスフェクトしてもよい；トランスジェネシスは非ヒト動物に用いることもできる。遺伝子からの相同領域を用いて宿主ゲノムの特定の遺伝子座に直接組み込むことができ、それによってその遺伝子座の遺伝子の発現を調節することができるし（例えば、ＰＴＸ３遺伝子座におけるプロモーター非含有レポーターまたは選抜マーカーの相同的組換え）、ＰＴＸ３遺伝子の異所コピーを導入することができる。ポリペプチドは細胞抽出物を用いてインビトロで産生することもできるし、遺伝子操作された細胞を用いてインビボで産生することもできる。

発現ベクターを用いて、下方制御されたか完全に欠損した遺伝子の機能を置換することができ、部分的に欠損した遺伝子の機能を補うことができ、または遺伝子の活性と競合させることができる。したがって、宿主の同族の遺伝子の活性は、ネオモルフィック（neomorphic）、ヒポモルフィック（hypomorphic)、ハイパーモルフィック(hypermorphic）、または正常であってよい。機能の置換または補充は、上記の方法によって達成することができ、遺伝子操作された細胞または生物体は下流領域の高発現または低発現について選抜することができる（例えば、転写または翻訳された産物の量、または産物の生物機能の評価）。発現した下流領域およびネオモルフィック、ハイパーモルフィックまたは正常遺伝子の間の競合は、多量体タンパク質複合体において存在する合成相互作用により達成できる。あるいは、負の調節因子または細胞内で機能を阻害する一本鎖抗体を発現ベクターの下流領域にコードさせてもよい。それゆえ、少なくとも部分的なＰＴＸ３活性の阻害が、アンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡ干渉技術によって達成され、ここで、発現ベクターは、ＰＴＸ３ヌクレオチド配列の部分に対応する非修飾アンチセンス分子、リボザイム、またはｓｉＲＮＡ分子に対応する下流領域を含む。

ＰＴＸ３遺伝子発現またはタンパク質活性を上昇または低下させる化合物は、その生殖能力に対する効果、受胎能の低下、または受胎能の向上についてアッセイすればよい。

アンチセンスポリヌクレオチドはｍＲＮＡ転写産物にハイブリダイズすることにより直接翻訳を阻害するか、またはそのような遺伝子の転写産物を分解することにより作用することができる。アンチセンス分子は、少なくとも１つの遺伝子の機能性部分を、発現ベクターにおいてプロモーターの下流の領域としてアンチセンス方向に用いることによって組換えにより作ることができる。化学修飾された塩基または結合を用いて、分解を抑制するか体内での半減期を長くすることによってアンチセンスポリヌクレオチドを安定化させることができる（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオネート、ペプチド核酸）。アンチセンス分子の配列は、翻訳開始部位に相補的なものとすればよい（例えば、標的ヌクレオチド配列の−１０から＋１０）。

リボザイムは、ＲＮＡ転写産物またはゲノムの特異的切断を触媒する。作用機構は、相補的な細胞またはウイルスＲＮＡへの配列−特異的ハイブリダイゼーションに続くヌクレオチド鎖切断による。阻害は、リボヌクレアーゼＨ活性に依存的である場合も依存的でない場合もある。リボザイムは標的ＲＮＡに相補的な１または複数の配列、およびＲＮＡ切断に必要な触媒配列を含む（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、斧頭（axehead）モチーフ）。例えば、対象のＲＮＡ中の潜在的リボザイム切断部位はまず、以下のトリヌクレオチド配列を含むリボザイム切断部位について対象のＲＮＡを走査することによって同定される：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。一旦同定されると、切断部位を含む対象ＲＮＡの領域に対応する約１５から約２０のリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが、候補オリゴヌクレオチド配列を不適切に変えるような予測される構造的特徴、例えば、二次構造について評価される。候補配列の好適性は、次いでそのハイブリダイズ能力および切断標的ＲＮＡによって評価され得る。リボザイムは組換えによって産生されたものでも化学的に合成されたものでもよい。

ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する少なくとも２０−２５塩基対の二本鎖ＲＮＡのことをいう。標的ＲＮＡに対応する二本鎖ｓｉＲＮＡは、その鎖の別々の転写によって形成されたものでも、反対の方向性である一対のプロモーターからの連動した転写によって形成されたものでも、少なくとも部分的に自己相補性配列を有する一本鎖ＲＮＡのアニーリングによって形成されたものでもよい。あるいは、許容される修飾塩基によるいくらかの置換を有する少なくとも約２１から約２３塩基対の二本鎖オリゴリボヌクレオチドを化学的に合成してもよい（例えば、２つのリボヌクレオチドの３’オーバーハングを有する２１リボヌクレオチドの二本鎖）。しかし、ｓｉＲＮＡ配列の内部のミスマッチは干渉を無効にする。ＲＮＡ干渉によって標的化された領域は、好ましくは遺伝子のコード領域として転写される。干渉はおそらく２１から２３塩基対はなれた部位の標的ＲＮＡを切断する細胞内因子（例えば、リボヌクレアーゼＩＩＩ）に依存する；切断部位の位置は、ガイドｓｉＲＮＡの３’末端よりむしろ５’末端によって規定されるようである。少量のｓｉＲＮＡによるプライミングにより、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅後に干渉がトリガーされる。

ＰＴＸ３に対して特異的な抗体を用いて阻害または検出を行なってもよい。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、動物（例えば、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ）を抗原によって免疫化し、任意に同じ抗原または関連する抗原に対してアフィニティー精製を行なうことによって調製できる。抗原は、自然のタンパク質、タンパク質分解または遺伝子操作によって生じた断片、融合タンパク質、またはインビトロで翻訳または合成されたタンパク質であって、抗体が結合する少なくとも１または複数のエピトープを含むものであればよい。抗体断片は、タンパク分解による切断または遺伝子操作によって調製できる；ヒト化抗体および一本鎖抗体は、フレームワーク分子に対して抗体の抗原結合ドメインからの配列を移植することによって調製できる。その他の結合分子（例えば、リガンド−受容体結合のアゴニストまたはアンタゴニスト）は、抗原に特異的に結合するメンバーについてコンビナトリアルライブラリー（例えば、ファージ・ディスプレー・ライブラリー）をスクリーニングすることによって調製することができる。抗原は遺伝子によってコードされる全長タンパク質であってもその１または複数の断片であってもよい。抗体は、抗体によって認識されるエピトープが異なる種間でどれほど保存されているかに応じて、ＰＴＸ３に対して特異的であってもよく、その他のペントラキシンと交差反応するものでもよい。例えば、米国特許第５４０３４８４号；第５７２３２８６号；第５７３３７４３号；第５７４７３３４号；および第５８７１９７４号を参照されたい。

ＰＴＸ３−特異的結合試薬（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド）を診断的に用いてＰＴＸ３核酸またはタンパク質を検出してもよいし、ＰＴＸ３活性の阻害用に治療的に用いてもよい（例えば、転写、翻訳、プロセシング、分泌、受容体結合）。特に、ＰＴＸ３転写およびＰＴＸ３の受容体への結合に影響を与える試薬が望ましい。

本発明の化合物またはその誘導体を、医薬として用いてもよく、本明細書に記載する１または複数の用途を有する医薬組成物を処方するために用いてもよい。

本発明の目的はそれゆえ、女性対象における生殖能力を向上させる薬物の調製のための組換えヒトＰＴＸ３の使用である。

本発明のさらなる目的は、ヒトＰＴＸ３ｃＤＮＡを含有するウイルスベクターまたはプラスミドベクターの、生殖能力の向上を必要とする女性対象の治療のための使用である。

本発明のさらなる目的は、ＰＴＸ３タンパク質のヒト女性における生殖能力の診断マーカーとしての使用である。

本発明のさらなる目的は、女性対象における生殖能力に影響を及ぼす能力を評価する、医薬化合物のスクリーニングのための標的タンパク質としてのＰＴＸ３の使用である。

本発明の化合物は、培養中の細胞にインビトロで投与してもよく、インビボで生体内の細胞に投与してもよく、あるいはエキソビボ（生体外）で対象の体外で細胞に投与し、同じまたは別の対象の体内に戻してもよい。対象は生殖年齢にある女性（雌）である；対象は、妊娠を望んでいるものであっても、妊娠の危険を有するものでもよい。

化合物またはその誘導体を用いて、薬物またはその他の医薬組成物を製造してもよい。さらに医薬上許容される担体を含む組成物およびさらに対象への組成物の送達に有用な成分を含む組成物の使用は当該技術分野で知られている。そのような担体およびその他の成分の本発明の組成物への添加は当業者の技術範囲内である。

医薬組成物は、女性の生殖系（例えば、子宮内膜、卵巣）への直接適用に適する製剤として投与してもよく、腸または血液循環の通過に適した製剤として投与してもよい。あるいは、医薬組成物を培地に添加してもよい。活性の化合物に加えて、そのような組成物は医薬上許容される担体およびその他の投与の促進および／または取りこみの促進のための公知の成分を含んでいてもよい。組成物は、単回用量で投与してもよく、様々な時期に投与される複数回用量で投与してもよい。

医薬組成物はいかなる公知の経路によって投与してもよい。例えば、組成物を粘膜、肺、局所投与してもよいし、またはその他の限局性または全身性投与をしてもよい（例えば、経腸および非経口）。特に、生殖系の中または周囲においてＰＴＸ３活性を有効な量で達成することが望まれる。これは局所投与、生殖器官の近くへの移植、または腟坐薬の使用を含む。「非経口」という語には、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下内、およびその他の注射または注入技術が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

用量および投与時期、剤形、および投与経路の好適な選択は、対象における好適な応答（即ち、効力）を達成する目的で、不適切な毒性またはその他のそれに対する害を避けて（即ち、安全性）行なうとよい。それゆえ「有効」とは、所望の効果（例えば、生殖能力への影響、受胎能の向上、あるいは受胎能の低減など）を達成するための条件の常套的な操作を含むような選択を意味する：。

１日１回の女性対象に対して投与される大量瞬時投与製剤が、便利な投与スケジュールである。あるいは、有効用量を１日おき、週１回、または月１回投与してもよい。医薬組成物における活性成分の用量レベルは、対象における化合物またはその誘導体の一過性または持続性濃度を達成するため、また所望の治療応答を得るために変動させ得る。しかし、所望の治療効果を達成するために必要とされる用量より低いレベルから開始して、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることも当業者の技術範囲内である。

投与は女性対象の生殖周期（例えば、月経）に応じて時期を決めてもよい。実際的には、体温またはホルモンレベルを、生殖における排卵および月経のような事象の代わりとして用いればよい。

化合物の投与量は以下のような因子に依存する。例えば、化合物の生理活性および生物学的利用率（例えば、体内における半減期、安定性、および代謝）；化合物の化学的特性（例えば、分子量、疎水性、および溶解度）；投与経路および投与計画；その他。特定の対象に対して達成されるべき特定の用量レベルは様々な因子、例えば、年齢、健康状態、病歴、体重、１または複数のその他の薬剤との組合せ、および疾患の重篤度、に依存することが理解されよう。

「治療」という語は、とりわけ患者における不妊の１または複数の症状を低減または緩和することを意味する。特定の対象について、症状の改善、その悪化、退行、または進行は、客観的または主観的指標によって決定し得る。治療にはまた、その他の既存の治療態様および薬剤（例えば、過剰排卵）との組合せも含まれる。したがって組合せ治療を行なってもよい。

ヘテロ接合性のＰＴＸ３遺伝子について遺伝的に改変された雌および雄のマウスは正常であって妊娠可能である。それらの間の育種により、予想された数のホモ接合性のヌルマウスがメンデル比で生じた。しかし、ホモ接合性の雌と雄の間の育種（ＰＴＸ３−／−）は、完全に不妊である。育種結果は、ホモ接合性の雄は、通常野生型（ＰＴＸ３＋／＋）またはヘテロ接合性（ＰＴＸ３＋／−）の雌と交尾させた場合妊娠可能であるが、ＰＴＸ３−／−雌は、雄の遺伝子型とかかわりなく常に不妊であることを示す。交尾実験は、ＰＴＸ３−／−およびＰＴＸ３＋／＋雌の間で、４日間の自然交尾期間の後または過剰排卵の後で交尾プラグの頻度に差が無いことを示すものであった（表１）。自然排卵した卵の数（表１）（ＰＴＸ３＋／−において平均マウス１匹当たり７、ｎ＝４、そしてＰＴＸ３−／−マウスにおいてマウス一匹当たり７．８、ｎ＝８）またはホルモンにより誘発して排卵した卵の数（ＰＴＸ３＋／−において平均マウス１匹当たり３５、ｎ＝９、そしてＰＴＸ３−／−マウスにおいてマウス一匹当たり２７、ｎ＝１８）は、＋／＋および−／−マウスにおいて同程度であった。データは、４回行なったうち１回の代表的な実験からのものである。卵母細胞および透明帯の形態は正常であり、最初の極体が、ＰＴＸ３＋／＋およびＰＴＸ３−／−マウスの両方からの、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）処理の１６時間後に得た卵母細胞の約５０％において観察された（表１）。これらのデータは、排卵および卵母細胞成熟は正常であって、不妊の原因ではないことを示す。対照的に、ＰＴＸ３−／−マウスの輸卵管から収集した卵丘では形態的異常（図１Ｂおよび１Ｄ）が一致して観察された。というのは、顆粒膜細胞がゆるく卵母細胞に結合しており、放射冠を形成していなかった。ＰＴＸ３−／−由来の卵丘は、インビトロで不安定であり、顆粒膜細胞は自然に収集後（ｈＣＧ後１４−１６時間、または自然交尾後０．５日目）短時間（ＰＴＸ３−／−において１５−６０分、それに対して、ＰＴＸ＋／＋卵丘において数時間）で卵母細胞から脱落し、迅速に卵母細胞が裸出した。

妊娠が中断されるか否か、それはいつかを調べるために、自然排卵またはホルモンにより誘発した排卵の後の交尾後の様々な時点において接合体および胚を収集した。生存可能な精子が欠損マウスの輸卵管において見られたにもかかわらず、どの卵母細胞もインビボで二細胞段階に発達してはおらず（１．５日目）（表２）２つの前核を有する卵母細胞も観察されなかった（０．５日目）。さらに不妊の原因を調べるために、ＰＴＸ３＋／＋胚盤胞をＰＴＸ３−／−偽性妊娠雌に移植したが、正常な妊娠および分娩が観察された。これによって着床およびその後の段階の欠陥という可能性が排除された。

ＰＴＸ３−／−卵母細胞が受精し得たか否かを評価するために、インビトロ受精（ＩＶＦ）を成体雄からの野生型精子を用いて行ない、ＰＴＸ３＋／＋またはＰＴＸ３−／−卵母細胞を授精させた（表２）。ＩＶＦはまず、透明帯を有さない卵母細胞について行ない、ＤＮＡ−特異的蛍光色素 Hoechst 33258で染色して融合を観察した。このような条件下で、正常精子のＰＴＸ３−／−卵母細胞の原形質膜に対する結合および、精子のＰＴＸ３＋／＋（７７％）およびＰＴＸ３−／−（６８％）卵母細胞に対する比較融合能力を観察した（表２）。これらの結果は、精子と卵との結合および融合がＰＴＸ３の不在下で起こりうることを示唆するものであった。ｈＣＧ処理の１３−１５時間後に収集したインタクトな卵丘を授精させ、ＰＴＸ３−／−卵母細胞の受精および二細胞段階への進行を、ＰＴＸ３＋／＋卵母細胞に対応する頻度で観察した（表２）。これらのデータは卵母細胞の質がＰＴＸ３欠損マウスにおいて正常であることを確認するものである。卵丘がインビボで重要な役割を果たすが、インビトロ受精ではそうではないことから、これらの結果から、卵丘における異常がＰＴＸ３−／−雌の不妊の原因であることが示唆される。

卵巣組織におけるＰＴＸ３ｍＲＮＡの発現をノザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーションにより調べた。ホルモンにより誘導した過剰排卵の後、ＰＴＸ３ｍＲＮＡ発現（全組織におけるノザンブロッティングにより評価した）がｈＣＧ処理の二時間後に開始し、１２−１４時間後まで続いた（図２Ａを参照されたい）。これは、排卵の数時間後までの排卵前増殖に対応する［２０］。卵丘のヒアルロニダーゼ処理および卵母細胞からの分離によって得た顆粒膜細胞は、ＰＴＸ３転写産物を発現した。

過剰排卵をさせない正常条件下での発現をインサイチュハイブリダイゼーションにより調べた。未処理の雌の器官のインサイチュハイブリダイゼーション（図２Ｂ）により、卵巣におけるＰＴＸ３ｍＲＮＡ発現が確認され、これは成熟した濾胞の顆粒膜細胞に限定されており、卵母細胞における転写の証拠は見られなかった。

卵巣組織におけるＰＴＸ３タンパク質発現を次いで分析した。ウェスタンブロッティングにより、ＰＴＸ３はＰＴＸ３＋／＋卵丘に結合していることが示された（特に細胞害マトリックスに結合している）。なぜなら、卵丘細胞を卵母細胞から分離させるヒアルロニダーゼ処理により、免疫反応性が阻害されたからである（図２Ｃ）。ホルモンにより誘導した過剰排卵後（ｈＣＧの１３−１５時間後）に収集したＰＴＸ３＋／＋および−／−卵丘の免疫蛍光分析により、ＰＴＸ３と卵丘の細胞外マトリックスとの結合が確認された（図２Ｄ）。

これらのデータは、ＰＴＸ３欠損により起こる不妊は、卵母細胞の受精の欠陥によることを示唆する。というのはＰＴＸ３欠損は生殖のその他の段階、つまり交尾から排卵、着床および妊娠に影響を与えないからである。ＰＴＸ３転写産物は正常な卵巣においてはもっぱら成熟した濾胞の顆粒膜細胞、および分離した顆粒膜細胞によって発現し、卵母細胞によっては発現されない。ＰＴＸ３ｍＲＮＡ発現は、ホルモンにより誘導した過剰排卵の後には卵巣組織全体において誘導される。最後にＰＴＸ３タンパク質は単離した卵丘の細胞外マトリックスにおいて同定された。これはおそらく顆粒膜細胞によって産生されたものである。ＰＴＸ３−／−マウスに分析により、不妊の決定因子が、異常な卵丘であることが同定された。ＰＴＸ３−／−雌からの卵丘は形態的異常を示した。これらは明確な放射冠を欠き、インビトロ培養において卵母細胞から迅速に脱離した。ＰＴＸ３欠損卵丘の「脆弱性」が、この特有のマトリックスにおけるＰＴＸ３の構造的役割に影響を与えている可能性がある。あるいはマトリックス溶解の調節機構の変化に影響を与えている可能性がある。これらの結果によりＰＴＸ３が新規な卵丘の細胞外マトリックスの構成要素であり、受胎能に重要な役割を果たしているということが同定された。卵丘は、インビトロでは必須ではないが、インビボ受精において重要な役割を果たしている。それゆえ卵丘の異常はＰＴＸ３−／−雌性マウスの不妊に関与していると考えられる。

材料および方法
ＰＴＸ３−／−マウスの作成
マウスＰＴＸ３遺伝子のエキソン１から２にわたる８．５ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を用いて、これにＩＲＥＳ−ＬａｃＺカセット、そしてｐＷＨ９プラスミドからのＰＧＫ−ネオマイシン耐性遺伝子を、最初のコードＡＴＧの７１ｂｐ下流のエキソン１中の部位に組み込んだ。ＥＳ細胞の培養方法、選抜および同定は、［２０］に記載のように行なった。５つの別々に標的化したＲ１ＥＳ細胞クローンをサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定した。これには、プローブＡ（第二イントロン中のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ ７５０ｂｐ断片）を用いた。ランダムな組みこみの証拠はプローブＢ（ネオマイシン耐性遺伝子由来）によって検出されなかった。２つのＥＳ細胞クローンをＣ５７Ｂｌ／６胚盤胞に注入した。マウスの遺伝子型同定のために、尾部生検からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。これには以下の２つのプライマーセットを用いた（プライマーセット１：５’−ＡＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＣＧＡＴ−３’、配列番号：７；５’−ＴＣＣＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡ−３’配列番号：８；プライマーセット２：５’−ＣＴＧＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣ−３’、配列番号：９；５’−ＴＣＣＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡ−３、配列番号：１０）。これらはそれぞれ野生型アレルまたは標的化されたアレルを検出するものである。表現型分析を独立したクローンに由来する２つの系統について行ない、結果は、１２９Ｓｖ−Ｃ５７Ｂｌ／６混合系(mixed)および１２９Ｓｖ純系の遺伝的背景において確認された。ＰＴＸ３＋／＋マウスは１２９Ｓｖ−Ｃ５７Ｂｌ／６ ＰＴＸ３−／−同腹仔または、Charles River、Calco、Italy.から得た１２９ＳｖまたはＣ５７Ｂｌ／６マウスであった。

動物に関する手順およびその世話は、治験ガイドライン（institutional guidelines）に従い、これは国内（4D.L. N.116、G.U.、suppl. 40、18-2-1992)および国際法(EEC Council Directive 86/609、OJ L 358、1、12-12-1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals、U.S. National Research Council、1996)によるものであった。動物の使用数を最小にするために限りない努力を払った。

ＰＴＸ３ｍＲＮＡおよびタンパク質
ＲＮＡを細胞から抽出し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（GIBCO BRL）を用いて精製した。ノザンブロッティング、プローブ標識、およびハイブリダイゼーション（結合および洗浄）条件は［２１］に記載のように行なった。

インサイチュハイブリダイゼーション：４％パラホルムアルデヒドで固定し、液体窒素で凍結した野生型およびＰＴＸ３−／−卵巣から収集したクリオスタット切片（１３μｍ）を用いてインサイチュハイブリダイゼーションを［２２］に記載のように行なった。簡単に説明すると、プロテイナーゼＫおよび０．２Ｎ ＨＣｌで透過処理したスライドを、６５℃で一晩、ＰＴＸ３ｃＤＮＡ含有ベクター（pBluescript）からStratageneＲＮＡ転写キットを用いて作成した放射性標識したリボプローブとともにインキュベートした。次いで、標本をホルムアミド含有緩衝液で洗浄し、空気乾燥し、写真乳剤に浸し、４℃で暗箱の中で少なくとも１０日間インキュベートした。現像後、スライドを２μｇ／ｍｌの Hoechst 33258色素の溶液で対比染色した。ウェスタンブロット分析のために、過排卵した雌から収集したインタクトな卵丘、卵丘細胞、または卵母細胞から得た全細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐａｇｅ）で分離し、ニトロセルロースフィルター（Hybond ECL、Amersham）に電気ブロットし、精製ビオチン化−抗マウスＰＴＸ３ポリクローナルハムスター血清（１μｇ／ｍｌ）で、次いでストレプト−アビジン−ＨＲＰ（BIOSPA、Italy）で標識した。標識したタンパク質を増強化学発光（ECL、Amersham）により検出した。

卵母細胞および胚収集、インビトロ受精、および胚移植
卵丘、接合体、および胚を、自然交尾後の未処理の雌の輸卵管または子宮から収集した［２０］。過剰排卵を５ユニットの妊娠雌ウマ血清（PMS、Folligon、Intervet）および４８時間後の５ユニットのヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（hCG、Corulon、Intervet）による処理により誘導した。卵丘を交尾後様々な時期またはｈＣＧ処理の１３−１５時間後に収集した。卵丘細胞および卵母細胞をヒアルロニダーゼ処理によって分離した［２０］。

過排卵した雌から得た卵のインビトロ受精（ＩＶＦ）を［２０］に記載のようにインタクトな卵丘を用いて、または、透明帯を有さない卵を用いて行なった［２０］。これらは１μｇ／ｍｌのHoechst色素によってＭ１６培地（Sigma）［２３］中で染色されており、ＢＤＦ雄からの精子を用いた。受精および精子と卵との融合はインタクトな卵丘については授精の翌日に二細胞段階胚を数えることにより、透明帯を有さない卵については授精の４時間後に蛍光授精精子を有する卵を数えることにより評価した。

胚移植は［２０］に記載のように行ない、２．５日偽性妊娠ＰＴＸ３−／−雌の子宮に移植した３．５日ＰＴＸ３＋／＋胚盤胞を用いた。

参考文献
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本明細書において引用する特許、特許出願およびその他の刊行物は、引用によりその全体が本明細書に含まれる。

特許請求の範囲およびその法律的な均等物の範囲が意味するところに含まれるすべての改変および置換は本発明の枠内に含まれる。「含む」という移行句を用いる請求項は、その他の要素がその請求項の範囲に含まれてもよいことを意味する；本発明は、「含む」という用語ではなく、「実質的に〜からなる」という移行句を用いても記載され（即ち、それらが実質的に本発明の作用に影響を与えない場合、その他の要素がその請求項の範囲に含まれてもよいことを意味する）、また「からなる」という移行句を用いても記載される（即ち、本発明に通常付随する不純物または重要ではない活性を除き、請求項に挙げられた要素のみが請求項の範囲に含まれてよいことを意味する）。３つの移行句のいずれも本発明の請求の範囲に用いられ得る。

本明細書において記載された要素は、請求の範囲に明示的に断りの無い限り特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、特許請求の範囲に記載される明細書からの限定ではなく、特許により法的に保護される範囲の決定の基礎となるものである。

対照的に、従来技術の特定の態様が特許請求の範囲に記載された本発明を予測したり新規性を喪失させない程度に従来技術は明示的に本発明から除外される。特定の態様において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの種が特許請求の範囲において引用されていてもよい。ただし、自然の(native)核酸またはタンパク質は排除される（例えば、配列表に示されていないヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有するもの）。例えば、遺伝コードの縮重を利用して配列番号：２をコードするヌクレオチド配列を有するが配列番号１ではない、ポリヌクレオチドを提供してもよい。同様に、配列番号：２のアミノ酸残基の１または複数を変更することによって、マウスおよび／またはヒトタンパク質と同一ではないが機能的に同等なＰＴＸ３ポリペプチド（例えば、少なくとも９０％の同一性）を提供してもよい。

本発明がその精神または基本的特徴から逸脱することなくその他の特定の形態において実施化できることが当業者にとって明らかである。記載された態様は単に本発明を例示するものであって、限定するものではない。なぜなら本発明に与えられる法的保護範囲は、本明細書ではなく添付の特許請求の範囲によって示されるからである。

（原文に記載なし）

Claims (1)

1. ヒト女性における生殖能力を診断するためのPTX3タンパク質を含む診断マーカー。

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