PL205928B1 - Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej pentraksyny PTX3 oraz białka PTX3 - Google Patents

Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej pentraksyny PTX3 oraz białka PTX3

Info

Publication number
PL205928B1
PL205928B1 PL368413A PL36841302A PL205928B1 PL 205928 B1 PL205928 B1 PL 205928B1 PL 368413 A PL368413 A PL 368413A PL 36841302 A PL36841302 A PL 36841302A PL 205928 B1 PL205928 B1 PL 205928B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ptx3
leu
protein
glu
ala
Prior art date
Application number
PL368413A
Other languages
English (en)
Other versions
PL368413A1 (pl
Inventor
Alberto Mantovani
Original Assignee
Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sigma Tau Ind Farmaceuti filed Critical Sigma Tau Ind Farmaceuti
Publication of PL368413A1 publication Critical patent/PL368413A1/pl
Publication of PL205928B1 publication Critical patent/PL205928B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

Opis wynalazku
Tło wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy aktywności PTX3 koniecznej dla płodności kobiet. Genetyczna mutacja, której skutkiem jest obniżenie aktywności PTX3 wywołuje u kobiet niepłodność.
Pentraksyny należą do nadrodziny białek, charakteryzującej się cykliczną multimeryczną strukturą (1). Klasycznym przykładem krótkiej pentraksyny białka C-reaktywnego (CRP) i składnika surowicy amyloidu P (SAP) są białka fazy ostrej występujące, kolejno, u człowieka i myszy, produkowane w wątrobie w odpowiedzi na mediatory zapalenia; w szczególności wzbudzane bezpośrednio przez interleukinę-6 (2-3).
Długie pentraksyny wykazują podobieństwo do klasycznych krótkich pentraksyn, ale różnią się obecnością niespokrewnionej długiej N-końcowej domeny, przyłączonej do domeny C-końcowej pentraksyny, jak również organizacją genomową lokalizacją chromosomów, źródłem komórkowym, bodźcami indukującymi oraz rozpoznawanymi ligandami. Długa pentraksyna 3 (PTX3) jest pierwszą długą pentraksyną zidentyfikowaną jako gen ulegający ekspresji pod wpływem interleukiny-1 (IL-1) w komórkach endotelialnych (4), oraz jako gen uruchamiany czynnikiem nekrozy nowotworu-α (TNFa), w fibroblastach (5). PTX3 jest również produkowana przez makrofagi oraz inne typy komórek i tkanek pod wpływem działania mediatorów zapalenia (LPS, IL-1, TNF-alfa) (6-8). PTX3 składa się z C-końcowej pentraksyno-podobnej domeny zawierającej sekwencję 203 aminokwasów, oraz z odmiennej N-końcowej domeny zbudowanej ze 178 aminokwasów. Glikolizowane protomery PTX3 (45 kDa), w trakcie sekrecji skupiają się formując 10-20 multimerów (9). PTX3 nie wiąże się z klasycznymi ligandami pentraksyny, do których należą fosfoetanoloamina, fosfocholina, wysokopirogronianowa agaroza, kolagen IV, fibronektyna lub żelatyna. Przeciwnie, PTX3 łączy się specyficznie, wykazując wysokie powinowactwo, do C1q za pomocą domeny pentraksyny (9). Poziomy plazmatyczne PTX3 w normalnych warunkach są bardzo niskie (< 2 ng/ml), ale wzrastają w stanach chorobowych (10-100 ng/ml), włączając infekcje (10).
Pozostałe długie pentraksyny klonowane po PTX3 obejmują apeksynę świnki morskiej (11, 12) ulegającą ekspresji w akrosomie spermy, XL-PLXN1 z Xenopus laevis (13), szczurzą neuronalą pentraksynę 1 (NP1) (14), ludzką NP 1 i NP2 (15, 16), mysią NP1 i NP2 (15), Narp (17), i neuronalny receptor pentraksyny (NRP), przypuszczalną integralną pentraksynę błonową (18-19). Funkcje długich pentraksyn in vivo nie zostały jednoznacznie zdefiniowane.
PTX3 składa się z dwóch strukturalnych domen: domena N-końcowa niespokrewniona z żadną znaną cząsteczką i domena C-końcowa podobna do krótkich pentraksyn, takich jak białko C-reaktywne (Breviario et al. J. Biol. Chem., 267: 22190-22197, 1992). Znaczące podobieństwo znaleziono pomiędzy ludzką PTX3 (hPTX3) a pentraksyną mysią (mPTX3). Stopień podobieństwa pomiędzy ludzkimi i mysimi genami PTX3 wynosi 82%, i osiąga poziom 90% w warunkach, gdy brane są pod uwagę substytucje konserwatywne (Introna et al., Blood, 87: 1862-1872, 1996). Geny są ulokowane w miejscach syntenicznych chromosomu. Wysoki stopień podobieństwa pomiędzy sekwencjami hPTX3 i mPTX3 jest znakiem wysokiego stopnia zachowania pentraksyn w trakcie ewolucji (Pepys & Baltz, Adv. Immunol., 34: 141-212, 1983). Pentraksyny przedstawiono w publikacji Gewurz et al. (Curr. Opin. Immunol., 7:54-64, 1995).
W WO 99/32516 opisano zastosowanie PTX3 w celach terapeutycznych leczenia raka, zapaleń i chorób zakaźnych.
W amerykańskim patencie US 5,767,252 opisano czynnik wzrostu dla komórek neuronalnych, należący do rodziny pentraksyn.
W WO 02/36151 opisano zastosowanie PTX3 do wytwarzania leków służących zapobieganiu i leczeniu schorzeń autoimmunologicznych.
Dla porównania z powyższymi, udział aktywności PTX3 w zjawisku płodności u kobiet ujawniły badania i wyniki badań nad myszami zmodyfikowanymi genetycznie w ich genetycznym locus PTX3, które tworzono poprzez homologiczną rekombinację w embrionalnych komórkach macierzystych.
W niniejszym zgłoszeniu ujawniono manipulowanie aktywnością PTX3, a tym samym regulowanie płodności u kobiet. Efekty niepłodności mogą zostać naprawione, zdolność reprodukcyjna może wzrosnąć lub obniżyć się zgodnie z wymaganiami, poziom płodności u samic może wzrosnąć lub może być regulowany, możliwa jest również kombinacja powyższych stanów. Inne sposoby leczenia, jak zapłodnienie in vitro, wymagają inwazyjnych czynności i skomplikowanych technologii. Zgłoszenie dotyczy
PL 205 928 B1 potrzeby stworzenia terapii, które wpływają na płodność samic. Dodatkowe zalety i udoskonalenia przedyskutowane zostaną poniżej, lub też będą w sposób oczywisty wynikały z niniejszego ujawnienia.
Kompozycje farmaceutyczne, metody ich zastosowania i przygotowania, oraz dalsze przedmioty wynalazku opisano poniżej.
Streszczenie wynalazku
Celem wynalazku jest stworzenie kompozycji farmaceutycznej, w której zawarty jest czynnik zmieniający aktywność PTX3 wystarczająco skutecznie, aby oddziaływać na zdolności reprodukcyjne samic. Odkrycie, że aktywność PTX3 jest do wspomnianej zdolności konieczna, może być wykorzystane, jako terapia dla kobiet lub zwierząt mających problemy z reprodukcją lub też może być użyte do diagnozowania ich zdolności reprodukcyjnych.
Do przykładów takich czynników należą polinukleotydy odpowiadające genom PTX3, polipeptydy odpowiadające białkom PTX3 kodowanym tym sposobem, oraz inne, które podwyższają lub obniżają poziom ekspresji genów PTX3. Do nich należą sekwencje nukleotydów i aminokwasów przedstawione poniżej, ich analogi, sekwencje zawierające mutacje i polimorfizmy, oraz inne warianty tych cząsteczek (np. cząstkowe oligonukleotydy i oligopeptydy). Hybrydy, między co najmniej jedną częścią PTX3 i częścią heterologeniczną (polinukleotydu lub polipeptydu) są uznane za geny chimerowe lub warianty fuzji białek. Mogą być użyte genetyczne wektory, jako wektory wahadłowe do wprowadzenia, co najmniej jednej partii PTX3 do gospodarza, lub do ekspresji, co najmniej jednej partii PTX3 poprzez transkrypcję i/lub translację w komórce gospodarza, lub przy użyciu przynajmniej częściowo oczyszczonych składników. Aktywatory (np. interleukina-6, NF-κΒ, agoniści receptora) lub inhibitory (np., przeciwciała, IkB, antagoniści receptora) mogą być również użyte, jako czynniki kształtujące aktywność PTX3. Powyższy czynnik można otrzymać z ludzi i zwierząt (np. ssaków).
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanej ludzkiej PTX3 do otrzymania leku wywołującego wzrost zdolności reprodukcyjnej u osobnika żeńskiego z defektem zdolności reprodukcyjnej.
Korzystnie, zastosowanie to charakteryzuje się tym, że wspomnianym osobnikiem jest kobieta lub samica zwierzęcia.
Korzystna realizacja powyższego zastosowania charakteryzuje się tym, że lek podawany jest dosystemowo.
W kolejnej korzystnej realizacji niniejszego wynalazku lek podawany jest domiejscowo. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka PTX3 jako markera diagnostycznego zdolności reprodukcyjnej u osobnika żeńskiego.
W rezultacie, może być otrzymana kompozycja w zastosowaniu według wynalazku, odpowiednia do podawania systemowego lub przystosowana do podawania do miejscowego (np. wewnątrz lub w pobliże żeńskich organów rozrodczych). Kompozycja może zostać użyta do leczenia niepłodności lub jako środek antykoncepcyjny. Kolejna realizacja wynalazku zmierza do zapewnienia metod podawania kompozycji farmaceutycznej danemu osobnikowi w celu leczenia żeńskiej niepłodności lub w celach antykoncepcyjnych, w ilości wystarczającej do wzrostu lub odpowiednio obniżenia zdolności reprodukcyjnej osobników żeńskich.
Detekcja PTX3 u osobników żeńskich i skorelowanie jej ilości ze zdolnością reprodukcyjną powyższego osobnika jest kolejnym przedmiotem wynalazku. Mutacje w ludzkim genetycznym locus PTX3 zlokalizowane byłyby w chromosomie 3q24-q28; mutacje w genach wchodzących w interakcje zlokalizowane byłyby na zewnątrz genetycznego locus PTX3. Funkcja wariantu PTX3 może zostać określona na podstawie porównania ze znanymi sekwencjami PTX3 lub innymi sekwencjami pentraksyny; fałdowaniem, glikolizacją sekrecją tworzeniem multimerów, wiązaniem do receptora lub sygnalizacją; wpływem na zdolność reprodukcyjną płodność, niepłodność; lub na podstawie kombinacji powyższych czynników.
Celem kolejnej realizacji jest zbadanie, co najmniej jednego czynnika, który zmieniając aktywność PTX3 wpływa tym samym na zdolność rozrodczą osobników żeńskich, jak również otrzymanie danego czynnika w takim procesie. Przedstawiono kilka przykładów takich czynników.
W innej realizacji mogą być uzyskiwane komórki kobiet i samic innych ssaków, które są genetycznie zmutowane w celu obniżenia aktywności PTX3. Takie komórki dostarczają modeli zaburzeń zdolności reprodukcji (np. niepłodność) in vitro i in vivo. Mogą zostać wykorzystane do skreeningu lub do badań potencjalnych środków terapeutycznych. Dalsze aspekty wynalazku staną się jasne dla specjalisty w oparciu o przedstawiony opis, zastrzeżenia i ujawnione wskazówki.
PL 205 928 B1
Skrótowy opis figur rysunku i listy sekwencji
Na figurach 1A-1F przedstawiono nieprawidłową morfologię wzgórków jajonośnych (cumuli oophori) pochodzących z myszy PTX3 -/-. Wzgórki jajonośne zebrano 14-16 h po traktowaniu hCG. Pokazane są bezpośrednio po zebraniu (A i B) lub 4 h później (C i D).
W przypadku myszy PTX3 +/+ (A i C), komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa tworzą spójny i trwały wzgórek wokół oocytu. U myszy PTX3 -/- (B i D), komórki są luźno skupione wokół oocytu a wzgórek zniknął zupełnie w 4 h. Badanie histologiczne jajników myszy PTX3 +/+ (E) i PTX3 -/- (F) pokazują niezmienione jamowate pęcherzyki jajnika. Figury 2A-2D pokazują mRNA PTX3 i ekspresję białek w tkance jajnikowej. (A) Kinetyka ekspresji PTX3 w jajniku po wywołanej hormonami nad-owulacji (traktowanie PMS, następnie po 48 h traktowanie hCG) została pokazana na poziomie mRNA. Jajniki zebrano w 0, 6, 16, 24, lub 48 godzinie po traktowaniu PMS a następnie w 2, 6, 16, 24, lub 48 godzinie po traktowaniu hCG. 10 μg z całkowitego RNA wprowadzono do każdego toru. Bromek etydyny barwiący żel został pokazany w niższym panelu. (B) Hybrydyzacja jajnika in situ: w komórkach warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa ma miejsce ekspresja mRNA PTX3 tylko w wypadku dojrzałych pęcherzyków jajnika. (C) Ekspresja PTX3 przez wzgórki jajonośne (C.O.), komórki wzgórka jajonośnego (komórki C.O.), i oocyty została wykryta za pomocą Western blotting. Wzgórki jajonośne pobrano z czterech nad-owulujących osobników żeńskich PTX3 +/+ i PTX3 -/-, komórki wzgórka jajonośnego i oocyty otrzymano kolejno z siedmiu i czternastu nad-owulujących PTX3 +/+ osobników żeńskich. (D) Przedstawiono fazę kontrastową (prawy panel) i analizę immuno-fluorescencyjną (lewy panel) wzgórków jajonośnych z myszy PTX3 -/- (niższe panele) i PTX3 +/+ (wyższe panele).
Na liście sekwencji przedstawiono sekwencje ludzkiego cDNA i jego otwartej ramki odczytu (odpowiednio SEQ ID NOS: 1-2), mysiego cDNA i jego otwartej ramki odczytu (odpowiednio SEQ ID NOS: 3-4), ludzkie i mysie regiony regulatorowe powyżej ramki odczytu (SEQ ID NOS: kolejno 5-6) oraz startery PCR (SEQ ID NOS: 7-10). Zestawienie ludzkiej i mysiej sekwencji aminokwasów pokazuje, że 312 z 381 reszt jest identycznych (82%) a 351 reszt jest przynajmniej do siebie podobnych (92%). Oba geny zawierają trzy eksony: pierwszy koduje 43 reszty aminokwasowe, drugi koduje 135 reszt aminokwasowych, niewykazujących wysokiego podobieństwa do znanych motywów sekwencji, a trzeci koduje 203 reszty aminokwasowe podobne do pentraksyn. Pentraksyno-podobne domeny zawierają dwie reszty Cys w pozycji 162 i 254 i zgodną sekwencję pentraksyno-podobną His-Xaa-Cys-Xaa-Ser/Thr-Trp-Xaa-Ser (SEQ ID NO: 11).
Opis specyficznego zastosowania wynalazku
Polinukleotydy odpowiadające całemu lub części kwasu nukleinowego PTX3 (np., transkryptom lub genom), zawierające mutanty lub inne ich odmiany, mogą być wykorzystane do wywołania wzrostu aktywności PTX3 (np., ekspresja polipeptydu PTX3 in vitro lub in vivo), do wypełnienia lub naprawy genetycznej wady (np., transfekcja, infekcja), do obniżenia aktywności PTX3 (np., antysensowne, rybozym, siRNA), lub do detekcji komplementarnych polinukleotydów. Podobnie, polipeptydy odpowiadające białku PTX3, które zawierają mutanty i ich warianty, mogą być użyte bezpośrednio do zapewnienia aktywności PTX3; do produkcji inhibitorawych przeciwciał, agonistów, antagonistów; oraz do identyfikowania, izolacji lub detekcji przez wiązanie prób wchodzących w interakcje białek (np., przeciwciał, receptorowych agonistów lub antagonistów),.
Natywny PTX3 jest glikozylowany (potencjalna glikozylacja w miejscu -N w pozycji 203). Multimeryczny kompleks PTX3, o względnej masie cząsteczkowej około 900 kDa, eluowano za pomocą filtracji żelowej. Kompleks migrował w elektroforezie żelowej w warunkach denaturujących i niedenaturujących, jako dominujące pasmo o ok. 440 kDa (np. 9- lub 10-mer o ok. 45 kDa protomerach z dwoma głównymi pasmami w zakresie 540-600 kDa. Analiza z wykorzystaniem techniki dichroizmu kołowego wykazała, że PTX3 zawiera przede wszystkim strukturę harmoniki beta z fragmentami struktury alfa-helikalnej. Polipeptyd PTX3 lub jego kompleks może być identyfikowany, izolowany, lub wykrywany bezpośrednio cząstką wiążącą (np. przeciwciało, naturalny lub nienaturalny peptydowy mimetyk) dla produktu genu PTX3.
Kandydujące związki użyteczne w oddziaływaniu na zdolności reprodukcyjne mogą wchodzić w interakcje z reprezentatywnym polinukleotydem PTX3 lub polipeptydem PTX3, mogą również być obserwowane pod kątem ich zdolności do zapewnienia metody wykorzystanej w diagnozowaniu i leczeniu. Produkty te mogą być stosowane w testach (np. diagnozy) lub do leczenia; dogodnie zapakowane, jako zestaw testowy lub jako forma farmaceutyczna. Wiązanie do C1q było specyficzne i nasycone (jeden protomer PTX3 wiąże się do jednego receptora C1q) o stałej Kd 7.4 x 10-8 M. Analiza kinetyczna prowadzi do obliczenia Kon 2.6 x 105 M-1s-1 i Koff4 x 10-4s-1. Ligand wiążący C1q to domena
PL 205 928 B1
PTX3 pentraksyno-podobna z multimeryzacją konieczną do wiązania się (prawdopodobnie przez wewnątrz-cząsteczkowe wiązanie cysteiny). Istnieje możliwość scharakteryzowane innych receptorów dla PTX3.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest hybrydowy polinukleotyd PTX3 lub polipeptyd PTX3: np. transkrypcyjna chimera lub translacyjna fuzja. W chimerach transkrypcyjnych, przynajmniej jeden transkrypcyjny region regulatorowy heterologicznego genu jest wiązany do polinukleotydu PTX3 lub, alternatywnie, transkrypcyjny region regulatorowy genu PTX3 jest wiązany do przynajmniej jednego heterologicznego polinukleotydu. Ramki odczytu polipeptydu PTX3 i przynajmniej jedna heterologiczna domena aminokwasowa są połączone w zapisie dla translacyjnej fuzji. Jeżeli jako heterologiczny region lub domena wykorzystany jest marker reporterowy lub selekcyjny, wówczas efekt mutacji nukleotydu PTX3 lub sekwencji aminokwasowych na funkcję PTX3 może być bez trudności zbadany. W szczególnoś ci, moż na zastosować chimerę transkrypcyjna do lokalizacji regulowanego promotora genu PTX3, a translacyjna fuzja może być wykorzystana do lokalizacji proteiny PTX3 w komórce. Dla przykładu, transkrypcyjne regiony regulatorowe, wiążące ligand domeny, lub domeny multimeryzacji z PTX3 mogą zostać włączone w cząstkę hybrydy.
„PTX3” odnosi się do mysich i ludzkich genów i białek, mutantów i polimorfizmów występujących w naturze, ich różnych wariantów, (np. mutanty i analogi nie znalezione w naturze) jak również ich analogów. Chemiczna struktura PTX3 może wskazywać na polimer naturalnych lub nienaturalnych nukleotydów związanych naturalnymi lub nienaturalnymi wiązaniami kowalencyjnym (np. polinukleotyd), a także może być polimerem naturalnych lub nienaturalnych aminokwasów związanych naturalnymi lub nienaturalnymi wiązaniami kowalencyjnym (np. polipeptyd). Patrz tabele 1-4 WIPO Standard ST.25 (1998) pełna lista naturalnych i nienaturalnych nukleotydów i aminokwasów.
„Mutanty” to polinukleotydy i polipeptydy PTX3 posiadające przynajmniej jedną funkcję, która jest bardziej lub mniej aktywna, istniejącą funkcję, która jest zmieniona lub nieobecna, nową funkcję, która nie jest naturalnie obecna, lub ich kombinacje.
„Polimorfizmy” to polinukleotydy i polipeptydy PTX3, które są genetycznie zmienione, ale zmiany te nie koniecznie pociągają za sobą konsekwencje w postaci zmian w funkcjach.
„Analogi” to polinukleotydy i polipeptydy PTX3 o różnych strukturach chemicznych, ale ściśle ekwiwalentnej względem natywnych genów lub protein funkcji.
Funkcje PTX3 przedstawione są w niniejszym opisie w szczegółach. Mutanty, polimorfizmy i analogi mogą powstawać dzię ki wykorzystaniu inż ynierii genetycznej lub syntezy chemicznej, jakkolwiek synteza preferowana jest w przypadku nienaturalnych nukleotydów, aminokwasów lub sprzężeń.
„Oligonukleotydy” i „oligopeptydy” są krótkimi wersjami polinukleotydów lub polipeptydów (np. mniej niż 30, 60, 90 lub 180 nukleotydów lub aminokwasów). Mogą być fragmentem nukleotydu PTX3 lub sekwencji aminokwasowej opisanej w niniejszym zgłoszeniu. Najczęściej powstają w syntezie chemicznej, ale można również przeprowadzić rozplecenie dłuższych polinukleotydów lub polipeptydów. Elektroforeza i wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (HPLC) są odpowiednimi technikami do oczyszczania krótkich produktów.
Gen PTX3 może być identyfikowany za pomocą precyzyjnej hybrydyzacji: np. 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C lub 70°C dla oligonukleotydu; 500 mM NaHPO4 pH 7,2, 7% dodecylosiarczansodu (SDS), 1% albuminy surowicy cielęcej (BSA), 1 mM EDTA, 45°C lub 65°C dla polinukleotydu o 50 zasadach lub dłuższego. Białko PTX3 może być identyfikowane przy użyciu przeciwciał lub innych wiążących protein, jako sonda z zastosowaniem precyzyjnego wiązania: np. 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% surfaktant TWEEN 20, 1% BSA, temperatura pokojowa. Warunki przemywania mogą się różnić ze względu na regulowanie stężenia soli i temperatury w taki sposób, aby stosunek sygnał/szum był wystarczający dla specyficznej hybrydyzacji lub wiązania. Takie metody izolacyjne mogą być stosowane do identyfikowania nieznanego kwasu nukleinowego spokrewnionego z PTX3 lub białka, przy użyciu sondy, która wykrywa znany kwas nukleinowy PTX3 lub takie białko. Przykładowo, mieszanina kwasów nukleinowych lub białek może być rozdzielona dzięki jednej lub więcej właściwościom fizycznym, chemicznym i/lub biologicznym, wówczas obecność lub brak kwasu nukleinowego PTX3 lub takiego białka może być wykryta dzięki specyficznemu wiązaniu sondy. Sondę można również wykorzystać do detekcji obecności lub nieobecności znanego genu PTX3 lub takiego białka, lub do identyfikacji nieznanego wcześniej genu PTX3 lub takiego białka. Warunki blokowania i przemywania mogą być zróżnicowane w celu otrzymania sygnału hybrydyzacji kwasu nukleinowego lub wiązania białka, który jest specyficzny i/lub redukuje tło.
PL 205 928 B1 „Wyizolowany” produkt jest przynajmniej częściowo oczyszczony z macierzystej komórki (np. ludzkiej, ssaczej, bakteryjnej, drożdży) lub z źródła produkcji. Przykładowo, porównując do lizatu komórki macierzystej, izolowany produkt jest oczyszczony, co najmniej w 50%, 75%, 90%, 95% lub w 98% z innych chemiczno-podobnych roztworów (np. cał kowite kwasy nukleinowe dla polinukleotydów lub całkowite białka dla polipeptydów). Dla zsyntetyzowanego chemicznie polimeru nukleotydów lub aminokwasów, czystość określa się przez porównanie do zakończonych lub zablokowanych przedwcześnie produktów, i taki polimer, ze względów praktycznych, może być uznany za wyizolowany bez oczyszczania. Oczyszczanie można wykonać stosując techniki biochemiczne takie jak, frakcjonowanie komórek, wirowanie, chromatografię, elektroforezę, precypitację, specyficzne wiązanie, lub ich wzajemne kombinacje. Najczęściej, rozpuszczalnik (np. woda) i funkcjonalnie obojętne związki chemiczne (np. sole i bufory) wyklucza się w przypadku określania czystości. Stąd, kompozycja farmaceutyczna może zawierać czynniki odpowiedzialne w większości, jeśli nie w całości, za aktywność PTX3.
Znaczenie „heterologiczny” zależy od kontekstu. Na przykład, ligacja heterologicznych regionów nukleotydów w celu tworzenie chimery oznacza, że regiony te nie występują w naturze w postaci kolistej (np. polinukleotyd PTX3 ludzkiego pochodzenia przyłączony do ludzkiego nie-PTX3 transkrypcyjnego regionu regulatorowego). Kolejnym przykładem jest fuzja domen aminokwasowych, które nie zostały znalezione u człowieka w formie kolistej (np. ludzkiego pochodzenia polipeptyd PTX3 przyłączony do ludzkiej nie-PTX3 domeny multimeryzacji.) Ligacja regionów nukleotydowych lub łączenie domen, aminokwasowych, jednego elementu pochodzącego od człowieka drugiego od zwierzęcia, są heterologiczne, ponieważ pochodzą od różnych gatunków. W dalszym przykładzie transfekcja wektora lub konstruktu ekspresyjnego do heterologicznej komórki gospodarza, lub transgeneza heterologicznego nie-ludzkiego organizmu oznacza, że wektor lub konstrukt ekspresyjny nie występuje w naturze w genomie komórki lub organizmu. „Rekombinowany” produkt jest efektem ligacji heterologicznych regionów w celu uzyskania rekombinowanego polinukleotydu, lub ulegających fuzji heterologicznych domen w celu utworzenia rekombinowanego polinukleotydu. Rekombinacja może być przeprowadzona genetycznie in vitro za pomocą oczyszczonych enzymów lub in vivo w kulturze komórkowej.
Według jednego z aspektów wynalazku polinukleotydy (np. DNA lub RNA, jedno- lub dwuniciowy), które w sposób specyficzny hybrydyzują do genów PTX3 i ich transkrypty, mogą być użyte, jako sondy lub startery. Takie polinukleotydy mogłyby w pełnej długości pokrywać cały gen lub transkrybowaną wiadomość (np. rekombinowany klon w fagomidzie, plazmid, bakteriofag, kosmid, sztuczny chromosom drożdży lub YAC, sztuczny bakteryjny chromosom lub BAC, lub inny wektor), domenę N-końcową „PTX3-unikatową” lub domenę C-końcową „pentraksyno-podobną”, ekson lub szczególny rejon kodujący, lub krótszą sekwencją unikatową dla genów PTX3 lub jej transkrypty, ale zawierające tylko część identyczną. Sonda wiązałaby się stabilnie z celem, aby wytworzyć sygnał hybrydyzacji specyficzny dla, polinukleotydu PTX3 lub takiego polipeptydu, podczas gdy starter może wiązać się z docelową czą stką mniej stabilnie, ponieważ powtarzają ce się cykle polimeryzacji lub ligacji bę d ą również dawały specyficzny sygnał amplifikacji. Polinukleotydy mogą mieć długość co najmniej 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 1200, 2400, 5000, 10K, 20K, 40K, 100K, 250K, lub 500K nukleotydów (włączając zakres ich intermediatów).
Charakterystycznie, sekwencja nukleotydowa może wykazywać tylko 85% zgodności sekwencji, lub korzystniej, przynajmniej 90% zgodności sekwencji w porównaniu do regionu kodującego, SEQ ID NO: 1 lub 3, wyłączając delecje i insercje, które mogą mieć miejsce, i nadal będzie uważana za pokrewną. Sekwencje aminokwasowe są uważane za pokrewne przy 90% zgodności sekwencji, porównując do SEQ ID NO: 2 lub 4. Ale korzystna jest zgodność w 95% lub większa, a bardziej korzystna jest zgodność sekwencji 98% i większa.
Nie jest wymagane zastosowanie kompleksowych matematycznych algorytmów w wypadku, gdy sekwencje mogą być uszeregowane nie wykazując przy tym wielu dziur. Jakkolwiek takie algorytmy znane są w tej dziedzinie i są stosowane z użyciem nieobecnych w komercyjnych pakietach z oprogramowaniem parametrów. Zobacz Doolittle, Of URFS i ORFS, University Science Books, 1986; Gribskov i Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991; i cytowane w niniejszym opisie odnośniki. Procent zgodności pomiędzy parami sekwencji może zostać obliczony przy użyciu algorytmu znajdującego się w komputerowym programie BESTFIT (Smith and Waterman, J. Mol. Biol., 147:195-197, 1981; Pearson, Genomics, 11:635-650,1991).
Kolejny algorytm liczący rozbieżność sekwencji został wykorzystany do szybkiego przeszukiwania baz danych i umieszczony w programie komputerowym BLAST (Altschul et al., Nuci. Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).
PL 205 928 B1
Konserwatywne substytucje aminokwasowe (np. para Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys lub Gln/Asn) mogą być wykorzystane przy zestawianiu, ponieważ oczekuje się, że chemiczne podobieństwo tych par reszt aminokwasowych mogłoby w wielu przypadkach przekładać się na pełnione funkcje. Oczekuje się, że substytucje aminokwasowe, które mają zachować biologiczne funkcje polipeptydu zachowałyby chemiczne własności podstawianych reszt aminokwasowych, do których należą hydrofobowość, hydrofilowość, ładunek bocznego łańcucha lub rozmiar. Ekwiwalencja funkcyjna lub zachowanie biologicznych funkcji może zostać oszacowane metodami determinującymi strukturę i zanalizowane jak opisano w niniejszym wynalazku. W ten sposób sekwencje aminokwasowe uwa ż a się za zgodne w 90% podobieństwa sekwencji między dwoma polipeptydami; jakkolwiek, korzystniej, gdy występuje 95% lub więcej zgodności sekwencji, bardziej korzystnie, gdy występuje 98% lub więcej zgodności sekwencji. Kodony używane w natywnych sekwencjach nukleotydowych mogą być zaadaptowane do translacji mającej miejsce w heterologicznym gospodarzu, dzięki przyswojeniu preferencji kodonu gospodarza. To mogłoby prowadzić do przystosowania procesu translacyjnego heterologicznego gospodarza bez istotnych zmian w chemicznej strukturze polipeptydu. Polipeptyd PTX3 i jego warianty (np. delecja, tasowanie domen lub duplikacja, insercja, substytucja, lub ich kombinacje) są również przydatne dookreślania zależności struktura-funkcja (np. skanowanie alaniny, substytucja aminokwasowa konserwatywna lub niekonserwatywna). Do przykładów należą, fałdowanie i procesowanie białka PTX3, sekrecja protomeru PTX3 i tworzenie multimerów, wiązanie ligandów do receptora, sygnalizacja, lub ich kombinacje. Patrz: Wells (Bio/Technology, 13: 647-651, 1995) i US Patent 5,534,617. Bezpośrednia ewolucja poprzez przypadkowe mutagenezy lub tasowanie genów z użyciem PTX3 mogą być wykorzystane do otrzymania nowych, doskonalszych funkcji według kryterium selekcyjnego. Zmutowane, polimorficzne i analogowe polipeptydy PTX3 kodowane są przez odpowiednie zmutowane, polimorficzne i analogowe polinukleotydy PTX3. Zależność struktura-aktywność PTX3 może być badana (np. studia SAR) przy użyciu różnych odmian polipeptydów powstający przez transfekcję konstruktu ekspresyjnego do komórki gospodarza lub produkowanych bez endogenicznego PTX3. W ten sposób mutacje w odosobnionych domenach polipeptydu PTX3 mogą być związane ze spadkiem lub wzrostem aktywności w funkcjach białek. Sekwencja nukleotydowa PTX3 może być wykorzystana do produkcji polipeptydu powstałego w wyniku fuzji z przynajmniej jedną heterologiczną domeną peptydową (np. etykieta powinowactwa lub epitopowa). Oligopeptyd jest korzystny do produkcji specyficznego przeciwciała i mapowania epitopem PTX3-specyficznego przeciwciała. Polipeptyd może mieć długość, co najmniej 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 lub więcej aminokwasów (włączając ich zakres intermediatów). Oligopeptydy mogą być przyłączone do jednej etykiety powinowactwa ze specyficznie wiążącej pary (np. przeciwciało-dioksygenin/hapten/peptyd, biotyna-awidyna/streptawidyna, transferaza S glutationowa-glutation, białko wiążące maltozę-maltoza-białko wiążące maltozę, proteina A lub G/immunoglobulina, polihistydyna-nikiel). Produkowany może być albo pełnej długości polipeptyd PTX3 (np. SEQ ID NO: 2 lub 4), albo krótszy fragment (np. N-końcowa lub C-końcowa domena); dowolnie z włączeniem heterologicznej domeny peptydowej. Polipeptyd PTX3 może być syntetyzowany na drodze chemicznej, oczyszczony z naturalnego źródła, syntetyzowany w transfekowanej komórce gospodarza, lub może powstać w kombinacji powyższych procesów. Nukleotydowa sekwencja PTX3 lub jej część może zostać wykorzystana do monitorowania ekspresji PTX3, do określenia sekwencji PTX3 i/lub do detekcji różnych wariantów PTX3. Wynalazek zapewnia również sondy hybrydyzacji i amplifikacji starterów (np. reakcja łańcuchowa polimerazy, łańcuchowa reakcja ligacji, inne izotermalne reakcje amplifikacji) Para takich starterów może być użyta do analizy RT-PCR w celu oszacowania ilości transkryptu PTX3 wewnątrz komórki. Startery amplifikacji mogą mieć długość między 15 a 30 nukleotydów (korzystnie, około 25 nukleotydów) przyłączając się do zarówno sensownej lub antysensownej nici (korzystnie, para będzie komplementarna do każdej nici) i mogą kończyć się w pozycji 3' oraz w dowolnym miejscu w obrębie sekwencji SEQ ID NOS: 1, 3 i 5-6 lub ich odcinków komplementarnych. Stąd też, wynalazek będzie użyteczny dla rozwoju i utylizacji starterów PTX3 i innych oligonukleotydów w celach oszacowania ilości pokrewnego RNA i DNA wewnątrz komórek.
Przyłączanie polinukleotydów lub polipeptydów może zachodzić w roztworze lub na substracie. Forma testu może wymagać lub nie oddzielenia związanych od niezwiązanych. Wykrywalne sygnały mogą być bezpośrednie lub pośrednie, należące do jakiejkolwiek części związanego kompleksu, mierzone kompetycyjnie, amplifikowane, lub kombinacje powyższych. Etap blokowania lub wymywania może być uwzględniony w celu polepszenia czułości i/lub specyficzności. Przyłączenie polinukleotydu lub polipeptydu, wchodzącego w interakcje białka, lub wiążącej się cząsteczki do substratu przed, po,
PL 205 928 B1 lub w czasie wiązania skutkuje pochwyceniem niezwiązanych cząstek. Taka immobilizacja będzie oznaczała trwale związanie z substratem w warunkach przemywania. Zobacz US Patent 5, 143, 854 i 5,412,087. Zmiany w ekspresji genów mogą objawiać się w komórce wpł ywając na inicjację transkrypcji, stabilność transkryptu, translację transkryptu na produkt białkowy, przetwarzanie glikoprotein, stosunek fałdowania lub sekrecji, lub kombinację powyższych. Gen, transkrypt lub polipeptyd również mogą być badane za pomocą technik takich jak transkrypcja in vitro, translacja in vitro, hybrydyzacja Northern, hybrydyzacja kwasu nukleinowego, RT-PCR, transkrypcja run-on, hybrydyzacja Southern, znakowanie metabolicznych białek, wiązanie przeciwciał, immunoprecypitacja (IP), test immunoenzymatyczny ELISA, radioimmunoenzymatyczny (RIA), znakowanie fluorescencyjne lub barwienie histochemiczne, mikroskopowe i analizy obrazu cyfrowego, oraz analiza lub sortowanie fluoroscencyjnie aktywowanej komórki.
Reporterowy lub selekcyjny gen markerowy, którego produkty można łatwo zaobserwować, może być użyty do wygodnej detekcji. Geny reporterowe obejmują np., fosfatazę alkalinową β-galaktozydazę (LacZ), acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT), β-glukoronidazę (GUS), lucyferazę (LUC), zielone i czerwone fluorescencyjne białka (kolejno, GFP i RPF), peroksydazę chrzanową (HRP), β-laktamazę, oraz ich pochodne (np. błękit EBFP, cyjanowy ECFP, żółto-zielony EYFP, destabilizowane warianty GFP, stabilizowane warianty GFP, lub warianty powstałe w fuzji sprzedawane, jako fluorescencyjne białka Living Colors produkowane przez Clontech). Geny reporterowe wykorzystałyby pokrewne substraty, które najchętniej oznaczane są dzięki chromogennemu, fluorescencyjnemu, luminescencyjnemu sygnałowi. Z drugiej strony, analizowany produkt może być znakowany heterologicznym epitopem (np. FLAG, MYC, antygen T SV40, transferaza glutationowa, polihistydyna, białko wiążące maltozę), dla którego dostępne są pokrewne przeciwciała lub żywice o takim powinowactwie. Przykłady leków, dla których istnieją selekcyjne geny markerowe nadające oporność, to ampicylina, genetycyna/kanamycyna/neomycyna, hygromycyna, puromycyna i tetracyklina. Metaboliczny enzym (reduktaza dihydrofolianowa, HSV-1 kinaza tymidynowa) może zostać wykorzystany, jako marker selekcyjny w przypadku wrażliwych komórek i auksotrofów. Na przykład, metotreksan może spowodować wzrost liczby kopii polinukleotydu przyłączonego do markera selekcyjnego DHFR lub gancyklowir może wybrać nieprawidłowo wirionowy marker selekcyjny kinazy, tymidynowej. Polinukleotyd może ulegać ligacji z wiążącym oligonukleotydem lub być sprzężony z jednym z członków specyficznie wiążącej się pary (np. przeciwciało-digoksygenin/hapten/epitop peptydowy, biotyna-awidyna/streptawidyna, transferaza S glutationowa lub GST-glutation, lektyna-cukier, białko wiążące maltozęmaltoza, polihistydyna-nikiel, białko A/G-immunoglobulina). Polinukleotyd może być sprzężony przez ligację sekwencji nukleotydowej kodującej wiążącego się członka. Polipeptyd może łączyć się z jednym z członków specyficznie wiążącej się pary na drodze fuzji kodowanej przez powyższy ulegający ligacji lub sprzężeniu polinukleotyd, lub alternatywnie, przez bezpośrednie wiązanie chemiczne z reaktywną resztą na wiążącym się członku na drodze chemicznego cross-linkingu. Takie polinukleotydy i polipeptydy mogą być użyte, jako reagent posiadający pewne powinowactwo w celach zidentyfikowania, izolacji oraz detekcji interakcji, które obejmują specyficzne wiązanie produktu transkryptu lub produktu białkowego wektora ulegającego ekspresji. Przed lub po łączeniu, na zasadzie powinowactwa, produktu transkryptu lub białka, molekuła przyłączona do polinukleotydu lub polipeptydu może zostać związana ze swoim pokrewnym wiążącym członkiem. To może prowadzić do powstania kompleksu w roztworze, lub kompleksu immobilizowanego na pewnej podstawie. Miejsce rozpoznawane przez proteazę (np. dla enterokinazy, faktora Xa, ICE, sekretazy, trombiny) może znajdować się pomiędzy przyległymi domenami, w celu umożliwienia miejscowo- specyficznej proteolizy, w wyniku, której zachodzi oddzielenie powyższych domen i/lub pozbawienie białka aktywności.
Sondy i startery mogą zostać wykorzystane do identyfikowania genów PTX3 lub ich wariantów. Przykładowo, sonda lub starter specyficzny dla ludzkiego genu PTX3 zidentyfikowanego w niniejszym wynalazku, może zostać użyty do wykrywania obecności lub nieobecności tego genu, stąd wysuwa się wniosek, że źródło genu jest odpowiednio obecne lub nieobecne. Genetyczny polimorfizm i mutacje w genie PTX3 mogą być specyficznie wykrywane dzięki umiejscowieniu potencjalnie nieprawidłowo dopasowanej zasad(y) w środkowej części sondy lub na końcu 3' startera, aby stabilizować lub destabilizować wiązanie sondy lub startera do miejsca przeznaczenia zależące od tego czy docelowa sekwencja w danym miejscu jest komplementarna do zasady czy nie. Genetyczny polimorfizm i mutacje mogą być również wykrywane poprzez zmianę długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), fragmentów chronionych przed nukleazą (np. S1 nukleazą, deoksyrybonukleazą I, rybonukleazą A, H lub Tl) lub produktu amplifikowanego. W przypadku skomplikowanych genetycznych odcisków palca,
PL 205 928 B1 identyfikacja każdego z komponentów nie musi być konieczna, ponieważ wizualne porównanie może skutecznie wykazać różnice (np. RAPD). Różnice są również wykrywane w masie cząsteczkowej (MW) lub punkcie izoelektrycznym (pl) białka PTX3 przez przeprowadzenie kolejno elektroforezy żelowej lub ogniskowania izoelektrycznego. Obecność białka PTX3 może być wykorzystana, jako wskaźnik aktywności PTX3 w ludzkich płynach i tkankach. Płynem może być krew, produkty krwi, (np. plazma, surowica), płyny obmywające, plwocina lub tym podobne. Do przykładowych tkanek należą nabłonek (np. płuca) lub błona śluzowa (np. usta, pochwa), jakkolwiek infekcje mogą mieć zasięg systemowy i mogą również obejmować inne typy tkanek. Sygnały mogą być odebrane in situ dla stałych tkanek, lub na zdyspergowanej lub zhomogenizowanej tkance (np. rozcieńczona lub nierozcieńczona substancja organiczna, płyn) lub na wymazie komórkowym lub preparacie kontaktowym. Potencjalne dla zapłodnienia oocyty mogą być wyselekcjonowane dzięki ekspresji PTX3.
Konstrukcja wektorów wahadłowych lub ekspresyjnych
Wektor wahadłowy lub ekspresyjny jest polinukleotydem rekombinacyjnym, który w swojej postaci chemicznej jest zarówno kwasem deoksyrybonukleinowym (DNA) i/lub kwasem rybonukleinowym (RNA). Postać fizyczna wektora może być jednoniciowa lub dwuniciowa, topologicznie może być liniowy lub kolisty. Wektor korzystnie jest dwuniciowym deoksyrybonukleinowym kwasem (dsDNA) lub jest konwertowany do dsDNA po wprowadzeniu do komórki (insercja retrowirusa do genomu gospodarza, jako prowirusa). Wektor może zawierać jeden lub więcej regionów z ssaka, owada, rośliny, grzyba lub wirusa (np. adenowirus, defektywne wirusy wymagające obecności adenowirusa, jako wirusa pomocniczego, cytomegalowirus, wirus ospy ptasiej (FPV), wirus opryszczki pospolitej, lentivirus, wirus białaczki Moloney'a, mysi wirus nowotworu gruczołu sutkowego, wirus mięsaka Rousa, wirus SV40, wirus kro wianki) jak również regiony nadające się do genetycznej manipulacji (np. marker selekcyjny, łącznik z wielokrotnymi miejscami rozpoznawanymi przez endonukleazy restrykcyjne, promotor do transkrypcji in vitro, starterowe miejsca annealingu do replikacji in vitro). Wektor może być połączony z białkami i innymi kwasami nukleinowymi w trakcie przenoszenia (np. spakowany w wirialnej cząstce) lub zagęszczony substancją chemiczną (polimer kationowy) w celu dodarcia do wejścia komórki lub tkanki. Wybór wektorowych polinukleotydów i metody wprowadzenia ich do systemu rozrodczego kobiety (np. do endometrium, jajnika) zależy od możliwości i umiejętności ich stosowania. Wektor ekspresyjny może zawierać region regulatorowy dla ekspresji genów (np. promotor, wzmacniacz, wygaszacz, akceptorowe lub donorowe miejsce zespalania składowych, sygnał poliadenylacji, sekwencja lokalizacji komórkowej). Możliwe jest otrzymanie różnych poziomów transkrypcji za pomocą czynnika z systemem regulatorowym, który odpowiada na dany czynnik (tertracyklina/tetR lub FK506/FKBP). Wektor może następnie zawierać jedno lub więcej akceptorowe lub donorowe miejsce zespalania składowych, w obrębie ulegającego ekspresji rejonu; sekwencję zgodną Kozaka powyżej ulegającego ekspresji rejonu do rozpoczęcia translacji; i poniżej ekspresjonowanego regionu, wielokrotne kodony stopu w trzech kolejnych ramkach odczytu w celu zagwarantowania terminacji translacji, jeden lub więcej sygnałów degradacji mRNA, sygnał terminacji transkrypcji, sygnał poliadenylacji, sygnał rozszczepienia 3'. Dla ekspresjonowanych regionów, które nie zawierają intronu (np. region kodujący z cDNA), para akceptorowych lub donorowych miejsc zespalania składowych może być preferowana lub nie. Użytecznym byłoby, jakkolwiek, uwzględnienie sygnału/ów degradacji mRNA, tak, aby jeśli to konieczne tylko w warunkach indukujących ekspresjonowany był jeden lub więcej regionów znajdujące się poniżej.
Wektor wahadłowy może następnie zawierać sekwencję początku replikacji (ARS-sekwencja warunkująca autonomiczną replikację), umożliwiającą replikację wektora wbudowanego w genom gospodarza lub jako autonomicznie replikujący się episom. Sekwencje centromerowe i telomerowe również mogą być zawarte w celach, kolejno, chromosomalnej segregacji i ochrony końców chromosomów. Przypadkowe lub kierunkowe wbudowanie do genomu gospodarza prawdopodobnie zapewni utrzymanie się wektora, ale episomy mogą być zachowane poprzez selektywny wybór, lub alternatywnie mogą być preferowane w tych zastosowaniach, w których wektor obecny jest tylko przejściowo.
Wektor może być zarówno wahadłowy, jaki i ekspresyjny.
Rejon ulegający ekspresji może pochodzić z jakiegokolwiek interesującego nas genu i może zostać dostarczony w obu orientacjach względem promotora. Rejon ulegający ekspresji w pozycji antysensownej będzie użyteczny do tworzenia antysensownego polinukleotydu lub siRNA. Gen może pochodzić z komórki lub organizmu gospodarza należącego do tego samego gatunku, lub może być zaprojektowany de novo. Fuzje z domeną/domenami genów, które mogą dzielić funkcję z PTX3, mogą być zanalizowane w celu zdefiniowania domeny/domen zawierających funkcję lub do zapewnienia wielofunkcyjnego, powstałego na skutek fuzji białka. Fuzję można również przeprowadzić z zastosowaniem
PL 205 928 B1 taga epitopowego (np. GFP, GST, HA, MYC). Niektóre geny produkują alternatywne transkrypty, kodują podjednostki, złożone w homomultimery lub heteromultimery, lub produkują propeptydy aktywowane przez rozszczepienie proteazą. Ulegające ekspresji rejony mogą kodować fuzję translacyjna; otwarte ramki odczytu rejonów kodujących polipeptydy i co najmniej jedna heterologiczna domena może ulegać ligacji w zapisie. Jeżeli marker reporterowy lub selekcyjny jest używany, jako heterologiczna domena, ekspresja fuzyjnego białka może zostać czytelnie oznaczona lub zlokalizowana. Heterologiczna domena może być tagiem powinowactwa lub epitopowym. Skreening kandydujących związków.
Kolejnym aspektem wynalazku są chemiczne i genetyczne związki, ich pochodne, oraz kompozycje je zawierające, które są efektywne w leczeniu niepłodności lub w antykoncepcji. Ilość, która jest podawana do leczenia, jej skład, czas i cykl dostarczenia są efektywne w obniżeniu niepłodności lub w podwyższeniu lub obniżeniu poziomu zdolności reprodukcyjnej lub wywołaniu wzrostu płodności.
Określenie takich ilości, składu, czasu i cyklu dostarczania leku należy do umiejętności specjalistów w dziedzinie. Metoda skreeningu może obejmować podawanie organizmowi wybranego związku, lub inkubowanie związku z komórką, a następnie określenie czy ekspresja genów ulega modulacji. Takie modulacje mogą wywołać wzrost lub spadek aktywności, która całkowicie lub w części kompensuje zmianę związaną z lub powodującą płodność lub niepłodność. Ekspresja genu może wzrosnąć lub zmaleć na poziomie stosunku inicjacji transkrypcyjnej lub elongacji; stabilności transkryptu; stosunku inicjacji translacyjnej lub elongacji, stabilności białka, stosunku przetwarzania białka, fałdowania lub sekrecji, proporcji białka o konformacji aktywnej, tworzenia multimerów, wiązania do receptora, lub kombinacji powyższych procesów. Patrz, przykładowo, US Patents 5,071,773 i 5,262,300. Możliwe są gruntowne analizy skreeningowe (np. użycie równoległego procesowania i/lub automatyki).
Metoda skreeningu może obejmować inkubowanie wybranego związku z komórką zawierającą rejon reporterowy, rejon reporterowy zawierający transkrypcyjny rejon regulatorowy PTX3 związany kowalencyjnie w konfiguracji cis z niżej położonym genem, kodującym możliwy do oznaczenia produkt; oraz mierzenie produkcji oznaczanego produktu. Albo chimera z położonym wyżej rejonem genu PTX3, albo translacyjna fuzja w ramce z inicjacyjnym kodonem ATG mogą zostać wykorzystane do zapewnienia regulatorowego rejonu transkrypcyjnego. Dla przykładu, nie musi zostać wykorzystana żadna ilość SEQ ID NO: 5 lub 6. Kandydujący związek wywołujący wzrost produkcji oznaczanego produktu byłby identyfikowany, jako czynnik aktywujący ekspresję genów, podczas gdy kandydujący związek wywołujący spadek produkcji oznaczanego produktu byłby identyfikowany, jako czynnik hamujący ekspresję genów. Patrz przykład : US Patents 5,849,493 i 5,863,733. Regulacja transkrypcji PTX3 (np. region regulatorowy translacji i pokrewny czynnik transkrypcyjny) została scharakteryzowana dla genów ludzkich i mysich (Altmeyer et al., J. Biol. Chem., 270:25584-25590; Basile et al., J. Biol. Chem., 272: 8172-8178, 1997). Transkrypcja PTX3 jest specyficzna dla pewnych typów komórek. Reakcja transkrypcji PTX3 na stymulację cytokiny odbywa się za pośrednictwem interakcji z czynnikami transkrypcyjnymi NFkB oraz IkB, jak również ze specyficznymi komórkowo czynnikami. Metoda skreeningu może obejmować pomiar in vitro transkrypcji z sekwencji konstruktu reporterowego w obecności lub pod nieobecność kandydującego związku (sekwencja konstruktu reporterowego zawierająca transkrypcyjny rejon regulatorowy), a następnie określenie czy transkrypcja ulega zmianie pod wpływem obecności kandydującego związku. Transkrypcja in vivo może być oznaczona za pomocą ekstraktu nie zawierającego komórek, częściowo oczyszczonych frakcji komórek, oczyszczonych czynników transkrypcyjnych lub polimerazy RNA, lub kombinacji powyższych. Patrz przykład US Patents 5,453,362; 5,534,410; 5,563,036; 5,637,686; 5,708,158; oraz 5,710,025. Techniki stosowane do mierzenia aktywności translacyjnej i transkrypcyjnej in vivo są powszechnie znane. Przykładowo, jądrowa analiza run-on może być użyte do mierzenia transkrypcji genu reporterowego. Translacja genu reporterowego może być mierzona przez oznaczenie aktywności produktu translacji. Aktywność genu reporterowego może być mierzona poprzez oznaczenie jednej lub kilku transkrypcji produktu polinukleotydowego (np. RT-PCR lub transkrypt), translacji produktu polipeptydowego (np. immunoanaliza białek), oraz biologicznej aktywności białka reporterowego per se.
Związek, który powoduje wzrost lub spadek ekspresji genu PTX3 lub aktywności tego białka mógłby zostać zanalizowany pod względem oddziaływania na zdolność reprodukcyjną, redukując niepłodność lub wpływając na wzrost płodności. Białko znakowane epitopem PTX3 lub przeciwciało specyficzne dla białka PTX3 może zostać wykorzystane do oczyszczonego na drodze chromatografii powinowactwa multimeru lub innego kompleksu zawierającego PTX3. Kandydujące składniki mogą być analizowane pod kątem ich zdolności do obniżania nadmiaru (np. ustalony poziom kompleksu),
PL 205 928 B1 stosunku skupiania, sekrecji lub biologicznej aktywności kompleksu. Przykładowo, może zostać zidentyfikowany związek, który wywołuje wzrost lub hamuje wiązanie pomiędzy białkiem PTX3 i jego receptorem. Białko PTX3 może zostać przyłączone do substratu jak opisano powyżej. Kandydujący związek jest inkubowany z immobilizowanym białkiem PTX3 w obecności co najmniej jednego różnego składnika kompleksu w przynajmniej częściowo oczyszczonej postaci lub jako surowa mieszanina. Co więcej, jeden lub więcej składników kompleksu może zostać przyłączonych do substratu, a kandydujący związek może być inkubowany z immobilizowanym składnikiem w obecności białka PTX3 z udziałem, lub bez, dodatkowych składników kompleksu w przynajmniej częściowo oczyszczonej formie lub jako surowa mieszanina. Przykłady warunków dla wiązania się przedstawione są poniżej. Po inkubacji, wszystkie niezwiązane komponenty mogą zostać odmyte, pozostawiając jeden lub kilka składników kompleksu przyłączonych do substratu. Tworzenie kompleksu z włączeniem białka PTX3 może również zachodzić w roztworze a wówczas kompleks zawierający PTX3 może być immobilizowany lub też nie. Redukcja jest odwrotną reakcją, która rozbija multimery PTX3. Ilość każdego ze składników kompleksu może zostać oszacowana po odmyciu i odseparowaniu kompleksu od innych białek (np. analiza heterogeniczna), lub z pominięciem separacji (analiza homogeniczna). Przykładowo, może zostać oznaczona przy użyciu analizy immunologicznej, jak ELISA, RIA lub Western blotting. Formowanie kompleksu może zostać zbadane dzięki wiązaniu przeciwciała do epitopu, który jest zależny od procesu formowania lub do epitopu maskowanego po formowaniu. Kompleks może być immobilizowany przed lub po formowaniu się poprzez wiązanie przynajmniej jednego składnika kompleksu do substratu. Wiązanie kompleksu do substratu może być oznaczone bez separacji dzięki detekcji takiej jak SPA lub BiaCore. Ilość jednego lub więcej przyłączonych składników kompleksu jest określana wraz z kandydującym składnikiem oraz bez. Pożądany związek to ten, który powoduje wzrost lub spadek obfitości, skupiania, sekrecji, formowania multimerów, aktywności biologicznej PTX3, lub kombinacji powyższych.
Genetyczne związki wykorzystywane do leczenia
Aktywacja może zachodzić dzięki indukcji wektora ekspresyjnego zawierającego rejon ekspresji, który koduje białko posiadające aktywność PTX3 lub regulujące aktywność PTX3 (np. pełnej długości region kodujący lub funkcjonalne części genu PTX3; hipermorficzne mutanty, homologi, ortologi, lub ich paralogi, induktory ostrej fazy; czynniki pozytywnej transkrypcji na genie PTX3), lub który koduje białko znoszące tłumienie aktywności PTX3 (np. przynajmniej częściowo hamowana ekspresja negatywnego regulatora genu PTX3). Nad-ekspresja transkrypcji lub translacji, jak i nad-ekspresja funkcji białka, jest bardziej bezpośrednim podejściem do aktywacji genu. Alternatywnie, znajdujący się poniżej ekspresjonowany rejon może prowadzić homologiczną rekombinację do locus w genomie i dlatego może zastępować endogeniczny transkrypcyjny rejon regulatorowy genu z kasetą ekspresyjną lub specyficzną genetyczną mutację.
Wektor ekspresyjny może zostać wprowadzony do komórki gospodarza lub zwierzęcia nieczłowieka dzięki zastosowaniu technik transfekcji i transgenezy, np.z użyciem jednej lub wielu substancji chemicznych (np. fosforan wapnia, DEAE-dekstran, lipidy, polimery), biolistyków, elektroporacji, technologii nagiego DNA, mikroiniekcji, lub infekcji wirionem Wprowadzany wektor ekspresyjny może integrować się z genomem gospodarza komórki lub zwierzęcia, lub też może pozostać, jako episom. Znanych jest wiele obojętnych lub naładowanych lipidów, steroli i innych fosfolipidów wykorzystywanych, jako lipidowe przenośniki. Przykładowo, lipidy obojętne to dioleoilo fosfotydylocholina (DOPC) i dioleoilo fosfotydylo etanoloamina (DOPE), lipidem anionowym jest dioleoilo fosfotydyloseryna (DOPS); lipidy kationowe to dioleoilo trimetylo amoniako propan (DOTAP), dioktadecylodiamidoglicylo spermina (DOGS), dioleoilo trimetylo amoniak(DOTMA) oraz 1,3-dioleoiloksy-2-(6-karboksyspermylo)propyloamido tetraoctan (DOSPER). Dipalmitoilo fosfotydylocholina (DPPC) może być włączona w celu podwyższenia skuteczności i/lub stabilności dostarczania. FUGENE 6, LIPOFECTAMINA, LIPOFECTIN, DMRIE-C, TRANSFECTAM, CELLFECTiN, PFX-1, PFX-2, PFX-3, PFX-4, PFX-5, PFX-6, PFX-7, PFX-8, TRANSFAST, TFX-10, TFX-20, TFX-50, oraz lipidy LIPOTAXI należą do związków prawnie zastrzeżonych. Łańcuch polimerowy może być kationowym dendrymerem, poliamidem, poliamidoaminą, polietylenem lub glikolem polipropelynowym (PEG), polietylenoiminą (PEI), polilizyną lub ich kombinacją stąd, alternatywnie, materiał polimerowy może być formowany w nanocząstki lub mikrocząstki. W technologii nagiego DNA, wektor (zazwyczaj plazmid) dostarczany jest do komórki lub tkanki, gdzie może zostać lub niezintegrowany z genomem gospodarza bez użycia chemicznych czynników transfekcji (np. polimery, lipidy) kondensujących wektor przed jego wprowadzeniem do komórki lub tkanki. Transfekowana może być komórka zwierzęca, owada, grzyba lub bakteryjna; transgeneza może zostać przeprowadzona u zwierzęcia nie-człowieka. Rejon homologiczny genu może być wykorzystany do bezpośred12
PL 205 928 B1 niej integracji ze szczególnym genetycznym locus w genomie gospodarza i stąd może regulować ekspresję genu w tym locus (np. homologiczna rekombinacja pozbawionych promotorów markerów reporterowych lub selekcyjnych w genetycznym locus PTX3) lub mogą zostać wprowadzone kopie ektopowe genu PTX3. Polipeptydy mogą być również produkowane in vitro w ekstrakcie komórkowym lub in vivo w komórce manipulowanej genetycznie.
Wektor ekspresyjny może zostać użyty do wymiany funkcji genu, który jest hamowany lub całkowicie wadliwy, uzupełnienia funkcji częściowo defektywnego genu, lub do konkurowania z aktywnością genu. W ten sposób, aktywność pokrewnego genu gospodarza może być neomorficzna, hipomorficzna lub normalna. Wymiana lub uzupełnienie funkcji może nastąpić dzięki zastosowaniu metod wyżej przedyskutowanych, albo komórka lub organizm genetycznie manipulowane mogą zostać wyselekcjonowane do wysokiej lub niskiej ekspresji (np. oszacowanie ilości produktów transkrypcji i translacji lub biologicznej funkcji każdego z produktów) znajdującego się poniżej rejonu. Konkurencja pomiędzy poniżej ekspresjonowanym rejonem a neomorficznym, hipermorficznym lub normalnym genem może mieć miejsce ze względu na syntetyczne interakcje w multimerycznym kompleksie białkowym. Alternatywnie, negatywne regulatorowe lub posiadające jeden łańcuch przeciwciało hamujące funkcje wewnątrzkomórkowo może być kodowane przez dolny rejon wektora ekspresyjnego. Dlatego też, przynajmniej częściowa inhibicja aktywności PTX3 może zostać osiągnięta za pomocą anty sensownej, rybozymowej lub RNA interferencyjnej techniki, w której wektor ekspresyjny zawiera dolny region odpowiadający niezmodyfikowanej antysensownej cząstce, rybozymowi, lub cząsteczce si RNA odpowiadającej części sekwencji nukleotydowej PTX3.
Związek wywołujący wzrost lub spadek aktywności ekspresji genu PTX3 lub aktywności białka mógłby być oznaczany ze względu na swój wpływ na aktywność reprodukcyjną, redukując poziom niepłodności lub podwyższając płodność.
Polinukleotydy antysensowne mogą działać przez bezpośrednio blokowaną translację na skutek hybrydyzowania do transkryptów mRNA lub degradacji takich transkryptów genu. Ta antysensowna cząstka może zostać stworzona na drodze rekombinacji dzięki zastosowaniu przynajmniej jednej funkcyjnej części genu w orientacji, antysensownej jako regionu poniżej promotora w wektorze ekspresyjnym. Zmodyfikowane chemicznie zasady lub wiązania mogą zostać wykorzystane do stabilizowania antysensownego polinukleotydu przez obniżenie poziomu degradacji lub wydłużenie okresu półtrwania w organizmie (np. metylofosforany, fosforotionian, peptydowe kwasy nukleinowe). Sekwencja cząsteczki antysensownej może być komplementarna do miejsca inicjacji translacji (np. pomiędzy -10 i +10 docelowej sekwencji nukleotydowej).
Rybozymy katalizują specyficzne rozplatanie transkryptu RNA lub genomu. Mechanizm działania obejmuje specyficzną względem sekwencji hybrydyzację do komplementarnego komórkowego lub wirionowego RNA, po której następuje rozszczepienie endonukleotydowe. Inhibicja może zależeć lub nie od aktywności rybonukleazy H. Rybozym zawiera jedną lub kilka sekwencji komplementarnych do docelowego RNA, jak również sekwencje katalityczne odpowiedzialne za rozplatanie RNA (np elementy głowy młotka, głowa topora, spinka do włosów). Przykładowo, potencjalne rybozymowe miejsca rozplatania w obrębie danego RNA są początkowo rozpoznawane przez skanowanie danego RNA pod kątem miejsc rybozymowego rozszczepienia, zawierających następujące trinukleotydowe sekwencje: GUA, GUU i GUC. Raz zidentyfikowane, oligonukleotydy z około 15 do około 20 rybonukleotydów odpowiadające rejonom danego RNA z miejscem rozplatania, mogą być ocenione pod kątem przewidywanych własności strukturalnych, jak struktura drugorzędowa, które to mogą wykluczyć kandydujące sekwencje oligonukleotydowe jako nieodpowiednie. Przydatność kandydujących sekwencji ocenia się na podstawie ich zdolności do hybrydyzowania i rozplatania docelowego RNA. Rybozym może powstać w wyniku rekombinacji lub może być zsyntetyzowany chemicznie.
siRNA odpowiada dwuniciowemu RNA zawierającemu 20-25 par zasad, który pośredniczy w interferencji RNA (RNAi). Dupleks siRNA odpowiadający docelowemu RNA może być formowany poprzez oddzielną transkrypcję nici, sparowaną transkrypcję z pary promotorów o różnej polarności, lub przez annealing pojedynczej nici RNA posiadającej, co najmniej częściowo komplementarną do siebie sekwencję. Alternatywnie, podwojone oligorybonukleotydy o przynajmniej 21 do około 23 parach zasad mogą być syntetyzowane chemicznie (np. dupleks 21 rybonukleotydów z ramionami 3' dwóch rybonukleotydów) z udziałem kilku substytucji tolerowanych przez modyfikowane zasady. Interferencję znosi jakkolwiek wadliwe parowanie w centrum sekwencji siRNA. Korzystnie, rejon docelowy interferencji RNA powinien być transkrybowany, jako kodujący rejon genu. Interferencja okazuje się być zależną od czynników komórkowych, (np. rybonukleaza III), które rozplatają docelowe miejsca RNA w odległoPL 205 928 B1 ści 21-23 zasady; pozycja miejsca rozplatania definiowana jest przez koniec 5' przewodzącego siRNA w większym stopniu niż przez koniec 3'. Priming przez małe ilości siRNA może uruchomić interferencję po amplifikacji za pomocą RNA-zależnej polimerazy RNA.
Przeciwciało specyficzne dla PTX3 może być użyte do inhibicji lub detekcji. Przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne mogą zostać przygotowane przez immunizowanie zwierząt (np. kurczaka, chomika, myszy, szczura, królika, kozy, konia) antygenem, lub opcjonalnie oczyszczone w chromatografii powinowactwa wobec tego samego lub pokrewnego antygenu. Antygen może być białkiem natywnym, fragmentem powstałym w proteolizie lub dzięki inżynierii genetycznej, białkiem powstałym w fuzji lub białkiem przepisanym i syntetyzowanym in vivo, które zawiera, co najmniej jeden lub więcej epitopów przyłączonych przez przeciwciało. Fragmenty przeciwciała mogą zostać przygotowane przez proteolityczne rozplatanie lub w wyniku działań inżynierii genetycznej; humanizowane przeciwciała i przeciwciała pojedynczego łańcucha mogą powstać dzięki transplantacji sekwencji domen przeciwciała wiążących antygen do cząsteczek szkieletowych. Inne wiążące cząsteczki (np. agoniści lub antagoniści wiązania ligand -receptor) mogą być przygotowane przez skreening kombinatorycznej biblioteki w poszukiwaniu członka, który wiąże specyficznie antygen, (np. typująca biblioteka fagowa). Antygen może być białkiem o pełnej długości, kodowanym przez gen lub jego fragmenty. Przeciwciało może być specyficzne względem PTX3 lub może wchodzić w reakcje krzyżowe z innymi pentraksynami w zależności od tego jak mocno rozpoznawany przez przeciwciało epitop jest zachowany pośród różnych gatunków. Patrz, dla przykładu, US Patents 5,403,484; 5,723,286; 5,733,743; 5,747,334; oraz 5,871,974.
Czynniki specyficznie wiążące PTX3 (np. polinukleotydy, polipeptydy) mogą zostać wykorzystane w celach diagnostycznych do detekcji kwasu nukleinowego PTX3 lub takiego białka, albo do leczenia przez hamowanie aktywności PTX3 (np. transkrypcja, translacja, przetwarzanie, sekrecja, wiązanie receptora). Pożądane są szczególnie czynniki, które wpływają na transkrypcję PTX3 i wiązanie PTX3 do receptora. Związki wynalazku lub ich pochodne mogą być wykorzystane, jako lek lub mogą być użyte do stworzenia kompozycji farmaceutycznej, która będzie posiadała jedno lub więcej zastosowań.
Stąd też jednym z przedmiotów wynalazku jest zastosowanie, rekombinowanego ludzkiego PTX3 do przygotowania leku podnoszącego zdolności reprodukcyjne u osobników żeńskich.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirialnych lub plazmidowych wektorów zawierających ludzkie cDNA PTX3 do leczenia osobników żeńskich w celu podwyższenia zdolności reprodukcyjnej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka PTX3 jako diagnostycznego markera zdolności reprodukcyjnej kobiet.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie PTX3, jako białka docelowego do skreeningu związków farmaceutycznych pod kątem oszacowania ich wpływu na zdolność reprodukcyjną osobników żeńskich.
Związki niniejszego wynalazku mogą być podawane kulturom komórkowym in vitro, in vivo komórkom w organizmie lub ex vivo komórkom na zewnątrz badanego podmiotu, które mogą zostać ponownie umieszczone w tym samym lub innym podmiocie. Przedmiotem badania jest osobnik żeński w wieku reprodukcyjnym, który chce zajść w ciążę lub objęty jest ryzykiem zagrożenia ciąży.
Związki lub ich pochodne mogą zostać wykorzystane do produkcji leku lub innych kompozycji farmaceutycznych. Zastosowanie kompozycji, która następnie zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz kompozycji, która zawiera również związki użyteczne do dostarczania kompozycji do obiektu znane są w niniejszej dziedzinie. Dodanie takich nośników oraz innych komponentów do kompozycji wynalazku na tym poziomie działań jest korzystne.
Kompozycja farmaceutyczna może być podawana w formie nadającej się do bezpośredniego zastosowania w systemie reprodukcyjnym osobników żeńskich (np. endometrium, jajniki), lub może być odpowiednia do przenoszenia drogą jelitową lub z wykorzystaniem cyrkulacji krwi. Przeciwnie, kompozycja farmaceutyczna może zostać dodana do medium kultury komórkowej. Oprócz składnika aktywnego, taka kompozycja może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub inne składniki znane pod względem ułatwiania procesu podawania i/lub podwyższenia orientacji. Kompozycja może być podawana w pojedynczych dawkach lub w wielokrotnych w odpowiednich odstępach czasowych.
Kompozycja farmaceutyczna może być podawana każdą znaną drogą. Przykładowo, kompozycja może być wprowadzana przez błonę śluzową, płuca, domiejscowo lub inną lokalną lub systemową drogą (np. dojelitowo i pozajelitowo). W szczególności pożądane byłoby otrzymanie efektywnej aktywności PTX3 w lub wokół systemu reprodukcyjnego. To może wymagać zastosowania podawania miej14
PL 205 928 B1 scowego, implantacji blisko reprodukcyjnego narządu lub dopochwowego czopka. Termin „pozajelitowy” obejmuje podskórne, doskórne, domięśniowe, dożylne, dotętnicze, dooponowe oraz inne iniekcyjne i infuzyjne techniki, bez ograniczeń.
Odpowiedni wybór ilości, odstępów czasowych podawania dawek, składu, drogi podawania dokonuje się stawiając sobie na celu prawidłową odpowiedź badanego podmiotu (skuteczność) oraz unikanie nadmiernej toksyczności lub innych uszkodzeń (bezpieczeństwo). Stąd też, „efektywny” odpowiada takim wyborom, które uwzględniają rutynowe zmiany warunków ukierunkowane na osiągnięcie pożądanego efektu: np. wpływ na zdolność reprodukcyjną wywołanie wzrostu płodności lub zmniejszenie niepłodności. Dawka bolus kompozycji podawana osobnikowi żeńskiemu raz dziennie jest wygodnym schematem dozowania. Alternatywnie, efektywna dawka może być podawana, co drugi dzień, raz w tygodniu, lub raz w miesiącu. Poziom dawkowania aktywnych składników w kompozycji farmaceutycznej może również różnić się, aby osiągnąć chwilowe lub stałe stężenie składnika lub jego pochodnej u badanego osobnika, oraz aby otrzymać pożądaną terapeutyczną odpowiedź. Jakkolwiek, umiejętnością w tej dziedzinie jest rozpoczęcie dozowania od poziomu niższego niż wymagany do otrzymania pożądanego efektu terapeutycznego, a następnie zwiększanie dozowania aż do momentu, kiedy taki efekt zostanie osiągnięty.
Dozowanie może być określone w czasie zależnie od cyklu reprodukcyjnego (miesiączka) osobnika żeńskiego. W kwestii praktycznej, temperatura ciała i poziom hormonów mogą zostać wykorzystane, jako zastępcy elementów w reprodukcji takich jak owulacja i menstruacja.
Ilość podawanego składnika zależy od takich czynników jak, np. bioaktywność, biodostępność składnika (okresu półtrwania w ciele, stabilność, metabolizm); własności chemiczne składnika (np. masa cząsteczkowa, hydrofobowość oraz rozpuszczalność); droga i schemat podawania, itp. Zrozumiałe jest również, że specyficzny poziom dawki, który powinien zostać osiągnięty u poszczególnych osobników, może zależeć od różnorodnych czynników włączając wiek, stan zdrowia, historię przebytych chorób, wagę, kombinację z jednym lub kilkoma lekami oraz dotkliwość choroby. Termin „leczenie” odnosi się do, inter alia, redukowania lub łagodzenia jednego lub więcej symptomów niepłodności w dotknię tym chorobie podmiocie. Dla danego podmiotu, poprawa symptomów, pogorszenie, regresja, lub progresja mogą zostać określone subiektywną lub obiektywną miarą. Leczenie może również obejmować kombinację z innymi istniejącymi sposobami leczenia oraz czynnikami (np. nadowulacja). W ten sposób leczenie kombinacyjne może być praktykowane.
P r z y k ł a d y.
Heterogeniczne męskie i żeńskie osobniki myszy modyfikowane genetycznie pod względem genu PTX3 są normalne i płodne. Hodowla inter se obrodziła przewidywaną liczbą homozygotycznych myszy z częstością Mendeliana. Jakkolwiek, hodowla w kombinacji homozygotycznych żeńskich i męskich osobników (PTX3-/-) jest całkowicie niepłodna. Wyniki hodowli wskazują, ż e homozygotyczne osobniki męskie są prawidłowo płodne w warunkach parowania ich z dziką odmianą (PTX3 +/+) lub heterozygotycznych (PTX3 +/-), podczas gdy osobniki żeńskie PTX3 -/- są zawsze niepłodne, niezależnie od męskiego genotypu. Eksperymenty parowania wykazały, że nie istniały różnice pomiędzy osobnikami żeńskimi PTX3 -/- a PTX3 +/+ w częstości kontaktów płciowych po spontanicznym czterodniowym parowaniu lub po okresie nadowulacji (tabela 1). Liczba jaj powstałych spontanicznie w owulacji (tabela 1) (średnio 7 na mysz, n=4 w PTX3 +/- i 7.8 na mysz, n=8, w myszach PTX3 -/-) lub jaj hormonalnie indukowanych (średnio 35 na mysz, n=9, w PTX3 +/- i 27 na mysz, n=18, w myszach PTX -/-) była porównywalna z myszami +/+ i -/-. Dane pochodzą z jednego reprezentatywnego eksperymentu z czterech przeprowadzonych. Oocyty i morfologia osłonki przejrzystej wykazywały stan normalny, a pierwsze ciałka polarne obserwowano w ok. 50% oocytów otrzymanych 16 godzin po potraktowaniu ludzką kosmówkową gonadotropiną (hCG) z zarówno myszy PTX3+/+ jak i PTX3 -/- (tabela 1). Niniejsze dane wskazują, że owulacja i dojrzewanie oocytów przebiegają normalnie i nie są przyczyną niepłodności. Dla porównania, morfologiczne nieprawidłowości wzgórków jajonośnych zebranych z jajowodu myszy PTX3 -/- (fig. 1B i 1D) konsekwentnie obserwowano, ponieważ komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa były luźno przyłączone do oocytów i nie tworzyły wieńca promienistego. Pochodzące z PTX3 -/- wzgórki były nie trwałe in vitro, a komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa spontanicznie odłączały się od oocytów w krótkim czasie (15-60 min w PTX3 -/- versus kilka godzin w wzgórkach PTX3 +/+) od zebrania (14-16 godzin po hCG, lub po upływie połowy dnia od naturalnego parowania), prowadząc szybko do denudacji oocytów.
PL 205 928 B1
T a b e l a 1 Częstość normalnego parowania i owulacji u myszy PTX3 -/-
PTX3 +/+ PTX3 -/- wartość P
Częstość parowania Spontaniczna (a) dzień 1 4/9 2/10 NS
dzień 2 2/5 2/8 NS
dzień3 2/3 2/5 NS
Po nadowulacji 4/4 8/8 NS
Owulacja spontaniczna (b): owulacja myszy 4/4 5/5 NS
jajeczka na mysz 7 7.8 -#
Po nadowulacji: owulacja myszy 5/5 6/6 NS
jajeczka na mysz 37.8 33.3 -
Obecność ciał polarnych w powstałych 53/98 54/109 NS
w owulacji jajeczkach (c) (54%) (49%) -
□ a) osobniki żeńskie przebywały z osobnikami męskimi przez okres 4 dni i były sprawdzane codziennie na obecność kontaktów płciowych □ b) owulacja była badana u osobników żeńskich, u które miały kontakt płciowy □ c) obecność pierwszego ciałka polarnego była zbadana w oocytach zebranych 15 h po działaniu HCG.
NS, nieznacząco różne (p < 0,05) od kontroli myszy PTX3 +/+ wykonanej testem Fischer'a # liczby odnoszą się do zlanych próbek z myszy PTX3+/+ lub PTX3 -/-. Podobny brak różnicy można było zauważyć w czterech eksperymentach z 5-7 myszami.
Aby zrozumieć czy i kiedy ciąża została przerwana, zygoty i embriony zostały zebrane w różnych odstępach czasowych od parowania, po spontanicznej lub wyindukowanej hormonalnie owulacji. Nigdy nie zaobserwowano oocytów rozwiniętych do stadium dwu-komórkowego in vivo (dzień 1.5) (tabela 2), ani oocytów z dwoma projądrami (dzień 0,5), jeśli nawet znalezioną aktywną spermę w jajowodzie wadliwej myszy. W celu dalszych badań nad ustaleniem powodu/powodów niepłodności blastocyty PTX3 +/+ zostały przeniesione do pseudo-ciężarnych osobników żeńskich PTX3 -/-, ale obserwowano normalną ciążę i normalny poród. To wykluczało błędy implantacji i dalsze następstwa.
T a b e l a 2. Zapłodnienie myszy PTX3 -/-
Zapłodnienie PTX3 +/+ PTX3 -/- wartość P
In vivo jajeczka zapłodnione w całości Owulacja spontaniczna 17/28 (60%) 0/39 (0%) < 0,0001#
Po nadowulacji 81/162 (50%) 0/192 (0%) < 0,0001
In vitro Po usunięciu osłonki przejrzystej (b) 21/27 (77%) 21/31 (68%) NS+
Stosując nienaruszone cumuli oophori (c) 79/189 (41,8%) 68/169 (40%) NS
□ a) embriony zostały zebrane 1,5 dnia po zapłodnieniu, w stadium dwukomórkowym □ b) fuzja została zbadana techniką transferową 4 h po inseminacji □ c) dwukomórkowe embriony były liczone jeden dzień po inseminacji # test Fisher'a NS, nieznacząco różne (p<0.05) od kontroli myszy PTX3 +/+
Aby oszacować czy oocyty PTX3 -/- mogą być zapłodnione, przeprowadzono zapłodnienie in vitro (INF) wykorzystując semitypową spermę pochodzącą z dorosłych myszy do inseminowania oocy16
PL 205 928 B1 tów PTX3 -/- lub PTX3 +/+ (tabela 2). IVF początkowo prowadzone było z użyciem oocytów uwolnionych z osłonki przejrzystej i wybarwionych DNA-specyficznym fluorochromem Hoechst 33258 w celu obserwowania fuzji. W tych warunkach, obserwuje się wiązanie normalnej spermy do błony plazmatycznej oocytów PTX3 -/- oraz porównywalną zdolność do fuzji oocytów PTX3 +/+ (77%) i PTX3 -/(68%) ze spermą (tabela 2). Powyższe rezultaty sugerują, że wiązanie spermy i fuzja mogą występować pod nieobecność PTX3. Nienaruszone wzgórki zebrane 13-15 h po działaniu hCG inseminowano, po czym obserwowano zapłodnienie oocytów PTX3 -/- i progres w rozwoju do fazy stadium dwukomórkowego z częstością porównywalną z oocytami PTX3 +/+ (tabela 2). Powyższe dane potwierdzają, że jakość oocytów u myszy z wadliwym PTX3 jest taka jak normalnie. Ponieważ wzgórek jajonośny odkrywa krytyczną rolę dla zapłodnienia in vivo, ale nie in vitro, powyższe rezultaty sugerują, że odchylenia od normy we wzgórku stanowią podstawę niepłodności osobników żeńskich PTX3 -/-.
Ekspresja mRNA PTX3 w jajnikowych tkankach została zobrazowana dzięki wykorzystaniu techniki Northern blotting oraz hybrydyzacji in situ. Po hormonalnie wywołanej nadowulacji, ekspresja mRNA PTX3 (oceniana za pomocą Northern blotting w całej tkance) rozpoczyna się, 2 h po działaniu hCG i trwa aż do 12-14 h (patrz fig. 2A), odpowiadając pre-owulacyjnej ekspansji aż do kilku godzin po owulacji (20). Komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa otrzymane w działaniu hyaluronidazą na wzgórki jajonośne i przez separację z oocytów, ekspresjonowały transkrypty PTX3.
Ekspresja w warunkach normalnych pod nieobecność nadowulacji została zbadana techniką hybrydyzacji in situ. Hybrydyzacja in situ organów z niepoddanych działaniu osobników żeńskich (fig. 2B) potwierdziła ekspresję mRNA PTX3 w jajniku, ograniczoną do komórek warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa dojrzałych pęcherzyków, bez znaku obecności transkrypcji w oocytach.
Zanalizowano następnie ekspresję białka w komórkach jajników. Western blotting wykazał, że PTX3 było związane ze wzgórkiem PTX3 +/+ (a w szczególności z zewnątrzkomórkowym, matriks), ponieważ działanie, hyaluronidazą która oddziela komórki wzgórka od oocytów, zniosło immunoreaktywność (fig. 2C). Analiza immunofluoroscencyjna wzgórków jajonośnych PTX3 +/+ i -/- zebranych po hormonalnie wywołanej nadowulacji (13-15 h po hCG) potwierdziła związek PTX3 z matriks wewnątrzkomórkowym wzgórka (fig. 2D).
Powyższe dane sugerują, że niepłodność wywołana wadliwością PTX3 powstała z powodu braku zapłodnienia, jako że wadliwość, PTX3 nie wpływa na dalsze etapy reprodukcji, od sparowania po owulację, implantację oraz ciążę. Transkrypty PTX są ekspresjonowane w normalnym jajniku wyłącznie przez komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa dojrzałych pęcherzyków jajnikowych, jak również przez odseparowane komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa, ale nie oocyty. Ekspresja mRNA PTX3 jest indukowana w całej tkance jajnikowej następując po hormonalnie indukowanej nadowulacji. Ostatecznie, białko PTX3 zostało wykryte w zewnątrzkomórkowym matriks izolowanego wzgórka jajonośnego, produkowane przypuszczalnie przez komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka Graafa. Analiza myszy PTX3 -/- ujawniała odbiegający od normy wzgórek jajonośny, jako wyznacznik niepłodności. Cumuli oophori z osobników żeńskich PTX3 -/- wykazały morfologiczne zmiany. Brakowało im wyraźnie zarysowanego wieńca promienistego a w warunkach kultury in vitro, gwałtownie oddzielały się od oocytów. Wrażliwość wzgórków o wadliwym PTX3 może odzwierciedlać strukturalną rolę PTX3 w tym szczególnym matriks lub zmianę w mechanizmie regulacyjnym rozpuszczania się matriks. Powyższe wyniki przedstawiają PTX3, jako nowy składnik zewnątrzkomórkowego matriks wzgórka jajonośnego, odgrywający kluczową rolę w płodności. Wzgórek jajonośny, uważany za niezbędny in vitro, odgrywa kluczową rolę w zapłodnieniu in vivo. Dlatego też, nieprawidłowości wzgórka jajonośnego przypuszczalnie mają związek z niepłodnością samiczek myszy PTX3 -/-.
Materiały i metody
Generacja myszy PTX3 -/Genomowy fragment DNA o 8,5 kb obejmujący eksony 1 do 2 mysiego genu PTX3 wykorzystano do wbudowywania kasety IRES-LacZ, po której występuje gen oporności na PGK-neomycynę z plazmidu pWH9 w eksonie 1 w pozycji 71 bp w dół od pierwszego kodującego ATG. Metody hodowania kultury, selekcji i identyfikacji komórek ES przeprowadzono według opisu powyżej (20). Pięć niezależnie ukierunkowanych klonów Rl komórek ES zostało zidentyfikowanych techniką hybrydyzacji Southern blot, przy użyciu sondy A (fragment EcoRI/EcoRV 750 bp w drugim intronie). Nie wykryto żadnego dowodu przypadkowej integracji w przypadku sondy B (z genu oporności na neomycynę). Dwa klony komórkowe ES zostały wszczepione do blastocytów C57BI/6. W celu ustalenia genotypu myszy, DNA otrzymany z biopsji ogona został amplifikowany w polimerazowej reakcji łańcuchowej z dwoma kompletami starterowymi (komplet starterowy 1):
PL 205 928 B1
5'-AGCAATGCACCTCCCTGCGAT-3', SEQ ID NO:7;
5'-TCCTCGGTGGGATGAAGTCCA-3' SEQ ID NO:8; komplet starterowy 2:
5'-CTGCTCTTTACTG AAGGCTC-3', SEQ ID NO: 9;
5'-TCCTCGGTGGG ATGA AGTCC A-3', SEQ ID NO: 10), które kolejno wykryły semitypowe lub docelowe allele. Analiza fenotypowa została przeprowadzona na dwóch liniach pochodzących z niezależnych klonów, a rezultaty potwierdzono genotypowo w mieszańcach 129Sv-C57BI/6 oraz w 129Sv. Myszy PTX3 +/+ były młodymi z pomiotu 129Sv-C57BI/6 PTX3 -/- lub myszami 129 Sv lub C57BI/6 otrzymanymi z Charles River, Calco, Włochy.
Procedury z wykorzystaniem zwierząt oraz opieka nad nimi prowadzone są według instytucjonalnych wytycznych pozostających w zgodzie z narodowymi (4D.L. N.116, G.U., suppl. 40, 18-2-1992) oraz międzynarodowym prawem i polityką (EEC Council Directive 86/609, OJ L 358, 1,12-12-1987; NIH Guide for the Care and Use of Labolatory Animals, U.S. National Researcg Council, 1996). Podjęto wszelkie wysiłki w celu zminimalizowania cierpienia i liczby wykorzystanych zwierząt.
mRNA PTX3 oraz białko PTX3
RNA został wyekstrahowany z komórek i oczyszczony przy użyciu reagentu TRIZOL (GIBCO BRL). Zgodnie z warunkami opisanymi w (21) przeprowadzono Northern blotting, znakowanie sondą oraz hybrydyzację (wiązanie i odmywanie). Hybrydyzacja in situ: układy kriostatyczne (13 μm) otrzymane z jajników dzikich odmian oraz PTX3 -/-, utrwalone 4% paraformaldehydem i zamrożone w ciekłym azocie zostały użyte do przeprowadzenia hybrydyzacji in situ tak jak opisano (22) Szkiełka permeabilizowane proteinazą K oraz 0,2 M HCl, inkubowano w 65°C przez całą noc wraz z radioaktywnie znakowaną rybosondą utworzoną z cDNA PTX3 zawierającego wektor (pBluescript) przy użyciu zestawu transkrypcyjnego Stratagene RNA. Następnie, próbki zostały przemyte buforem zawierającym formamid, suszone na powietrzu, zanurzone w emulsji fotograficznej oraz inkubowane w temp. 4°C w ciemnym pudełku przez okres, co najmniej 10 dni. Po wywołaniu, szkiełka zostały przebarwione w 2 μg/ml roztworze barwnika Hoechst 33258. Do analizy Western biot, całkowite ekstrakty komórek otrzymane z nietkniętych cumuli oophori, komórek wzgórka, lub oocytów zebranych z nadowuluujących samic zostały oddzielone z wykorzystaniem elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym (Strona), elektro-blottowane na filtrach nitrocelulozowych (Hybond ECL, Amersham), oraz znakowane oczyszczoną biotynylowaną anty-mysią PTX3 poliklonalną surowicą z chomika 1 ug/ml, następnie strept-awidyno-HRP (BIOSPA, Włochy). Znakowane białka wykryto wykorzystując wzmożoną chemiluminescencję (ECL, Amerham).
Zebranie oocytów i embrionów, zapłodnienie in vitro, oraz embrio-transfer.
Cumuli oophori, zygoty i embriony otrzymano z jajowodu lub macicy niepoddanych działaniu osobników żeńskich po naturalnym parowaniu (20). Nadowulację wyindukowano działaniem 5 unitów surowicy ciężarnej maciory (PMS, Folligon, Intervet) oraz 5 unitami ludzkiej kosmówkowej gonadotropiny (hCG, Corulon, Intervet) 48 godzin później. Wzgórki jajonośne zbierano w różnych odstępach czasu po parowaniu lub 13-15 h po traktowaniu hCG. Komórki wzgórka oraz oocyty były oddzielone na skutek działania hyaluronidazy (20).
Zapłodnienie in vitro (IVF) jajeczek otrzymanych z nadowulujących samic przeprowadzono z jajeczkami nienaruszonego wzgórka jajonośnego jak zostało opisane (20) lub z wolnymi od osłonki przejrzystej (zona pellucida) jajeczkami zabarwionymi 1 μg/ml barwnikiem Hoechst w medium M16 (Sigma) (23) oraz spermą samców BDF. Zapłodnienie i fuzję spermy-jajeczka oszacowano licząc dwukomórkowe embriony 1 dzień po inseminacji nienaruszonego wzgórka jajonośnego, lub przez liczenie jajeczek z fluorescencyjną spermą 4 h po inseminacji wolnych od osłonki przejrzystej jajeczek.
Embrio-transfer został przeprowadzony według opisu (20), z wykorzystaniem 3,5 dniowych blastocytów PTX3 +/+ wszczepionych do macicy samic PTX3 -/- z 2,5 dniową ciążą rzekomą.
Patenty, zgłoszenia patentowe oraz inne publikacje cytowane tu są umieszczone w pełnej wersji, w jako odnośnik w niniejszym dokumencie.
Wszelkie zmiany (modyfikacje) lub zamiany (podstawienia), które mieszczą się w znaczeniu zastrzeżeń oraz w ich prawnych odpowiednikach, powinny zawierać się w ich zakresie. W zastrzeżeniu, w którym zastosowano zmianę na „zawierać się w”, można zawrzeć inne elementy, które będą mieściły się w zakresie tego zastrzeżenia; także wynalazek opisany w tych zastrzeżeniach poprzez zastosowanie zwrotu „składa się zasadniczo z” (pozwala na umieszczenie innych składników, które mieszczą się w zakresie zastrzeżenia, jeżeli nie wpływają one w sposób istotny na działanie wynalazku) oraz zmiana „składać się z” (pozwala na zamieszczenie tylko składników wymienionych w zastrzeżeniu, innych niż niekonsekwentne i nieprawidłowe działania, które są zwyczajowo związane z wynalazkiem) za18
PL 205 928 B1 miast określenia „zawierać się w”. Każde z trzech określeń może być wykorzystane w celu zastrzeżenia wynalazku.
Należy rozumieć, że składnik opisany w niniejszej dokumentacji nie powinien być interpretowany, jako ograniczenie zastrzeganego wynalazku, chyba, że jest on wyraźnie działaniu osobników żeńskich po naturalnym parowaniu (20). Nadowulację wyindukowano działaniem 5 unitów surowicy ciężarnej maciory (PMS, Folligon, Intervet) oraz 5 unitami ludzkiej kosmówkowej gonadotropiny (hCG, Corulon, Intervet) 48 godzin później. Wzgórki jajonośne zbierano w różnych odstępach czasu po parowaniu lub 13-15 h po traktowaniu hCG. Komórki wzgórka oraz oocyty były oddzielone na skutek działania hyaluronidazy (20).
Zapłodnienie in vitro (IVF) jajeczek otrzymanych z nadowulujących samic przeprowadzono z jajeczkami nienaruszonego wzgórka jajonośnego jak zostało opisane (20) lub z wolnymi od osłonki przejrzystej (zona pellucida) jajeczkami zabarwionymi 1 μg/ml barwnikiem Hoechst w medium Ml6 (Sigma) (23) oraz spermą samców BDF. Zapłodnienie i fuzję spermy-jajeczka oszacowano licząc dwukomórkowe embriony 1 dzień po inseminacji nienaruszonego wzgórka jajonośnego, lub przez liczenie jajeczek z fluorescencyjną spermą 4 h po inseminacji wolnych od osłonki przejrzystej jajeczek.
Embrio-transfer został przeprowadzony według opisu (20), z wykorzystaniem 3,5 dniowych blastocytów PTX3 +/+ wszczepionych do macicy samic PTX3 -/- z 2,5 dniową ciążą rzekomą.
Patenty, zgłoszenia patentowe oraz inne publikacje cytowane tu są umieszczone w pełnej wersji, w jako odnośnik w niniejszym dokumencie.
Wszelkie zmiany (modyfikacje) lub zamiany (podstawienia), które mieszczą się w znaczeniu zastrzeżeń oraz w ich prawnych odpowiednikach, powinny zawierać się w ich zakresie. W zastrzeżeniu, w którym zastosowano zmianę na „zawierać się w”, można zawrzeć inne elementy, które będą mieściły się w zakresie tego zastrzeżenia; także wynalazek opisany w tych zastrzeżeniach poprzez zastosowanie zwrotu „składa się zasadniczo z” (pozwala na umieszczenie innych składników, które mieszczą się w zakresie zastrzeżenia, jeżeli nie wpływają one w sposób istotny na działanie wynalazku) oraz zmiana „składać się z” (pozwala na zamieszczenie tylko składników wymienionych w zastrzeżeniu, innych niż niekonsekwentne i nieprawidłowe działania, które są zwyczajowo związane z wynalazkiem) zamiast określenia „zawierać się w”. Każde z trzech określeń może być wykorzystane w celu zastrzeżenia wynalazku.
Należy rozumieć, że składnik opisany w niniejszej dokumentacji nie powinien być interpretowany, jako ograniczenie zastrzeganego wynalazku, chyba że jest on wyraźnie wymieniony w zastrzeżeniach. Zatem, zastrzeżenia są podstawą do określenia zakresu gwarantowanej prawnej ochrony a nie ograniczeniem wynikającym z dokumentacji, która jest zawarta w zastrzeżeniach.
Przeciwnie, poprzedni stan techniki jest jasno wyłączony z wynalazku w stopniu konkretnych realizacji, które mogłyby stanowić o przewidywalności wynalazku lub mogłyby pozbawić wynalazek nowości. W pewnych realizacjach, kategoria (rodzaj) polinukleotydów lub polipeptydów może być wymieniona w zastrzeżeniach z klauzulą, że natywne kwasy nukleinowe lub białka są wyłączone (np. mając sekwencje nukleotydowa lub aminokwasową, która nie znajduje się w wykazie sekwencji). Na przykład, degeneracja kodu genetycznego może zostać wykorzystana w celu uzyskania polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej kodującej SEQ ID NO: 2, która jednak nie jest SEQ ID NO: 1. Podobnie, funkcjonalny polipeptyd PXT3 może być ekwiwalentem mysiego lub ludzkiego białka, ale nie jest on identyczny z tymi białkami, (np. może być w 90% identyczny), z powodu zmiany jednej lub więcej reszt aminokwasowych SEQ ID NO: 2.
Dla eksperta z tej dziedziny będzie oczywiste, że wynalazek może być realizowany w innych specyficznych postaciach bez utraty natury wynalazku oraz jego kluczowych właściwości. Opisane realizacje powinny być uważane, jako poglądowe (ilustrujące) i nieograniczające, ponieważ zakres prawnej ochrony niniejszego wynalazku będzie określony w dołączonych zastrzeżeniach a nie w dokumentacji wynalazku.
PL 205 928 B1
1. Emsley et al., Structure of pentameric human serum amyloid P component. Nature, 1994.
367:338-345.
2. Baumann & Gauldie, The acute phase response. Immunol. Today, 1994. 15:74-80.
3. Steel & Whitehead, The major acute phase reactants: C-reactive protein, serum amyloid P component and serum amyloid A protein. Immunol. Today, 1994. 15:81-88.
4. Breviario et al., Interleukin-l-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component. J. Biol. Chem., 1992. 267:22190-22197.
5. Lee et al., TSG-14, a tumor necrosis factor- and IL-l-inducible protein, is a no vel member of the pentaxin family of acute phase proteins. J. Immunol., 1993. 150:1804-1812.
6. Lee et al., Relationship of TSG-14 protein to the pentraxin family of major acute phase proteins. J. Immunol., 1994. 153:3700-3707.
7. Vidal Alles et al., Inducible expression of PTX3, a new member of the pentraxin family, in human mononuclear phagocytes. Blood, 1994. 84:3483-3493.
8. Introna et al., Cloning of mouse PTX3, a new member of the pentraxin gene family expressed at extrahepatic sites. Blood, 1996. 87:1862-1872.
9. Bottazzi et al., Multimer formation and ligand recognition by the long pentraxin PTX3 - Similarities and differences with the short pentraxins C-reactive protein and serum amyloid P component. J. Biol. Chem., 1997. 272:32817-32823.
10. Muller et al, Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlate with severity of infection in critically ill patients. Crit. Care Med. 2001. 29:1404-1407.
11. Noland et al., The sperm acrosomal matrix contains a no vel member of the pentaxin family of calcium-dependent binding proteins. J. Biol. Chem., 1994. 269:32607-32614.
12. Reid & Blobel, Apexin, an acrosomal pentaxin. J. Biol. Chem., 1994. 269:32615-32620.
13. Seery et al., Identification of a novel member of the pentraxin family in Xenopus laevis. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1993. 253:263-270.
14. Schlimgen et al., Neuronal pentraxin, a secreted protein with homology to acute phase proteins of the immune system. Neuron, 1995. 14:519-526.
15. Omeis et al., Mouse and human neuronal pentraxin 1 (NPTX1): Conservation, genomie structure, and chromosomal localization. Genomics, 1996. 36:543-545.
16. Hsu & Perin, Human neuronal pentraxin II (NPTX2): Conservation, genomie structure, and chromosomal localization. Genomics, 1995. 28:220-227.
17. Tsui et al., Narp, a novel member of the pentraxin family, promotes neurite outgrowth and is dinamically regulated by neuronal activity. J. Neurosci., 1996. 15:2463-2478.
18. Dodds et al., Neuronal pentraxin receptor, a novel putative integral membranę pentraxin that interacts with neuronal pentraxin 1 and 2 and taipoxin-associated calcium-binding protein 49. J. Biol. Chem., 1997. 272:21488-21494.
19. Kirkpatrick et al., Biochemical interactions of the neuronal pentraxins. Neuronal pentraxin (NP) receptor binds to taipoxin and taipoxin-associated calcium-binding protein 49 viaNPl andNP2. J. Biol. Chem., 2000. 275:17786-17792.
20. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo. A laboratory manuał. 2nd Ed., 1994: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
21. Introna et al., Treatment of murine peritoneal macrophages with bacterial lipopolysaccharide alters expression of c-fos and c-myc oncogenes. J. Immunol., 1986. 137:2711-2715.
22. Biffo & Tolosano, The use of radioactively labelled riboprobes for in situ hybridization: Background and examples of application. Liver, 1992. 12:230-237.
23. Conover & Gwatkin, Pre-loading of mouse oocytes with DNA-specific fluorochrome (Hoechst 33342) permits rapid detection of sperm-oocyte fusion. J. Reprod. Fertil., 1988. :681-690.
PL 205 928 B1
Wykaz sekwencji <110> Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. <120> Długa pentraksyna ΡΤΧ3 i Płodność żeńska <130> 012-ST-01-US <140>
<141>
<150> US 60/309,472 <151> 2001-08-03 <160> 11 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1837 <212> DNA <213> Homo sapiens <300>
<301> Breviario et al.
<302> Interleukin-1 Inducible Genes in Endothelial Cells <303> Journal of Biologicai Chemistry <304> 267 <305> 31 <306> 22190-22197 <307> 1992-11-05 <308> Χ636613 <309> 1993-07-29 <400> 1 ctcaaactca tccagcaatg gaactcggat ccatcccact gctcttcatc cgacgtcctg cctggcgagg cgagctgctg ggcgcagcgc gacgcgagcc ttgtgaaaca agtgagacca attaaacaaa gtatctcagc tgaagccatg agggctcaca aggtcacatt tgtgggtggt ctgggatagt catccggggg gtatgtttca aacacatgcc tgaaagagag aaggaaagac tttcagttta tgttgaacag gaattttaca tatgtacctt actataaatg aagttatatt aaataaaata gctcacttga catctccttg gattatgatc gaggacccca atgctggaga cggggcgagc ccgtgcgcgc caggcgaccc ccagaggagg gacctgcacg gctattttat atgaggcttg accatcctgt taccaatcca gtttccctgg tccttgtggg gttcctgagg ggctttgatg gttcttagca aatattgttg taaatgttgt agttgggaag agttgagacc attggaaaaa atgctgtgtc agggacaatt ttggaagaat attacaaaaa tagtttatgt gcaaaaggga ttttataaaa gagtctcctc cgattctgtt tcatgtatgt cgccgtgcga actcgcagat tgcagaggct cgggggctcc gcgacgcggg cggggcgcgc cggtgcaggg tcccaatgcg agtcttttag tttcctatgg tagtgtttgt gaaggtggac taaatggtga gaggaatcct aaacattagc atgaagagat ggtggggagt gaaactccac gtctgaaaac aatctttatt gcttttgagg tctgtcagat gttttacttt aacaaaataa aaatgatgaa gttataatcg tttgtattaa ctaaaaaaa a ccgccagctg ttgtgctctc gaatttggac ctgcggtcag gagagagcgc gcgggaggag cgcagaggcc ccgcaggctg cctggccgcg ctgggctgcc ttccaagaag tgcctgcatt cacaaagagg ggtgggtgga ccacctgtgc actggcggct gcagattggc cttctctggg aagagagacc cacagagatc ttgaagccaa tcagtgcata tgtactggcc ataatgttac aaactctcaa tctttggtta gatttgttgt aacatattta aatgt cacgt tttaagacta aaaaaaa tggaaagaac tggtctgcag aacgaaatag gagcactcgg atgctgctgc ctgggccggc aggctgacca gcgcgtatgg gtgctagagg cggagctggc atttttggaa tgggtcaaag aatccatatg gaggagaaca ggcacctgga accactgttg caagaaaaga agactcacag ggaggagcag cagccacatg
3CJclcIcLQ clclcLC ataggaacac aaatactgaa tagactttat ataattaaaa attttgtttt ccattgttca tactacaagg ttttgagaag tttttgtaaa tttgcgtctc tgttggccga acaatggact aatgggacaa aagccacgga tcgcggaaag gtgctctgga agggcgcgga agctgcggca tgccggcagg gcgtgcatcc ccacagatgt aaatccagct aactggttgc attcagagga agatggccac atggctgctg gcttcaatat agtcttgtca gaggagctca tcacacttaa ttgagactaa taaacagttg gccatggtgc aggactgtat ggccagagat ttgttattgg tgacttaaca atagtcatat gctctactgt
837
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 205 928 B1 <220>
<221> PEPTYD SYGNAŁOWY <222> (1)..(17) <223>
<220>
<221> MAT_PEPTYD <222> (18)..(381) <300>
<301> Breviarlo et al.
<302> Interleukln-1 Inducible Genes in Endothelial Cells <303> Journal of Biological Chemistry <304> 267 <305> 31 <306> 22190-22197 <307> 1992-11-05 <308> CAA45158 <309> 1993-07-29 <400> 2
Met His -15 Leu Leu Ala -10 Ile Leu Phe -5 Cys Ala Leu Trp Ser Ala Val Leu
Ala Glu -1 1 Asn Ser 5 Asp Asp ] Tyr .0 Asp Leu Met 15 Tyr Val Asn Leu Asp Asn
Glu Ile Asp 20 Asn Gly Leu 25 His Pro Thr 30 Glu Asp Pro Thr Pro Cys Asp
Cys Gly Gin 35 Glu His 40 Ser Glu Trp 45 Asp Lys Leu Phe Ile Met Leu Glu
Asn Ser 50 Gin Met 1 Arg 55 Glu Arg Met 60 Leu Leu Gin Ala Thr Asp Asp Val
Leu Arg 65 Gly Glu 70 Leu Gin Arg 75 Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala
Glu Ser 80 Leu Ala 85 Arg Pro Cys 90 Ala Pro 95 Gly Ala Pro Ala Glu Ala Arg
Leu Thr Ser 100 Ala Leu Asp 105 Glu Leu Leu 110 Gin Ala Thr Arg Asp Ala Gly
Arg Arg Leu 115 Ala Arg Met 120 Glu Gly Ala 125 Glu Ala Gin Arg Pro Glu Glu
Ala Gly 130 Arg Ala Leu 135 Ala Ala Val 140 Leu Glu Glu Leu Arg Gin Thr Arg
Ala Asp 145 Leu His Ala 150 Val Gin Gly 155 Trp Ala Ala Arg Ser Trp Leu Pro
Ala Gly 160 Cys Glu 165 Thr Ala Tle 170 Leu Phe Pro 175 Met Arg Ser Lys Lys Ile
Phe Gly Ser 180 Val His Pro 185 Val Arg Pro 190 Met Arg Leu Glu Ser Phe Ser
Ala Cys Ile Trp Val Lys Ala Thr Asp Val Leu Asn Lys Thr Ile Leu
195 200 205
PL 205 928 B1
Phe Ser 210 Tyr Gly Thr 215 Lys Arg Asn 220 Pro Tyr Glu Ile Gin Leu Tyr Leu
Ser Tyr Gin Ser Ile Val Phe Val Val Gly Gly Glu Glu Asn Lys Leu
225 230 235
Val Ala Glu Ala Met Val Ser Leu Gly Arg Trp Thr His Leu Cys Gly
240 245 250 255
Thr Trp Asn Ser Glu Glu Gly Leu Thr Ser Leu Trp Val Asn Gly Glu
260 265 270
Leu Ala Ala Thr Thr Val Glu Met Ala Thr Gly His Ile Val Pro Glu
275 280 285
Gly Gly Ile Leu Gin Ile Gly Gin Glu Lys Asn Gly Cys Cys Val Gly
290 295 300
Gly Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Phe Ser Gly Arg Leu Thr Gly Phe
305 310 315
Asn Ile Trp Asp Ser Val Leu Ser Asn Glu Glu Ile Arg Glu Thr Gly
320 325 330 335
Gly Ala Glu Ser Cys His Ile Arg Gly Asn Ile Val Gly Trp Gly Val
340 345 350
Thr Glu Ile Gin Pro His Gly Gly Ala Gin Tyr Val Ser
360 <210> 3 <211> 1841 <212> DNA <213> Mus musculus <300>
<301> Introna et al.
<302> Cloning ot Mouse ΡΤΧ3 <303> Blood <304> 87 <305> 5 <306> 1862-1872 <307> 1996-03-01 <308> Χ83601 <309> 1996-01-10 <400> 3 actcctgcct cacactatct ctccegggct caaactcgga tcactgtaga gtctcgcttc 60 ttcccctgcg gctgcgaacg aaatttcgcc tctccagcaa tgcacctccc tgcgatcctg 120 ctttgtgctc tctggtctgc agtagtggct gagaoctcgg atgactacga gctcatgtat 180 gtgaatttgg acaacgaaat agacaatgga cttcatccca ccgaggaccc cacgccatgc 240 gactgccgcc aggagcactc ggagtgggac aagctgttca tcatgctgga gaactcgcag 300 atgcgggagg gcatgctgtt gcaggccacc gacgacgtcc tccgtggaga gotgcagcgg 360 ctgcgggcag agctggggcg gctggcgggc ggcatggcga ggccgtgcgc agccggtggc 420 cccgcagacg ccaggctggt gcgggcgctg gagccgctgc tgcaggagag ccgtgacgcg 480 agcctcaggc tggcgcgcct ggaggacgcg gaggcgcggc gacccgaggc gacagtgcct 540 ggcctaggcg ctgtgctgga ggaactgcgg cggacgcgcg ccgacctgag cgccgtgcag 600 agctgggtcg cccgccactg gctgcccgca ggttgtgaaa cagcaatttt cttcccaatg 660 cgttcgaaga agatttttgg aagcgtgcat cctgtgagac caatgaagct tgaatctttt 720 agtacttgca tttgggtcaa agccacagat gtattaaaca aaaccatcct gttttcttat 780 ggcacaaagt ggaaccccta tgagattcag ctgtacctca gttcccagtc cctagtgttg 840 gtggtgggtg gaaaggagaa caagctggct gcagacactg tggtgtccct ggggaggtgg 900 tcccacctgt gtggcacctg gagttcagag caggggagca tgtccctgtg ggcaaacggg 960 gagctggtgg ctaccactgt agagatggcc aaaagtcact ctgttcctga gggtggactc 1020
PL 205 928 B1 ctacagattg gccaagaaaa gaatggttgc tgtgtaggtg ggggctttga cgaatcatta 1080 gcattttctg gaagaatcac aggcttcaat atctgggatc gggttctcag cgaggaggag 1140 atacgggcca gtggaggagt cgaatcctgt cacatccggg gaaatgtcgt cgggtgggga 1200 gtcacagaga ttcaggcgca cggaggagcc cagtatgttt cttaagtgtt gtgaaaatct 1260 acttgaagcc aaaggagact cacattttaa atatgccagt tggaaaagtc tgaaaacttc 1320 ggtgcgtaat agacgaatga aggagagact tgagattgtc tttgtttatc ttggcaaaat 1380 actgaataca cagttgaagg gaaggcttga gagagggctc cgggatgttg ttactaagcc 1440 ttatactgtg gtgctttcag attaatgtct gcctctgtca gataaaccct cagataacta 1500 aacatgactg gactctgaac agagggacga ttgtgtgact tttttttttt tttattttgg 1560 ttaattttat tttggccaga gacattttta tattggaaga ataacaaaac aagctctgtt 1620 gcccattgtt cattctttct ggtgtgtatt ttgtgacaaa agagatgatg agaaaaccat 1680 aattatacca caaagtgact tattaacgaa cataaatgta gcttacgtgt tataatccaa 1740 tccatttggg agaaggtagt tgtgtaattt atattgtgaa atgtaattgt attaatttta 1800 tttttgtaaa agtctactgt aaataaattg ttttataaag c 1841 <210> 4 <211> 381 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> PEPTYD SYGNAŁOWY <222> (1)..(17) <223>
<220>
<221> MAT_PEPTIDE <222> (18) .. (381) <223>
<300>
<301> Introna et al.
<302> Cloning of Mouse ΡΤΧ3 <303> Blood <304> 87 <305> 5 <306> 1862-1872 <307> 1996-03-01 <308> CAA58580 <309> 1996-01-10 <400> 4
Met His -15 Leu Pro Ala -10 Ile Leu Leu -5 Cys Ala Leu Trp Ser Ala Val Val
Ala -1 1 Glu Thr Ser 5 Asp Asp Tyr 10 Glu Leu Met 15 Tyr Val Asn Leu Asp Asn
Glu Ile Asp 20 Asn Gly Leu 25 His Pro Thr 30 Glu Asp Pro Thr Pro Cys Asp
Cys Arg 35 Gin Glu His 40 Ser Glu Trp 45 Asp Lys Leu Phe Ile Met Leu Glu
Asn Ser 50 Gin Met Arg 55 Glu Gly Met 60 Leu Leu Gin Ala Thr Asp Asp Val
Leu 65 Arg Gly Glu 70 Leu Gin Arg 75 Leu Arg Ala Glu Leu Gly Arg Leu Ala
Gly Gly Met Ala Arg Pro Cys Ala Ala Gly Gly Pro Ala Asp Ala Arg
85 90 95
PL 205 928 B1
Leu Vai Arg 100 Ala Leu Glu 105 Pro Leu Leu Gin Glu 110 Ser Arg Asp Ala Ser
Leu Arg Leu Ala Arg Leu Glu Asp Ala Glu Ala Arg Arg Pro Glu Ala
115 120 125
Thr Val Pro Gly Leu Gly Ala Val Leu Glu Glu Leu Arg Arg Thr Arg
130 135 140
Ala Asp Leu Ser Ala Val Gin Ser Trp Val Ala Arg His Trp Leu Pro
145 150 155
Ala Gly Cys Glu Thr Ala Ile Phe Phe Pro Met Arg Ser Lys Lys Ile
160 165 170 175
Phe Gly Ser Val His Pro Val Arg Pro Met Lys Leu Glu Ser Phe Ser
180 185 190
Thr Cys Ile Trp Val Lys Ala Thr Asp Val Leu Asn Lys Thr Ile Leu
195 200 205
Phe Ser Tyr Gly Thr Lys Trp Asn Pro Tyr Glu Ile Gin Leu Tyr Leu
210 215 220
Ser Ser Gin Ser Leu Val Leu Val Val Gly Gly Lys Glu Asn Lys Leu
225 230 235
Ala Ala Asp Thr val Val Ser Leu Gly Arg Trp Ser His Leu Cys Gly
240 245 250 255
Thr Trp Ser Ser Glu Gin Gly Ser Met Ser Leu Trp Ala Asn Gly Glu
260 265 270
Leu Val Ala Thr Thr Val Glu Met Ala Lys Ser His Ser Val Pro Glu
275 280 285
Gly Gly Leu Leu Gin Ile Gly Gin Glu Lys Asn Gly Cys Cys Val Gly
290 295 300
Gly Gly Phe Asp Glu Ser Leu Ala Phe Ser Gly Arg Ile Thr Gly Phe
305 310 315
Asn Ile Trp Asp Arg Val Leu Ser Glu Glu Glu Ile Arg Ala Ser Gly
320 325 330 335
Gly Val Glu Ser Cys His Ile Arg Gly Asn Val Val Gly Trp Gly Val
340 345 350
Thr Glu Ile Gin Ala His Gly Gly Ala Gin Tyr Val Ser
360
<210> 5 <211> 1531 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> PROMOTOR <222> (1) . . (1317) <223>
<220>
<221> WIĄZANIE BIAŁKA <222> (1222)..(1231)
PL 205 928 B1 <223> NF-kB <30 0>
<301> Basile et al.
<302> Characterization of the Promoter for the <303> Journal of Biological Chemistry <304> 272 <305> 13 <306> 8172-8178 <307> 1997-03-28 <308> Χ97748 <309> 1997-11-15
Humań Long Pentaxin ΡΤΧ3 <400> 5 gaattccccg tcatcaacat aggggcccta cgggattttc catgtgaaca acatgatcct gaaaagaaac ccccattcta acgtctgtaa tcgagaccag tgggtgtggt cttgaaccca ggcaacaaga ctcctcaagt ttcttaafat tgtacaaagg acagaaaatg cctccttcat agaagcccag gtaaaccttt cccctccccc tcatccccat ctcactctcc gaactttgcg gcagtgttgg atagacaatg gatctccctt ctaactctcc acctttggcc taagctttgc ttccacatgg 60 ttggtggtta tagaactaat aacccctatc tcacttcact cctatgccag 120 gcatcagctc atgggattgt tgtttttgct ttcctctcta tctttggctc 180 cccttacttt aatgggagct catctgtacc ttttaagttt ttattaatat 240 cagacctgta tatattgtta gaagcagaaa tctctaagtt tacttttaaa 300 tgcctcgaaa ccttgtagaa taatataatg tccacataat accaagttat 360 atacctaaat aactaaataa gtatattcct tttttccccc agcttttttt 420 ggttacccag ttgtactgtg ttgtttgtca taggccgggt gaggtggctc 480 tcctagcaat ttgggaggcg aaggcgggtg gatcgcctga ggtcaggagt 540 cctggctaac atggtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaattaac 600 ggcgggtgcc tgtaattcca gctacttggg aagctgaggt aggagaatcg 660 ggatgcggag gttgcagtga gccgagatca caccattgca ctccagcctg 720 gcgaaattca gtctoaaaaa aaaaaattat ctataaaagt ataggtgcaa 780 attaaagaca agatagctcg gattggactt gactttcaga gccataacta 840 gttggtttat cttggaatca gaccattttc agtttcaacc tgtaaaacag 900 aaacatggaa agttttctat atataaaggg ttgtgaaata ataacagctc 960 ctgaaatgat gatttgcttc agtaccctot gaaatttctc ccctaccacc 1020 ccccattgct atcaattcaa attacaacag ctaattctca ggagaacagt 1080 tttctctcct ctttcccctc tgaccctcct ccaattaatc tgactgcagc 1140 gcggtttaat attgtgcaac ttccacattt ccctcgctct cccacccagc 1200 accaaattca ggggaactcc cgttaccgca gtgccaccag cattactcat 1260 tcaggctttc ctcagcattt attaaggact ctctgctcca gcctctcact 1320 tccgctcaaa ctcagctcac ttgagagtct cctcccgcca gctgtggaaa 1380 tctctccagc aatgcatctc cttgcgattc tgttttgtgc tctctggtct 1440 ccgagaactc ggatcattat catctcatgt atgtgaattt ggacaacgaa 1500 gactccatcc cactgaggac c 1531 <210> 6 <211> 2708 <212> DNA <213> Mus musculus <220>
<221> PROMOTOR <222> (1)..(1373) <223>
<300>
<301> Altmeyer et al.
<302> Promoter Structure and Transcriptional Activation <303> Journal of Biological Chemistry <304> 270 <305> 43 <306> 25584-15590 <307> 1995-10-27 <308> 033842 <309> 1995-10-27 <400> 6 atcccagagg ctctctgtac tggcattagg acctcacagc accacatcag gtttcttaat 60
PL 205 928 B1 gtggactcta gaaactgaac tcgagcccac agccttagga gaaaagcacc ttacaaagct 120 gtggctccac actgcccttt aaacaatatc gtattgtctc atattgccat cgctttctga 180 tggctttaac ggtttcaaac ataccctgtc tttagccgtg atctcaaata agtgaagctc 240 ttgagcaggg gcctgatgcc ttttgacttt gtgttgattc atgcttatga tgccctgttc 300 cctccgtgtc tagctatgtt taactgtgga ttcaattttt attggtgggt ggattggtac 360 atgcatgtgc attccagatg cgtgagggca ctcaggccag gaaagccact catgagtctc 420 tgtcaggagc agaggaattt acctatggaa atccaagagc agccttctga gaggcctggc 480 ctgagggtag tacccctccc atcatgatca ggatgtgact ggtaaccctc cccctccatc 540 tcctttgtat attggagact tgtatcagct caggggtatc ctctgggagt ggttccctct 600 agatctgtgt agttttttag atcttgcttt atttggagtt tattctcatg ttttaatttt 660 ttatcactat tattatgact tatcaacacc tatctaggta cttttcactg ggggaggggg 720 caggttttac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acagtcaota 780 atgtaaaatt taaaacaggg accttgatag gatatgtcca agaataccca agcaccctaa 840 agccactata ttcccgccct cactttcctg ttttactggg ttttgaccoa gccatactgt 900 gttttttagt tgctccacca gaggagtcaa gactagttag tcaagattga cttctagagt 960 cataaaaatt cttaatgggt tattttggag tcacggaatc attttctata gcttggtctt 1020 gagaaagtat ccaaaggaaa agtgaaaaaa aaaagttttc cataacttca ggggttgtgg 1080 agtaatgaaa gctcacacca aatgccaaaa tgataattcg ccctgtacct ctgtgctcct 1140 caccccccaa agcgctagca cttcaggtta cagcaactaa tcctcagggg caccagaaaa 1200 gtccagcttc cctccccttc tccccctgac tcgcctctaa ttaatctgcc tgcagtgtgg 1260 acctcggtgg tttaacattg tgcaacctct tcagctccct tgccctccca cccaaccccc 1320 tcccccaaat ccaggggaac tccctcgcgc tgtgccaccg acattagtca ttcatccgct 1380 catgctttgg agcgtttatt aagggcttca ctcctgcctc acactatctc tcccgggctc 1440 aaactcggat cactgtagag tctcgcttct tcccctgcgg gtgcgaagca aatttcggct 1500 ctccagcaat gcacctccct gcgatcctge tttgtgctct ctggtctgca gtagtggctg 1560 agacctcgga tgactacgag ctcatgtatg tgaatttgga caacgaaata gacaatggac 1620 ttcatcccac cgaggaccgt aagttcattt ttaactctct cagcgtatca aaactacata 1680 actcacttct gggggggcgc gattaacata attaacatag atagccaatg aagcaagcta 1740 aaattatact ttatttgtga aagcaaggac tgggggaaaa aaggaaagca aggaaatatc 1800 tgagaaaagc cagaggtttt aaattatttt tgtaacattt atgatgagtt aagttatacg 1860 aaatctttaa ctgtttttag ctatattaat ggcattttct cagttagttt aacatgtcta 1920 taaagaatag tctgtgtcat ctttgagttt acacgcacgc tgttttcaga gctatcctta 1980 gaaggagagc gttgctgggg acaggctgaa acttggagtc accaagagtg caacccatgg 2040 ccacccagga caagctgata acacttgtgt gtgtcctgcg ttctagccac gccatgcgac 2100 tgcgcccagg agcactcgga gtgggacaag ctgttcatca tgctggagaa ctcgcagatg 2160 cgggagggca tgctgttgca ggccaccgac gacgtcctcc gtggagagct gcagcggctg 2220 cggtcagagc tgggccggct ggcgggcggc atggcgaggc cgtgcgcagc cggtggcccc 2280 gcagacgcca ggctggtgcg ggcgctggag ccgctgctgc aggagagccg tgacgcgagc 2340 ctcaggctgg cgcgcctgga ggacgcggag gcgcggcgac ccgaggcgac agtgcctggc 2400 ctaggcgctg tgctggagga actgcggcgg acgcgctccg acctgagcgc cgtgcagagc 2460 tgggtcgccc accactggct gcccgoaggt aagcccacgg tcggctctgt ccctagaggc 2520 aagcttttgt gggaccctca cactcagagc cccagtactt ttcataggca cactcacaga 2580 gctcacacca cgccaggcag ctcattgcct tttaaaagta tttccaagcc cgaggaaccc 2640 aaaagaaaaa aacgaggatt taaaccatca gtctggaagt tgacgtcaga ggttcctgat 2700 accggatc 2708 <210> 7 <211> 21 ' <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<22 3> PRIMER OLIGONUKLEOTYDOWY <400> 7
agcaatgcac ctccctgcga t <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220> <223> PRIMER OLIGONUKLEOTYDOWY 21
PL 205 928 B1 <400> 8 tcctcggtgg gatgaagtcc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> PRIMER OLIGONUKLEOTYDOWY <400> 9 ctgctcttta ctgaaggctc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<22 3> PRIMER OLIGONUKLEOTYDOWY <400> 10 tcctcggtgg gatgaagtcc a 21 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> SEKWENCJA ZGODNA “PENTRAKSYNO-PODOBNA” <220>
<221> MISC_CECHA <222> (2)..(2) <223> any amino acid <220>
<221> MISC__ CECHA <222> (4)..(4) <223> any amino acid <220>
<221> MISC_ CECHA <222> (5) . . (5) <223> Ser or Thr <220>
<221> MISC_ CECHA <222> (7)..(7) <223> any amino acid <400 11
His Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Ser
5
PL 205 928 B1

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej PTX3 do otrzymania leku wywołującego wzrost zdolności reprodukcyjnej u osobnika żeńskiego z defektem zdolności reprodukcyjnej.
  2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wspomnianym osobnikiem jest kobieta samica zwierzęcia.
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że lek podawany jest dosystemowo.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że lek podawany jest odmiejscowo.
  5. 5. Zastosowanie białka PTX3 jako markera diagnostycznego zdolności reprodukcyjnej u osobnika żeńskiego.
PL368413A 2001-08-03 2002-07-18 Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej pentraksyny PTX3 oraz białka PTX3 PL205928B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30947201P 2001-08-03 2001-08-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL368413A1 PL368413A1 (pl) 2005-03-21
PL205928B1 true PL205928B1 (pl) 2010-06-30

Family

ID=23198379

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL368413A PL205928B1 (pl) 2001-08-03 2002-07-18 Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej pentraksyny PTX3 oraz białka PTX3

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20040198655A1 (pl)
EP (1) EP1411971B1 (pl)
JP (1) JP4312599B2 (pl)
KR (1) KR100890999B1 (pl)
CN (1) CN1231257C (pl)
AT (1) ATE321566T1 (pl)
AU (1) AU2002324328B2 (pl)
BR (1) BR0211619A (pl)
CA (1) CA2454421C (pl)
DE (1) DE60210297T2 (pl)
DK (1) DK1411971T3 (pl)
ES (1) ES2261714T3 (pl)
HK (1) HK1068797A1 (pl)
HU (1) HU228978B1 (pl)
MX (1) MXPA04000909A (pl)
PL (1) PL205928B1 (pl)
PT (1) PT1411971E (pl)
WO (1) WO2003011326A1 (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1298487B1 (it) * 1997-12-19 2000-01-10 Sigma Tau Ind Farmaceuti Composizioni farmaceutiche comprendenti pentraxina lunga ptx3 per la terapia di patologie di tipo infettivo, infiammatorio o tumorale,
ITRM20020109A1 (it) * 2002-02-28 2003-08-28 Sigma Tau Ind Farmaceuti Derivati funzionali della pentraxina lunga ptx3 per preparare un vaccino autologo per la cura dei tumori.
ITRM20030595A1 (it) * 2003-12-23 2005-06-24 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso della ptx3 o di un suo derivato funzionale da sola o in associazione con tsg6 per il trattamento di patologie degenarative dell'osso o della cartilagine e per il trattamento della infertilita' femminile.
ITRM20040489A1 (it) * 2004-10-08 2005-01-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Pentraxina lunga ptx3 deglicosilata o desialidata.
CA2605068A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Delivery of sirna by neutral lipid compositions
KR101365906B1 (ko) * 2005-12-29 2014-02-21 휴매니타스 미라솔 에스.피.에이. 임산 기간의 염증 자궁내막 기능장애용 진단 테스트
FR2896588B1 (fr) * 2006-01-20 2016-08-19 Univ D'angers Methode de diagnostic in vitro de reponse immunitaire autoimmune par detection d'anticorps diriges contre l'antigene pentraxine 3.
ES2389452T3 (es) 2006-05-02 2012-10-26 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Uso de timosina 1, sola o en combinación con PTX3 o ganciclovir, para el tratamiento de infección por citomegalovirus
US9177098B2 (en) 2012-10-17 2015-11-03 Celmatix Inc. Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time
US10162800B2 (en) 2012-10-17 2018-12-25 Celmatix Inc. Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time
US9836577B2 (en) 2012-12-14 2017-12-05 Celmatix, Inc. Methods and devices for assessing risk of female infertility
AU2015209126A1 (en) * 2014-01-27 2016-08-04 Celmatix, Inc. Methods for assessing whether a genetic region is associated with infertility
CA2954895A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Celmatix Inc. Methods and systems for assessing infertility and related pathologies

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1298487B1 (it) * 1997-12-19 2000-01-10 Sigma Tau Ind Farmaceuti Composizioni farmaceutiche comprendenti pentraxina lunga ptx3 per la terapia di patologie di tipo infettivo, infiammatorio o tumorale,

Also Published As

Publication number Publication date
CN1231257C (zh) 2005-12-14
MXPA04000909A (es) 2004-03-26
JP2005502640A (ja) 2005-01-27
HU228978B1 (en) 2013-07-29
PL368413A1 (pl) 2005-03-21
JP4312599B2 (ja) 2009-08-12
DE60210297D1 (de) 2006-05-18
BR0211619A (pt) 2004-08-24
EP1411971A1 (en) 2004-04-28
WO2003011326A1 (en) 2003-02-13
HUP0400662A2 (hu) 2004-11-29
ATE321566T1 (de) 2006-04-15
AU2002324328B2 (en) 2007-09-06
HK1068797A1 (en) 2005-05-06
DE60210297T2 (de) 2007-01-11
ES2261714T3 (es) 2006-11-16
HUP0400662A3 (en) 2010-01-28
DK1411971T3 (da) 2006-08-07
CA2454421C (en) 2013-03-12
CA2454421A1 (en) 2003-02-13
KR20040019107A (ko) 2004-03-04
CN1538849A (zh) 2004-10-20
KR100890999B1 (ko) 2009-03-31
EP1411971B1 (en) 2006-03-29
US20040198655A1 (en) 2004-10-07
PT1411971E (pt) 2006-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ivanov et al. Cerebellar ataxia, seizures, premature death, and cardiac abnormalities in mice with targeted disruption of the Cacna2d2 gene
PL205928B1 (pl) Zastosowanie rekombinowanej ludzkiej pentraksyny PTX3 oraz białka PTX3
US20060015954A1 (en) GPR54 knock-out mammals and screening methods using them
US20060148001A1 (en) Compositions and methods for treating female fertility
AU2002324328A1 (en) Use of long pentraxin PTX3 for treating female infertility
KR20000010606A (ko) 전사 인자 활성을 변조시킴으로써 t 세포 서브셋을 조절하기위한 방법 및 조성물
US20060242724A1 (en) Receptor
US20020155564A1 (en) Cloning of a high growth gene
JPWO2006129881A1 (ja) 骨・関節疾患の予防・治療剤およびそのスクリーニング方法
US20060123502A1 (en) Assay methods for identifying RE2-like antagonists, methods of use, and non-human transgenic animals
US20030041341A1 (en) Non-human transgenic animal whose germ cells and somatic cells contain a knockout mutation in DNA encoding 4E-BP1
US20030059434A1 (en) Methods and compositions for treating gastrointestinal tract mucin production associated disease conditions
US20090233986A1 (en) Methods and compositions for using sax2
JP2006025647A (ja) Ｆｓｐ２７ノックアウト動物
US6794147B1 (en) Methods for identifying contraceptive compounds
US20030082650A1 (en) Great gene and protein
JP2007282501A (ja) アポトーシス制御能力の検定方法
WO2004074475A1 (ja) 転写制御シスエレメント及びそれに特異的に結合する転写調節因子並びにそれらの用途
MXPA04009105A (es) Inhibicion de la subunidad °3 de los canales ca2+ de tipo l.
JP2005187408A (ja) 血管新生調節剤
WO2003029818A2 (en) Methods and animal models for tumor formation involving dutti
JP2001095578A (ja) 精巣特異的遺伝子
WO2004039972A1 (ja) Ｈｉ７ｔ２１３遺伝子導入動物および新規なｈｉ７ｔ２１３タンパク質およびそのｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140718