KR20000010606A - 전사 인자 활성을 변조시킴으로써 t 세포 서브셋을 조절하기위한 방법 및 조성물 - Google Patents

전사 인자 활성을 변조시킴으로써 t 세포 서브셋을 조절하기위한 방법 및 조성물 Download PDF

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아이-쳉 호
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Abstract

본 발명은 NF-AT 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 1가지 이상의 전사 인자의 활성을 변조시킴으로써 T 헬퍼 타입 2(Th2) 관련된 시토카인, 특히 인터루킨-4의 생성을 변조시키는 방법에 관한 것이다. 1가지 구체예에 있어서, maf 패밀리 단백질(예를 들어, c-Maf 또는 p18과 같은 작은 maf 단백질)의 활성이 변조된다. 또 다른 구체예에 있어서, NF-AT 패밀리 단백질(예를 들어, NIP45)과 상호작용하는 단백질의 활성이 변조된다. 예를 들어, maf 패밀리 단백질 및 NF-AT 단백질의 활성이 변조되거나 maf 단백질 및 NF-AT와 상호작용하는 단백질의 활성이 변조되는 조합 방법은 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 전사 인자 활성을 변조시키는 작용제를 사용하여 피검체내에서의 T 헬퍼 타입 1(Th1) 또는 T 헬퍼 타입 2(Th2) 서브셋의 발달을 변조시키기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, NIP45를 코드화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 NIP45 조성물, 안티센스 핵산 분자, NIP45 핵산 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 발현 벡터가 도입된 숙주 세포 및 NIP45 트랜스유전자를 갖는 사람 이외의 형질전환된 동물이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명은 단리된 NIP45 단백질 및 펩티드, NIP45 유합 단백질 및 항-NIP45 항체를 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 NIP45 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

전사 인자 활성을 변조시킴으로써 Ｔ 세포 서브셋을 조절하기 위한 방법 및 조성물
CD4+T 헬퍼 세포는 균일한 집단은 아니지만, 시토카인 분비를 기초로 하여 T 헬퍼 타입 1(Th1) 및 T 헬퍼 타입 2(Th2)로 명명되는 2가지 이상의 서브셋으로 나뉠 수 있다 [참조: Mosmann, T.R. et al. (1986) J.Immunol. 136:2348-2357; Paul, W.E. and Seder, R.A. (1994) Cell 76:241-251; Seder, R.A. and W.E. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:635-673]. Th1 세포는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-γ(IFN-γ)를 분비시키는 반면에, Th2 세포는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-10(IL-10) 및 인터루킨-13(IL-13)을 생성시킨다. 두 서브셋은 모두 종양 괴사 인자(TNF) 및 과립구/대식구-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 시토카인을 생성시킨다. 이들의 상이한 시토카인 발현 이외에, Th1 및 Th2 세포는 상이한 작용 활성을 갖는 것으로 생각된다. 예를 들어, Th1 세포는 지연형 과민성 반응을 유도하는 데에 관여하는 반면에, Th2 세포는 B 림프구에 효율적인 "도움(help)"을 제공하고, IgG1 및 IgE 항체의 생성을 자극하는 데에 관여한다.
현재 Th1 대 Th2 세포의 비율이 자가면역, 알레르기 및 전염병과 같은 면역학적으로 매개된 질병의 광범한 정렬의 결과와 관련이 있다는 풍부한 증거가 있다. 예를 들어, 마우스에서의 실험적인 레슈마니아 감염의 경우, 감염에 내성이 있는 동물은 Th1 반응을 우세하게 일으키는 반면에, 진행성 감염에 민감한 동물은 Th2 반응을 우세하게 일으킨다 [참고문헌: Heinzel, F.P., et al. (1989) J. Exp. Med. 169:59-72; Locksley, R.M. and Scott, P. (1992) Immunoparasitology Today 1:A58-A61]. 쥐과 동물 주혈흡충병의 경우, Th1 대 Th2 스위치는 암컷 기생충에 의해 조직내로 알이 방출됨과 동시에 관찰되며, 이는 질병 상태의 악화와 관련이 있다 [참고문헌: Pearce, E.J., et al. (1991) J.Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M., et al. (1991) J.Immunol. 141:1344-1327; Kullberg, M.C., et al. (1992) J.Immunol. 148:3264-3270]. 만성 감염(예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 및 결핵에 의한 감염) 및 특정한 전이성 암종을 포함하는 다수의 사람 질병은 또한 Th1 대 Th2 스위치를 특징으로 한다 [참조: Shearer, G.M. and Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M and Shearer, G.M. (1993) Immunology Today 14:107-111; Yamamura, M., et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:1005-1010; Pisa, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:7708-7712; Fauci, A.S. (1988) Science 239:617-623]. 또한, 특정한 자가면역 질병은 우세한 Th1 반응과 관련이 있는 것으로 밝혀져 왔다. 류마티스성 관절염에 걸린 환자는 활액분비 조직에서 우세하게 Th1 세포를 가지며[참고문헌: Simon, A.K., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8562-8566], 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 자가반응성 Th1 세포에 의해 유도될 수 있다 [참고문헌: Kuchroo, V.K., et al. (1993) J. Immunol. 151:4371-4381].
Th1 및 Th2 서브셋의 비율을 변화 또는 조작하는 능력은 IL-2 만을 분비시키는 CD4 T 헬퍼 전구체 세포(Thp)의 분화가 Th1 또는 Th2 이펙터 세포가 되도록 선택되는 메카니즘의 이해를 필요로 한다. 시토카인은 그 자체로 유력한 Th 세포 유도물질이며, 자가조절성 루프를 형성한다는 것은 명백하다 [참조: Paul, W.E. and Seder, R.A. (1994) Cell 76:241-251; Seder, R.A. and Paul, W.E. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:635-673]. 따라서, IL-4는 전구체가 Th1으로 분화되는 것을 억제하면서 Th2 세포의 분화를 촉진하는 반면에, IL-12 및 IFN-γ는 반대 효과를 갖는다. 따라서, Th1:Th2 비율을 변화시키는 1가지 가능한 수단은 선택된 시토카인의 수준을 증가 또는 감소시키는 것이다. 시토카인 또는 시토카인에 대한 항체를 직접 투여하는 것은 Th1 또는 Th2 세포 중의 하나에 의해 매개되는 특정한 질병에 대한 효과를 갖는 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들어, 재조합 IL-4 또는 IL-12에 대한 항체가 투여되면 EAE, 즉 Th1 유도된 자가면역 질병이 개선되는 반면에[참조: Racke; M.K. et al. (1994) J.Exp.Med. 180:1961-1966; and Leonard, J.P. et al. (1995) J.Exp.Med. 181:381-386], 항-IL-4 항체는 Th2 매개된 기생충성 질병, 즉 레슈마니아 메이져를 치료한다 [참고문헌: Sadick, M.D. et al. (1990) J.Exp. Med. 171:115-127]. 그러나, 치료적 선택으로서, 시토카인 또는 항체의 전신 투여는 원하지 않는 부작용을 가질 수 있기 때문에, Th1/Th2 서브셋을 조작하기 위한 대안적인 방법이 여전히 필요한 상태이다.
Th2 세포 또는 임의의 T 세포 시토카인에서의 IL-4의 조직 특이적 발현에 대한 분자적 기초는 인식되지 않아 오고 있다. 1가지 가능성은 시토카인을 선택적으로 사일런싱(silence)시키는 리프레서 단백질의 존재이다. 전사 사일런싱은 박테리아, 효모 및 포유동물 유전자에 대해 널리 증명되어 왔다. 예로는 이.퀄라이 열조절 유전자[참고문헌: Goransson, M. et al. (1990) Nature 344:682-685], 효모 α2 메이팅(mating) 타입 유전자[참고문헌: Keleher, C.A. et al. (1988) Cell 53:927-936] 및 포유동물 MHC 클래스 I 및 TcRα 유전자[참고문헌: Weisman, J.D. and Singer, D.S. (1991) Mol. Cell. Biol. 11:4228-4234; Winoto, A. and Baltimore, D. (1989) Cell 59:649-655]가 있다. 실제로, 제노푸스(Xenopus) 난모세포 내에 IL-2 게놈 DNA을 주입하는 것을 포함하는 초기 실험은 활성화된 T 세포 추출물에 대하여 휴면 상태의 IL-2에 대한 리프레서 단백질의 존재를 암시하였다 [참고문헌: Mouzaki, A. et al. (1991) EMBO J. 10:1399-1406]. 이러한 실험은 휴면 상태의 T 세포에서의 IL-2 생성의 부재는 IL-2 프로모터내의 네거티브 요소와 상호작용함으로써 IL-2의 전사를 사일런싱시키는 단백질에 기인하는 것임을 암시하였다. 두 번째 가능성은 Th 선택적 트랜스액티베이터의 존재이다. 시토카인 유전자의 전사 요소에 대한 실험은 이들 시토카인 유전자의 조절에 대한 통찰력을 제공하였다. 예를 들어, IL-4 시토카인 프로모터의 분석은 NF-AT 및 AP-1 패밀리의 일원을 포함하는 수 개의 전사 인자에 대한 기능적으로 중요한 부위를 밝혀내 왔다 [참고문헌: Rooney, J.W. et al. (1995) Immunity 2:473-483; Szabo, S.J. et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4793-4805]. NF-AT는 시클로스포린 A 민감성 세포질성 인단백질 및 AP-1 패밀리 일원 단백질로 구성된 유도성 핵 성분을 함유하는 다중서브유닛 전사 복합체이다 [참고문헌: Flanagan, W.M. et al. (1991) Nature 351:803-807; Jain, J. et al. (1992) Nature 356:801-804]. NF-ATp의 정제 및 클로닝은 전사 인자중의 NFκB 패밀리의 Rel 상동성 도메인(RHD)에 대한 제한된 서열 동일성을 갖는 영역을 밝혀내었다 [참고문헌: McCaffrey, P.G. et al. (1993) Science 262:750-754]. 3개의 관련된 유전자, NF-ATc, NF-AT4/x/c3 및 NF-AT3/c4의 후속 클로닝 및 서열화는 유사한 도메인을 밝혀내었다. NF-AT 패밀리 일원은 이러한 도메인 내에서 약 70% 서열 유사성을 공유하며, 전사 인자중의 Rel/NFκB 패밀리의 RHD에 대해 약 18% 서열 유사성을 공유한다. NF-AT 패밀리 일원의 RHD 에서의 매우 제한된 서열 유사성과 일관되게, NFκB 및 NF-AT 단백질의 거동은 현저한 차이가 있으며, NF-AT 표적 유전자의 전사 조절을 매개하는 경로에 대해서는 훨씬 적게 알려져 있다. 그러나, NF-AT 패밀리 일원이 IL-2 및 IL-4를 포함하는 다수의 시토카인 유전자의 프로모터에 결합하여 이를 트랜스액티베이팅시킬 수 있음을 고려해 볼때[참고문헌: Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553; Szabo, S.J. et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4793-4805; Flanagan, W.M. et al. (1991) Nature 352:803-807; Northrop, J.P. et al. (1994) Nature 369:497], NF-AT 단백질은 Th1- 또는 Th2 특이적 시토카인 전사를 매개하는 데에 직접적인 원인이 될 것 같지는 않다.
전부는 아니지만 대부분의 시토카인 프로모터 조절 영역중의 NF-AT 결합 부위는 일반적으로 AP-1 패밀리의 일원인 보조 전사 인자와 결합하는 근접 부위를 수반한다. NF-AT 및 AP-1 단백질은 대등적 및 협동적으로 결합하며, 이들 단백질은 IL-2 및 IL-4 프로모터의 온전한 활성에 필요한 것으로 밝혀져 왔다. 다양한 AP-1 단백질, 상세하게는 c-Jun, c-Fos, Fra-1, Fra-2, Jun B 및 Jun D가 이들 부위와 결합하는 것으로 밝혀져 왔다 [참고문헌: Rao, A. et al. (1994) Immunol. Today 15:274-281; Jain, J. et al. (1993) Nature 365:352-355; Boise, L.H. et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:1911-1919; Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553; Rooney, J. et al. (1995) Mol Cell. Biol. 15:6299-6310]. 그러나, 이들 AP-1 단백질 중에 Th-1 또는 Th2 특이적 방식으로 발현되는 것은 없으며, AP-1 패밀리 일원이 IL-2 또는 IL-4 복합 부위로 분화적 보충되는 것에 대한 증거는 없다 [참고문헌: Rooney, J. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:6299-6310]. 따라서, NF-AT 단백질 뿐만 아니라 AP-1 패밀리 일원인 c-Jun, c-Fos, Fra-1, Fra-2 및 Jun D도 Th2 세포내에서의 IL-4의 조직 특이적 전사를 설명할 수 없다.
도 1A는 시토카인 발현이 리프리서에 기인하는 것이 아님을 입증하기 위해 이용된 세포 융합 방법의 개략도이다.
도 1B는 비융합된 Th1 클론(D1.1), 비융합된 Th2 클론(D10), Th1과 Th2 호모카리온 및 Th1-Th2 헤테로카리온에 의해 발현된 IL-2 및 IL-4 시토카인, 및 대조 액틴, mRNA의 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 도시한다.
도 2A는 Th1 세포, Th2 세포 또는 B 림프종 세포에서의 단리된 cDNA 클론의 발현을 도시하는 노던 블롯 분석이다. GAPDH에 특이적인 대조 프로브는 RNA의 동일한 로딩을 나타내기 위해 사용되었다.
도 2B는 정상적인 천연 비장 세포가 Th2 세포로 시험관내 분화되는 동안에 단리된 cDNA 클론의 상향조절된 발현을 도시하는 노던 블롯 분석이다. 전체 RNA는 표시된 시점에서 채취된 세포로부터 단리되었다. 적합한 희석도에서의 배양물 상층액은 Th1 또는 Th2 계통으로의 분화를 결정하기 위해 ELISA에 의한 시토카인(IL-10) 생성에 대해 측정되었다.
도 3A는 c-Maf에 의한 IL-4 프로모터의 Th1 클론(AE7)으로의 트랜스액티베이션을 도시하는 막대 그래프이다. AE7 세포는 야생형 IL-4 CAT 리포터 구조물 및 대조 플라스미드(pMEX-NeoI), c-Maf 발현 플라스미드(pMEX-Maf) 또는 c-Fos 발현 플라스미드(pMEX-c-Fos) 중의 하나로 코트랜스펙팅되었다. 각각의 샘플의 반을 CD3에 대한 항체로 트랜스펙팅시킨후 24시간 동안 자극시켰다. 모든 샘플을 트랜스펙팅시킨지 48시간후에 채취하고, 상대적인 CAT 활성을 결정하였다.
도 3B는 야생형 IL-4 CAT 리포터 구성물 및 2개의 대조 플라스미드(pMEX-NeoI 및 pREP4)중의 하나, c-Maf 발현 플라스미드 및 대조 플라스미드(pMEX-Maf 및 pREP4), c-Fos 발현 플라스미드 및 대조 플라스미드(pMEX-c-Fos 및 pREP4), c-Jun 발현 플라스미드 및 대조 플라스미드(pMEX-c-Jun 및 pREP4), 대조 플라스미드 및 NF-ATp 발현 플라스미드(pMEX-NeoI 및 pREP-NF-ATp), c-Maf 발현 프라스미드 및 NF-ATp 발현 플라스미드(pMEX-Maf 및 pREP-NF-ATp) 또는 c-Fos 발현 플라스미드 및 NF-ATp 발현 플라스미드(pMEX-c-Fos 및 pREP-NF-ATp)로 코트랜스펙팅된 M12 B 림프종 세포에서의 상대적인 CAT 활성을 도시하는 얇은막 크로마토그래피 플레이트의 사진이다. 샘플의 반은 PMA 및 이오노마이신(ionomycin)으로 트랜스펙팅시킨후 24시간 동안 자극시켰다. 모든 샘플을 트랜스펙팅시킨지 48시간 후에 채취하여, 상대적인 CAT 활성을 결정하였다.
도 4는 c-Maf 및 NF-ATp의 전위적 발현에 의해 M12에서의 IL-4의 내인적 생성을 도시하는 막대 그래프이다. 표시된 대조 또는 발현 플라스미드로 안정하게 트랜스펙팅된 세포를 24시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 자극시키지 않거나 자극시켰다. 각각의 샘플로부터의 200㎕의 상층액으로 시토카인 정량을 위해 ELISA를 수행하였다.
도 5A는 항-CD3 항체로 자극시킨후 표시된 시점에서 채취한 Th2(D10, CDC35) 또는 Th1(AE7, S53) 클론으로부터의 핵 추출물을 사용하여 수행된 IL-4 프로모터의 DNAse I 풋프린트(footprint)의 사진으로, 이는 IL-4 프로모터내의 추정 MARE 부위의 바로 다운스트림에 위치한 Th2 특이적 풋프린트를 도시한다. IL-4 프로모터의 비코딩 가닥 상의 2개의 Th2 특이적 과민성 잔기는*로 표시된다. IL-4 프로모터 프로브(핵 추출물이 없음) 및 막삼-길버트 A/G 래더(ladder)의 DNAse I 소화의 5개 레인은 DNAse I 처리된 샘플 옆에 뻗어있다.
도 5B는 쥐과 동물 IL-4 프로모터의 인접 조절 영역의 개략도이다. 윗 부분은 쥐과 동물 IL-4 프로모터의 주요 서열을 도시한다. 표시된 숫자는 +1에서의 전사 개시 부위와 관련이 있다. 별표는 DNAse I 풋프린트 상에 도시된 Th2 특이적 과민성 잔기를 나타낸다. 아래의 영역은 EMSA 및 도 6 및 7에 도시된 기능 검정법에서 사용된 야생형(-59 내지 -28) 올리고누클레오티드 및 4bp 돌연변이체를 도시한다. 변화된 누클레오티드는 진한 소문자로 나타나며, 윗 부분에 도시된 번호화 시스템에 상응한다.
도 6은 c-Jun이 아닌 c-Maf가 인접 IL-4 프로모터에 결합하고, NF-ATp와 복합체를 형성함을 입증하는 전기영동적 이동성 시프트 검정법(EMSA)의 사진이다. EMSA를 표시된 단백질 및 표지된 이중가닥 올리고누클레오티드를 사용하여 수행하였다.
도 7A는 c-Maf 발현 벡터, 및 야생형 IL-4 CAT 리포터 구성물 또는 도 5B에 도시된 4bp 돌연변이체중의 하나로 코트랜스펙팅된 M12 세포에서의 상대적인 CAT 활성을 도시하는 얇은막 크로마토그래피(바닥)의 사진으로서, c-Maf에 의한 IL-4 프로모터의 트랜스액티베이션이 MARE 및 Th2 특이적 풋프린트를 맵핑함을 입증한다. 3개의 독립적인 실험의 평균 및 1가지 대표적인 실험이 위 및 아래에 각각 도시되어 있다.
도 7B는 c-Maf, IL-4 프로모터(-59 내지 -27) 프로브 및 경합물질로서의 표시된 비표지된 이중가닥 올리고누클레오티드를 사용하여 수행한 EMSA의 사진으로서, 재조합 c-Maf의 IL-4 프로모터로의 결합이 MARE 및 Th2 특이적 풋프린트를 맵핑함을 입증한다.
도 8은 LacZ 리포터 플라스미드 pSH18과 함께, NIP45 플라스미드, 및 "베이트(bait)"로서의 NF-ATp-RHD 또는 대조 베이트로서 Max, CDK2 또는 pEG202 중의 하나로 형질전환된 효모 콜로니(3중)의 사진으로서, NIP45 플라스미드 및 NF-ATp-RHD 베이트를 함유하는 콜로니만이 LacZ 리포터 유전자를 발현시킴을 나타낸다.
도 9는 NIP45 및 NF-ATp가 HepG2 세포에서 상호작용함을 입증하는 면역침전/웨스턴 블롯 실험의 사진이다.
도 10은 효모 2-혼성체 스크린으로부터 단리된 본래의 NIP45 cDNA 클론(위) 및 D10.G4 람다 zap II 라이브러리로부터 단리된 최장 NIP45 cDNA 클론(아래)의 구성을 비교하는 개략도이다.
도 11은 본래의 NIP45 cDNA 단리물의 누클레오티드 및 예측되는 아미노산 서열을 도시한다.
도 12는 NIP45 cDNA의 소수성 플롯을 도시한다.
도 13은 다양한 조직에서의 NIP45 전사체 수준의 RNA 블롯 분석의 사진이다.
도 14A는 HA-에피토프 태그된 NIP45 단백질을 코드화하는 발현 구성물로 트랜스펙팅되고, 1차 항체로서 HA-에피토프에 특이적인 단클론성 항체 및 인도카르보시아닌 표지된 염소 항-마우스 2차 시약으로 프로빙된 BHK 세포의 면역형광 분석의 사진이다.
도 14B는 DNA 염색 염료 훽스트(Hoechst) 33258로 역염색된 도 7A에 도시된 동일한 세포의 사진이다.
도 14C는 NF-AT4를 코드화하는 발현 구성물로 트랜스펙션되고, 1차 항체로서 항-NF-AT4 특이적 항체 및 인도카르보시아닌 표지된 염소 항-마우스 2차 시약으로 프로빙된 비자극된 BHK 세포의 면역형광 분석의 사진이다.
도 14D는 DNA 염색 염료 훽스트 33258로 역염색된 도 7C에 도시된 동일한 세포의 사진이다.
도 14E는 NF-AT4를 코드화하는 발현 구성물로 트랜스펙팅되고, 1차 항체로서 항-NF-AT4 특이적 항체 및 인도카르보시아닌 표지된 염소 항-마우스 2차 시약으로 프로빙된 이오노마이신 처리된 BHK 세포의 면역형광 분석의 사진이다.
도 14F는 DNA 염색 염료 훽스트 33258로 역염색된 도 7D에 도시된 동일한 세포의 사진이다.
도 15는 3X NF-AT-CAT 리포터 유전자 구성물(3개의 NF-AT 결합 부위를 함유함), 및 대조 발현 플라스미드 또는 NF-AT 패밀리 발현 플라스미드(NF-ATp, NF-ATc, NF-AT3 또는 NF-AT4)를 단독으로(-) 또는 NIP45 발현 플라스미드와 조합하여(+) 트랜스펙팅시킨 HepG2 세포에서의 CAT 검정 결과의 사진(왼쪽) 및 CAT 활성의 상대적인 폴드(fold) 유도를 정량하는 막대 그래프이다.
도 16은 IL-4 CAT 리포터 유전자 구성물(IL-4 프로모터의 -732bp 까지 연장되어 있음) 및 표시된 바와 같이 NF-ATp, NIP45 및/또는 c-Maf 발현 구성물의 조합물로 트랜스펙팅시킨 HepG2 세포에서의 CAT 검정 결과의 사진(왼쪽) 및 CAT 활성의 상대적인 폴드 유도를 정량하는 막대 그래프이다.
도 17은 NF-ATp, c-Maf 및 pCl 벡터 대조물에 대한 발현 플라스미드(윗 막대) 또는 NF-ATp, c-Maf 및 NIP45에 대한 발현 플라스미드(아래 막대)로 일시적으로 코트랜스펙팅시킨 M12B 림프종 세포의 상층액에서의 IL-4의 수준(pg/ml)을 도시하는 막대 그래프이다.
도 18은 정상적인 천연 비장 세포가 Th2 세포로 시험관내에서 분화하는 동안에 0일, 1일, 3일, 5일 또는 7일째에 발현된 전사체의 노던 블롯 분석이며, 이는 시간이 지남에 따른 c-maf의 상향조절된 발현 및 p18의 하향조절된 발현을 도시한다.
도 19는 IL-4 프로모터 리포터 유전자 구성물, 및 c-Maf 발현 벡터 단독(5㎍), p18 발현 벡터 단독(10㎍) 또는 증가량의 p18 발현 벡터 단독(2.5, 5 또는 10㎍)과 함께 일정량의 c-Maf 발현 벡터(5㎍)로 트랜스펙팅시킨 M12 세포에서의 상대적인 CAT 활성을 도시하는 얇은막 크로마토그래피 플레이트의 사진으로서, p18에 의한 IL-4 프로모터 활성의 억제를 도시한다.
도 20은 c-maf cDNA의 발현을 조절하기 위해 CD4 프로모터/인핸서를 사용하는, T 세포에서의 과발현용 c-maf 트랜스유전자의 개략도이다.
도 21은 야생형 마우스 또는 c-maf 트랜스페닉(tranfenic) 마우스로부터의 림프 마디(LN), 비장 또는 흉선에서의 전체 세포수(x 백만)를 도시하는 막대 그래프로서, c-maf 형질전환된 마우스가 림프성 기관에서 감소된 세포수를 나타냄을 입증한다.
도 22는 야생형 마우스 또는 c-maf 트랜스페닉 마우스에서의 혈청 IgE의 기초 수준(ng/ml)을 도시하는 막대 그래프이다.
발명의 요약
본 발명은 Th2 특이적 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 1개 이상의 전사 인자의 활성을 변조시킴으로써 Th2 관련된 시토카인의 생성을 조절하고, Th1 또는 Th2 서브셋을 조절하기 위한 방법 및 이러한 조절에 유용한 조성물에 관한 것이다. 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, Th2 세포에서의 IL-4의 조직 특이적 발현은 리프레서 단백질에 기인하는 것이 아니라 Th2 특이적 트랜스액티베이터 단백질에 기인하는 것임이 현재 발견되었다. 프로토(proto)-종양유전자 c-Maf가 Th2 관련된 시토카인 인터루킨-4의 조직 특이적 발현을 초래하는 것으로 현재 증명되었다. 더욱이, Th2 세포 이외의 세포(예를 들어, Th1 세포, B 세포 및 비림프성 세포)에서의 c-Maf의 전위적 발현은 IL-4 프로모터의 활성화를 초래하며, 적합한 조건하에서 내인성 IL-4의 생성을 초래한다. c-Maf 및 NF-AT가 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자 발현을 활성화시키는 것이 추가로 발견되었다.
또한, NIP45(NF-AT Interacting Protein 45)로 명명되는, 단백질중의 NF-AT 패밀리의 일원과 상호작용하는 45kDa가 현재 단리되고 특징화되었다. NIP45는 NF-AT의 Rel 상동성 도메인(RHD)와 상호작용하는 기능을 기초로 하여 단리되었다. NIP45는 NF-AT 및 c-Maf와 공동 작용하여 시토카인 유전자 발현을 자극하는 것으로 밝혀져 왔다. NIP45는 c-Maf 및 NF-AT에 의해 매개되는 유전자 발현을 가능하게 하여, 모든 3가지 인자(c-Maf, NF-AT 및 NIP45)가 세포내에서 활성인 경우, 고수준의 내인성 IL-4 생성을 자극시킨다. 트랜스액티베이션 도메인이 없는 작은 maf 단백질(예를 들어, p18)은 Th2 관련된 시토카인 유전자 발현, 예를 들어, c-Maf에 의해 매개된 발현을 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명은 NF-AT 패밀리 단백질과 함께 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 1가지 이상의 전사 인자의 발현 또는 활성을 변조시킴으로써 Th2 관련된 시토카인 발현을 변조시키는 방법에 관한 것이다. 1가지 구체예에 있어서, NF-AT 패밀리 단백질과 함께 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절함으로써, 발현 또는 활성이 변조되는 전사 인자는 Th2 특이적 전사 인자(예를 들어, Th2 특이적 maf 패밀리 단백질)이다. 또 다른 구체예에 있어서, NF-AT 패밀리 단백질과 함께 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절함으로써, 발현 또는 활성이 변조되는 전사 인자는 c-Maf와 같은 maf 패밀리 단백질이다. 또 다른 구체예에 있어서, NF-AT 패밀리 단백질과 함께 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절함으로써, 발현 또는 활성이 변조되는 전사 인자는 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하는 단백질(예를 들어, NIP45)이다. 또 다른 구체예에 있어서, p18과 같은 작은 maf 단백질의 발현 또는 활성이 변조된다. 본 발명의 방법은 1가지의 전사 인자(예를 들어, c-Maf 또는 NIP45 또는 p18) 또는 전사 인자의 조합체(예를 들어, c-Maf+NF-AT 또는 NF-AT+NIP45 또는 c-Maf+NF-AT+NIP45)를 변조시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 변조 방법은 일반적으로 세포를 전사 인자(들)의 발현 또는 활성을 변조시키는 작용제와 접촉시켜, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인의 생성을 변조시키는 것을 포함한다. 특히, 본 발명의 바람직한 작용제는 세포내에서 작용하여 전사 인자의 활성을 변조시킨다. 1가지 구체예에서, 본 발명의 변조 방법은 Th2 관련된 시토카인의 생성을 자극한다. 예를 들어, Th2 관련된 시토카인 생성은 Th1 세포, B 세포 또는 비림프성 세포에서 자극될 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 변조 방법은 Th2 관련된 시토카인의 생성을 억제한다. 본 발명의 방법으로 변조된 Th2 관련된 시토카인은 바람직하게는 인터루킨-4 이다.
다양한 작용제가 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 자극성 작용제는 세포내에 도입되어 발현되는 전사 인자를 코드화하는 핵산 분자일 수 있다. 대안적으로, 전자 인자의 발현 또는 활성을 증강시키는 화학적 작용제가 자극성 작용제로서 사용될 수 있다.
다양한 작용제가 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현 또는 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 억제성 작용제의 예로는 전사 인자를 코드화하는 유전자와상보적인 안티센스 핵산 분자, 전사 인자와 결합하는(예를 들어, 세포 핵 내에서) 세포내 항체, 억제 형태의 전사 인자(예를 들어, 우성 네거티브 형태) 및 전사 인자의 발현 또는 활성을 억제하는 화학적 작용제가 있다.
Th2 관련된 시토카인 유전자 발현을 조절하는 2가지 이상의 전사 인자의 발현 또는 활성을 변조시키는 것을 포함하는 조합적 방법은 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명의 그 밖의 구체예에 있어서, 세포는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 1가지 이상의 추가의 전사 인자의 활성을 변조시키는 1가지 이상의 추가의 작용제와 접촉된다. 바람직하게는, 발현 또는 활성이 변조되는 1가지 이상의 추가의 전사 인자는 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세포에 의한 시토카인 생성은 본 발명의 방법에 따라 시험관내 또는 생체내에서 변조될 수 있다. 1가지 구체예에 있어서, 세포는 생체내에서 변조성 작용제(들)과 접촉된후, 피검체내로 투여되어, 피검체내에서 Th1 및/또는 Th2 서브셋의 발달을 조절한다. 따라서, 또 다른 일면에서, 본 발명은 피검체내에서 Th1 또는 Th2 서브셋의 발달을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 생체외에서 변형된 세포가 피검체에게 투여되는 구체예 이외에, 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 1가지 이상의 전사 인자의 활성을 변조시키는 작용제를 피검체에게 직접 투여하여, 피검체내의 Th1 또는 Th2 세포의 발달을 변조시키는 것을 포함한다.
본 발명의 변조 방법은 다양한 임상 환경에서 Th1:Th2를 조작하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, Th2 형성의 억제는 알레르기성 질환, 악성종양 및 전염병에서 유용할 수 있는 반면에, Th2 형성의 증강은 자가면역 질병 및 장기 이식에서 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 NIP45 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 NIP45 단백질 및 NIP45를 코드화하는 단리된 핵산 서열의 단리된 조성물, 이들과 관련된 그 밖의 조성물 및 이들 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. NIP45 단백질의 아미노산 서열이 결정되었고(서열번호 6으로 도시됨), NIP45 단백질을 코드화하는 cDNA가 단리되었다(이것의 누클레오티드 서열은 서열번호 5로 도시됨). 1가지 일면에서, 본 발명은 NIP45를 코드화하는 단리된 핵산 분자 또는 이것의 단편을 제공한다. 1가지 구체예에 있어서, 본 발명은 NIP45 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 여기에서, 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열과 상동이고, NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인과 상호작용하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 엄격 조건하에서 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화되는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 그 밖의 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 코드화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. NIP45 융합 단백질을 코드화하는 단리된 핵산 분자 및 단리된 안티센스 핵산 분자는 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 NIP45 핵산 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터와 같은 벡터 및 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 1가지 구체예에 있어서, 이러한 숙주 세포는 적합한 배지에서 숙주 세포를 배양시킴으로써 NIP45 단백질을 생성시키기 위해 사용된다. 그런 다음, 소망에 따라, NIP45 단백질은 숙주 세포 또는 배지로부터 단리시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 단리된 NIP45 단백질 또는 이것의 부분에 관한 것이다. 1가지 구체예에 있어서, 본 발명은 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하는 단리된 NIP45 단백질 또는 이것의 부분을 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열을 포함하며, NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하는 단리된 단백질을 제공한다. NIP45 융합 단백질은 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 NIP45 단백질 또는 이것의 단편은 항-NIP45 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 NIP45 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 제공한다. 1가지 구체예에 있어서, 항체는 단클론성이다. 또 다른 구체예에 있어서, 항체는 검출성 물질로 표지된다.
본 발명의 NIP45 코드화 핵산 분자는 NIP45 단백질 또는 이것의 부분을 코드화하는 트랜스유전자를 갖는 세포를 함유하는 사람 이외의 트랜스제닉 동물을 작제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 또한 본 발명에 의해 제공된다. 1가지 구체예에 있어서, 트랜스제닉 동물에 함유된 NIP45 트랜스유전자는 내인성 NIP45 단백질을 코드화하는 내인성 유전자를 변화시킨다 (예를 들어, 동종 재조합 동물).
본 발명의 또 다른 일면은 생물학적 샘플 중에서 NIP45 단백질 또는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. NIP45 단백질 또는 mRNA를 검출하기 위해서, 생물학적 샘플은 NIP45 단백질을 검출할 수 있는 작용제(예를 들어, 표지된 항-NIP45 항체) 또는 NIP45 mRNA를 검출할 수 있는 작용제(예를 들어, NIP45 mRNA와 혼성화될 수 있는 표지된 핵산 프로브)와 접촉되어, NIP45 단백질 또는 mRNA의 존재가 생물학적 샘플에서 검출된다.
본 발명의 또 다른 일면은 NIP45의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 방법 및 NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 간의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 방법에 관한 것이다. NIP45 상호작용 단백질을 확인하기 위한 스크리닝 방법은 본 발명에 또한 포함된다.
본 발명의 또 다른 일면은 면역 세포와 같은 숙주 세포에서 maf 단백빌을 발현시키기 위한 조성물, 및 maf 단백질을 발현시키는 숙주 세포에 관한 것이다. 1가지 구체예에 있어서, 이들 조성물은 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현 벡터를 포함하며, 여기에서, maf 코드화 서열은 림프성 세포(예를 들어, T 세포 또는 B 세포) 또는 조혈성 간세포와 같은 특정 세포 타입내에서 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동적으로 결합되어 있다. 또 다른 구체예에 있어서,조성물은 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현 벡터가 도입된, 숙주 림프성 세포(예를 들어, 숙주 T 세포 또는 숙주 B 세포) 또는 숙주 조혈성 간세포와 같은 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 c-Maf 단백질을 발현시키는 트랜스제닉 동물을 추가로 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 트랜스제닉 동물은 마우스이고, 마우스는, 바람직하게는 c-maf cDNA에 작동적으로 결합된 CD4 프로모터/인핸서를 포함하는 트랜스유전자를 이용하여, T 세포내에서 c-Maf를 과발현시킨다.
발명의 상세한 설명
1가지 일면에 있어서, 본 발명은 전사 인자 활성을 변조시킴으로써 시토카인 유전자 발현 및 T 세포 서브셋을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 인터루킨-4 유전자의 Th2 특이적 발현이 특이적인 리프레서 단백질의 작용에 기인하는 것이 아니라 (실시예 1에 나타난 바와 같이), 특이적 트랜스액티베이터 단백질의 작용에 기인한다는 발견을 일부 이상으로 기초로 한다. 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, 인터루킨-4 유전자의 Th2 특이적 발현을 초래하는 전사 인자는 c-Maf 프로토-종양단백질로서 현재 확인되었고, 이것은 분화중인 및 성숙한 Th2 세포에서 선택적으로 발현되며, Th1 세포에는 존재하지 않는다 (실시예 2 참조). 정상적으로는 c-Maf를 발현시키지 않는 세포(예를 들어, Th1 세포 및 B 세포)에서의 c-Maf의 전위적 발현은 IL-4 프로모터의 트랜스액티베이션을 유도하며 (실시예 3 참조), 적합한 조건하에서는 내인성 IL-4의 생성을 유도한다 (실시예 4 참조). 더욱이, Th1 세포가 아닌 Th2 세포의 핵 추출물에 존재하는 단백질은 maf 반응 요소(MARE)의 영역에서 IL-4 프로모터를 풋프린팅하며 (실시예 5 참조), 재조합 c-Maf는 생체내에서 IL-4 프로모터와 결합한다 (실시예 6 참조). IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시키는 c-Maf의 능력은 IL-4 프로모터에서 MARE 및 Th2 특이적 풋프린트를 맵핑시킨다 (실시예 7 참조).
본 발명은 NF-AT와 상호작용하고, c-Maf 및 NF-AT에 의한 전사 활성화를 가능하게 하는 단백질의 발견을 부분 이상으로 기초로 한다. 이러한 단백질인 NIP45는 이것과 NF-AT의 Rel 상동성 도메인(RHD)과의 상호작용을 기초로 하여 확인되었다 (실시예 8 참조). 공동면역침전 실험은 NIP45 및 NF-AT가 생체내에서 포유동물 세포내에서 상호작용함을 입증하였다 (실시예 9 참조). NIP45를 코드화하는 cDNA가 서열화되고, 특징화되었다 (실시예 10 참조). NIP45 mRNA의 조직 발현 패턴의 조사는 NIP45 전사체가 비장, 흉선 및 고환에서 우선적으로 발현됨을 밝혀내었다 (실시예 11 참조). 세포억제성 편재화 실험은 NIP45 단백질이 세포 핵에 걸쳐 고르게 분포되어 있음을 입증하였다 (실시예 12 참조). 기능 실험은 NIP45가 NF-AT와 상승 작용하여 NF-AT 결합 부위를 함유하는 프로모터로부터의 전사를 자극시키고, 더욱이, NF-AT 및 c-Maf와 상승 작용하여 IL-4 프로모터로부터의 전사를 자극시킴을 밝혀내었다 (실시예 13 참조). 더욱이, NIP45, NF-AT 및 c-Maf가 일제히 작용하여 정상적으로는 IL-4를 발현시키지 않는 세포(예를 들어, B 세포)에서의 내인성 IL-4 유전자의 발현을 유도시킬 수 있다 (실시예 14 참조).
본 발명은 활성화 도메인이 없는 작은 maf 단백질인 p18이 c-Maf에 의해 매개되는 시토카인 유전자 발현을 억제할 수 있다는 발견을 추가로 부분 이상으로 기초로 한다. 시험관내에서의 T 헬퍼 세포 전구체의 분화는 c-maf 유전자 발현의 상향조절 및 p18 유전자 발현의 하향조절과 관련이 있다 (실시예 15 참조). 또한, c-Maf와 p18의 동시발현은 c-Maf의 단독 존재하에서의 IL-4 프로모터 활성과 비교해 볼때 IL-4 프로모터 활성을 억제시킨다 (실시예 16 참조).
본 발명은 T 세포에서 c-Maf 단백질을 과발현시키는 c-maf 형질전환된 동물의 생성을 추가로 기초로 한다 (실시예 17 참조). 이러한 동물은 IL-4를 과발현시키는(즉, 작은 흉선 및 비장, CD+/CD8+(이중-포지티브) 흉선세포 수의 현저한 감소, 감소된 CD4+포지티브 T 세포 및 혈청 IgE의 증가된 기초 수준) 형질전환된 동물과 매우 유사한 표현형을 나타낸다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 먼저 특정한 용어들을 정의한다.
본원에서 사용되는 용어 "Th2 관련된 시토카인"은 Th1 세포에 의해서 보다는 Th2 세포에 의해 우선적으로 또는 배제적으로 생성되는 시토카인을 의미하고자 한다. Th2 관련된 시토카인의 예로는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13이 있다. 본 발명의 방법에 따라 생성이 변조되는 바람직한 Th2 관련된 시토카인은 인터루킨-4 이다.
본원에서 사용되는 용어 "전사 인자"는 핵에서 작용하여 유전자의 전사적 발현을 조절하는 인자(예를 들어, 단백질)를 의미하고자 한다. "전사 인자"란 용어는 전사를 직접 조절하는 인자(예를 들어, 고유 전사 활성 또는 억제 활성을 가짐) 및 전사를 간접적으로 조절하는(예를 들어, 고유 전사 활성 또는 억제 활성을 갖는 그 밖의 인자와의 상호작용을 통해) 인자를 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 "활성화된 T 세포 패밀리 단백질의 핵 인자와 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는" 전사 인자는 NF-AT 단백질과 상승 작용 또는 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자를 의미하고자 한다. 즉, Th2 관련된 시토카인 유전자(예를 들어, IL-4)의 발현은 NF-AT 및 공동작용성 전사 인자가 둘 모두 존재하는 경우가 둘 중의 하나만 존재하는 경우 보다 더 크게 일어난다. 공동작용성 전사 인자는 NF-AT와 물리적으로 관련될 수 있거나 관련되지 않을 수 있다. NF-AT 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 예로는 maf 패밀리 단백질(예를 들어, c-Maf) 및 NF-AT 상호작용 단백질(예를 들어, NIP45)가 있다.
본원에서 사용되는 "Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는" 전사 인자는 NF-AT 패밀리 단백질과 공동 작용하는 지의 여부와 무관하게 Th2 관련된 시토카인 유전자의 전사 조절에 관여하는 전사 인자를 의미하고자 한다. NF-AT와 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자는 또한 Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 인자이다. 그러나, NF-AT와 공동 작용하지 않는 그 밖의 전사 인자는 또한 Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여할 수 있다. Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 것으로 생각되는 전사 인자의 예로는 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질, AP-1 패밀리 단백질 및 Stat6 이 있다 [참고문헌: Lederer, J. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:397-406].
본원에서 사용되는 용어인 "Th2 특이적 전사 인자"는 Th1 세포가 아닌 Th2 세포에서 우선적으로 또는 배제적으로 발현되는 전사 인자를 의미하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "접촉(contacting)"(즉, 세포를 작용제와 접촉시킴)은 작용제와 세포를 시험관내에서 함께 인큐베이팅시키고(예를 들어, 작용제를 배양물중의 세포에 첨가시킴), 작용제를 피검체에게 투여하여 작용제와 피검체의 세포가 생체내에서 접촉하는 것을 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 다양한 형태의 용어인 "변조"는 자극(예를 들어, 특정 반응 또는 활성을 증가 또는 상향조절시킴) 및 억제(예를 들어, 특정 반응 또는 활성을 감소 또는 하향조절시킴)를 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "maf 패밀리 단백질"은 v-Maf, c-Maf, mafB, Nrl, mafK, mafF, mafG 및 p18을 포함하는 AP-1/CREB/ATF 단백질의 서브-패밀리의 일원을 의미하고자 한다. [참조: Nishizawa, M. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7711-7715; Kataoka, K. et al. (1993) J. Virol. 67:2133-2141; Swaroop, A. et al. (1995) Porc. Natl. Acad. Sci. USA 89:266-270; Fujiwara, K.T. et al. (1993) Oncogene 8:2371-2380; Igarashi, K. et al. (1995) ChemJ. Biol. 270:7615-7624; Andrews, N.C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11488-11492; and Kataoka, K. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2180-2190].
본원에서 사용되는 용어인 "작은 maf 단백질"은 c-Maf의 아미노-말단 활성 도메인에 상응하는 도메인이 없는 maf 패밀리 단백질을 의미하고자 한다. 작은 maf 단백질의 예로는 mafK, mafF, mafG 및 p18이 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "NF-AT 패밀리 단백질" (또한, 간단히 "NF-AT"로서 명명됨)은 NF-ATp, NF-ATc, NF-AT4/x/c3 및 NF-AT3/c4를 포함하는, 활성화된 T 세포 전사 인자의 핵 인자의 패밀리의 일원을 의미하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인"(RHD 도메인으로서 약기됨)은 전사 인자의 Rel/NFκB 패밀리의 RHD 내에서 약 70%의 서열 유사성을 갖는 NF-AT 패밀리 내의 도메인을 의미하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "NF-AT 상호작용 단백질"("NF-AT 패밀리 단백질 상호작용 단백질"과 혼용됨)은 NF-AT 패밀리 단백질과 물리적인 결합을 형성하는(예를 들어, NF-AT 패밀리 단백질과 공동면역침전됨) 인자를 의미하고자 한다. 바람직하게는, NF-AT 상호작용 단백질은 NF-AT 패밀리 단백질의 RHD와 상호작용한다. NF-AT 상호작용 단백질의 예로는 NIP45가 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "NIP45"는 서열번호 6에 도시된 아미노산 서열을 갖는(또는 서열번호 5에 도시된 누클레오티드 서열에 의해 코드화되는) 단백질 뿐만 아니라 NF-AT의 RHD와 상호작용하는 능력을 보유하는 이것의 포유동물 동족체(예를 들어, 사람 NIP45) 및 이것의 변형된 형태(예를 들어, 돌연변이되거나 절단된 형태)를 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "AP-1 패밀리 단백질"은 전사 인자의 AP-1 패밀리의 일원인 단백질을 의미하고자 하며, 이것의 예로는 c-Jun, c-Fos, Fra-1, Fra-2, Jun B 및 Jun D 가 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA)를 포함하고자 한다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중가닥 DNA 이다.
본원에서 사용되는 용어인 "단리된 핵산 분자"는 핵산이 유도되는 생물체의 게놈 DNA내의 핵산을 자연적으로 플랭킹하는 유전자 서열(즉, 핵산이 유도되는 생물체의 게놈 DNA 내의 단리된 핵산 분자에 인접한 위치에 있는 유전자 서열)이 없는 핵산을 의미한다. 예를 들어, 다양한 구체예에 있어서, 단리된 NIP45 핵산 분자는 핵산 분자가 유도되는 세포의 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹하는 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만의 누클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 그 밖의 세포성 물질이 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "엄격 조건하에서 혼성화되는"은 서로 60% 이상이 상동인 핵산 서열이 전형적으로 서로 혼성화된 상태로 남게되는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명하고자 한다. 바람직하게는, 조건은 서로 65% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 75% 이상이 상동인 서열이 전형적으로 서로 혼성화된 상태로 남아 있을 정도이다. 이러한 엄격 조건은 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 발견될 수 있다. 엄격 혼성화 조건의 바람직한, 이에 제한되지 않는 예로는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 혼성화시킨후, 50 내지 65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것이다.
본원에서 사용되는 "자연발생적인" 핵산 분자는 자연계에서 발생하는 누클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자(예를 들어, 천연 단백질을 코드화함)를 의미한다.
본원에서 사용되는 "안티센스" 핵산은 단백질을 코드화하는 "센스" 핵산 에 상보적인, 예를 들어, 이중가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나, mRNA 서열에 상보적이거나, 유전자의 코딩 가닥에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 누클레오티드 서열의 영역을 의미하는 반면에, "비코딩 영역'은 아미노산으로 번역되지 않는 누클레오티드 서열의 영역(예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어인 "벡터"는 이것에 결합된 또 다른 핵산 분자를 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 1가지 타입은 "플라스미드"이며, 이것은 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또 다른 타입은 바이러스 벡터이며, 여기에서, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈내로 결찰될 수 있다. 특정한 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자체 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 그 밖의 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 이들이 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 간단히 "발현 벡터"로 명명된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서는, "플라스미드" 및 "벡터"가 혼용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 보편적인 사용 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련된 바이러스)와 같이 동등한 기능을 수행하는 그 밖의 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.
본원에서 사용되는 용어인 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터와 같은 본 발명의 핵산이 도입된 세포를 의미하고자 한다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"란 용어는 본원에서 혼용된다. 이러한 용어가 특수한 주제 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 잠재적인 후손을 의미하는 것으로 이해되어져야 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인하여 특정 변형이 후속되는 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손은 실제로 모세포와 동일할 수 없지만, 본원에서 사용되는 용어의 범위내에는 여전히 포함된다.
본원에서 사용되는 "세포내의 핵산 분자의 발현에 적합한 형태"인 핵산 분자는 핵산 분자가 발현을 위해 사용하려는 숙주 세포 및 원하는 발현 수준을 기초로 하여 선택된 1개 이상의 조절 서열을 포함하며, 이러한 조절 서열은 발현시키려는 핵산 분자에 작동적으로 결합되어, 핵산 분자에 의해 코드화되는 단백질이 숙주 세포에서 발현되게 한다. 이러한 핵산 분자의 예로는 숙주 세포에서 발현시키려는 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터가 있다.
본원에서 사용되는 "형질전환된 동물"은 사람 이외의 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스를 의미하며, 동물의 1개 이상의 세포는 "트랜스유전자"를 포함한다. "트랜스유전자"란 용어는 형질전환된 동물이 발생되는 세포의 게놈에 통합되어 있고, 성숙한 동물의 게놈에 남아있는 외인성 DNA로서, 예를 들어, 형질전환된 동물의 1가지 이상의 세포 타입 또는 조직에서 코드화된 유저자 생성물의 발현을 유도한다.
본원에서 사용되는 용어인 "동종 재조합 동물"은 형질전환된 사람 이외의 동물의 타입, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스를 의미하며, 동물 중의 내인성 유전자는, 동물의 발생 전에, 내인성 유전자와 동물의 세포(예를 들어, 동물의 배 세포)에 도입된 외인성 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의해 변화되었다.
본원에서 사용되는 "단리된 단백질"이란 용어는 세포로부터 단리되거나 재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 경우의 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는 단백질 또는 화학적으로 합성되는 경우의 화학적 전구물질 또는 그 밖의 화학물질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 즉 Fab 및 F(ab')2단편과 같은 항원을 특이적으로 결합시키는(면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "단클론성 항체" 및 "단클론성 항체 조성물"은 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 하나의 종만을 함유하는 항체 분자의 군에 관한 것이다. 이와 같이 단클론성 항체 조성물은 보편적으로 이것이 면역반응하는 특정 항원에 대한 단일 결합 친화성을 나타낸다.
본원에 사용된, "전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 세포내 활동하는 작용제"는 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 세포의 세포내 영역, 예를 들어 세포질 또는 세포핵에서 작용하는 작용제에 관한 것이다. 이와 같이, 항체와 같이, 세포 표면에 결합하는 작용제는 용어 "전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 세포내 활동하는 작용제"에 포함되는 것으로 의도되지 않는다. 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 세포내 활동하는 작용제의 예로는 전사 인자를 코드화하는 핵산 분자, 안티센스 핵산 분자, 세포내 항체, 우성 네거티브 억제 물질 및 세포에 유입하고 전사 인자 발현 또는 활성을 조정(즉, 자극 또한 억제함)하는 화학 작용제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 결합 분자"는 단백질을 코드화하는 핵산(예를 들어, mRNA 분자)에 결합하거나 단백질 자체에 결합함으로써 관심의 표적 단백질(예를 들어, 전사 인자)의 발현 또는 활성을 억제시키기 위해 세포내 활동하는 작용제를 포함하는 것으로 의도된다. 세포내 결합 분자의 예는 안티센스 핵산, 세포내 항체 및 우성 네거티브 억제 물질을 포함한다.
본 발명의 다양한 일면은 하기의 소단락에서 더욱 상세하게 설명된다.
I. Th2 관련된 시토카인 생성의 조정
지금까지 인터루킨-4 유전자의 Th2 특이적 발현에 반응하는 전사 인자는 c-Maf 원종양 유전자로서 확인되어 왔다. 그러므로, c-Maf의 발현 및/또는 활성의 조정은 인터루킨-4의 생성을 조절하는 수단을 제공한다. IL-4 자체는 Th2 세포 발달에서 자동조절 작용기로서 작용하여(참고문헌: Paul, W.E. 및 Seder, R.A. (1994) Cell 76:241-251; Seder, R.A. 및 Paul, W.E. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:635-673), IL-4의 생성이 추가 Th2 분화를 통해 IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13과 같은 부가의 Th2 관련된 시토카인의 생성을 초래할 수 있기 때문에, c-Maf 발현 및/또는 활성의 조정은 Th2 관련된 시토카인의 생성을 조정하기 위한 일반적인 접근법을 제공한다.
단백질의 maf 패밀리는 v-Maf, c-Maf, mafB, Nrl, mafK, mafF, mafG 및 p18을 포함하는 AP-1/CREB/ATF 단백질의 서브-패밀리이다. ν-maf 종양 유전자는 본래 닭의 자발성 근건막 섬유육종(musculoaponeurotic fibrosarcoma)으로부터 단리되고 조류의 레트로바이러스의 형질전환 유전자, AS42로서 확인되었다 [참고문헌: Nishizawa, M.K. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7711-7715]. V-maf는 c-fos 및 c-jun 종양 유전자에 대한 상동을 이용하여 42kd 염기 영역/류신 지퍼(b-zip) 단백질을 코드화한다. 이것의 세포내 상동체, 즉 c-maf 원종양 유전자는 v-maf로부터의 코딩 영역에서 단지 2개의 구조적 변화부를 갖는다 [참고문헌: Kataoka, K. et al. (1993) J. Virol. 67:2133-2141]. maf 패밀리는 c-Maf, mafB, 사람 망막 특이적 단백질 Nrl(Swaroop, A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89:266-270), mafK, mafF, mafG 및 p18을 포함한다. 마지막 4개, 즉 mafK, mafF, mafG 및 p18은 각각 트랜스액티베이트 영역("작은 maf 영역")을 함유하는 c-maf의 2/3의 아미노 말단이 부족한 단백질 코드화한다 [참고문헌: Fujiwara, K. T. et al. (1993) Oncogene 8:2371-2380; Igarashi, K. et al. (1995) J. Biol Chem. 270:7615-7624; Andrews, N.C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11488-11492; Kataoka, K. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2180-2190]. C-maf 및 다른 maf 패밀리 성분은 서로 및 Fos 및 Jun 패밀리 동종이량체 및 이종이량체를 형성하고, 서로 쌍을 이루는 AP-1 단백질의 공지된 능력과 일관된다 [참고문헌: Kerppola, T. K. 및 Curran, T. (1994) Oncogene 9:675-684; Kataoka, K. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:700-712]. c-Maf 동종이량체가 결합하는, c-Maf 감응 요소(MARE)로 칭해지는 DNA 표적 서열은 코어 TRE(T-MARE) 또는 CRE9C-MARE) 팔린드롬을 각각 함유하는 13 또는 14bp 요소이다. c-Maf가 푸르키니에 신경 특이적 프로모터 L7로부터의 전사를 자극하는 것으로 제시되어 왔고(Kurscher, C. 및 Morgan, J.I. (1994) Mol. Cell. Biol. 15:246-254) Nrl이 QRI 망막 특이적 유전자의 발현을 유도하는 것으로 제시되어 왔을지라도(Swaroop, A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89:266-270), 본 발명에 앞서, maf 패밀리 성분의 작용에 대해 공지된 것은 거의 없다. 그러나, 본 발명 이전에, 임파성 세포에서 발현된 유전자의 조절 또는 어떤 조직에서의 시토카인 유전자 발현에서 c-Maf 또는 다른 maf 패밀리 성분이 관련된 보고는 전혀 없었다.
작은 maf는 동종이량체이지만 본질적으로는 에리트로이드 특이적 인자 p45NF-E2를 갖는 이종 이량체 파트너로서 결합되어 글로빈 유전자 전사를 활성화시키는 경우 α 및 β 글로빈 전사의 억제제로서 작용하는 것으로 제시되어 왔다 [참고문헌: Kataoka, K. et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 15:2180-2190; Igarashi, K. et al. (1994) Nature 367:568-572]. MafK 패밀리 발현은 적백혈병 세포 분화를 유도하는 것으로 제시되어 왔다 [참고문헌: Igarashi, K. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7445-7449]. 본 발명은 작은 maf 단백질(예를 들어, p18)이 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조정할 수 있는 증거를 제공한다. 따라서, 작은 maf 단백질의 발현 및/또는 활성의 조정은 또한 Th2 관련된 시토카인 유전자의 생성을 조절하는 수단을 제공한다.
본 발명은 추가로 NF-AT에 결합하고 NF-AT과 함께 상승 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조정하는 NF-AT-상호작용 단백질, NIP45를 제공한다. NIP45는 하기에 추가로 상세히 설명된다. 이와 같이 NF-AT-상호작용 단백질, 예컨대 NIP45의 발현 및/또는 활성의 조정은 또한 Th2 관련된 시토카인 유전자의 생성을 조절하는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명은 Th2 관련된 시토카인 유전자 발현에 관련된 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정함으로써 세포에 의해 Th2 관련된 시토카인 생성을 조정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 세포는 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인의 생성이 조정되도록 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하는 항원과 접촉된다. 한 구체예에서, 조정하려는 전사 인자는 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자(예를 들어, c-Maf 또는 NIP45)의 발현을 조절하는 전사 인자로서 특징지어진다. 또 다른 구체예에서, 조정하려는 전사 인자는 maf 패밀리 단백질(예를 들어, c-Maf 또는 작은 maf 단백질, 예컨대 p18)이다. 또 다른 구체예에서, 전사 인자는 NF-AT-상호작용 단백질(예를 들어, NIP45)이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조정 작용제는 세포내 활동하여 전사 인자의 활성을 조정함으로써 특징지어진다. 한 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포를 전사 인자 발현 및/또는 활성을 자극하는 자극제와 접촉시킴으로써 자극된다. 본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포를 전사 인자 발현 및/또는 활성을 억제시키는 억제제와 접촉시킴으로써 억제된다.
실시예에서 증명되는 바와 같이, c-Maf가 IL-4 유전자 발현의 조직 특이성에 대해 반응할지라도, c-Maf는 하나 이상의 부가 전사 인자와 상승작용적으로 활동하여 IL-4 유전자 전사를 활성화시킨다. 특히, c-Maf는 NF-AT 단백질과 상승작용적으로 활동하여 IL-4 유전자 발현을 자극한다. 더욱이, NF-AT 단백질 및 전사 인자의 AP-1/CREB/ATF 패밀리의 다른 성분은 Th1 및 Th2 관련된 시토카인 유전자 모두의 발현을 조절하는데 관여하는 것으로 증명되었다. 실시예에서 추가로 증명되는 바와 같이, NF-AT, NIP45와 상호작용하는 단백질은 NF-AT와 상승작용적으로 활동하여 NF-AT 부위를 함유하는 프로모터로부터의 발현을 자극한다. 더욱이, Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현은 c-Maf, NF-AT 및 NIP45의 3개 인자 모두의 존재에 의해 가능하다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성을 조정하는 본 발명의 방법은 세포를 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하는 다수의 작용제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이, 세포가 제 1 작용제와 접촉하는 본 발명의 방법에서, 이 방법은 세포를 Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 하나 이상의 부가 전사 인자를 조정하는 하나 이상의 부가 작용제와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 부가 작용제(들)은 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT-상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가 전사 인자(들)의 발현 또는 활성을 조정한다.
실시예에서 추가로 증명되는 바와 같이, 작은 maf 단백질(예를 들어, p18)은 포지티브 트랜스액티베이터(예를 들어, c-Maf)에 의해 중재되는 Th2 관련된 시토카인 유전자를 억제시킬 수 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성을 조정하는 본 발명의 방법은 세포를 작은 maf 단백질의 발현 또는 활성을 조정(즉, 자극 또는 억제함)하는 작용제 단독 또는 다른 maf 패밀리 단백질, NF-AT 패밀리 단백질 또는 NF-AT-상호작용 단백질과 같은 다른 전사 인자의 활성을 조정하는 작용제와 함께 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 작은 maf 단백질은 p18 이다. 작은 maf 단백질의 다른 예는 mafK, mafF 및 mafG를 포함한다.
A. 자극제
본 발명의 방법에 따라, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성을 자극하기 위해, 세포는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자(예를 들어, c-Maf, NIP45, p18)의 발현 및/또는 활성을 자극하는 자극제와 접촉된다. Th2 관련된 시토카인 생성은 상기 시토카인, 예컨대, Th1 세포, B 세포 또는 비임프성 세포를 정상적으로 발현시키지 않는 세포 유형에서 자극될 수 있다. 또한, Th2 관련된 시토카인 생성은 Th1 경로 대신에 Th2 경로를 따라 이들의 분화를 촉진시키는 헬퍼 전구체 세포(Thp)에서 자극될 수 있다.
바람직한 자극제는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자를 코드화하는 핵산 분자이고, 핵산 분자는 세포에서의 전사 인자의 발현에 적합한 형태로 세포내로 도입된다. 예를 들어, c-Maf cDNA는 재조합 발현 벡터로 클로닝되고 벡터는 세포내로 트랜스펙션된다. 실시예 3에서 증명되는 바와 같이, Th1 세포, B 세포 또는 비임프성 세포에서의 c-maf 재조합 발현 벡터의 이소성 발현은 IL-4 프로모터의 활성화를 초래한다. 부가적으로, 적당한 조건(하기에 더욱 상세하게 설명됨)하에서, 내인성 IL-4 유전자의 전사는 자극되며, 시토카인을 정상적으로 발현시키지 않는 세포에 의한 IL-4 생성을 초래한다 (실시예 4 참조).
세포에서 maf 패밀리 단백질을 발현시키기 위해, 보편적으로 maf 패밀리 cDNA가 먼저 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터내로 도입된다. maf 패밀리 cDNA는 예를 들어 폴리머라아제 쇄반응(PCR)을 사용한 증폭에 의하거나 적당한 cDNA 라이브러리를 스크리닝시킴으로써 수득될 수 있다. maf 패밀리 cDNA의 누클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 표준 PCR 방법에 의한 증폭을 고려하는 PCR 프라이머의 디자인 또는 표준 혼성화 방법을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝시키는데 사용될 수 있는 혼성화 프로브의 디자인에 사용될 수 있다. 바람직하게는, maf 패밀리 cDNA는 c-maf 원종양 유전자의 cDNA이다. 포유류(마우스) c-maf cDNA의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있으며 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 기탁 번호 S74567로 기탁되어 있다 [참고문헌: Kurscher C. 및 Morgan, J.I. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:246-254]. 이러한 포유류 c-maf는 조류의 ν-maf 서열에 매우 상동이고(Nishizawa, M.K. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7711-7715 에 기재되어 있고 진뱅크 기탁 번호는 D28598 및 D28596 이다), 이것은 c-maf가 종 중에서 잘 보존된 것을 나타낸다. 사람을 포함하여, 다른 포유류 종으로부터의 c-maf cDNA는 표준 분자 생물학 기술(예를 들어, PCR 또는 cDNA 라이브러리 스크리닝)을 사용하여 단리될 수 있고 프라이머 또는 프로브는 마우스 또는 조류 서열을 기초로 하여 디자인될 수 있다. 마우스 c-maf cDNA에 상동인 사람 부분 cDNA 서열은 또한 진뱅크 데이터베이스에 기탁번호 H24189 및 N75504로 기탁되어 있다. 다른 maf 패밀리 성분의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 그 예로는 다음과 같다: MafB(Kataoka, K. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:7581-91; 진뱅크 기탁 번호 D28600), MafG(Kataoka, K. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:7581-91; 진뱅크 기탁 번호 D28601 및 D28602), MafF(진뱅크 기탁 번호 D16184) 및 MafK(Igarashi, K. et al. (1995) J. Biol Chem. 270:7615-7624; 진뱅크 기탁 번호 D16187 및 D42124).
maf 패밀리 cDNA의 단리 또는 증폭 이후에, DNA 단편은 발현 벡터내로 도입된다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 분자 결합되는 또 다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자에 관한 것이다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이것은 부가의 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프에 관한 것이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스성 벡터이고, 여기에서 부가의 DNA 단편은 바이러스성 게놈내로 결찰될 수 있다. 일부 벡터(예를들어, 복제의 박테리아성 기원을 갖는 박테리아성 벡터 및 에피솜성 포유류 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자발적 복제될 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜성 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 일부 벡터는 이들이 조작가능하게 결합되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 이용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 대부분 통상적으로 벡터의 형태로 사용되기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 상기 발현 벡터의 다른 형태, 예컨대 바이러스성 벡터(예를 들어, 복제 결여성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련된 바이러스)를 포함하는 것으로 의도되며 이들은 동등한 작용을 한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태의 핵산을 포함하며, 이것은 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포 및 원하는 발현 수준을 기초로 하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미하고, 발현되는 핵산 서열에 조작적으로 결합된다. 재조합 발현 벡터내에서, "조작적으로 결합되는"은 누클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 경우 숙주 세포에서의 발현)을 고려하는 방식으로 관심의 누클레오티드 서열이 조절 서열(들)에 결합되는 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 증강제 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 시그날)을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 조절 서열은 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. 조절 서열은 숙주 세포의 여러 유형에서 누클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열, 단지 일부 숙주 세포에서 누클레오티드 서열의 발현을 유도하는 서열 또는 단지 일부 조건(예를 들어, 유도성 조절 서열)하에서 누클레오티드 서열의 발현을 유도하는 서열을 포함한다.
발현 벡터의 디자인이 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있는 것은 당업자들에게 인지될 것이다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 작용은 바이러스성 조절 요소에 의해 종종 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 세포 확대 바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유도된다. 포유류 발현 벡터의 비제한적 예는 pCDM8(Seed, B., (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195)를 포함한다. 상이한 조절 서열을 갖는 다양한 포유류 발현 벡터가 시판되고 있다. 포유류 숙주 세포에서 핵산의 구성적 발현을 위해서, 바람직한 조절 요소는 세포 확대 바이러스 프로모터/증강제이다. 더욱이, 포유류 세포에서 사용하기 위한 유도성 조절 시스템은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 유전자 발현이 중금속 이온(참고문헌: Mayo et al. (1982) Cell 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), 열 충격(참고문헌: Nouer et al. (1991) in Heat Shock Response, e.d. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, pp167-220), 호르몬(참고문헌: Lee et al. (1981) Nature 294:228-232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042: Klock et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel & Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604; 및 PCT Publication No. WO 93/23431), FK 506 관련된 분자(참고문헌: PCT Publication No. WO 94/18317) 또는 테트라사이클린(참고문헌: Gossen, M. 및 Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; PCT Publication No. WO 94/29442; 및 PCT Publication No. WO 96/01313)에 의해 조절되는 시스템이 있다. 또 다른 많은 조직 특이성 조절 서열이 당해 분야에 공지되어 있으며, 알부민 프로모터(간 특이적; 참고문헌: Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), 임파성 특이적 프로모터(참고문헌: Calame 및 Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(참고문헌: Winoto 및 Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 및 면역글로불린(참고문헌: Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen 및 Baltimore (1983) Cell 33:741-748), 신경 특이적 프로모터(예를 들어, 신경 필라멘트 프로모터; 참고문헌: Byrne 및 Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), 췌장 특이적 프로모터(참고문헌: Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) 및 유선 특이적 프로모터(예를 들어, 우유 유장 프로모터, 참고문헌: 미국 특허 제 4,873,316 호 및 유럽 특허 공개 제 264,166 호)를 포함한다. 발달적으로 조절되는 프로모터는 또한 예를 들어 쥐 혹스 프로모터(참고문헌: Kessel 및 Gruss (1990) Science 249:374-379) 및 α-페토단백질 프로모터(참고문헌: Campes 및 Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)을 포함한다.
벡터 DNA는 보편적인 트랜스펙션 기술을 통해 포유류 세포내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "트랜스펙션"의 여러 가지 형태는 외부 핵산(예를 들어, DNA)를 포유류 숙주 세포로 도입시키기 위한 당해 분야에 인지된 여러 가지 기술(인산칼슘 동시 침전, DEAE-덱스트란이 중재된 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기 영동 포함)에 관한 것이다. 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 적합한 기술은 하기 문헌 및 다른 실험 책자에서 발견될 수 있다 [참고문헌: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)].
포유류 세포의 안정한 트랜스펙션을 위해서, 사용되는 트랜스펙션 기술 및 발현 벡터에 따라, 세포의 작은 분획만이 이들의 게놈내로 외부 DNA를 통합시킬 수 있는 것이 공지되어 있다. 이들 성분들을 확인하고 선택하기 위해, 선택성 마커(예를 들어, 항생물질에 내성인 것)를 코드화하는 유전자는 일반적으로 관심의 유전자와 함께 숙주 세포내로 도입된다. 바람직한 선택성 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같이, 약물에 대해 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택성 마커를 코드화하는 핵산은 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 별개의 벡터, 또는 더욱 바람직하게는 동일한 벡터상에서 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 트랜스펙션된 세포는 약물 선택(예를 들어, 다른 세포는 죽을지라도, 선택성 마커를 혼입하는 세포는 생존할 것이다)에 의해 확인될 수 있다.
숙주 세포에서 전사 인자의 발현에 적합한 형태인, Th2 관련된 시토카인 유전자 발현을 조절하는 다른 전사 인자를 코드화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지되거나 본원에 기재된 누클레오티드 서열을 사용하여 상기에 설명한 바와 같이 제조될 수 있다. 누클레오티드 서열은 표준 PCR 방법에 의한 cDNA의 증폭을 고려하는 PCR 프라이머의 디자인 또는 표준 혼성화 방법을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝시키는데 사용될 수 있는 혼성화 프로브의 디자인을 위해 사용될 수 있다. NIP45의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 각각 서열 번호 5 및 6에 기재되어 있다. p18, mafK, mafF 및 mafG를 포함하여, 작은 maf 단백질의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고문헌: Fujiwara, K. T. et al. (1993) Oncogene 8:2371-2380: Igarashi, K. et al. (1995) J. Biol Chem. 270:7615-7624; Andrews, N.C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11488-11492; Kataoka, K. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2180-2190]. NF-ATp, NF-ATc, NF-AT4/x/c3 및 NF-AT3/c4를 포함하여, NF-AT 패밀리 단백질의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열을 당해 분야에 공지되어 있다. 4개의 NF-AT 패밀리 성분은 확인되었다 [참고문헌: Emmel, E.A. et al. (1989) Science 246:1617-1620; Flanagan, W.M. et al. (1991) Nature 352:803-807; Jain. J. et al. (1993) Nature 365:352-355; McCaffrey, P.G. et al (1993) Science 262:750-754; Rao, A. (1994) Immunol. Today 15:274-281; Northrop, J.P. et al. (1994) Nature 369:497). 바람직하게는, NF-AT cDNA는 NF-ATp의 cDNA이다. 포유류 NF-ATp cDNA의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: McCaffrey, P.G. et al (1993) Science 262:750-754]. 포유류 NF-ATp cDNA의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있고 진뱅크 데이터베이스에 기탁 번호 U08015로 기탁되어 있다 [참고문헌: Northrop, J.P. et al. (1994) Nature 369:497]. 포유류 NF-AT3 및 NF-AT4 cDNA의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Hoey, T. et al. (1995) Immunity 2:461-472]. AP-1 패미릴 단백질의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 사람 c-fos의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Bohmann, D. et al. (1987) Science 238:1386-1392]. 사람 jun-B 및 jun-D의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Nomura, N. et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3047-3048]. 사람 fra-1 및 fra-2의 누클레오티드 및 예상된 아미노산 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Matsui, M. et al. (1990) Oncogene 5:249-255].
세포에서 Th2 관련된 시토카인의 발현을 자극하는 자극제의 또 다른 형태는 세포(예를 들어, maf 패밀리 단백질, 예컨대 c-Maf 또는 p18, 또는 NIP45와 같은 NF-AT과 상호작용하는 단백질)에서 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 내인성 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 화학적 화합물이다. 상기 화합물은 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 화합물에 대해 선택하는 스크리닝 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 적합한 스크리닝 검정의 예는 하기의 소단락 V에서 추가로 상세하게 기재되어 있다.
Th2 관련된 시토카인 유전자 발현을 조절하는 제 1 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제의 사용 이외에도, 본 발명의 자극 방법은 Th-1 또는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는데 기여하는 하나 이상의 부가적 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 하나 이상의 부가적 작용제의 사용을 포함할 수 있다. 실시예 4에서는, M12B 림프종 세포에서 내인성 IL-4의 발현의 자극이 c-Maf 발현 벡터 및 NF-AT 발현 벡터 모두의 세포내로의 도입을 필요로 함으로써, c-Maf 및 NF-AT가 상승작용적으로 활동하여 IL-4 전사를 활성화시키고, c-maf가 발현의 조직 특이성에 원인이 되는 것을 증명하는 것이 제시되어 있다. 실시예 14에서는, M12B 림프종 세포에서 내인성 IL-4의 발현의 자극이 c-Maf, NF-AT 및 NIP45의 동시 발현에 의해 가능해지는 것이 추가로 제시되어 있다. 당업자는 일부 세포가 충분한 양의 내인성 c-Maf, NF-AT 및/또는 NIP45를 발현시켜 단일 작용제 단독의 사용이 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 자극하는데 충분할 수 있는 것을 인지하는 반면, 일부 상황에서는, Th2 관련된 시토카인 생성의 원하는 자극을 달성하기 위해, 일부 세포 유형을 사용하여 c-Maf 및 NF-AT 2가지 모두, c-Maf 및 NIP45 2가지 모두와 같은 다수의 전사 인자, 또는 3가지 모두의 단백질(c-Maf, NF-AT 및 NIP45)을 자극하는 것이 필요할 수 있다.
따라서, 세포가 제 1 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제와 접촉하는 본 발명의 자극 방법에서, 이 방법은 세포를, Th1 또는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는데 기여하는 하나 이상의 부가 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 하나 이상의 부가 작용제와 접촉시키는 것으로 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발현 또는 활성이 조정되는 하나 이상의 부가적 전사 인자는 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 자극 방법은 c-Maf의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제 및 NF-AT 패밀리 단백질 또는 NF-AT 패밀리 단백질(예를 들어, NIP45)와 상호작용하는 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 2 작용제의 사용을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 자극 방법은 c-Maf의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제, NF-AT 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 2 작용제 및 NF-AT 패밀리 단백질(예를 들어, NIP45)와 상호작용하는 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 3 작용제의 사용을 포함한다. 세포에서 NF-AT 또는 NIP45 활성을 자극하기 위한 바람직하는 작용제는 NF-AT 또는 NIP45를 코드화하는 재조합 발현이고, 재조합 발현 벡터는 세포내로 도입되고 NF-AT 또는 NIP45는 세포에서 발현된다. NF-AT 및 NIP45 코드화 발현 벡터는 c-Maf 발현 벡터에 대해 상기에 설명된 바와 같이 제조되고 세포내로 도입될 수 있다.
세포에서 NF-AT 또는 NIP45의 활성을 자극하기 위해 NF-AT 또는 NIP45 cDNA의 사용하는 것 대신에, 세포에서 NF-AT 또는 NIP45 활성을 자극하는 하나 이상의 화학적 화합물이 본 발명의 자극 방법에서 제 2 (또는 부가적) 작용제로서 사용될 수 있다. 세포에서 NF-AT 활성을 자극하는 화합물은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고문헌: Rao, A. (1994) Immunol. Today 15:274-281]. 예를 들어, 포르볼 에스테르 포르볼 마이리스테이트 아세테이트(PMA) 및 칼슘 요노포어(예를 들어, 요노마이신)를 사용한 일부 세포의 자극은 세포핵에 NF-AT의 전좌를 일으킨다 [참고문헌: Flanagan, W.M. et al. (1991) Nature 352:803-807; Jain. J. et al. (1993) Nature 365:352-355]. 부가적으로, 예를 들어 안티-CD3 항체를 사용하는, T 세포 수용체(TcR)를 통한 T 세포의 자극은 T 세포에서 NF-AT를 활성화시킨다.
NF-AT 단백질 이외에도, c-Jun, c-Fos, Fra-1, Fra-2, Jun B 및 Jun D를 포함하여, AP-1 패밀리 성분이 Th1 및 Th2 관련된 시토카인 유전자 모두의 발현을 조절하는데 관여하는 것으로 제시되어 있다 [참고문헌: Rao, A. (1994) Immunol. Today 15:274-281; Jain. J. et al. (1993) Nature 365:352-355; Boise, L.H. et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:1911-1919; Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553; Rooney, J. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:6299-6310]. 상기 인자들은 시토카인 유전자 발현의 Th1/Th2 특이성에 대해 반응하지 않고, 이들 인자들은 IL-4 유전자 발현의 조절시에 c-Maf와 상승작용하는 것으로 나타나지 않을지라도(실시예 참조), AP-1 패밀리 성분은 Th2 세포에서 IL-4 발현을 증가시키는 것으로 제시되어 있다 [참고문헌: Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553]. 따라서, 일부 상황에서 c-Maf 활성( 및 가능하게는 NF-AT 활성)을 자극하는 것 이외에도, 또한 AP-1 패밀리 단백질의 활성을 자극하는 것도 유용할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 자극 방법은 c-Maf의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제 및 AP-1 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 2 작용제의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, c-Maf의 발현 또는 활성을 자극하는 제 1 작용제, NF-AT 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 2 작용제 및 AP-1 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 제 3 작용제의 사용을 포함한다. 또한 NIP45 활성이 maf, AP-1 및/또는 Nf-AT 패밀리 단백질과 함께 조정될 수 있다.
세포에서 AP-1 활성을 자극하기 위한 바람직한 작용제는 AP-1 단백질을 코드화하는 재조합 발현이고, 재조합 발현 벡터는 세포내로 도입되고 AP-1 단백질은 세포에서 발현된다. AP-1 코드화 발현 벡터는 c-Maf 발현 벡터에 대해 상기에 설명된 바와 같이 제조되고 세포내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 세포에서 AP-1 활성을 자극하는 하나 이상의 화학적 화합물이 본 발명의 자극 방법에서 부가적 작용제로서 사용될 수 있다. 세포에서 AP-1 활성을 자극하는 화합물은 당해 분야에 공지되어 있으며, PMA/칼슘 요노포어(예를 들어, 요노마이신) 및 안티-CD3 항체를 포함한다.
B. 억제제
본 발명의 방법에 따라, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성을 억제하기 위해, 세포는 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자(예를 들어, c-Maf, NIP45, p18)의 발현 및/또는 활성을 억제하는 억제제와 접촉한다. 한 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포가 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하기 위해 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하는 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제와 접촉됨으로써 억제된다. 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포가 Th2 특이적 전사 인자, 바람직하게는 c-Maf의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제와 접촉함으로써 억제된다. 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포가 NF-AT 패밀리 단백질, 바람직하게는 NIP45와 상호작용하는 단백질의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제와 접촉함으로써 억제된다. 그러나 또 다른 구체예에서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성은 세포가 작은 maf 단백질의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제와 접촉함으로써 억제된다. 자극 방법에 대해서 상기에 설명된 바와 같이, 본 발명의 억제 방법은 세포를 maf 패밀리 단백질, NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질을 포함하여, Th2 관련된 시토카인 유전자 발현을 조절하는 2개 이상의 전사 인자의 발현 또는 활성을 조정하는 2개 이상의 작용제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
Th2 관련된 시토카인 생성은 예를 들어, Th2 세포 또는 헬퍼 전구체 세포 (Thp)에서 억제되어 Th2 경로 대신에 Th1 경로를 따른 이들의 분화를 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 억제제는 예를 들어 전사 인자의 발현 또는 활성을 억제시키기 위해 작용하는 세포간 결합 분자일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "세포간 결합 분자"는 단백질을 코드화하는 단백질 또는 핵산(예를 들어, mRNA 분자)에 결합함으로써 단백질의 발현 또는 활성을 억제하기 위해 세포내 활동하는 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 세포간 결합 분자의 예는 하기에 추가로 상세하게 설명되며, 안티센스 핵산, 세포내 항체 및 우성 네거티브 억제물질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 억제제는 전사 인자(예를 들어, maf 패밀리 단백질, 예컨대 c-Maf 또는 p18, 또는 NF-AT 상호작용 단백질, 예컨대 NIP45)를 코드화하는 유전자, 상기 유전자의 일부, 또는 안티센스 핵산 분자를 코드화하는 재조합 발현 벡터에 상보적인 안티센스 핵산 분자이다. 세포에서 특정 단백질의 발현을 하향 조절하기 위한 안티센스 핵산의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고문헌: Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari, F.K. 및 McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M.R. 및 Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. 및 Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335]. 안티센스 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자(예를 들어, mRNA 서열)의 코딩 가닥에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 다른 핵산 분자의 코딩 가닥에 수소를 결합시킬 수 있다. mRNA 서열에 상보적인 안티센스 서열은 mRNA, mRNA의 5' 또는 3' 비번역된 영역 또는 코딩 영역을 다리화시키는 영역 및 비번역된 영역(예를 들어, 5' 비번역된 영역 및 코딩 영역의 접합부)에서 발견되는 서열에 상보적일 수 있다. 추가로, 안티센스 핵산은 서열에 있어서 mRNA를 코드화하는 유전자의 조절 영역, 예를 들어 전사 개시 서열 또는 조절 요소에 상보적일 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 핵산은 코딩 가닥상에서 또는 mRNA의 3' 비번역된 영역에서 개시 코돈을 미치거나 우선하는 영역에 상보적이도록 디자인된다. 본원에 설명된 전사 인자의 세포내에서의 발현을 억제시키기 위한 안티센스 핵산은 본원에 설명된 또는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 왓손 및 크릭 염기쌍 규칙에 따라 구성된 전사 인자의 누클레오티드 서열을 기초로 하여 디자인될 수 있다.
안티센스 핵산은 여러 가지 상이한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산은 단지 maf 패밀리 유전자의 일부에 상보적인 올리고누클레오티드일 수 있다. 안티센스 올리고누클레오티드는 당해 분야에 공지된 화학적 합성 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 안티센스 올리고누클레오티드는 천연 누클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성도리 수 있거나 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된, 다양하게 변형된 누클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 누클레오티드가 사용될 수 있다. 배양물중의 세포에서 전사 인자 발현을 억제시키기 위해, 하나 이상의 안티센스 올리고누클레오티드가 배양 배지중의 세포에, 보편적으로 200㎍ 올리고누클레오티드/ml로 첨가될 수 있다.
대안적으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 이차 클론화되는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사되는 핵산은 관심의 표적 핵산에 안티센스 배향일 수 있다). 관심의 세포에서 안티센스 RNA 분자의 발현을 유도하는, 안티센스 배향에서 클론화되는 핵산에 조작적으로 결합되는 조절 서열이 선택될 수 있으며, 예를 들어 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 유도성 발현을 유도하는, 프로모터 및/또는 증강제 또는 다른 조절 서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 발현 벡터에 대해 상기에 설명된 바와 같이 제조되며, 단 cDNA(또는 이것의 일부)는 안티센스 배향에서 벡터내로 클론화된다. 안티센스 발현 벡터는 예를 들어, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 감독된 바이러스의 형태일 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 발현 벡터에 대해 상기에 설명된 바와 같이, 표준 트랜스펙션 기술을 사용하여 세포내로 도입된다.
또 다른 구체예에서, 억제제로서 사용하기 위한 안티센스 핵산은 리보자임이다. 리보자임은 단일 가닥 핵산을 분할할 수 있고, 상보적 영역을 갖는, 리보누클레아제 활성이 있는 촉매적 RNA 분자이다 [참고문헌: Ohkawa, J. et al. (1995) J. Biochem. 118:251-258; Sigurdsson, S.T. 및 Eckstein, F. (1995) Trends Biotechnol. 13:286-289; Rossi, J.J. (1995) Thends Biotechnol. 13:301-306; Kiehntopf, M. et al. (1995) J. Mol. Med. 73:65-71]. 본원에 설명된 전사 인자를 코드화하는 mRNA에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 전사 인자의 누클레오티드 서열을 기초로 하여 디자인될 수 있다. 예를 들어, 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 염기 서열이 c-maf mRNA 또는 다른 전사 인자 mRNA에서 분할되는 염기 서열에 상보적이 되도록 구성될 수 있다. 예를 들어 세치(Cech) 등의 미국 특허 제 4,987,071 호와 제 5,116,742 호를 참조한다. 대안적으로, c-maf mRNA( 또는 다른 전사 인자 mRNA)는 RNA 분자의 푸울로부터 특이적 리보누클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다 [참고문헌: Bartel, D. 및 Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418].
세포에서 Maf 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제시키는데 사용될 수 있는 억제제의 또 다른 유형은 본원에 설명된 전사 인자에 대해 특이적인 세포내 항체이다. 세포에서 단백질 작용을 억제시키기 위한 세포내 항체의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고문헌: Carlson, J.R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S, et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T.M. et al. (1990) FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J.R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S, et al. (1994) Bio/Technology 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y, et al. (1994) Proc, Natl. Acad, Sci, USA 91: 5932-5936; Beerli, R.R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R.R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A.M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J.H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137; PCT Publication No. WP 94/02610 by Marasco et al; and PCT Publication No. WP 95/03832 by Duan et al].
세포내 항체를 사용하여 단백질 활성을 억제시키기 위해, 세포내로 벡터의 도입시에, 항체 쇄가 세포의 세포내 구획에서 작용성 항체로서 발현되는 형태로 항체 쇄를 코드화하는 재조합 발현 벡터가 제조된다. 본 발명의 억제 방법에 따라 전사 인자 활성을 억제시키기 위해, 바람직하게는 전사 인자와 특이적으로 결합하는 세포내 항체는 세포핵내에서 발현된다. 세포내 항체의 핵 발현은 항체 경쇄 및 중쇄 유전자로부터 N 말단 소수성 리더 서열을 코드화하는 누클레오티드 서열을 제거하고 경쇄 및 중쇄 유전자의 N 또는 C 말단에서 핵 국소화 시그날을 코드화하는 누클레오티드 서열을 첨가함으로써 수행될 수 있다 [참고문헌: Biocca, S, et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilkar, A.M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551]. 세포내 항체 쇄의 핵 표적화를 위해 사용되는 바람직한 핵 국소화 시그날은 SV40 라아지 T 항원의 핵 국소화 시그날이다 [참고문헌: Biocca, S, et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Mhashilkar, A.M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551].
세포내 항체 발현 벡터를 제조하기 위해, 관심의 표적 단백질, 예를 들어 Maf 패밀리 단백질 또는 본원에 설명된 다른 전사 인자에 특이적인 항체 쇄를 코드화하는 항체 경쇄 및 중쇄 cDNA는 보편적으로 maf 단백질에 특이적인 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마로부터 단리된다. Maf 패밀리 단백질에 대한 항혈청의 제조는 당해 분야에 공지되어 있다 [참고문헌: Fujiwara, K. T. et al. (1993) Oncogene 8:2371-2380; Kataoka, K. et al. (1993) J. Virol. 67:2133-2141; Kerppola, T. K. 및 Curran, T. (1994) Oncogene 9:675-684; Igarashi, K. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7445-7449]. 안티-Maf 단백질 항체는 적합한 피검체(예를 들어, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유류)를 Maf 단백질 면역원으로 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 적당한 면역원성 제제는 예를 들어, 재조합적으로 발현된 Maf 단백질 또는 화학적으로 합성된 Maf 펩티드를 함유할 수 있다. 제제는 추가로 보조제, 예컨대 프로인트 완전 또는 불완전 보조제, 또는 유사하는 면역자극제를 포함할 수 있다. 항체 생성 세포는 상기 피검체로부터 수득할 수 있고 표준 기술, 예컨대 코올러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein)(1975, Nature 256:495-497)에 의해 설명된 하이브리도마 기술에 의해 단클론성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다 [참고문헌: Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; 및 Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75]. 단클론성 항체 하이브리도마를 생성하기 위한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고문헌: R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet, 3:231-36]. 간단하게, 불멸의 세포선(보편적으로 골수종)은 상기에 설명되는 바와 같이 maf 단백질 면역원으로 면역화된 포유류로부터의 림프구(보편적으로 비세포)에 융합되고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상층액은 Maf 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위해 스크리닝된다. 림프구 및 불멸화된 세포선을 융합시키는데 사용되는 널리 공지된 많은 프로토콜 중 어느 것이나 안티-Maf 단백질 단클론성 항체를 발생시키는 목적에 적용될 수 있다 [참고문헌: G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol, Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra]. 더욱이, 당업자는 또한 유용한 상기 방법들의 많은 변형이 있는 것을 인지할 것이다. 보편적으로 불멸의 세포선(예를 들어, 골수종 세포선)은 림프구와 같은 포유류 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 쥐 하이브리도마는 불멸화된 마우스 세포선을 갖는 본 발명의 면역원성 제제로 면역화된 마우스로부터의 림프구를 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직한 불멸의 세포선은 하이폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")를 함유하는 배양 배지에 민감한 마우스 골수종 세포선이다. 수많은 골수종 세포선 중 어느 것이나 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 사용될 수 있으며, 예를 들어 P3-NS1/l-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포선이 있다. 이들 골수종 세포선은 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC, 메릴랜드 록빌 소재)로부터 시판되고 있다. 보편적으로, HAT에 민감한 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비세포에 융합된다. 그 후 융합으로부터 얻어지는 하이브리도마 세포는 HAT 배지를 사용하여 선택하고, 비융합되고 비생산적으로 융합된 골수종 세포(비융합된 비세포는 형질전환되지 않기 때문에 수일 후 죽는다)를 치사시킨다. maf 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 예를 들어 표준 ELISA 검정을 사용하여, 상기 항체에 대한 하이브리도마 배양 상층액을 스크리닝시킴으로써 확인한다.
단클론성 항체 분비 하이브리도마를 제조하는 것 대신에, 본원에 설명된 전사 인자에 결합하는 단클론성 항체는 단백질 또는 이것의 펩티드를 사용하여 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 표시 라이브러리)를 스크리닝시켜, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 라이브러리 성분을 분리시킴으로써 확인되고 단리될 수 있다. 파지 표시 라이브러리를 발생시키고 스크리닝시키기 위한 키트는 시판되고 있다 [참고문헌: the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 the Stratagene SurfZAPTMPhage Display Kit, Catalog No. 240612]. 부가적으로, 파지 표시 라이브러리를 발생시키고 스크리닝시키는데 특히 사용할 수 있는 방법 및 시약의 예는 하기 문헌에서 발견될 수 있다
관심의 전사 인자에 특이적인 단클론성 항체(예를 들어, 하이브리도마 유도 단클론성 항체 또는 복합 라이브러리로부터의 재조합 항체)가 확인되는 경우, 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄를 코드화하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 단리된다. 하이브리도마 유도 항체에 있어서, 경쇄 및 중쇄 cDNA는 예를 들어, PCR 중폭 또는 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해 수득될 수 있다. 예컨대 파지 표시 라이브러리로부터의, 재조합 항체에 있어서, 경쇄 및 중쇄를 코드화하는 cDNA는 라이브러리 스크리닝 과정 동안에 단리된 표시 팩키지(예를 들어, 파지)로부터 회수될 수 있다. PCR 프라이머 또는 cDNA 라이브러리 프로브가 제조될 수 있는 항체 경쇄 및 중쇄 유전자의 누클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 많은 상기 서열은 하기 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 and in the "Vbase" human germline sequence database].
일단 수득되면, 항체 경쇄 및 중쇄 서열은 표준 방법을 사용하여 재조합 발현 벡터내로 클론화된다. 상기에 설명된 바와 같이, 경쇄 및 중쇄의 소수성 리더를 코드화하는 서열은 제거되고 핵 국소화 시그날(예를 들어, SV40 라아지 T 항원으로부터의 시그날)을 코드화하는 서열은 경쇄 및 중쇄 모두의 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 코드화하는 서열에 골격내에서 결합된다. 발현 벡터는 세포내 항체를 여러 가지 상이한 형태 중 하나로 코드화할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 벡터는 전체 길이 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현시켜 전체 길이의 항체를 세포내적으로 발현되도록 한다. 또 다른 일구체예에서, 벡터는 전체 길이의 경쇄를 코드화하고, 중쇄의 VH/CH1 영역만을 코드화하여 Fab 단편이 세포내적으로 발현되도록 한다. 가장 바람직한 구체예에서, 벡터는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역이 가요성 펩티드 링커(예를 들어, (Gly4Ser3))에 의해 연결되고, 단일쇄 분자로서 발현되는 단일쇄 항체(scFv)를 코드화한다. 세포내 전사 인자 활성을 억제하기 위해, 전자 인자 특이적 세포내 항체를 코드화하는 발현 벡터는 이전에 논의된 바와 같은 표준 트랜스펙션법에 의해 세포에 도입된다.
본 발명의 억제제의 또 다른 형태는 본원에서 논의되어 있으며, 또한 본원에서는 우성 네가티브 억제제로서 언급된 전사 인자(예를 들어, maf 단백질)의 억제 형태이다. 단백질의 maf 패밀리는 동종이량체화하고, Fos 및 Jun과 같은 그 밖의 AP-1류의 일원으로 이종이량체화하는 것으로 공지되어 있다[참조예: Kerppola, T.K. and Curran, T. (1994) Oncogene 9:675-684; Kataoka, K. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:700-712]. 이량체를 형성하는 전사 인자의 활성을 억제시키는 한 방법은 작용성 전사 인자로 이량체화시킬 수는 있지만 전사 활성화 능력은 결여되어 있는 우성 네가티브 억제제를 사용하는 것이다[참조예: Petrak, D. et al. (1994) J. Immunol. 153:2046-2051]. 작용성 전사 인자로 이량체화시키므로써, 이러한 우성 네가티브 억제제는 이들의 활성을 억제시킬 수 있다. 이러한 과정은 유전자 발현을 조절하는 수단으로써 자연적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, mafK, mafF, mafG 및 p18과 같이 "작은" maf 단백질은 다수이며, 이들은 트랜스활성화 도메인을 함유하는 c-Maf 아미노산 말단의 3분의 2가 결여되어 있다[참조: Fujiwara, K.T. et al. (1993) Oncogene 8:2371-2380; Igarashi, K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7615-7624; Andrews, N.C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11488-11492; Kataoka, K. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2180-2190]. 작은 maf 단백질의 동종이량체는 전사의 네가티브 조절제로서 작용하고(Igarashi, K. et al.(1994) Nature 367:568-572), 작은 maf 단백질중 세개(MafK, MafF 및 MafG)는 v-Maf 종양단백질에 의해 매개되는 트랜스활성화를 경합적으로 억제하는 것으로 기재되어 있다[Kataka, K. et al. (1996) Oncogene 12:53-62]. 추가로, MafB는 Ets-1의 상호작용 파트너로서 확인되었으며, 트랜스페린 수용체의 Ets-1 매개된 트랜스활성화를 억제하고, 적혈구 분화를 억제하는 것으로 기재되어 있다[Sieweke, M.H. et al. (1996) Cell 85:49-60].
따라서, 본 발명의 억제제는 c-Maf로 이량체화할 수 있지만 전사 활성능은 결여되어 있는 Maf 단백질의 형태일 수 있다. 이러한 우성 네가티브 형태의 Maf 단백질은 예를 들어, 천연적으로 트랜스활성화 도메인이 결여된 작은 Maf 단백질(예를 들어, MafK, MafF, MafG), MafB 또는 트랜스활성 도메인이 제거된 c-Maf의 돌연변이형일 수 있다. 이러한 도메인 네가티브 Maf 단백질은 표준 트랜스펙션법에 의해 세포에 도입되는 Maf 단백질을 코드화하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 세포에서 발현될 수 있다. 트랜스활성화 도메인이 결여된 c-Maf의 돌연변이형을 발현시키기 위해, c-Maf의 아미노산 말단 트랜스활성화 도메인을 코드화하는 누클레오티드 서열은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 c-maf cDNA로부터 제거된다. 바람직하게는 적어도 아미노산 1 내지 122가 제거된다. 보다 바람직하게는 적어도 1 내지 187, 또는 아미노산 1 내지 257이 제거된다. 염기성 류신 지퍼 영역을 코드화하는 누클레오티드 서열은 유지된다. 양말단이 잘린 cDNA는 재조합 발현 벡터로 삽입되고, 이후 세포내에 도입되어 트랜스활성화 도메인이 결여되어 있는 양말단이 잘린 c-maf의 발현을 세포내에서 허용한다.
세포에서 maf 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제하는 데 사용될 수 있는 억제제의 또 다른 유형은 세포내에서 내인성 maf 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물이다. 이러한 화합물은 maf 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물을 선택하는 스크린닝 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 적합한 스크린닝 검정의 예가 하기 서브섹션 V에 보다 상세하게 기재되어 있다.
자극제에 관련하여 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 억제법은 Th1- 또는 Th2 관련된 시토카인 유전자를 조절하는 데 기여하는 하나 이상의 추가 전사 인자의 발현 또는 활성을 억제하는 하나 이상의 추가 억제제를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명의 억제 방법은 세포를, maf 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제 1 작용제와 NF-AT 패밀리 단백질 또는 NF-AT 상호작용 단백질(예를 들어, NIP45)의 발현 또는 활성을 억제하는 제 2 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 억제 방법은 maf 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제 1 작용제, NF-AT 패밀리 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제 2 작용제 및 NF-AT 상호작용 단백질(예를 들어, NIP45)의 발현 또는 활성을 억제하는 제 3 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. NF-AT, NF-AT 상호작용 및 AP-1 단백질을 억제하기 위한 억제제의 유형의 예로는 안티센스 핵산, 세포내 항체, 우성 네가티브 억제제 및 상기 기재된 바와 같이 내인성 단백질을 억제하는 화합물이 포함된다. 후자와 관련하여, NF-ATp의 핵 전위가 면역억제제 시클로스포린 A 및 FK506에 의해 억제되는 것으로 당해에 공지되어 있다[참조예: Rao, A. (1994) Immunol. Today 15:274-281; Rao, A.(1995) J. Leukoc. Biol. 57:536-542]. 따라서, 억제 방법의 일 구체예에서, 시클로스포린 A 또는 FK506(또는 이외 관련된 칼신유린(calcineurin) 경로를 억제하는 약제)와 같은 면역억제제는 c-Maf의 발현 또는 활성을 억제하는 작용제와 배합하여 사용된다.
세포에 의해 Th2 관련된 시토카인의 생성을 조절하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내에서 실시될 수 있다(생체내 시험은 하기 서브섹션에서 논의될 것이다). 시험관내 방법을 실시하기 위해, 세포는 표준 방법에 의해 피검체로부터 입수하고, Th2 관련된 시토카인의 생성을 각각 촉진하거나 억제하는 본 발명의 촉진제 또는 억제제로 시험관내에서 인큐베이팅(즉, 배양)시켰다. 예를 들어, 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 피검체로부터 취하여 예를 들어 Ficoll/Hypaque로 밀도 구배 원심분리법에 의해 분리될 수 있다. 특정 세포 집단을 표준 방법을 사용하여 고갈시키거나 부유하게 할 수 있다. 예를 들어, 단핵세포/마크로파아지는 플라스틱상의 부착에 의해 분리될 수 있다. T 세포 또는 B 세포는 예를 들어 T 세포 또는 B 세포 표면 마아커에 대한 항체를 사용하는 포지티브 및/또는 네가티브 선택에 의해, 예를 들어 세포를 특이적 1차 단일클론성 항체(mAb)로 인큐베이팅시킨 후에 1차 mAb를 결합시키는 2차 항체로 피복된 자성 비드를 사용하여 mAb를 결합시키는 세포를 분리시키므로써 부유되거나 고갈될 수 있다. 말초혈 또는 골수 유도된 조혈성 간세포는 간세포 특이적 mAb(예를 들어, 항 CD34 mAb)를 사용하는 유사한 기법에 의해 분리될 수 있다. 특이적 세포 집단은 또한 표준 방법에 따른 형광 활성 세포 분류에 의해 분리될 수 있다. 당해 공지된 세포 특이적 표면 마아커에 대한 단일클론성 항체는 다수가 상업적으로 입수할 수 있다.
Th2 관련된 시토카인, 특히 IL-4의 생성 자극을 초래하는 자극제가 시험관내에서 사용되는 경우, 시토카인은 추가 사용을 위해 배양 상층액으로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 상층액 또는 이의 정제된 부분은 배양물중의 T 세포에 사용되어 시험관내 Th1 또는 Th2 세포의 발생에 영향을 미칠 수 있다. 다르게는 배양 상층액 또는 이의 정제된 부분은 피검체에 투여되어 피검체내에서 Th1 대 Th2 반응의 발생에 영향을 미칠 수 있다.
또한, 시험관내에서 자극제 또는 억제제로 처리된 세포는 피검체에 투여되어 피검체에서 Th1 대 Th2 반응의 발생에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 세포에 의해 Th2 관련된 시토카인의 생성을 조절하기 위한 본 발명의 방법은 세포를 피검체에 투여하므로써 피검체에서 Th1 대 Th2 세포의 발생을 조절하는 것을 추가로 포함한다. 생체외 변형 및 재투여에 바람직한 세포 유형에는 T 세포, B 세포 및 조혈성 간세포가 포함된다. 피검체에 투여하기 위해, 먼저 피검체에 투여하기 전에 세포로부터 배양물중의 잔류 작용제를 제거하는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어 세포의 Ficoll/Hypaque 구배 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 세포의 생체외 유전자 변형후에 피검체로의 재투여에 대한 추가 논의는 더블유. 에프. 앤더슨(W.F. Anderson) 등의 미국 특허 제 5,399,346호를 참조한다.
II. 피검체에서 Th1 또는 Th2 세포의 발생을 조절하기 위한 방법
본 발명의 또 다른 일면은 피검체에서 Th1 또는 Th2 세포의 발생을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 용어 "피검체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 피검체의 예에는 사람, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 쥐, 소, 말, 염소 및 양이 포함된다. 상기 논의된 바와 같이, 피검체에서 Th1/Th2 비를 조절하는 한 방법은 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 또는 조혈성 간세포)를 생체외에서 하나 이상의 본 발명의 조절제로 처리하므로써 세포에 의해 Th2 관련된 시토카인의 생성이 조절되도록 한 후 피검체에 세포를 투여하는 것이다. 또 다른 구체예에서, Th1/Th2 비는 피검체에 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 활성을 조절하는 작용제를 투여하여 피검체내 Th1 또는 Th2 세포의 발생을 조절하므로써 피검체내에서 조절된다. 바람직한 구체예에서, 전사 인자는 maf 패밀리 단백질, 바람직하게는 c-Maf 단백질 또는 작은 maf 단백질(예를 들어, p18)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 전자 인자는 NF-AT 패밀리 단백질, 바람직하게는 NIP45와 상호작용하는 단백질이다. 바람직하게는 Th2 관련된 시토카인은 IL-4이다. 피검체내 Th2 반응의 발생은 본 발명의 하나 이상의 자극제의 투여에 의해 촉진되는 반면, 피검체내 Th1 반응의 발생은 본 발명의 하나 이상의 억제제의 투여에 의해 촉진될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 특정 상황에서는 추가로 많은 전사 인자(예를 들어, maf 패밀리 단백질, NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질 및/또는 AP-1 패밀리 단백질의 배합)의 활성을 조절하는 것이 바람직할 수 있다.
핵산(전사 인자, 안티센스 RNA, 세포내 항체 또는 우성 네가티브 억제제를 코드화하는 재조합 발현 벡터를 포함)을 포함하는 자극제 또는 억제제에 대해, 자극제 또는 억제제는 생체내 세포로 핵산(DNA)를 도입시키는 당해 공지된 방법을 사용하여 피검체의 세포로 도입될 수 있다. 이러한 방법의 예에는 하기 방법이 포함된다:
직접 주입: 네이키드(naked) DNA는 DNA를 세포에 직접 주입하므로써 생체내 세포로 주입될 수 있다[참조예: Acsadi et al.(1991) Nature 332:815-818; Wolff et al.(1990) Science 247:1465-1468]. 예를 들어, DNA를 생체내 세포내 주입하기 위해 전달 장치(예를 들어, "유전자 건(gun)")가 사용될 수 있다. 이러한 장치는 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어, 바이오라드(BioRad)사로부터).
수용체 매개된 DNA 흡수: 네이키드 DNA는 또한 세포 표면 수용체에 대한 리간드에 결합되는 폴리리신과 같은 양이온에 DNA를 착화시키므로써 생체내 세포로 도입될 수 있다[참조예: Wu, G. and Wu, C.H.(1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; 및 미국 특허 출원 제 5,166,320호]. 수용체로의 DAN 리간드 착물의 결합은 수용체 매개된 세포 이물 흡수에 의해 DNA의 흡수를 용이하게 한다. 천연적으로 엔도좀을 분열시키고, 이로써 세포질로 물질을 방출시키는 아데노바이러스 캡시드에 결합된 DNA 리간드 착물은 세포내 리소좀에 의한 착물의 열화를 피하는 데 사용될 수 있다[참조예: Cuiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Crisiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126].
레트로바이러스: 결함 레트로바이러스는 유전자 치료 목적을 위해 유전자 이동에 사용하는 데 양호하게 특징화된다[참조예: Miller, A.D.(1990) Blood 76:271]. 재조합 레트로바이러스는 레트로바이러스 게놈에 혼힙된 가치있는 누클레오티드 서열을 가지는 것으로 구성될 수 있다. 추가로, 레트로바이러스 게놈의 부분은 제거되어 레트로바이러스 복제 결함을 부여할 수 있다. 이후, 복제 결함 레트로바이러스는 표준 방법에 의해 헬퍼 바이러스를 사용하므로써 표적 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있는 비리온으로 패키징된다. 재조합 레트로바이러스를 생성하고 시험관내 또는 생체내 세포를 이러한 바이러스로 감염시키기 위한 원안이 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14)과 기타 표준 실험 편람에서 발견된다. 적합한 레트로바이러스의 예에는 당해 기술자에게 널리 공지되어 있는 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM이 포함된다. 적합한 패키징 바이러스계의 예에는 ΨCrip, ΨCre, Ψ2 및 ΨAm이 포함된다. 레트로바이러스는 다양한 유전자를 상피 세포, 내피 세포, 림프구, 근모세포, 간세포, 골수 세포를 포함하는 많은 상이한 세포 유형으로 시험관내 및/또는 생체내에서 도입하는 데 사용된다[참조예: Eglitis, et al.(1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligna(1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Sience 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al.(1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwe et al.(1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 제 4,868,116호, 미국 특허 제 4,980,286호, PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345 및 PCT 출원 WO 92/07573]. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 게놈(및 이에 삽입된 외래 핵산)이 숙주 게놈으로 통합되어 핵산을 세포로 안정하게 도입시키기 위해 표적 세포를 분할할 필요가 있다. 따라서, 표적 세포의 복제를 자극할 필요가 있다.
아데노바이러스: 아데노바이러스의 게놈은 가치있는 유전자 생성물을 코드화하고 발현시키나 정상적인 세포 용해 바이러스 생활환으로 복제할 수 있는 능력면에서는 비활성화되도록 조작될 수 있다[참조예: Berkner et al.(1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al.(1991) Science 252:431-434; and rosenfeld et al(1992) Cell 68:143-155]. 아데노바이러스 균주 Ad 형 5 dl324 또는 그 밖의 아데노바이러스 균주로부터 유도된 적합한 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Ad2, Ad3, Ad7 등)는 당해 기술자들에게 널리 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 이들이 효과적인 유전자 전달 비히클이 되도록 세포를 분할할 필요가 없으며, 기도 상피(Rosenfeld et al.(1992), 상기 인용됨), 내피 세포(Lemarchand et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486), 간세포(Herz and Gerard(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) 및 근육 세포(Quantin et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584)를 포함하는 광범위한 세포 유형을 감염시키는 데 사용될 수 있다는 점에서 유리하다. 추가로, 도입된 아데노바이러스 DNA(및 이에 함유된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈으로 통합되지 않으나 에피솜으로 존재하므로써 도입된 DNA가 숙주 게놈(예를 들어, 레트로바이러스 DNA)으로 통합되는 상황에서 삽입성 돌연변이생성의 결과로서 일어날 수 있는 잠재적인 문제점을 피한다. 또한, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 운반 용량은 이외 유전자 전달 벡터에 비해 크다(8 킬로베이스 이하)[참조: Berkner et al. 상기 언급됨; Haj-Ahmand and Graham(1986) J. Virol. 57:267]. 현재 사용되는 대부분의 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자의 전부 또는 일부에 대해 삭제되지만 아데노바이러스 유전 물질의 80% 정도는 보유한다.
아데노 관련 바이러스: 아데노 관련 바이러스(AAV)는 효과적인 복제 및 증식적 생활환을 위한 헬퍼 바이러스로서, 아데노바이러스 또는 헤르페스와 같은 또 다른 바이러스를 필요로 하는 천연 결함 바이러스이다[참조예: Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol.(1992) 158:97-129]. 또한, DNA를 비분할 세포로 통합할 수 있으며, 고주파수의 안정한 통합을 나타내는 몇 안되는 바이러스중 하나이다[참조예: Flotte et al.(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al.(1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McLaughlin et al.(1989) J. Virol. 62:1963-1973]. 300개 정도로 적은 염기쌍의 AVV를 함유하는 벡터가 패키징될 수 있으며, 통합될 수 있다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. 트라췬(Tratschin) 등의 문헌((1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260)에 기재된 바와 같은 AAV 벡터는 DNA를 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 다양한 핵산이 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 유형에 도입되었다[참조예: Hermonat et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al.(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al.(1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al.(1984) J. Virol. 51:611-619; and Flotte et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790].
특정 발현 벡터 시스템과 핵산을 세포에 도입시키는 방법의 효능은 당해 통상적으로 사용되는 표준 접근법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 세포로 도입된 DNA는 필터 혼성화 기법(예를 들어, 서던 블롯팅)에 의해 검출될 수 있으며, 도입된 DNA의 전사에 의해 생성된 RNA는 예를 들어, 노던 블롯팅, RN아제 보호법 또는 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 검출될 수 있다. 유전자 생성물은 적합한 검정, 예를 들어 특이적 항체와 같은 생성된 단백질의 면역학적 검출, 또는 효소 검정과 같은 유전자 생성물의 기능적 활성을 검출하는 기능 검정에 의해 검출될 수 있다.
외인성 전사 인자 활성을 자극하거나 억제하는 화합물과 같은 조절제는 약제 조성물로서 피검체에 투여될 수 있다. 이러한 조성물을 일반적으로 조절제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여에 상용할 수 있는 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제 활성 물질로 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당해 널리 공지되어 있다. 종래의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 것을 제외하고, 조성물에 이들의 사용은 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 비경구, 피내 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 주사용 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 살균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절제와 같은 성분을 포함할 수 있다. 비경구 제제는 앰푸울, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다수개의 약병에 넣어질 수 있다.
주사 용도에 적합한 약제 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 살균 주사가능한 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 살균 분말이 포함된다. 정맥내 투여에 적합한 담체에는 생리 염수, 정균수, 크레모포 ELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 살균되어야 하며, 주사가 용이한 정도의 유체이어야 한다. 제조 조건하에서 안정하여야 하며 균 및 진균과 같은 미생물의 오염화 작용에 대해서는 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(에를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 렉시틴과 같은 피복물을 사용하므로써, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키므로써 유질될 수 있다. 미생물 작용은 방지는 여러 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 마니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 염화나트륨을 조성물중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물의 오랜 흡수는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 조성물 중에 포함시키므로써 초래될 수 있다.
살균 주사 용액은 적합한 용매중에서 요구량의 활성 성분을 상기 열거된 성분중 하나 또는 배합물과 함께 혼입하고, 필요에 따라 여과 살균시키므써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을 상기 열거된 성분들로부터 요구되는 그 밖의 성분과 염기성 분산 매질을 함유하는 살균된 비히클에 혼입시키므로써 제조된다. 살균 주사 용액을 제조하기 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조시켜 활성 성분의 분말과 이전에 살균 여과된 용액으로부터의 추가의 목적하는 성분을 얻는 것이다.
경구 조성물에는 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체가 포함된다. 이들 조성물은 젤라킨 캡슐에 넣어지거나 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적으로, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며, 정제, 알약 또는 캠슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세척제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이 경우 유체 담체중의 화합물은 구강에 사용되어 헹구고, 뱉거나 삼켜진다. 약제학적 상용성인 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 알약 등은 하기 성분 또는 유사 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 미소결정질 셀룰로오스, 검 트라칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제, 콜로이드 이산화규소와 같은 활주제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제, 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 항료와 같은 향미료.
일구체예에서, 활성 화합물은 이식 조직 및 미소캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 조절 제형과 같이 몸으로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리콜리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리아세트산과 같은 생물 분해성, 생물상용성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당해 기술자들에게는 자명할 것이다. 상기 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티컬스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 시판되어 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 단일콜론성 항체로 감염된 세포에 대해 표적된 리포좀 포함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국 특허 제 4,522,811호에서 기재된 바와 같이 당해 기술자들에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이와 복용량의 균일성을 위해 복용 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 복용 단위 형태란 치료 피검체에 대한 단위 복용으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위이며, 각각의 단위는 요구되는 약제 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과가 생기도록 계산된 규정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 규정은 (a) 활성 화합물의 특이한 특징 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 (b) 개인의 치료를 위한 활성 화합물과 같은 혼합 기술에서의 고유 제한 사항에 의한 것이라 할 수 있으며, 직접적으로 이들에 의존한다.
III. 본 발명의 방법의 적용
IL-4의 생성과 이에 따른 Th2 세포의 지속적인 형성을 조절하는 전사 인자의 확인은 본 발명의 조절 방법을 사용하여 여러 임상적 상황에서 T 세포 서브셋(subset) 선택적인 조작을 가능하게 한다. 본 발명의 자극 방법(즉, 자극제를 사용하는 방법)은 동시에 Th2 반응의 촉진과 Th1 반응의 하향 조절과 함께 Th2 관련된 시토카인의 생성을 초래한다. 대조적으로, 본 발명의 억제 방법(즉, 억제제를 사용하는 방법)은 동시에 Th2 반응의 하향조절과 Th1 반응의 촉진과 함께 Th2 관련된 시토카인의 생성을 억제한다. 따라서, Th2 반응이 유리한 질병 상태를 치료하기 위해서, 본 발명의 자극 방법이 Th2 반응이 촉진되면서 Th1 반응을 하향조절하도록 선택된다. 다르게는, Th1 반응이 유리한 질병 상태를 치료하기 위해서, 본 발명의 억제 방법이 Th2 하향조절되면서 Th1 반응을 촉진되도록 선택된다. 질병 상태를 치료하는 본 발명의 방법의 적용은 질병 상태의 치료, 장기간 또는 단기간으로의 질병상태와 관련된 증상의 유형 또는 갯수의 감소(즉, 질병상태의 호전) 또는 피검체에 대한 단순한 일시적으로 유리한 효과를 나타낼 수 있다.
우세한 Th1 또는 Th2형 반응과 관련된 많은 질병 상태는 질병을 앓고 있는 개인에 수행되는 반응 유형의 조절로 확인되어 유리할 수 있다. 이러한 질병에 대한 본 발명의 면역조절 방법의 적용은 하기에서 추가로 상세히 기술된다.
A. 알레르기
알레르기는 Th2 세포의 활성에 의해 생성이 조절되고, 이로써 시토카인이 생성되는 IgE 항체를 통해 매개된다. 알레르기 반응에서, IL-4는 Th2 세포에 의해 생성되고, 추가로 IgE 항체의 생성과 알레르기 반응을 매개하는 세포, 즉, 비만 세포 및 호염기성 세포의 활성을 촉진시킨다. IL-4는 또한 호산구 매개된 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 억제 방법은 병원 IgE 항체의 생성을 하향조절하는 수단으로서 Th2 관련된 시토카인의 생성 및 특히 알레르기 환자의 IL-4를 억제하는 데 사용될 수 있다. 억제제는 피검체에 직접 투여할 수 있거나 세포(예를 들어, Thp 세포 또는 Th2 세포)를 피검체로부터 취하여 생체외에서 억제제와 접촉시키고, 피검체에 재투여시킬 수 있다. 또한, 특정 상황에서는 알레르겐을 억제제 또는 알레르겐 특이 반응을 억제하는(예를 들어, 과민성을 없애는) 억제제로 처리된 세포와 함께 피검체에 동시투여하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 치료법은 Th2 관련된 시토카인에 대한 항체(예를 들어, 안티-IL-4 항체) 또는 시토카인 IL-12와 같은 그 밖의 Th1 촉진제를 Th1형 반응을 더 자극하기에 충분한 양으로 알레르기 피검체에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
B. 암
Th2 촉진 시토카인의 발현은 암 환자에게서 상승되는 것으로 보고되어 있으며(Yamamura, M., et al.(1993) J. Clin. Invest. 91:1005-1010; Pisa, P., et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7708-7712), 악성 질환은 질병 진행의 악화에 따라 Th1형 반응에서 Th2형 반응으로 이동하는 것과 관련된다. 따라서, 본 발명의 억제 방법은 Th1에서 Th2로의 이동을 방해하는 수단으로서 암 환자에게서 Th2 관련된 시토카인의 생성을 억제하고, 이로써 환자에게서 진행중인 Th1 반응을 촉진하여 질병의 진행을 호전시킬 수 있다. 억제 방법은 암을 앓고 있는 환자에게 억제제를 직접 투여하거나 피검체로부터 취해진 세포(예를 들어, Thp 또는 Th2 세포)를 생체외 억제제로 치료한 후 피검체에 세포를 재투여하는 것이 포함될 수 있다. 이 치료법은 Th2 관련된 시토카인에 대한 항체(예를 들어, 안티 IL-4 항체) 또는 시토카인 IL-12와 같은 그 밖의 Th1 촉진제를 Th1형 반응을 더 자극하는 데 충분한 양으로 수용자에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
C. 전염병
Th2 촉진 시토카인의 발현은 또한 HIV 감염, 결핵, 리슈마이아증, 주혈흡충병, 사상충 선충 감염 및 장 선충 감염을 포함하는 다양한 전염병 동안에 증가하는 것으로 보고되어 있으며(Shearer, G.M. and Clerici, M.(1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M and Shearer, G.M.(1993) Immunology Today 14:107-111; Fauci, A.S. (1988) Science 239:617-623; Locksley, R.M. and Scott, P.(1992) Immunoparasitology Today 1:A58-A61; Pearce, E.J., et al.(1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M., et al.(1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kullberg, M.C. et al.(1992) J. Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A.J., et al.(1993) J. Immunol. 150:1395-1402; Pearlman, E., et al.(1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K.J., et al.(1994) J. Exp. Med. 179:347-351), 이러한 전염병은 또한 면역반응에서 Th1에서 Th2로의 이동과 관련되어 있다. 따라서, 본 발명의 억제 방법은 Th1에서 Th2로의 이동을 방해하는 수단으로서 전염병을 앓고 있는 피검체에게서 Th2 관련된 시토카인의 생성을 억제하고, 이로써 환자에게서 진행중인 Th1 반응을 촉진하여 질병의 진행을 호전시킬 수 있다. 억제 방법은 전염병을 앓고 있는 환자에게 억제제를 직접 투여하거나 피검체로부터 취해진 세포(예를 들어, Thp 또는 Th2 세포)를 생체외 억제제로 치료한 후 피검체에 세포를 재투여하는 것이 포함될 수 있다. 이 치료법은 Th2 관련된 시토카인에 대한 항체(예를 들어, 안티 IL-4 항체) 또는 시토카인 IL-12와 같은 그 밖의 Th1 촉진제를 Th1형 반응을 더 자극하는 데 충분한 양으로 수용자에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
D. 자가면역 질병
본 발명의 자극 방법은 Th2형 기능장애와 관련된 자가면역 질병을 치료하는 데 치료적으로 사용될 수 있다. 많은 자가면역 질환은 자기 조직에 대해 반응하고, 질병의 경과 상태에 관련된 자가항체 및 시토카인의 생성을 촉진하는 T 세포의 부적합한 활성화에 기인한다. 헬퍼형 반응의 조절은 자가면역 질병의 진행에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE)에서, 질병의 도입시기에서의 IL-4의 투여에 의한 Th2형 반응의 자극은 자가면역 질병의 강도를 감소시킨다[참조: Paul, W.E., et al.(1994) Cell 76:241-251]. 또한, 질병으로부터 동물을 회복시키는 것은 Th2 특이적 시토카인의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 Th2 형 반응의 증가와 관련된 것으로 기재되어 있다[참조: Koury, S.J., et al.(1992) J. Exp. Med. 176:1355-1364]. 또한, EAE를 억제하는 T 세포는 Th2 특이적 시토카인을 분비한다[참조: Chen, C., et al.(1994) Immunity 1:147-154]. EAE에서 Th2 형 반응의 자극은 질병에 대한 보호 효과를 가지기 때문에, 다발성 경화증(이에 대해 EAE는 모델이다)을 앓고 있는 피검체에게서 Th2 반응을 자극하는 것은 치료적으로 유리할 것으로 여겨진다.
유사하게, 마우스의 제 1형 당뇨병에서의 Th2형 반응의 자극은 질병에 대해 보호 효과를 제공한다. 사실상, IL-4(Th2 반응을 촉진함)로 NOD 마우스를 치료하는 것은 이들 마우스에게서 정상적으로 발생하는 제 1형 당뇨병의 발병을 예방하거나 지연시킨다[참조: Rapoport, M.J. et al.(1993) J. Exp. Med. 178:87-99]. 따라서, 당뇨병을 앓고 있거나 걸리기 쉬운 피검체에서 Th2 반응의 자극은 질병의 효력을 호전시키거나 질병의 발병을 억제시킬 수 있다.
Th2 형 반응이 유리할 수 있는 또 다른 자가면역 질병은 류마티드 관절염(RA)이다. 류마티스 관절염을 앓고 있는 환자는 활액 조직에서 Th1 세포가 우세한 것으로 연구되어 있다[참조: Simon, A.K., et al.,(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8562-8566]. RA를 앓고 있는 환자에게서 Th2 반응을 자극시키므로써 해로운 Th1 반응은 동시에 하향조절되므로써 질병의 효과를 호전시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 자극 방법은 Th2 형 반응이 질병 동안에 유리한 자가면역 질병을 앓고 있거나 걸리기 쉬운 피검체에게서 Th2 관련된 시토카인의 생성을 자극하는 데 사용될 수 있다. 자극 방법은 피검체에게 억제제를 직접 투여하거나 피검체로부터 취해진 세포(예를 들어, Thp, Th1 세포, B 세포, 비림프구 세포)를 생체외 억제제로 생체외 치료한 후 피검체에 세포를 재투여하는 것이 포함될 수 있다. 이 치료법은 Th1 관련된 시토카인에 대한 항체 또는 IL-4 그 자체와 같은 그 밖의 Th2 촉진제를 Th2형 반응을 더 자극하는 데 충분한 양으로 피검체에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
Th2 반응이 바람직한 상기 기재된 자가면역 질병과 대조적으로, 이외의 자가면역 질병이 Th1형 반응에 의해 호전될 수 있다. 이러한 질병은 본 발명의 억제제를 사용하여 치료될 수 있다(상기 암 및 전염병에 대해 기술된 바와 같음). 이 치료법은 Th1 촉진 시토카인(예를 들어, IFN-γ)를 Th1형 반응을 더 자극하기에 충분량으로 피검체에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
자가 면역 질병 치료의 효능은 상기 기재된 사람 질병의 동물 모델(예를 들어, 다발성 경화증의 모델로서 EAE와 당뇨병의 모델로서 NOD 마우스)로 시험하거나 사람 자가면역 질병의 동물 모델로 양호하게 특징화될 수 있다. 이러한 동물 모델은 홍반성 루프스에 대한 모델로서 mr/lpr/lpr 마우스, 류마티스 관절염에 대한 모델로서 뮤린 콜라겐 유도 관절염, 및 뮤린 실험적 중증군무력증이 포함된다[참조: Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856]. 본 발명의 조절(즉, 자극 또는 억제)제는 시험 동물에 투여되고, 이후 시험 동물의 질병 진행은 사용되는 특정 모델에 대한 표준 방법에 의해 모니터한다. 조절제의 효능은 비처리된 동물(또는 대조제로 처리된 동물)과 비교하여 조절제로 처리된 동물의 질병 상태가 호전되므로써 입증된다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 자가면역 성분을 가지는 자가면역 질병 및 질환의 예로는 당뇨병, 관절염(류마티스 관절염, 어린이 류마티스 관절염, 골간절염, 건성성 관절염 포함), 다발성 경화증, 중증근무력증, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토프성 피부염 및 습진성 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군(쇼그렌 증후군에 부수적인 건성 각결막염을 포함), 원형 탈모증, 절지동물의 물림 반응에 의한 알레르기 반응, 크론 질병, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 건성 결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 루푸스, 경피증, 질염, 직장염, 약진, 나병 역전 반응, 나성 결절홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈 뇌척수염, 특발성 양측성 점진적 감각신경성난청, 무형성 빈혈, 적혈구계 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다연골염, 베게너육아종증, 만성활성성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 열대병, 편평 태선, 크론 질병, 그라베스 안병증, 유육종증, 원발 담즙성 간경변증, 포도막염 후유증 및 간질성 폐섬유증이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
E. 이식
이식편 거부 또는 이식편 수용이 이식편 수용자에서의 특정 T 세포 서브셋(즉, Th1 또는 Th2 세포)의 작용에 배타적으로 기여할 수 있는 것은 아니지만(Dallman, M.J.(1995) Curr. Opin. Immunol, 7:632-638), 많은 연구에서는 연장된 이식편 생존에서 우세한 Th2 반응 또는 이식편 거부에서 우세한 Th2 반응이 관련되어 있다. 예를 들어, 이식편 수용은 Th2 시토카인 패턴의 생성과 관련되어 있고/있거나 이식편 거부는 Th1 시토카인 패턴의 생성에 관련되어 있다[참조: Takeuchi, T. et al. (1992) Transplantation 53:1281-1291; Tzakis, A.G. et al.(1994) J. Pediatr. Surg. 29:754-756; Thai, N.L. et al.(1995) Transplantation 59:274-281]. 추가로, Th2 시토카인 표현형을 가지는 세포의 인입전달은 피부 이식편 생존을 연장하고(Maeda, H. et al.(1994) Int. Immunol. 6:855-862), 이식편 대 숙주 질병을 감소시킨다(Fowler, D.H. et al.(1994) Blood 84:3540-3549; Fowler, D.H. et al.(1994) Prog. Clin. Biol. Res. 389:533-540). 또한, Th2 분화를 촉진하는 IL-4의 투여는 심장성 동종이식 생존을 연장하는 반면(Levy, A.E. and Alexander, J.W.(1995) Transplantation 60:405-406), Th1 분화를 촉진하는 안티 IL-10 항체와 결합한 IL-12의 투여는 피부 동종이식 거부를 증대한다[참조: Gorczynski, R.M. et al.(1995) Transplantation 60:1337-1341].
따라서, 본 발명의 자극 방법은 이식 수용자에게서 Th2 관련된 시토카인의 생성을 자극하여 이식편의 생존을 연장시키는 데 사용될 수 있다. 상기 자극 방법은 실질기관 이식과 척수 이식에 모두 사용될 수 있다(예를 들어, 이식편 대 숙주 질병을 억제하기 위해). 상기 자극 방법은 이식 수용자에게 자극제를 직접 투여하거나 피검체로부터 취해진 세포(예를 들어, Thp, Th1 세포, B 세포, 비림프구 세포)를 자극제로 생체외 치료한 후 피검체에 세포를 재투여하는 것이 포함될 수 있다. 이 치료법은 Th1 관련된 시토카인에 대한 항체 또는 IL-4 그 자체와 같은 그 밖의 Th2 촉진제를 Th2형 반응을 더 자극하는 데 충분한 양으로 피검체에게 투여하므로써 증대될 수 있다.
상기 질병 상태에 더하여, 본 발명의 조절제는 또한 그 밖의 목적에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 자극 방법(즉, 자극제를 사용하는 방법)은 이들 시토카인을 상업적으로 생성하기 위해 시험관내에서 Th2 촉진 시토카인(예를 들어, IL-4)의 생성을 촉진할 수 있다(예를 들어, 세포를 시험관내에서 자극제와 접촉시켜 IL-4 생성을 자극할 수 있으며, IL-4는 배양 상층액으로부터 회수되어 필요에 따라 추가 정제되고, 상업용으로 패키징될 수 있다).
또한, 본 발명의 조절 방법은 피검체에게서 가치 있는 항원에 대한 Th1 또는 Th2 반응을 촉진하도록 백신 접종에 적용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조절제는 Th1 반응 또는 Th2 반응에 대한 백신에 대해 면역 반응을 유도하는 보조제로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 가치 있는 항원에 대한 항체 반응을 자극하기 위해(즉, 백신 접종 목적으로), 본 발명의 항원 및 자극제는 Th2 반응이 효과적인 B 세포 헬프를 제공하고 IgG1 생성을 촉진하기 때문에 피검체에 동시투여되어 피검체에서의 항원에 대한 Th2 반응을 촉진할 수 있다. 다르게는, 가치있는 항원의 세포 면역 반응을 촉진하기 위해, 본 발명의 항원 및 억제제는 Th1 반응이 세포 매개된 면역 반응(예를 들어, 지연된 과민성 반응)의 전개를 유리하게 하기 때문에 피검체에 동시투여되어, 피검체에서의 항원에 대한 Th1 반응을 촉진할 수 있다. 가치있는 항원과 조절제는 함께 단일의 약제 조성물로 제형되거나 개별적인 조성물로 제형될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 가치있는 항원과 조절제는 피검체에 동시에 투여된다. 다르게는, 특정 상황에서, 항원을 먼저 투여한 후 조절제를 투여하거나 이 반대로 하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 자연적으로 Th1 반응을 일으키는 항원의 경우, 먼저 항원을 단독으로 투여하여 Th1 반응을 자극한 후, 자극제를 단독으로 또는 항원의 부스트와 함께 함께 투여하여 Th2 반응에 대한 면역 반응으로 이동시키는 것이 유리할 것이다).
IV. Maf 조성물
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 방법에 따라 피검체에 세포 또는 Th1/Th2 발생에 의한 Th2 관련된 시토카인 생성을 조절하는 데 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특정 세포 유형에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열에 작용적으로 결합된 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 조절 서열은 림프성 세포(예를 들어, T 세포 또는 B 세포)에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도한다. 일 구체예에서, 림프성 세포는 T세포이다. T 세포 특이적 조절 요소는 T세포 수용체 유전자의 프로모터 조절 영역과 같이 당해에 공지되어 있다[참조예: Winto and Baltimore(1989) EMBO J. 8:729-733; Leiden, J.M. (1994) Annu. Rev. Immunol. 11:539-570; Hettman, T. and Cohen, A.(1994) Mol. Immunol. 31:315-322; Redondo, J.M. et al.(1991) Mol. Cell. Biol. 11:5671-5680]. T세포 특이적 조절 요소의 또 다른 예로는 CD3 유전자(참조예: Clevers, H. et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8623-8627; Clevers, H.C. et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8156-8160; Georgeopoulos, K. et al.(1988) EMBO J 7:2401-2407), CD4 유전자(참조예: Sawada, S. and Littman, D.R.(1991) Mol. Cell. Biol. 11:5506-5515; Salmon, P. et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739-7743; Hanna, Z. et al.(1994) Mol. Cell. Biol. 14:1084-1094; GenBank accession numbers U01066 and S68043 for human CD4 promoter sequences) 및 CD2 유전자(참조예: Zhumabekov, T. et al.(1995) J. Immunol. Methods 185:133-140)으로부터 유도된 것들이 있다. T세포 수용체 유전자의 프로모터 및 인핸서와 같은 하나 이상의 T 세포 특이적 조절 요소를 포함하는 DNA 단편은 목적하는 영역의 5' 및 3' 말단에 상응하는 올리고누클레오티드 프라이머 및 주형으로서 T세포로부터의 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해서와 같이 표준 분자 생물학 방법에 의해 얻어질 수 있다. T세포 특이적 조절 요소를 포함하는 DNA 단편이 얻어지면, maf 단백질을 코드화하는 dDNA에 작용적으로 결합될 수 있으며(예를 들어, 두개의 DNA단편은 조절 성분이 maf 서열의 5'에 위치되도록 함께 결찰될 수 있다), 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 플라스미드 벡터와 같은 벡터에 도입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 림프성 세포는 B세포이다(즉, 재조합 발현 벡터내에서, maf 패밀리 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열은 조절 서열에 작용적으로 연결되어 B 세포내 특이적으로 maf 패밀리의 발현을 유도한다). B 세포 특이적 조절 성분은 면역글로불린 유전자의 프로모터 조절 영역과 같이 당해 공지되어 있다[참조예: Banerji et al.(1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore(1983) Cell 33:741-748]. B세포 특이적 조절 성분의 또 다른 예로는 CD20(B1) 유전자(참조예: Thevenin, C. et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:5949-5956; Rieckmann, P. et al.(1991) J. Immunol. 147:3994-3999), Fc 엡실론 RIIa 유전자(참조예: Suter, U. et al.(1989) J. Immunol. 143:3087-3092) 및 주요 조직적합성 제 2류 유전자(참조예: Glimcher, L.H. and Kara. C. J.(1992) Annu. Rev. Immunol. 10:13-49; Benoist, C. and Mathis, D.(1990) Annu. Rev. Immunol. 8:681-715)로부터 유도된 것들이 있다. 면역글로불린 유전자의 프로모우터 및 인핸서와 같은 B 세포 특이적 조절 요소를 포함하는 DNA 단편은 목적하는 영역의 5' 및 3' 말단에 상응하는 올리고누클레오티드 프라이머 및 템플레이트로서 B세로포부터의 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해서와 같이 표준 분자 생물학 방법에 의해 얻어질 수 있다. B세포 특이적 조절 요소를 포함하는 DNA 단편이 얻어지면, maf 단백질을 코드화하는 cDNA에 작용적으로 결합될 수 있으며(예를 들어, 두개의 DNA 단편은 조절 성분이 maf 서열의 5'에 위치되도록 함께 결찰될 수 있다), 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 플라스미드 벡터와 같은 벡터에 도입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 조혈성 간 세포에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열에 작용적으로 결합된 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 조혈성 간세포 특이적 조절 요소는 당해 공지되어 있다. 바람직하게는 CD34 유전자로부터 유도된 조절 성분이 사용된다[참조예: Satterthwaite, A.B. et al.(1992) Genomics 12:788-794; Burn, T. C. et al.(1992) Blood 80:3051-3059].
본 발명의 또 다른 일면은 maf 패밀리 단백질을 발현시키는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 세포는 Th2 관련된 시토카인(예를 들어, IL-4)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 또한 피검체에게 투여되어 피검체에서 Th1:Th2 비를 조작하는 수단으로서 피검체에서 Th2 관련된 시토카인을 생성할 수 있다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 서로 바꾸어 사용될 수 있으며, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손에 대해서도 관련된 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해서 후속되는 세대에서 특정의 변화가 발생될 수 있기 때문에, 그러한 후손세포는 사실 모세포와 동일할 수 없을 것이다. 그러나, 이러한 후손세포가 재조합 발현백터를 보유하고 있는 한, 상기 후손세포는 여전히 본 발명에서 사용된 "숙주세포"의 범위내에 포함되는 것으로 사료될 것이다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현벡터가 도입되는 숙주 림프구 세포를 제공한다. 숙주 림프구 세포는 T 세포 또는 B 세포일 수 있다. 본 발명의 숙주 T 세포는, 예를 들어, 시험관내(예, 실시예에 기재된 클론) 배양된 T 세포 클론, 또는 피검체(예, 말초 혈액 T 세포 또는 비장 T 세포)로부터 분리되는 정상적인 T 세포일 수 있다. 시험관내에서 T 세포 클론을 제조하고 배양하거나, T 세포(예, 말초혈액으로부터)를 분리하는 방법이 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, T 세포 특이적 세포 표면 마커(예, CD3) 또는 T 세포(예, CD4 또는 CD8)의 특이적 서브셋에 대한 표면 마커를 결합시키는 mAbs를 사용함에 의한 방법이 공지되어 있다. 재조합 발현백터는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침법, DEAE-덱스트란-중재된 트랜스펙션법, 리포펙션법, 또는 전기영동법을 포함하여, DNA를 포유동물 세포내로 도입시키는 다양한 공지된 트랜스펙션 방법중 한가지 방법에 의해 T 세포내로 도입될 수 있다. 숙주세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시키기에 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)], 및 그밖의 실험 매뉴얼에 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 숙주 림프구 세포는 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현백터가 도입되는 숙주 B 세포이다. B 세포는, 예를 들어, 시험관(예, 실시예에 기재된 M12 세포)내에서 배양된 B 림프종 세포, 또는 피검체(예, 말초혈액 B 세포 또는 비장 B 세포)로부터 분리된 정상적인 B 세포일 수 있다. 다양한 B 림프종 세포주가 본 기술분야에서 입수될 수 있으며, 그러한 세포를 시험관내 배양하는 표준방법이 공지되어 있다. 또한, 정상적인 B 세포(예, 말초혈액으로부터)을 분리하는 표준방법이 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, B 세포 특이적 세포 표면 마커(예, 막 면역글로불린, B7-1, CD20)을 결합시키는 mAbs의 사용에 의한 방법이 공지되어 있다. 재조합 발현벡터는 상기 T 세포에 대한 바와 같이 기재된 표준 방법에 의해 B 세포내로 도입될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현벡터가 도입되는 숙주 조혈성 간세포를 제공한다. 조혈성 간세포는, 예를 들어, 조혈성 간세포 특이적 세포표면 마커, 바람직하게는 CD34를 결합시키는 mAbs의 사용에 의해서 조혈성 간세포를 분리하는 기술분야에 공지된 표준방법으로 피검체(예, 피검체의 말초혈액 또는 골수)로부터 분리될 수 있다(간세포의 분리에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌[Wagner, J.E. et al., 1995, Blood 86: 512-523; Murray, L. et al., 1995, Blood 85; 368-378; Bernardi, A.C. et al., 1995, Science 267: 104-108; Bernstein, I.D. et al., 1994, Blood Cells 20: 15-24; Angelini, A. et al., 1993, Int. J. Artif. Organs 16 Suppl. 5:13-18; Kato, K. and Radburch, A., 1993, Cytometry 14: 384-392; Lebkowski, J.S. et al., 1992, Transplantation 53: 1011-1019; Lebkowski, J. et al., 1993, J. Hematother, 2:339-342]을 참조). 재조합 발현벡터는 상기 T 세포에 대한 바와 같이 기재된 표준방법으로 조혈성 간세포내로 도입될 수 있다.
본 기술분야의 전문가에게는 maf 패밀리 단백질과 관련된 상기된 조성물이 c-Maf 및 작은 maf(예, p18)와 같은 다양하면서도 상이한 maf게 단백질용으로 제조될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
본 발명은 또한 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 트랜스유전자를 지니는 유전자 이식동물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, maf 패밀리 트랜스유전자는 동물의 T 세포에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현된다. maf 패밀리 단백질의 조직 특이적 발현은 트랜스유전자중의 maf 코딩 서열을 특정의 세포형에서 코드화된 단백질을 직접 발현시키는 조절서열에 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 그러한 조직 특이적 조절요소는 기술분야에 공지되어 있으며, 이하 본원에서 상세히 설명된다. maf 패밀리 트랜스유전자의 T 세포 특이적 발현에 바람직한 조절요소는 CD4 프로모터/인핸서이다. 트랜스유전자에 사용되는 바람직한 maf 패밀리 단백질은 c-maf이다. 바람직한 c-maf 트랜스유전자 구조의 개략도를 도 20에 도시한다. 이러한 구조에서, CD4 프로모터/인핸서는 마우스 c-maf 유전자의 제 1 인트론에 작동적으로 결합하고, 이어서, 마우스 c-maf cDNA에 작동적으로 결합한 다음, SV40 폴리아데닐화 서열에 작동적으로 결합한다. 트랜스유전자 동물은 c-maf 트랜스유전자 구조물을 이하 본원에 보다 상세히 기재되는 바와 같은 트랜스유전자 동물을 제조하는 표준방법에 따른 수정된 난모세포내로 미세주입함으로써 제조될 수 있다. T 세포중의 c-maf 단백질을 과다발현하는 c-maf 트랜스유전자 마우스의 표현형은 실시예 17에 상세히 기재되어 있다. 이를 요약하면, 그러한 동물은, 작은 비장 및 흉선, 감소된 수의 이중 포지티브 흉선세포와 단일 포지티브 CD4+ 흉선세포 및 증가된 기본 수준의 혈청 IgE와 같은, IL-4 과다발현 트랜스유전자 마우스와 아주 유사한 표현형을 나타낸다. maf 패밀리 단백질을 발현하는 트랜스유전자 동물은 maf 패밀리 단백질의 활성을 변화시키는 능력에 대하여 시험 화합물을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 maf 패밀리 단백질를 발현하는 트랜스유전자 동물에게 투여될 수 있으며, 트랜스유전자 동물중의 시험 화합물의 효과는 시험 화합물이 존재하는 트랜스유전자 동물의 표현형을 시험 화합물이 부재하는 트랜스유전자 동물과 비교함으로써 측정할 수 있다.
V. NIP45 조성물 및 이를 사용하는 방법
A. 분리된 핵산분자
본 발명의 한가지 관점은 NIP45 또는 그의 단편을 코드화하는 분리된 핵산분자에 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산분자는 서열번호 5에 도시된 누클레오티드 서열을 포함한다. 서열번호 5의 서열은 마우스 NIP45 cDNA에 상응한다. 이러한 cDNA는 5' 비번역된 서열(누클레오티드 1-12) 및 3' 비번역된 서열(누클레오티드 1249-1946) 뿐만 아니라, NIP45 단백질(즉, 누클레오티드 13-1248로부터의 "코딩영역")을 코드화하는 서열을 포함한다. 또한, 핵산분자는 서열번호 5(즉, 누클레오티드 13-1248)의 코딩영역만을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산분자는 단지 일부의 서열번호 5의 코딩영역, 예를 들어, NIP45의 생물학적 활성 부분을 코드화하는 단편을 포함할 수 있다. 용어 "NIP45의 생물학적 활성 부분"은 NF-AT 패밀리 단백질의 RHD와 상호작용하는 능력을 보유하고 있는 NIP45의 부분들을 포함하는 것을 의미한다. NF-AT RHD와 상호작용하는 NIP45의 부분들의 능력은, 예를 들어, NF-AT RHD 융합 단백질을 사용한 시험관내 표준 상호작용 검정법으로 측정할 수 있다. NIP45의 생물학적 활성 부분을 코드화하는 핵산단편은 서열번호 5의 일부를 분리하고, NIP45 단백질 또는 펩티드의 코드화된 부분을 발현(예, 숙주세포내의 재조합 발현에 의해)시키고, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-NF-AT RHD 융합 단백질을 사용하여 NF-AT, 특히 NF-AT RHD와 상호작용하는 단백질의 능력을 검정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 유전암호의 축중에 기인되어 서열번호 5(및 이의 단편)와는 다르며, 그로 인해서 서열번호 5에 의해 암호화된 NIP45 단백질과 동일한 NIP45 단백질을 코드화하는 핵산분자를 포함한다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 서열번호 6에 도시된 아미노산 서열을 지닌 단백질을 코드화하는 누클레오티드서열을 지닌다. 또한, 본 발명은 서열번호 6의 생물학적 활성 부분과 같은 서열번호 6의 일부를 코드화하는 핵산분자를 포함한다.
서열번호 5의 누클레오티드 서열 또는 그의 일부를 지니는 핵산분자는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 기재된 서열 정보를 이용함으로써 분리될 수 있다. 예를 들어, NIP45 cDNA는 서열번호 5 전체 또는 일부를 혼성화 프로브로 이용하고, 표준 혼성화 기술을 이용함으로써 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다[문헌: Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 또한, 서열번호 5 또는 그의 일부를 포함하는 핵산분자는 서열번호 5의 서열을 기준으로 하여 디자인된 올리고누클레오티드 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 세포로부터 분리될 수 있으며(문헌[Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299]의 구아니디늄-티오시아네이트 추출과정에 의해서), cDNA는 역전사효소(미국 매릴랜드 베테스다 소재의 깁코/비알엘(Gibco/BRL)로부터 얻을 수 있는 몰로니 MLV 역전사효소; 또는 미국 플로리다 피츠버그에 소재하는 세이카가쿠 아메리카, 인코포레이티드(Seikagaku America, Inc.)로부터 얻을 수 있는 AMV 역전사효소)를 사용함으로써 제조할 수 있다. PCR증폭을 위한 합성 올리고누클레오티드 프라이머는 서열번호 5에 도시된 누클레오티드 서열을 기준으로 하여 디자인될 수 있다. 본 발명의 핵산은 cDNA 또는 게놈성 DNA를 표준 PCR 증폭 기술에 따른 주형 및 적절한 올리고누클레오티드 프라이머로서 사용함으로써 증폭될 수 있다. 상기와 같이 증폭된 핵산은 적절한 벡터내로 클로닝되고, DNA 서열 분석법에 의해 특정화될 수 있다. 또한, NIP45 누클레오티드 서열에 상응하는 올리고누클레오티드는, 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 사용한 표준 합성기술에 의해 제조될 수 있다.
서열번호 5에 나타낸 NIP45 누클레오티드 서열에 추가하여, 본 기술분야의 전문가라면, NIP45의 아미노산 서열을 변화시키는 DNA 서열 다형체가 군내에 존재할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. NIP45 유전자내의 그러한 유전적 다형체는 자연적인 대립유전자 변이에 기인되어 군내의 개체중에 존재할 수 있다. 이러한 자연적인 대립 유전자 변이는 전형적으로 유전자의 누클레오티드 서열에서 1 내지 5% 변이를 유도한다. 자연적인 대립 유전자 변이의 결과이며 NIP45의 기능활성은 변화시키지 않는 NIP45내의 일부 및 모든 누클레오티드 변이 및 그로 인한 아미노산 다형체가 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 인지된다. 또한, 그밖의 종으로부터의 NIP45 단백질을 코드화하여 서열번호 5의 마우스 서열과는 다르지만 마우스 서열과는 관련이 있는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산분자가 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 마우스 NIP45 cDNA의 자연적인 대립 유전자 변이체 및 사람 및 그밖의 포유동물 유사체에 상응하는 핵산분자가 본원에 기재된 마우스 NIP45 핵산 분자에 대한 그들의 상동성을 기준으로 하여, 정확한 혼성화 조건하에 표준 혼성화 기술에 따라 혼성화 프로브로서 마우스 cDNA 또는 그의 단편을 사용함으로써 분리될 수 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산분자는 정확한 조건하에서 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 혼성화된다. 특정의 구체예에서, 핵산은 적어도 길이에 있어서 15, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 1500이다. 바람직하게는, 정확한 조건하에서 서열번호 5의 서열에 혼성화되는 본 발명의 분리된 핵산분자는 천연 핵산분자에 상응한다. 한가지 구체예에서, 핵산서열은 천연의 사람 NIP45 단백질을 코드화한다. 또 다른 구체예에서, 핵산분자는 마우스 NIP45 단백질과 같은 쥐의 NIP45 단백질을 코드화한다.
군에 존재할 수 있는 NIP45 서열의 천연 대립 유전자 변이체에 추가하여, 본 기술분야의 전문가에게는 돌연변이에 의해 서열번호 5의 누클레오티드 서열내로 변화가 유도되어, NIP45단백질의 기능 활성은 변화시키지 않으면서, 코드화된 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유도할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 누클레오티드 치환은 서열 번호 5의 서열에서 이루어질 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 NIP45의 야생형 서열(예, 서열번호 6의 서열)이 변화되면서, NF-AT RHD와 상호작용하는 기능 또는 유전자 전사를 자극하는데 있어서 NF-AT 및 c-Maf와 공동작용하는 기능과 같은 NIP45의 기능활성은 변화되지 않은 잔기이며, "필수" 아미노산 잔기는 기능활성에 요구된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 NIP45 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 변화된 NIP 단백질을 코드화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 NIP45 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열과는 다르지만 NIP45 활성를 여전히 보유하고 있다. 한가지 구체예에서, 분리된 핵산분자는 서열번호 6의 핵산서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 NF-AT 패밀리 단백질의 RHD와 상호작용하는 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산분자에 의해 코드화된 단백질은 서열번호 6과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다.
두가지의 아미노산 서열(예, 서열번호 6과 그의 돌연변이 형태)의 상동율을 측정하기 위해서는, 서열들을 최적의 비교를 위해 정렬된다(예, 갭이 한 단백질의 서열에 도입되어 다른 단백질과 최적으로 정렬된다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기을 비교한다. 한 서열(예, 서열번호 6)에서의 위치가 다른 서열(예, NIP45의 돌연변이 형태)에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 채워지면, 분자는 그 위치에서 동일한 것이다(즉, 본원에서 아미노산 "상동성"은 아미노산 "동일성"과 동일한 의미를 나타낸다). 두 서열 사이의 상동율은 서열에 의해 공유된 동일한 위치에 대한 수치의 함수이다(즉, %상동성=동일한 위치의 수/ 전체 위치의 수 x 100).
서열번호 6의 단백질과 상동성인 NIP45 단백질을 암호하는 분리된 핵산 분자는 서열번호 5의 누클레오티드 서열내로 하나 이상의 누클레오티드의 치환, 부가, 또는 삭제를 도입함으로써 유도되어, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 삭제가 코드화된 단백질내로 도입될 수 있다. 돌연변이는 부위 유도된 돌연변이 유발 및 PCR 중재된 돌연변이 유발과 같은 표준기술에 의해 서열번호 5내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존성 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 형성된다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 지니는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 의미한다. 유사한 측쇄를 지니는 아미노산 잔기의 패밀리는 기술분야에 정의되어 있으며, 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성측쇄(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 측쇄된 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, NIP45 단백질내의 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄계로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 또한, 또 다른 구체예에서, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의한 바와 같이 NIP45 암호 서열의 전부 또는 일부에 걸쳐 무작위로 도입될 수 있고, 생성되는 돌연변이체는 NF-AT RHD와 상호작용할 수 있는 이들의 능력에 대하여 스크리닝(GST-NF-AT-RHD 융합 단백질을 이용)하여, NF-AT 상호작용 능력을 보유하는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 서열번호 5의 돌연변이 유발후에, 코드화된 돌연변이 단백질은 숙주세포에서 재조합적으로 발현되고, NF-AT와 상호작용하는 돌연변이 단백질의 능력은 시험관내 상호작용검정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 NIP45 단백질(예, 서열번호 6의 돌연변이되거나 절단된 형태)은 방사성 표지되어 GST-NF-AT RHD 융합 단백질과 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 글루타티온-세파로스 비드를 혼합물에 가하여, NIP45-GST-NF-AT RHD 복합체가 형성된 경우에, 그 복합체를 침전시킨다. 비드를 세척하여 비특이적 결합을 제거한 후에, 비드와 결합된 방사성 활성 단백질의 양을 측정하고, 용리액에 유지된 방사성 활성 단백질의 양과 비교하여, NIP45 단백질이 NF-AT의 RHD와 상호작용할 수 있는 지를 측정하였다.
본 발명의 또 다른 관점은 NIP45 mRNA 또는 유전자의 코딩 가닥에 대한 안티센스인 분리된 핵산 분자에 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 전체 NIP45 코딩 가닥에 상보적이거나, 단지 그의 일부에 상보적일 수 있다. 한가지 구체예에서, 안티센스 핵산분자는 누클레오티드 서열 코드화 NIP45의 코딩 가닥의 코딩영역에 대한 안티센스이다(예, 서열번호 5의 전체 코딩영역은 누클레오티드 13-1248을 포함한다). 또 다른 구체예에서, 안티센스 핵산분자는 NIP45를 암호와하는 누클레오티드 서열의 코딩가닥의 비코딩영역에 대한 안티센스이다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 길이에 있어서 적어도 15, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 1500 누클레오티드이다.
본원에 기재된 NIP45를 코드화하는 코딩가닥 서열(예, 서열번호 5)을 참조하면, 본 발명의 안티센스 핵산이 와트슨과 크리크 염기쌍(Watson and Crick)에 따라 설계될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 NIP45 mRNA의 전체 코딩영역에 상보성이거나, 또한, NIP45 mRNA의 코딩 또는 비코딩영역의 단지 일부에 대한 안티센스인 올리고누클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고누클레오티드는 NIP45 mRNA의 번역 개시부위를 둘러싸고 있는 영역에 상보성일 수 있다. 안티센스 올리고누클레오티드는, 예를 들어, 길이에 있어서 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 누클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 기술분야에 공지된 과정을 이용한 화학적 합성법 및 효소결찰 반응에 의해 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예, 안티센스 올리고누클레오티드)은 분자의 생물학적 안정성이 증가되거나 안티센스 및 샌스 핵산, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 사이에 형성된 이중나선의 물리적인 안정성이 증가되도록 설계된 다양한 변형 누클레오티드 또는 천연 누클레오티드를 사용함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝되는 발현백터를 사용함으로써 생물학적으로 생성될 수 있다(즉, 하기에서 상세히 기재되는 바와 같이, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 목적으로 하는 표적 핵산에 대하여 안티센스 배향일 것이다).
또 다른 구체예에서, 본 발명의 안티센스는 리보자임이다. 리보자임은 상보성 영역을 지니는 mRNA와 같은 단일 가닥 핵산을 분해할 수 있는 리보누클레아제 활성을 지니는 촉진성 RNA 분자이다. NIP45 코드화 핵산에 대한 특이성을 지니는 리보자임은 본원에 기재된 NIP45 cDNA의 핵산서열(서열번호 5)을 기준으로 하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 활성부위의 염기서열이 NIP45 코드화된 mRNA에서 분해되는 염기서열에 상보성인 테트라히메나 L-19 IVS RNA(Tetrahymena L-19 IVS RNA)의 유도체가 구성될 수 있다(참조예: 세크(Cech)등의 미국특허 제4,987,071호; 및 세크증의 미국특허 제5,116,742호). 또한, NIP45 mRNA는 RNA 분자의 풀(pool)로부터 특이적 리보누클레아제 활성을 지니는 촉진성 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다[참조예: Bartel, D. and Szostak, J.W.(1993) Science 261: 1411-1418].
본 발명의 또 다른 관점은 NIP45 융합 단백질을 코드화하는 분리된 핵산 분자에 있다. 비-NIP45 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코드화하는 제 2 누클레오티드 서열에 작동적으로 결합된 NIP45 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코드화하는 하나 이상의 제 1 누클레오티드 서열을 포함하는 상기 핵산분자는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. NIP45 융합 단백질은 이하 단락 C에서 상세히 설명된다.
B. 재조합 발현벡터와 숙주세포
본 발명의 또 다른 관점은 NIP45(또는 이의 일부)를 코드화하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 재조합 발현 벡터에 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주세포에서 핵산을 발현시키기에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함한다. 이러한 사항은 재조합 발현벡터가 발현에 이용되는 숙주세포에서 선택된 하나 이상의 조절서열을 포함하며, 여기서, 상기 서열은 발현되는 핵산서열에 작동적으로 결합된다. 재조합 발현벡터내에서, "작동적으로 결합된"은 목적하는 누클레오티드 서열이 누클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)에 결합(예, 벡터가 숙주세포내로 도입되는 경우에 시험관내 전사/번역 시스템 또는 숙주세포내에서)되는 것을 의미한다. 용어 "조절서열"은 프로모터, 증강배열 및 그밖의 조절요소(예, 폴리아데닐화 신호요소)를 포함하는 것을 의미한다. 그러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기재되어 있다. 조절서열은 다양한 형태의 숙주세포에서 누클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열 및 특정의 숙주세포에서만 누클레오티드 서열의 발현을 유도하는 서열(예, 조직 특이적 조절서열)을 포함한다. 본 기술분야의 전문가에게는 발현벡터의 설계가 형질전환되는 숙주세포의 선택 및 요구되는 단백질의 발현수준등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 본 발명의 발현벡터는 숙주세포내로 도입되어, 본원에 기재된 핵산에 의해 코드화된 융합 단백질 또는 펩티드를 포함한 단백질 또는 펩티드(예, NIP45 단백질, NIP45 단백질의 돌연변이형, 및 NIP45 융합 단백질등)을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵세포내에서 NIP45 단백질을 발현시키도록 설계될 수 있다. 예를 들어, NIP45는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아성 세포, 곤충세포(바쿨로바이러스(baculovirus) 발현벡터를 이용) 효모세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주세포는 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acdemic Press, San Diego, CA (1990)]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 재조합 발현벡터는, 예를 들어, T7 프로모터 조절서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
원핵생물에서의 단백질의 발현은 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 유도하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유한 벡터와 함께 이. 콜라이에서 가장 많이 수행된다. 융합 벡터는 다수의 아미노산을 본원에서 코드화된 단백질, 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에 부가한다. 이러한 융합 단백질은 전형적으로 세가지의 작용을 한다: 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키며; 3) 친화성 정제과정에서 리간드로 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 원핵성 분해 부위가 융합 부분 및 재조합 단백질의 접합부에서 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리한 다음 융합 단백질을 정제할 수 있도록 도입된다. 그러한 효소 및 이들의 동족 인식서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시키는 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscotaway, NJ)를 포함한다.
적합한 유도성 비융합 이. 콜라이 발현벡터의 예에는 pTrc[문헌: Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] 및 pET 11d[문헌: Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89]를 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자를 발현시키는 것은 혼성체 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 좌우된다. pET 11d벡터로부터의 표적 유전자를 발현시키는 것은 공동 발현된 바이러스성 RNA 중합효소(T7 gn1)에 의해 중재된 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 좌우된다. 이러한 바이러스성 중합효소는 lacUV5 프로머터의 전사조절하에 T7 gn1 유전자를 보호하는 내재성 λ 프로파아지로부터 숙주 스트레인 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
E. coli에서 재조합 단백질 발현을 최대화하는 한가지 방법은 용량이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시켜 재조합 단백질을 단백질 가수분해 방법으로 분해시키는 것이다[문헌: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]. 또 다른 방법은 발현 벡터내로 삽입되는 핵산의 핵산서열을 변경시켜 각각의 아미노산에 대한 각각의 코돈이 E. coli에 우선적으로 사용된 코돈이 되도록 하는 것이다[문헌: Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118]. 본 발명의 핵산서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술로 수행될 수 있다.
또 다른 구체예에서, NIP45 발현 벡터는 효모 발현벡터이다. 효모 S. 세리비새(S. cerivisae)에서 발현시키기 위한 벡터에는 pYepSec1[문헌: Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6:229-234], pMFa[문헌: Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943], pJRY88[문헌: Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123], 및 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)가 포함된다.
또한, NIP45는 바쿨로바이러스 발현벡터를 사용한 곤충세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충세포(예, Sf9 세포)에서 단백질을 발현시키는데 이용될 수 있는 바쿨로바이러스 벡터에는 pAc계열[문헌: Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 및 pVL 계열[문헌: Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39]이 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현벡터를 사용한 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현벡터의 예에는 pMex-NeoI, pCDM8[문헌: Seed, B., (1987) Nature 329:840] 및 pMT2PC[문헌: Kaufman et al., (1987), EMBO J. 6:187-195]가 포함된다. 포유동물 세포를 사용하는 경우에, 발현 벡터의 조절 기능은 바이러스성 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40(Simian Birus 40)으로부터 유도된다.
또 다른 구체예에서, 재조합 포유동물 발현벡터는 특정의 세포형에서 우선적으로 핵산을 발현시킬 수 있다(예, 조직 특이적 조절 요소는 핵산을 발현시키는데 사용된다). 조직 특이적 조절요소는 공지되어 있다. 이로 한정되는 것은 아니지만 적합한 조직 특이적 프로모터의 예에는 림포이드 특이적 프로모터[문헌: Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275], 특히, T 세포 수용체[문헌: Winoto and Baltiore (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 면역글로불린[문헌: Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33;741-748]의 프로모터, 알부민 프로모터(간 특이적; 문헌[Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277]), 뉴우런 특이적 프로모터(예, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477]), 췌장 특이적 프로모터[문헌: Edlund et al. (1985) Science 230:912-916], 및 유선 특이적 프로모터(예, 유장 프로모터; 미국특허 제4,873,316호 및 유럽출원공보 제264,166호)가 포함된다. 전개적으로 조절된 프로모터는 또한, 예를 들어, 쥐의 hox 프로머터[문헌: Kessel and Gruss (1990) Science 249 : 374-379] 및 α-페토단백질 프로모터[문헌: Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546]를 포함한다.
본 발명은 또한 안티센스 배향으로 발현벡터내로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 NIP45 mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의해)을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열에 작동적으로 결합된다. 다양한 형태의 세포형, 예를 들어, 바이러스성 프로모터 및/또는 증강배열에서 안티센스 RNA 분자의 연속적인 발현을 유도하는 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동적으로 결합된 조절서열이 선택되거나, 안티센스 꿈의 구성적 조직 특이적 또는 세포형 특이적 발현을 유도하는 조절서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현벡터는 안티센스 핵산이 고효능의 재조합 영역의 조절하에 생성되는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약화된 바이러스의 형태일 수 있으며, 고효능 조절영역의 활성은 벡터가 도입되는 세포형에 의해 측정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용한 유전자 발현의 조절에 관해서는 문헌[Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in genetics, Vol. I(1) 1986]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 벡터, 바람직하게는 재조합 발현벡터가 도입되는 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 예를 들어, NIP45 단백질은 E. coli, 곤충세포, 효모 또는 포유동물 세포(예, 챠이니스 햄스터 난소세포(CHO) 또는 COS 세포)와 같은 박테리아성 세포에서 발현될 수 있다. 그밖의 적합한 숙주세포는 기술분야에 공지된 세포이다. 벡터 DNA는 원핵 또는 진핵세포내로 통상의 형질변환 또는 트랜스펙션 기술을 통해 도입될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "트랜스펙션"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침법, DEAE-덱스트란 중재된 트랜스펙션, 리포펙션, 또는 전기영동법을 포함하는 외래 핵산(예, DNA)을 숙주세포내로 도입시키는 기술분야에 공지된 다양한 기술을 의미한다. 숙주세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시키는 적합한 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)] 및 그밖의 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정한 트랜스펙션에 있어서, 사용되는 발현 벡터 및 트랜스펙션 기술에 따라, 세포의 작은 분획이 외래 DNA를 이들의 게놈내로 통합시킬 수 있다. 이러한 통합체를 동정하고 선택하기 위해서는, 선택가능한 마커(예, 항생제에 내성)을 코드화하는 유전자가 일반적으로 목적하는 유전자와 함께 숙주세포내로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커에는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선택가능한 마커를 코드화하는 핵산은 NIP45를 코드화하는 벡터와 동일한 벡터상의 숙주세포내로 도입되거나, 별도의 벡터상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 트랜스펙션된 세포는 약물선택에 의해 동정될 수 있다(예, 선택가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하며, 그밖의 세포는 죽을 것이다).
배양물중의 원핵 또는 진핵 숙주세포와 같은 본 발명의 숙주세포는 NIP45 단백질을 생성(즉, 발현)시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 숙주세포를 사용하여 NIP45 단백질을 생성시키는 방법을 제공한다. 한가지 구체예에서, 이러한 방법은 NIP45가 생성될 때까지 적합한 배지에서 본 발명의 숙주세포(NIP45를 코드화하는 재조합 발현벡터가 도입되는)를 배양함을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 또한 배지 또는 숙주세포로부터 NIP45를 분리함을 포함한다. 이의 본래 형태에서, NIP45 단백질은 특정의 단백질이며, 따라서, 재조합 NIP45 단백질은 재조합 숙주세포내에서 세포내적으로 발현되고, 예를 들어, 숙주세포를 용해시키고 용해물로부터 재조합 NIP45 단백질을 회수함으로써 숙주세포로부터 분리될 수 있다. 또한, 재조합 NIP45 단백질은 이질성 부호의 서열을 단백질의 아미노 말단에 작동적으로 결합시켜 단백질이 숙주세포로부터 분비되게 함으로써 세포외 단백질로서 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 재조합 NIP45 단백질은 세포가 배양되는 배양배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 특정의 숙주세포는 또한 비사람 트랜스유전자 동물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한가지 구체예에서, 본 발명의 숙주세포는 NIP45 코딩 서열이 도입된 배 간세포 또는 수정된 난모세포이다. 그러한 숙주세포는 외생성 NIP45 서열이 게놈내로 도입된 비사람 트랜스유전자 동물, 또는 내인성 NIP45 서열이 변경된 동종 재조합 동물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 그러한 동물은 NIP 45의 기능 및/또는 활성을 연구하여 NIP45 활성의 조절자를 동정하고/거나 평가하는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 NIP45 단백질 또는 NIP45 단백질의 일부를 코드화하는 트랜스유전자를 지닌 세포를 함유하는 비사람 트랜스유전자 동물에 관한 것이다. 본 발명의 트랜스유전자의 또 다른 구체예에서, 트랜스유전자는 내인성 NIP45 단백질을 코드화하는 내인성 유전자를 변경시킨다(예, 내인성 NIP45 유전자가 작동적으로 파괴되거나 "녹아웃"되거나, 내인성 NIP45 유전자의 전사조절 영역이 변경되는 동족성 재조합 동물).
본 발명의 트랜스유전자는, 예를 들어, 미세주입법으로 수정된 난모세포의 웅성 전핵내로 NIP45 코드화 핵산을 도입시키고, 난모세포가 의사임신 자성 양육 동물에서 진화시킴으로써 생성될 수 있다. 서열번호 5의 마우스 NIP45 cDBA 서열은 트랜스유전자로서 비사람 동물(예, 마우스)의 게놈내로 도입될 수 있다. 또한, 사람 NIP45 유전자와 같은 마우스 NIP45 우전자의 포유동물 동족체가 마우스 NIP45 cDNA에 대한 혼성화를 기본으로 하여 분리될 수 있으며, 트랜스유전자로 사용될 수 있다. 인트론성 서열 및 폴리아데닐화 부호는 트랜스유전자에 포함되어 트랜스유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있다. 조직 특이적 조절서열(들)은 NIP45 트랜스유전자에 작동적으로 결합되어 특정세포에 대한 NIP45 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배아조작 및 미세주입을 통해서 트랜스유전자 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 기술분야에서 통상적인 방법이며, 예를 들어, 레더(Leder)등의 미국특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호, 와그너(Wagner)등의 미국특허 제4,873,191호 및 문헌[Hogan, B., Manipulating the mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]에 기재되어 있다. 유사한 방법이 그밖의 트랜스유전자 동물을 생성시키는데 사용된다. 트랜스유전자 동물은 트랜스유전자를 지니는 추가의 동물을 번식시키는데 이용된다. 또한, NIP45를 코드화하는 트랜스유전자를 지니는 트랜스유전자 동물은 다른 트랜스유전자를 지닌 다른 트랜스유전자 동물과 추가로 교배될 수 있다.
동족성 재조합 동물을 생성시키기 위해서, 삭제, 부가 또는 치환이 도입되어 내인성 NIP45 유전자을 변경, 예를 들어 기능적으로 파괴한 NIP45 유전자의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다. NIP45 유전자는 바람직하게는 마우스 NIP45 유전자이다. 예를 들어, 마우스 NIP45 유전자는 프로브로서 서열번호 5의 마우스 NIP45 cDNA를 사용함으로써 마우스 게놈성 DNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 마우스 NIP45 유전자는 마우스 게놈중의 내인성 NIP45 유전자를 변경시키기에 적합한 동족성 재조합 벡터를 구성시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 동족성 재조합시에 내인성 NIP45 유전자가 기능적으로 파괴되도록 설계된다(즉, 기능성 단백질을 더 이상 코드화하지 않음; "녹아웃" 벡터라 일컬어짐). 또한, 벡터는 동족성 재조합시에 내인성 NIP45 유전자가 돌연변이되거나 달리 변경되지만 기능성 단백질을 여전히 코드화하도록 설계될 수 있다(예, 상부 조절영역이 변경되어 내인성 NIP45 단백질의 발현을 변경한다). 동족성 재조합 벡터에서, NIP45 유전자의 변경된 부분은 NIP45 유전자의 추가 핵산에 의해 5' 및 3' 말단에서 우회되어 동족성 재조합이 배아간세포중의 내인성 NIP45아 벡터에 의해 지지된 내인성 NIP45 유전자 사이에 발생되게 한다. 추가의 우회 NIP45 핵산은 내인성 유전자로 동족성 재조합을 가능하게 하기에 충분한 길이이다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 우회 DNA(5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다[문헌: Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987)Cell 51:503 for a description of homologous recombination vector]. 벡터는 배아성 간세포주(예, 전기영동에 의해)내로 도입되고, 도입된 NIP45 유전자가 내인성 NIP45 유전자로 동족성으로 재조합되는 세포가 선택된다[문헌: Li, E. et al. (1992) Cell 69:915]. 선택된 세포는 이어서 동물(예, 마우스)의 배아세포내로 주입되어 응집 키메라를 형성한다[문헌: Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practice Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987)pp. 113-152]. 키메라 배아는 이어서 적합한 의사임신 자성 양육 동물내로 이식되어 유지된다. 후손의 검(germ) 세포에서 동족성으로 재조합된 DNA을 보호하는 후손은 동물의 모든 세포가 트랜스유전자의 검 세포주 전달에 의해 동족성 재조합 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 이용될 수 있다. 동족성 재조합 벡터와 동족성 재조합 동물을 구성시키는 방법은 문헌[Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829] 및 모우엘렉(Mouellec)등의 PCT 국제특허공보 WO 90/11354호; 스미티에스(Smithies)등의 WO 91/01140호; 지즐스트라(Zijlatra)등의 WO 92/0968호; 및 번스(Berns)등의 WO 93/04169호에 기재되어 있다.
C. 분리된 NIP45 단백질 및 항-NIP45 항체
본 발명의 또 다른 관점은 항-NIP45 단백질을 유도하는 면역원으로서 적합한 펩티드 단편 뿐만 아니라 생물학적 활성 단백질과 같은 분리된 NIP45 단백질 및 그의 일부에 관한 것이다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 분리된 NIP45 단백질 제제를 제공한다. 바람직하게는, NIP45 단백질은 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, NIP45 단백질은 서열번호 6과 실질적으로 상동성이며, 서열번호 6의 단백질의 기능활성을 지니지만, 자연적인 대립유전자 변이 또는 돌연변이에 기인되어 아미노산 서열에서 상이하거나, 상기 단락 A에서 상세하게 기재된 바와 같은 서열 번호 6의 단백질의 포유동물 동족체(사람 동족체)이다. 따라서, 또 다른 구체예에서, NIP45 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열에 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이며, NF-AT 패밀리 단백질의 RHD와 상호작용한다. 바람직하게는, 단백질은 서열번호 6에 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다.
다른 구체예에서, 본 발명은 분리된 NIP45 단백질의 일부를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 NF-AT와 상호작용하는 NIP45 단백질의 일부를 포함한다. 실시예에서 입증된 바와 같이, NIP45 단백질은 NF-AT의 RHD와 상호작용한다. 시험관내 상호작용 검정(단락 A에 기재된 바와 같이 GST-NF-AT RHD 융합 단백질을 사용)은 NF-AT Rel 상동성 도메인과 상호작용하는 NIP45 단백질의 능력을 측정하여 NF-AT와 상호작용하는 펩티드 단편을 동정하는데 사용될 수 있다.
NIP45 단백질은 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 예를 들어, 단백질을 코드화하는 핵산은 발현벡터내로 클로닝(상기된 바와 같이)되고, 발현벡터는 숙주세포내로 도입(상기된 바와 같이)되며, NIP45 단백질은 숙주세포에서 발현된다. NIP45 단백질은 이어서 표준 단백질 정제 기술을 사용한 적절한 정제방식에 의해 세포로부터 분리될 수 있다. 재조합 발현에 추가하여, NIP45 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성기술을 사용함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 본래의 NIP45 단백질은, 예를 들어, 항-NIP45 항체를 사용한 면역침전법에 의해 세포(예, T 세포)로부터 분리될 수 있다.
본 발명은 또한 NIP45 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, NIP45 "융합 단백질"은 비-NIP45 폴리펩티드에 작동적으로 결합된 NIP45 폴리펩티드를 포함한다. "NIP45 폴리펩티드"는 NIP45 단백질 또는 이의 펩티드 단편에 상응하는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 나타내며, "비-NIP45 폴리펩티드"는 또 다른 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 나타낸다. 융합 단백질내에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 NIP45 폴리펩티드와 비-NIP45 폴리펩티드가 서로 프래임에 융합되는 것을 의미한다. 비-NIP45 폴리펩티드는 NIP45 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 예를 들어, 한가지 구체예에서, 융합 단백질은 NIP45 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합되는 GST-NIP45 융합 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 NIP45 누클레오티드 서열이 pCEP4-HA 벡터내로 삽입되어[문헌:Herrscher, R.F. et al. (1995) Genes Dev. 9:3067-3082], NIP45 서열이 프래임에서 인플루엔자 적혈구 응집소 에피토프 tag에 융합되는 NIP45-HA 융합 단백질이다. 본 발명의 이러한 융합 단백질은 재조합 NIP45의 정제를 촉진한다.
바람직하게는, 본 발명의 NIP45 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은, 예를 들어, 결찰, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소분해, 적절한 유착성 말단의 충전, 바람직하지 않은 결합을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소 결찰을 위한 블런트(blunt) 말단되거나 스테거(stagger) 말단된 말단을 사용하는 통상의 기술에 따라 프래임에서 함께 결찰된다. 또 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함한 통상의 기술에 의해 합성될 수 있다. 또한, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 생성하도록 어닐링되고 재증폭될 수 있는 두 개의 구성 유전자 단편 사이에서 상보성 오버행을 유도하는 앵커 프라이머를 사용함으로써 수행될 수 있다[문헌: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992]. 또한, 이미 융합 부분(예, GST 폴리펩티드 또는 HA 에피토프 tag)을 코드화하는 많은 발현벡터가 시판되고 있다. NIP45 코드화 핵산은 그러한 발현벡터내로 클로닝되어 융합 부분이 프래임내에서 NIP45 단백질에 결합되게 할 수 있다.
분리된 NIP45 단백질 또는 그의 단편은 면역원으로 사용되어 폴리클론성 및 단클론성 항체 제제를 위한 표준 기술을 사용함으로써 NIP45를 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다. NIP45 단백질이 항체를 생성시키는데 사용되거나, 또한, NIP45의 항원 펩티드 단편이 면역원으로 사용될 수 있다. NIP45의 항원 펩티드 단편은 전형적으로 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열의 8 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, NIP45의 에피토프를 둘러싸서 펩티드에 대해 생성된 항체가 NIP45와의 특이적 면역 복합체를 형성하게 한다. 바람직하게는, 항원 펩티드는 10 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 15 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 20 이상의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 30 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 항원성 펩티드에 의해 둘러싸이는 바람직한 에피토프는 단백질, 예를 들어, 친수성 영역의 표면상에 위치하는 NIP45의 영역이다. 서열번호 6의 NIP45 단백질 서열의 소수성 분석결과가 표 12에 도시되어 있다.
NIP45 면역원은 전형적으로 면역원으로 적합한 피검체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그밖의 포유동물)를 면역시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어, 재조합적으로 발현된 NIP45 단백질 또는 화학적으로 합성된 NIP45 펩티드를 함유할 수 있다. 제제는 또한 프런드(Freund)의 완전 또는 불완전 보조제, 또는 유사한 면역 자극성 제제와 같은 보조제를 포함한다. 면역원성 NIP45 제제로 적합한 피검체를 면역시키는 것은 폴리클론성 항-NIP 항체 반응을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 항-NIP45 항체에 관한 것이다. 폴리클론성 항-NIP45 항체는 상기된 바와 같이 적합한 피검체를 NIP45 면역원으로 면역시킴으로써 제조될 수 있다. 면역된 피검체에서의 항-NIP45 항체 역가는 면역된 NIP45를 사용한 효소 결합된 면역흡착검정법(ELISA)에 의한 바와 같은 표준 기술로 시간별로 모니터링될 수 있다. 요구되는 경우, NIP45에 대하여 유도된 항체분자는 포유동물로부터 분리되고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 공지된 기술로 정제하여, HgG 분획을 얻을 수 있다. 면역시킨 후에 적절한 시간에, 예를 들어, 항-NIP45 항체 역가가 최고에 달하는 경우에, 항체 생성 세포를 피검체로부터 얻어, 문헌[Kohler and Milstein(1975, Nature 256:495-497), and Brown et al. (1981) J. Immunol 127;539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; and Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75]에 기재된 하이브리도마 기술, 보다 최근의 사람 B 세포 하이브리도마 기술[문헌: Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72], EBV-하이브리도마 기술[문헌: Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술로 단클론성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 단클론성 항체 하이브리도마를 생성시키는 기술은 공지되어 있다[문헌: R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York(1980); E.A. Lerner(1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36]. 요약하면, 죽지않는 세포주(전형적으로 미엘로마)는 상기된 바와 같은 NIP45 면역원으로 면역된 포유동물로부터의 림프구(전형적으로 비장세포)에 융합되고, 생성되는 하이브리도마 세포의 배양 상등물을 스크리닝하여, NIP45를 결합시키는 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 동정한다.
림프구와 불멸화된 세포주를 융합시키는데 사용된 많은 공지된 어떠한 원안이 항-NIP45 단클론성 항체를 생성시킬 목적으로 적용될 수 있다[문헌: G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet.; Lerner, Yale J. Biol. Med.; Kenneth, Monoclonal Antibodies]. 또한, 본 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게는 유용할 수 있는 많은 변화된 방법이 있다는 것이 자명할 것이다. 전형적으로, 불멸 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물종으로부터 유도된다. 예를 들어, 쥐과동물 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제조물로 면역시킨 마우스로부터의 림프구를 불멸화된 마우스 세포주와 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직한 불멸 세포주는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배지("HAT 배지")에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 많은 골수종 세포주 중 임의의 세포주, 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주가 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 사용된다. 이들 골수종 세포주는 매릴랜드 록스빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 입수할 수 있다. 전형적으로, HAT-민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 비장 세포에 융합된다. 그다음, 융합으로부터 생성되는 하이브리도마 세포가 융합되지 않거나 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는 HAT 배지를 사용하여 선택된다 (융합되지 않은 비장 세포는 이들이 형질전환되지 않기 때문에 수일 후에 사멸된다). 본 발명의 단클론성 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포는 예를 들어 표준 ELISA 검정을 사용하여, NIP45에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝시킴으로써 검출된다.
단클론성 항체 분비 하이브리도마를 제조하는 것 대신에, 단클론성 항-NIP45 항체는 재조합적 조합 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 NIP45로 스크리닝시켜서 NIP45에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 멤버를 단리시킴으로써 확인되고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 발생시키고 스크리닝시키기 위한 킷은 시판용이다 [참조예 : the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPTMPhage Display Kit, Catalog No. 240612]. 부가적으로, 항체 디스플레이 라이브러리를 발생시키고 스크리닝시키는 데에 사용하기 위해 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어 하기 특허 공보에 기술되어 있다 :
부가적으로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있는, 인간 및 비인간 부분 둘 모두를 포함하는 키메라 및 인간화 단클론성 항체와 같은 재조합 항-NIP45가 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 키메라 및 인간화 단클론성 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 하기 특허 공보에 기술된 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다 :
항-NIP45 항체(예를 들어, 단클론성 항체)는 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 NIP45를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 항-NIP 항체는 세포로부터의 천연 NIP45의 정제, 및 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 NIP45의 정제를 촉진시킬 수 있다. 검출은 항체를 검출성 물질에 결합(즉, 물리적 결합)시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출 물질의 예로는 다양한 효소, 보결 원자단, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질이 있다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린스테라아제가 있고; 적합한 보결 원자단 착물의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있고; 적합한 형광물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로티아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광물질의 예로는 루미놀이 있으며; 적합한 방사성 물질의 예로는125I,131I,35S 또는3H가 있다.
D. 약제 조성물
본 발명의 NIP 단백질 및 항-NIP45 항체는 투여에 적합한 조성물 중에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 단백질 또는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것이 전형적이다. 본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여물과 양립할 수 있는, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항박테리아제, 항균제, 등장성 및 흡수성 디스플레이 작용제 등을 포함하는 것을 의미한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 조성물 중의 이들 매질 작용제의 사용이 고려된다. 부수적 활성 화합물이 또한 조성물 중에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 이것의 예정된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 예를 들어, 비 경우, 경피 또는 피하 투여용으로 사용되는 용액 또는 현탁액은 주사용 물, 식염 용액, 비휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 살균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 중황산 나트륨과 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 긴장 조절제를 포함할 수 있다. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기에 의해 조절될 수 있다. 비경구용 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조한 앰풀, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알 중에 함유될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제 조성물은 살균 수용액(수용성) 또는 분산액, 및 살균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조물용 살균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체로는 생리학적 식염, 세균 발육 저지용 물, 크레모포르(Cremophor) ELTM(뉴저지 패리시패니의 BASF) 또는 포스페이트 완충 식염(PBS)가 있다. 모든 경우에, 조성물은 살균되어야 하고, 주시로부터 용이하게 배출될 정도로 유동성이 있어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담테는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액제 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 피복제를 사용함으로써, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 바람직한 유동성이 유지된다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알코올 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테라레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 유발시킬 수 있다.
살균성 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합물을 갖는 적합한 용매 중에 활성 화합물(예를 들어, NIP45 단백질 또는 항-NIP 항체)를 필요한 양으로 혼입시킨 후, 살균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분들과는 상이한 필요한 성분을 함유하는 살균 비히클 중에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 살균 주사 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 활성 성분의 분말, 및 사전에 살균 여과시킨 이들의 용액을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구용 조성물은 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함하는 것이 일반적이다. 경구 치료용 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한 구강세척제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기에서 유체 담체 중의 화합물은 경구 투여되고, 스위싱되고, 가래로 나오거나, 삼키게 된다. 약제학적으로 양립할 수 있는 결합제 및/또는 보조물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 미소결정 셀룰로오스, 트래거캔스 고무 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 분해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와같은 글리던트; 슈크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 조미료와 같은 풍미제 중 임의의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다.
하나의 양태에서, 활성 성분은 삽입물 또는 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하여, 제어 방출 제형과 같은 체내로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 방법은 당업자들에게는 명백해질 것이다. 재료는 또한, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티컬즈, 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 입수할 수 있다. 리포조옴 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론성 항체로 감염된 세포에 대해 표적화된 리포조옴을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국 특허 제 4,552,811호에 기술되어 있는 바와 같은, 당업자들에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
E. NIP45 활성을 검출하는 방법
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 다양한 NIP45 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 생물학적 샘플에서 NIP45 단백질 또는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 생물학적 샘플을 NIP45 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 작용제와 접촉시켜서, 생물학적 샘플에서 NIP45 단백질 또는 mRNA의 존재가 검출되게 하는 것을 포함한다. NIP45 단백질 또는 mRNA를 검출하기 위한 바람직한 작용제는 NIP45 mRNA에 혼성될 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 핵산 프로브는 예를 들어 길이상 누클레오티드가 15개 이상, 30개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상 또는 1000개 이상이고, 엄격한 조건하에 NIP45 mRNA에 특이적으로 혼성되기에 충분한 올리고누클레오티드와 같은 SEQ ID NO:5의 NIP45 cDNA 또는 이것의 일부일 수 있다. NIP45 단백질을 검출하기 위한 바람직한 작용제는 NIP45에 결합할 수 잇는 표지된 항체이다. 온전한 항체, 또는 이것의 단편(예를 들어 Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 표현 "표지된"은 프로브 또는 항체에 대해, 검출 물질을 프로브 또는 항체에 결합(즉, 물리적 결합)시킴에 의한 프로브 또는 항체의 직접 표지화, 및 직접 표지화되는 또다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 표지화를 포함하는 것을 의미한다. 간접 표지화의 예로는, 형광 표지된 이차 항체를 사용하는 일차 항체의 검출 및 형과 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있을 정도의 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단 표지화가 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 조직, 세포 및 생물학적 유체를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, NIP45 mRNA의 검출 기술은 노던 혼성화 및 원위치 혼성화를 포함한다. NIP45 단백질을 검출하는 기술은 효소 결합 면역흡수 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다.
VI. 조합 조성물 및 킷
변조제의 조합물을 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, Th2-관련 시토카인을 조절하는 전사 인자를 코드화시키는 2종 이상의 누클레오티드 서열이 재조합 발현 벡터에 혼입되고 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 본 발명은 재조합 인자, 및 이러한 인자가 도입되고, NF-AT 패밀리 단백질과 공동작용하여 Th2-관련 시토카인 유전자를 조절하는 제 1 전사 인자를 코드화시키는 제 1 누클레오티드 서열 및 Th2-관련 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 제 2 전사 인자를 코드화시키는 제 2 누클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 제 1 누클레오티드 서열은 maf 패밀리 단백질(예를 들어, Maf) 또는 NF-AT-상호작용 단백질(예를 들어, NIP45)을 코드화시킨다. 바람직하게는 제 2 누클레오티드 서열은 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT-상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 전사 인자를 코드화시킨다.
Th2-관련 시토카인 생성 또는 Th1/Th2 서브세트 발달을 변조시키는 킷이 또한 본 발명에 포함된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 킷은 변조제를 사용하여 Th2-관련 시토카인 생성 또는 Th1/Th2 서브세트 발달을 변조시키기 위한 변조제를 사용하기 위해 지시에 따라 포장된 본 발명의 1종 이상의 변조제를 포함한다. 하나의 양태에서, 킷은 Th2-관련 시토카인 생성 또는 상향 조절 Th2 서브세트 발달(또는 하향 조절 Th1 서브세트 발달)을 자극하는 데에 사용하기 위한 1종 이상의 자극제를 포함한다. 또 다른 양태에서, 킷은 Th2-관련 시토카인 생성 또는 하향 조절 Th2 서브세트 발달(또는 상향 조절 Th1 서브세트 발달)을 억제하는 데에 사용하기 위한 1종 이상의 억제제를 포함한다. 본 발명의 2종 이상의 변조제(예를 들어, 자극제 또는 억제제)를 포함하는 조합 킷이 또한 제공된다.
VII. 스크리닝 검정
본 발명의 또 다른 양태는 Th2-관련 시토카인 유전자의 발현을 변조하는 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 검정을 포함한다. 다양한 양태에서, 이들 스크리닝 검정은 예를 들어 전사 인자의 발현 또는 작용 활성을 변조시키는 화합물, 전사 인자와 상호작용하는 단백질, 및 이들 단백질-단백질 상호작용을 변조시키는 화합물, 및 전사 인자와 Th2-관련 시토카인 유전자 내의 시스-작용 표적 부위(예를 들어, MARE)의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 활성화된 T 세포(NF-AT) 패밀리 단백질의 핵 인자와 공동작용하여 Th2-관련 시토카인 유전자를 조절하는 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은,
NFAT 패밀리 단백질과 공동작용하여 Th2-관련 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 활성을 갖는 지시제 조성물을 제공하는 단계;
지시제 조성물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
지시제 조성물 중의 전사 인자의 활성에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하여, NFAT 패밀리 단백질과 공동작용하여 Th2-관련 시토카인 유전자의 발현을 하는 전사 인자의 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
전사 인자는 예를 들어, c-Maf 또는 작은 maf 단백질(예를 들어, p18)과 같은 maf 패밀리 단백질일 수 있다. 대안적으로, 전사 인자는 NIP45와 같은 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용하는 인자일 수 있다.
지시제 조성물은 세포 비함유 조성물이거나, 세포 조성물일 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 지시제 조성물은 Th2 세포와 같은 림프성 세포이다.
바람직한 양태에서, 지시제 조성물은 (i) 전사 인자 및 (ii) 전사 인자에 반응성인 수용체 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 지시제 세포는,
i) 전사 인자를 코드화시키는 재조합 발현 벡터; 및
ii) 수용체 유전자와 조작으로 결합된 Th2-관련 시토카인 유전자의 조절 서열을 포함하는 벡터를 함유하며,
상기 방법은,
a) 지시제 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
b) 시험 화합물의 존재하에 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 시험 화합물의 존재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준을 시험 화합물의 부재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준과 비교하여, 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 지시제 조성물은 (i) 전사 인자 및 (ii) 전사 인자가 결합하는 DNA 분자의 제조물을 포함하며, 상기 방법은,
a) 지시제 조성물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
b) 시험 화합물의 존재하에 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용의 정도를 측정하는 단계; 및
c) 시험 화합물의 존재하의 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용 정도를 시험 화합물의 부재하의 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용 정도와 비교하여, 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 하나의 양태에서, 전사 인자는 maf 패밀리 단백질이고, DNA 분자는 maf 반응 요소(MARE)이다.
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 전사 인자와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 확인한다. 이러한 양태에서,
지시제 조성물은, i) 전사 조절 서열에 작동적으로 결합된 수용체 유전자; 및
ii) NFAT 패밀리 단백질과 공동작용하여 Th2-관련 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자를 포함하는 제 1 융합 단백질을 코드화시키는 제 1 키메라 유전자를 포함하는 지시제 세포이며;
시험 화합물은 Th2 세포로부터 유도되는 단백질을 포함하는 제 2 융합 단백질을 코드화시키는, 제 2 키메라 유전자의 라이브러리를 포함하고;
수용체 유전자의 발현은 제 1 융합 단백질, 제 2 융합 단백질 및 전사 조절 서열 사이의 상호작용에 민감하며;
지시제 조성물 중의 전사 인자에 대한 시험 화합물의 효과는 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준을 측정하여 전사 인자와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 포함하는 시험 화합물을 확인함으로써 측정된다.
본 발명은 또한, NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에, (i) NIP45, 또는 이것의 NF-AT-상호작용 부분; 및 NF-AT 패밀리 단백질, 및 이것의 NIP45 상호작용 부분을 조합시키는 단계;
b) 시험 화합물의 존재 및 부재하에 (i)과 (ii) 사이의 상호작용 정도를 측정하는 단계; 및
c) NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 NF-AT 패밀리 단백질의 NIP45-상호작용 부분은 NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, (i)과 (ii) 사이의 상호작용 정도는 (i) 또는 (ii)를 검출 물질로 표지시키고, 비표지 (i) 또는 (ii)를 단리시키고, 비표지 (i) 또는 (ii)와 관련되게 되는 표지된 (i) 또는 (ii)의양을 정량화시킴으로써 측정된다. 상기 방법은 NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 검정의 하나의 바람직한 양태에서, 시험 화합물이 관심있는 전사 인자의 활성을 변조시키는 것으로 확인되면, 면역 반응에 대한 시험 화합물의 효과가 시험된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 면역 반응에 대한 화합물의 효과를 측정하여, 면역 반응을 변조시키는 화합물을 확인하는 것을 포함한다. 하나의 양태에서, 면역 반응에 대한 화합물의 효과는 인터로이킨-4 유전자와 같은 Th2-관련 시토카인 유전자의 발현에 대한 화합물의 효과를 측정함으로써 측정된다. 또 다른 양태에서, 면역 반응에 대한 관심있는 화합물의 효과는 T 헬퍼 타입 1(Th1) 또는 T 헬퍼 타입 2(Th2)의 발달에 대한 화합물의 효과를 측정함으로써 측정된다.
지시제 세포 중의 전사 인자의 발현을 위해 사용될 수 있는 재조합 발명 벡터는 당분야에 공지되어 있다 (상기 설명 및 또한 실시예 참조). 하나의 양태에서, 발현 벡터 내에서, 전사 인자 코드화 서열은 지시제 세포 중의 전사 인자의 구조적 발현을 제공하는 조절 서열(에를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서와 같은 바이러스성 조절 서열이 사용될 수 있음)에 작동적으로 결합된다. 지시제 세포 중의 전사 인자의 구조적 발현을 제공하는 재조합 발현 벡터의 사용이 전사 인자의 활성을 향상시키거나 억제하는 화합물의 확인을 위해 바람직하다. 대안적 양태에서, 발현 벡터 내에서, 전사 인자 코드화 서열은 상응하는 내인성 전사 인자 유전자의 조절 서열(예를 들어, 내인성 유전자로부터 유도된 프로모터 조절 서열 영역)에 작동적으로 결합된다. 내인성 조절 서열에 의해 전사 인자 발현을 조절하는 재조합 발현 벡터의 사용이 전사 인자의 전사적 발현을 향상시키거나 억제하는 화합물의 확인을 위해 바람직하다.
Th2-관련 시토카인 유전자를 사용하는 방법에서, 바람직하게는, Th2-관련 시토카인은 인터로이킨-4이다. Th2-특이적 유도성 IL-4 발현은 Th2 세포 중의 근위 IL-4 프로모터의 157bp 만큼 작은 정도 까지만 이루어질 수 있음이 이미 공지되어 있다 [참조 : Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405]. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 근위 IL-4 프로모터의 상기 영역, 가장 바람직하게는 IL-4 프로모터의 누클레오티드 -157 내지 +58(+1에서의 전사의 출발 부위에 대해)을 함유하는 수용체 유전자 구성물을 사용한다. 대안적으로, 더 강한 수용체 유전자 발현은 약 3kb의 업스트림 조절 서열과 같은 IL-4 업스트림 조절 영역의 더 긴 부분을 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 수용체 유전자 구성물은 문헌[Todd, M. et al. (1993) J. Exp. Med 177:1663-1674]에 기술되어 있다 [IL-4 수용체 유전자 구성물의 설명을 위한 실시예 참조].
다양한 수용체 유전자는 당분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 스크리닝 검정에 사용하기에 적합한다. 적하한 수용체 유전자의 예로는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파라아제 또는 루시퍼라아제를 코드화시키는 유전자가 있다. 이들 유전자 생성물의 활성을 측정하기 위한 표준 방법은 당분야에 공지되어 있다.
다양한 세포 타입이 스크리닝 검정에서 지시제 세포로서 사용하기에 적합하다. 바람직하게는, B 세포(예를 들어, M12 B 림프종 세포주) 또는 Th1 세포 클론(예를 들어 AE7 세포)와 같은, cMaf를 발현시키지 않는 세포주가 사용된다. HepG2 간종양 세포주와 같은 비림프종 세포주가 또한 지시제 세포로서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 시험 화합물의 존재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준은 시험 화합물의 부재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준보다 높고, 시험 화합물은 전사 인자의 발현 또는 활성을 자극하는 화합물로서 확인되었다. 또 다른 양태에서, 시험 화합물의 존재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준은 시험 화합물의 부재하의 지시제 세포 중의 수용체 유전자의 발현 수준보다 낮고, 시험 화합물은 전사 인자의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물로서 확인되었다.
수용체 유전자 구성물의 사용에 대한 대안으로서, 전사 인자의 발현 또는 활성을 변조시키는 화합물이 다른 "판독(read out)"을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 지시제 세포는 시험 화합물의 존재 및 부재하에 인큐베이팅된 전사 인자 발현 벡터로 형질감염될 수 있으며, Th2-관련 시토카인 생성은 배양물 상등액 내에서 지시제 세포 또는 시토카인 분비물(즉, IL-4 분비물) 중에서 시토카인 mRNA(예를 들어, IL-4 mRNA)를 검출시킴으로써 평가될 수 있다. 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 시토카인 mRNA를 검출하는 표준 방법이 당분야에 공지되어 있다. 효소 결합 면역흡수 검정(ELISA)과 같은, 배양물 상등액 중에서 시토카인 단백질을 검출하는 방법이 또한 당분야에 공지되어 있다. 시토카인 mRNA 및/또는 단백질을 검출하기 위한 방법의 추가의 설명은 실시예에 기술되어 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 관심있는 전사 인자, 예를 들어 c-Maf 또는 NF-AT 또는 NIP45와 상호작용하는 단백질(예를 들어, Th2 세포 중의 단백질)을 확인하기 위한 스크리닝 검정을 제공한다. 이들 검정은 당분야에 공지된 2-혼성체 검정 시스템(또한 상호작용 트랩 검정으로서 언급됨)을 기초로 설계될 수 있다 [참조예 : Field U.S. Patent No. 5,283,173; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696]. 2-혼성체 검정은 특정 표적 단백질과 상호작용하는 단백질을 확인하기 위해 사용하는 것이 일반적이다. 검정은 유전자 융합을 사용하여 작용성 전사 활성화제를 재구성하기 위해 상호작용할 수 있는 단백질을 확인한다. 전사 활성화제는 DNA-결합 도메인 및 전사 활성화 도메인으로 구성되며, 여기에서 2개의 도메인은 모두 표적 서열(예를 들어, GAL4에 대한 업스트림 활성화제 서열(UAS))로부터 다운스트림에 있는 유전자의 전사를 활성화시키는 데에 필요하다. 표적 "bait" 단백질을 코드화시키는 DNA 서열이 이들 도메인 중 어느 하나에 융합되고, DNA 서열의 라이브러리는 나머지 도메인에 융합된다. 표적 융합 단백질(예를 들어, 표적 GAL4 단백질(예를 들어, 표적 GAL4-융합 "bait")에 결합할 수 있는 "fish" 융합 단백질(융합 라이브러리로부터 발생됨)은 2개의 도메인(DNA-결합 도메인 및 전사 활성화 도메인)을 충분히 가깝게 접근시켜서 표적 서열로부터 다운스트림에 삽입된 수용체 유전자의 전사를 활성화시키는 것이 일반적일 것이다. 따라서, "fish" 단백질은 작용성 전사 활성화제(예를 들어, 작용성 GAL4 트랜스 활성화제)를 재구성하는 능력에 의해 확인될 수 있다.
이러한 일반적 2-혼성체 시스템은 표적 c-Maf 단백질(예를 들어, "bAit"로서 c-Maf/GAL4 결합 도메인 융합) 및 "fish" 융합 단백질의 cDNA 라이브러리(예를 들어, cDNA/GAL4 활성화 도메인 라이브러리)의 구성에 의해 c-Maf와 상호작용하는 (또는, 유사한 방법을 사용하여, 관심있는 다른 전사 인자와 상호작용하는) Th2 세포 중의 단백질을 확인하는 데에 적용될 수 있으며, 여기에서 cDNA 라이브러리는 Th2 세포의 mRNA로부터, 이들 구성물을 c-Maf에 반응성인 조절 서열(예를 들어, MARE 서열, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 IL-4 프로모터의 영역)에 결합된 수용체 유전자 구성물을 함유하는 숙주 세포 내에 도입시킴으로써 제조된다. cMaf와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 코드화시키는 cDNA는 수용체 유전자 구성물의 트랜스 활성화에 근거하여 확인될 수 있다.
대안적으로, 문헌[Sieweke, M.H. et al. (1996) Cell 85:49-60]에 기술된 것과 같은 "단일 혼성체" 검정이 사용되어, c-Maf와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 확인할 수 있다. 상기 검점은 상기 기술된 2-혼성체 시스템의 변형된 시스템이다. 상기 시스템에서, "bAit"는 트랜스 활성화 도메인이 제거된 전사 인자(예를 들어, 아미노-말단 트랜스 활성화 도메인이 제거된 cMaf)이고, "fish"는 비융합 cDAN 라이브러리(예를 들어, Th2 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리)이다. 이들 구성물은 전사 인자에 반응성인 조절 서열(예를 들어, MARE 서열, 예를 들어 cMaf에 반응성인 IL-4 프로모터의 영역)에 결합된 수용체 유전자 구성물을 함유하는 숙주 세포(예를 들어, 효모 세포) 내에 도입된다. c-Maf(또는 다른 관심있는 전사 인자)와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 코드화시키는 cDNA는 수용체 유전자 구성물의 트랜스 활성화를 근거로 하여 확인될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 IL-4 유전자 조절 영역에서 c-Maf ALC MARE와 같은 전사 인자가 결합하는 DNA 분자와 본 발명의 전사 인자의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 검정을 제공한다. DNA 결합 단백질과 표적 DNA 서열의 상호작용을 검출하는 검정(예를 들어, 전기영동 이동성 시프트 검정, DNAseI 풋프린팅 검정 등; 추가의 설명은 실시예 참조)은 당분야에 공지되어 있다. 시험 화합물의 존재하에 이러한 검정을 수행함으로써, 이들 검정은 DNA 결합 단백질과 이것의 표적 DNA 서열의 상호작용을 변조시키는(예를 들어, 억제 또는 향상시키는) 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 시험 화합물의 존재하에 전사 인자가 DNA 단편에 결합되는 양은 시험 화합물의 부재하에 전사 인자가 DNA 단편에 결합되는 양보다 많으며, 이 경우에, 시험 화합물은 전사 인자의 결합을 향상시키는 화합물로서 확인된다. 또 다른 양태에서, 시험 화합물의 존재하에 전사 인자가 DNA 단편에 결합되는 양은 시험 화합물의 부재하에 전사 인자가 DNA 단편에 결합되는 양보다 적으며, 이 경우에, 시험 화합물은 전사 인자의 결합을 억제시키는 화합물로서 확인된다.
NIP45 및 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 변조시키는 작용제를 확인하기 위한 본 발명의 방법에서, 단리된 NIP45 및/또는 NF-AT 패밀리 단백질이 방법에 사용되거나, 대안적으로, NIP45 및/또는 NF-AT 패밀리 단백질의 일부만이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 NF-AT Rel 상동성 도메인(또는 RHD를 포함하는 NF-AT의 더 큰 하위영역)이 NF-AT의 NIP45-상호작용 부분으로서 사용될 수 있다. 또한, NF-AT RHD에 결합할 수 있는 NIP45의 일부분이 사용될 수도 있다. 바람직한 양태에서, (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두는 GST 융합 단백질과 같은 융합 단백질이다 (예를 들어, GST-AT RHD가 NF-AT의 NIP45-상호작용 부분으로서 사용될 수 있다). (i)과 (ii) 사이의 상호작용 정도는 예를 들어, 단백질 중 하나를 검출성 물질(예를 들어, 방사성 표지)로 표지시키고, 비표지 단백질을 단리시키고, 비표지 단백질과 관련되게 되는 검출성 물질의 양을 정량화시킴으로써 측정될 수 있다. 검정은 NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 자극하거나 억제하는 작용제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 자극하는 작용제는 작용제의 부재하의 상호작용 정도와 비교하여 (i)과 (ii) 사이의 상호작용 정도를 증가시키는 능력에 근거하여 확인되며, 반면에 NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 작용제는 작용제의 부재하의 상호작용 정도와 비교하여 (i)과 (ii) 사이의 상호작용 정도를 감소시키는 능력에 근거하여 확인된다. 포슨(Pawson)의 미국 특허 제 5,352,660호에 기술된 바와 같이 SH2 도메인-리간드 상호작용을 변조시키는 작용제를 확인하기 위한 검정 시스템이 NIP45/NF-AT RHD 상호각용을 변조시키는 작용제를 확인하는 데에 적합하다.
본 발명은 제한하는 것으로 구성되어서는 안되는 하기의 실시에에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고문헌으로 인용되었다. 본원에 언급된 바와 같은 공개된 데이터베이스에 기탁된 누클레오티드 및 아미노산 서열이 또한 본원에 참고로 인용되었다.
실시예 1 : 시토카인 특이성은 포지티브 포지티브 변동 인자로 인한것이며, 수 용체로 인한 것은 아니다.
조직 특이성은 리프레서 또는 사일런서 단백질의 작용을 통해 달성할 수 있다. 따라서, IL-2 ALC IL-4 유전자를 각각 Th2 및 Th1에서 활성을 억제시키는 것이 가능하다. 리프레서 단백질의 존재에 대해 시험하기 위해, 체강 세포 융합을 상이한 MHC 클라스 I 하플로타입의 Th1(Dl.1)과 Th2(D10) 클론 사이에서 수행하였다. Th1 클론 Dl.1(Kd) 및 Th2 클론 D10(Kk)을 "현착액 세포 융합" 방법에 따라 융합시켰다 [참조 : Lane, R.D. et al. (1986) Methods Enzymol. 121:183-192]. 유합 후에, 세포를 8시간 동안 회수한 후, PE-콘쥬게이트된 항-Kk및 FITC-콘쥬게이트된 항-Kd항체[캘리포니아, 라 홀라(La Jolla)에 소재하는 파밍엔(Pharmingen)]을 사용하여 이중으로 착색시켰다. 세포를 크기를 기준으로 하여 분류하여, 비융합 세포를 헤테로카리온 및 호모카리온으로부터 구별하고, 형광에 의해 단일 포지티브 세포 및 이중 포지티브 세포를 확인하였다. 도 1A에 도시된 이러한 방법의 개략도에 제시된 바와 같이, 3가지 집단, 즉 큰 PE-포지티브 세포(Dl.1 x Dl.1), 큰 FITC-포지티브 세포(D10 x D10), 및 큰 PE 및 FITC 포지티브 세포(Dl.1 x D10)가 분류되었다. NHC 클라스 I Kb및 Kk마아커 둘 모두를 발현시키는 세포는 헤테로카오린이며, Kb및 Kk중 하나만을 발현시키는 세포는 호모카오린을 나타내며 대조표준으로서 사용하였다.
상기 3가지 집단을 CD3에 대한 항체를 갖는 배지 중에서 자극하여 시토카인 유전자 발현을 활성화시키고, RNA를 RT-PCR 및 노던 블롯 분석을 위해 제조하였다. 각각의 집단에 대해 약 5x105개의 세포가 얻어졌다. 일상적으로, 5 내지 10%의 세포가 융합을 일으켰다. 이들 3가지 집단을 각각 반으로 분할시키고, 반은 사전 세정시킨 항-CD3 피복판으로 옮기고, 나머지 반은 비피복판으로 옮겼다. 수시간 후에, 세포를 채취하고, 폴리(A+) RNA를 마이크로-패스트트랙(Micro-FastTrack)TM 킷[캘리포니아, 라 홀라에 소재하는 스트라타진(Stratagene)]을 사용하여 단리시켰다. cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) 킷[메릴랜드, 베테스다(Bethesda)에 소재하는 기브코/비알엘(Gibco/BRL)]을 사용하여 제조하고, 제조업자의 지시(캘리포니아, 라 홀라에 소재하는 스트라타진)에 따라 쥐과 IL-2, IL-4 및 β-액틴에 대해 특이적인 시판용 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 위해 사용하였다. PCR 반응에 0.5μ Ciα-32P-dCTP(3000 Ci/mmol, NEN 듀퐁)을 포함시켰다. PCR 생성물을 에탄올로 침전시키고, 비변성 PAGE에 의해 분리시키고, 건조시키고, 방사능 사진에 의해 가시화시켰다.
시토카인 mRNA 발현의 RT-PCT 분석의 결과를 도 1B에 도시하였다. Th1 및 Th2 클론 및 Th 호모카리온은 각각 IL-2(Th1) 또는 IL-4(Th2)만을 전사시켰으며, Th1/Th2 헤테로카리온은 두가지 시토카인을 모두 생성시켰다. 대조적으로, 리프레서 단백질(들)의 존재는 헤테로카오린에서 두가지 시토카인의 사멸을 유발시켰다. 이들 실험으로부터, Th1 대 Th2 세포에서의 시토카인 특이성이 선택적 사일런서 단백질보다는 Th-특이적 포지티브 변동 인자에 의해 중재됨이 결론지어졌다.
실시예 2 : 항-CD3 활성화된 Th2 클론으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터의 Th2-특이적 c-maf 유전자의 단리
효모 2-혼성체 시스템에 의해 NF-AT-상호작용 단백질에 대해 항-CD3 활성화된 Th2 클론(D10)으로부터 제조한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 동안(상기 시스템의 설명에 대해; 참조예 : 필드(Field)의 미국 특허 제 5,283,173호; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696], 다중 cDNA가 단리되었으며, 이들은 모두 매우 약한 상호작용제이었다. 그 다음에, 상기 스크린에서 수득된 모든 cDNA를 Th1 및 Th2 클론의 패널을 사용하는 노던 블롯 분석에 의해 Th-특이적 발현에 대해 평가하였다. 반복적으로 단리시킨 하나의 이러한 DNA(140개 중 60개)가 도 2A에 도시된 노던 블롯 분석에서 예시된 바와 같이, Th1 클론(AR5, OS6, D1) 또는 B 세포 림프종인 M12로부터가 아니라, Th2 클론(D10, CDC35)으로부터 제조된 RNA에서만 전사를 검출하였다. 또한, D10 Th2에서 검출된 전사물의 양은 항0CD3 항체에 의한 T 세포 수용체의 결찰에 의한 활성화시에 현저히 증가하였다. 상기 cDNA 클론에 의해 검출된 전사물의 유도는 항-CD3 처리시에 Th1 클론에서는 일어나지 않았다. 대조표준 프로브, 즉 GAPDH는 모든 레인에서 RNA의 거의 동등한 로딩을 나타내었다. 따라서, 림프성 계통에서의 상기 cDNA 클론의 발현은 Th2-특이적이고, T 세포 수용체를 통해 전달된 신호에 민감한 것으로 보인다. 이들 노던 블롯을 위해, 전체 RNA를 제조업자의 지시에 따라 트리졸(GIBCO/BRL)을 사용하여 제조하였다. 각가의 샘플로부터의 전체 RNA 10㎍을 포름알데히드 아가로오스 겔 상에서 분별시키고, 나일론막으로 옮겼다. 단리된 클론의 3' 비번역 영역으로부터 유도된 300 bp Dral 단편을 랜덤 프라이밍 DNA 표지화 킷(Random Primed DNA Labeling Kit)[인디애나, 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)]을 사용하여 표지화시켰다. 혼성화를 제조업자의 지시에 따라 QuikHyb(캘리포니아, 라 홀라에 소재하는 스트라타진)을 사용하여 수행하였다.
상기 유전자가 조직 특이성이고, 정상 Th 세포 발달 동안 조절되는 지를 측정하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다. 천연 비장 세포(Th 전구물질(Thp) 세포)를 시토카인 및 항-시토카인 항체(Th1에 대해 IFNγ 및 항-IL-4, Th2에 대해 IL-4 ALC 항-IFNg)의 존재하에 항-CD3로 처리함으로써 Th1 또는 Th2 경로를 따라 유도하였다. 비장 세포 현탁액을 생후 6 내지 8주된 Balb/c 마우스로부터 제조하고, 106세포/ml의 밀도로 10% FCS로 보충한 RPMI 1640 중에서 배양시키고, Th1 계통에 대해 5㎍/ml의 항-IL4 항체(IIB11) 또는 Th2 계통에 대해 5㎍/ml의 항-IFNγ 항체(XMG-1)의 존재하에 플레이트 결합 항-CD3 항체로 자극하였다. 자극 24시간 후에, 50 U/ml의 IL2를 모든 배지에 첨가하고, 500 U/ml의 IL4(Genzyme)를 Th2 배지에 첨가하였다. 일차 자극 7일 후에, 모든 세포를 채취하고, 세척하고, 플레이트 결합 CD3 항체로 재자극하였다. 일차(0 내지 8일) 및 이차(0 내지 20시간) 반응에서 자극후 다양한 시점에서 채취한 분화 세포의 노던 블롯 분석을 상기 기술된 방법을 사용하여 수행하고, Th1 또는 Th2로서 분화 Thp 세포의 확인을 IL-10 및 IFNγ에 대해 ELISA에 의해 배지 상등액을 분석함으로써 측정하였다. 시토카인 정량화에 대한 ELISA를 하기와 같이 수행하였다. 모든 항-시토카인 항체를 파밍엔으로부터 입수하였다. ELISA를 파밍엔의 지시에 따라 수행하였으며, 단, PBS/BSA 중에서 1:500으로 희석시킨 아비딘-알칼리성 포스파타아제(시그마)를 아비딘-퍼옥시다아제 대신에 사용하였다. 기질 완충제(10% 디에탄올아민, 0.5 mM MgCl2, 0.02% 나트륨 아지드, pH 9.8) 중의 4 mg/ml의 P-니트로페닐 포스파타아제(GIBCO BRL)를 기질로서 사용하였다.
대표적 결과를 도 2B에 도시한 2가지 독립된 실험에서, 상기 분석은 0일째에 기준선에서 천연 비장 세포에서의 상기 cDNA의 저수준 또는 비검출성 발현을 나타내었다. Th2 경로를 따라 분화시킨 배지에서, 전사의 실질적 유도는 일차 자극에서 8일째에, 그리고 이차 자극에서 20시간 째에 일어났다. 대조적으로, Th1 경로를 따라 유도된 세포에서는 유도가 일어나지 않았다. Th1 경로를 따라 유도된 세포 중에 존재하는 전사물의 저수준은 상기 생체외 분화 시스템에서 완전한 비대칭이 발생하지 않기 때문에 잔류 Th2 세포의 존재를 반영하는 것이다.
함께, 이들 실험을 단리된 cDNA가 Th2 클론에서 선택적으로 발현되어, T 세포 활성화시에 유도되고, Th1 클론 및 B 림프종이 없음을 나타내었다. 추가로, 상기 유전자는 Th1 발달 동안 유도되지 않고, Th2 계통에 대해 유도되는 경우에 정상 Thp에서 유도되었다.
효모 2-혼성체 스크린으로부터 얻어지는 cDNA를 표준 혼성화 방법에 의해 D10 Th2 세포 cDNA 라이브러리로부터 전장 cDNA를 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 4.3 kb cDNA 클론을 Th2 세포 라이브러리로부터 단리시키고, 표준 방법에 의해 서열화시켰다. 서열 분석은 상기 Th2-특이적 유전자가 서열상 c-maf 프로토-종양 유전자에 상응함을 나타내었다.
실시예 3: IL-4 프로모터의 활성화를 초래하는 Th1 및 B 세포에서의 c-Maf의 전위적 발현
AP-1/CREB/ATF 유전자 패밀리의 일원으로서 실시예 2에 기재된 단리된 cDNA의 확인은 이것의 Th2 세포에서의 선택적인 발현과 함께 c-Maf가 IL-4 유전자의 조직 특이적인 전사를 조절한다는 가능성을 증가시켰다. 추가로, c-maf를 코드화하는 전사체의 존재는 Th2 세포 및 조사된 4개의 형질전환된 마스트(mast) 세포 계통의 3개에서의 IL-4 발현과 매우 상호관련이 있었다. c-Maf가 IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시킬 수 있는 지를 시험하기 위해, 동시트랜스펙션 실험을 수행하였다.
Th1 클론 및 B 림프종 M12.4.C3(M12)는 모두 c-maf를 발현시키지 않거나 IL-4 유전자를 전사하지 않는다. c-Maf가 IL-4 유전자 발현을 조절하는 데에 중요한 전사 인자라면, 이들 세포에서의 강제적 발현은 IL-4 유전자 발현을 허용해야 한다. 이를 시험하기 위해, 온길이(4.3 kb) c-maf cDNA 클론을, 삽입된 서열의 발현을 유도하기 위해 CMV 인핸서를 사용하는 pMex-NeoI 포유동물 발현 벡터의 SalI 부위에 삽입시켰다. 그런 다음, c-Maf 발현 벡터를 IL-4 프로모터 리포터 구성물과 함께 Th1 클론 AE7 및 B 림프종 M12로 동시트랜스펙션시켰다. 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자에 작동적으로 결합된 -157 내지 +68의 IL-4 프로모터 단편을 함유하는 야생형 IL4 CAT 리포터 구성물의 생성은 호지, 엠.(Hodge, M.) 등의 문헌((1995) J. Immuno. 154:6397-6405)에 기재되어 있다. Th1 클론을 10% FCS 및 10% Con-A 자극된 래트 비장세포 상층액이 보충된 RPMI 1640에서 배양시키고, 적합한 항원 및 APC로의 2주간 자극에 의해 유지시켰다. M12 세포를 10% FCS가 보충된 RPMl 1640에서 배양하였다.
Th1 클론 AE7 또는 M12 B 림프종 세포를 실온에서 10분 동안 각각의 플라스미드의 20㎍(AE7) 또는 5㎍(M12)와 함께 혈청이 없는 RPMI 1640 중에서 2x10 세포/ml AE7 또는 3x10 세포/ml M12 세포를 함유하는 0.4ml의 세포를 예비인큐베이팅시킴으로써 일시적 트랜스펙션시켰다. 그런 다음, 샘플을 975 ㎌, 280V로 고정된 BIO-RAD 진 펄서(Gene Pulser)(BIO-RAD, Richmond, CA)를 사용하여 일렉트로포레이션시킨후, 즉시 얼음상에 10분 동안 놓는다. 트랜스펙션된 세포를 완전 배지에서 밤새 회복시키고, 항-CD3 항체가 결합된 플레이트({Pharmingen, San Diego, CA} 4℃에서 밤새 1XPBS 중의 1㎍/ml) 또는 50 ng/ml PMA(Sigma, St. Louis, MO) 및 1μM의 이오노마이신(Calbiochem Corp., La Jolla, California)로 24시간 동안 자극시켰다. 세포 용해물을 0.25 M Tris-Cl(pH 7.8)에서 동결-해동 분해에 의해 제조하였다. 동량의 단백질(5 내지 20 ㎍)을 CAT 분석에 이용하였다. CAT 분석을 토드, 엠.(Todd, M.)등의 문헌[J.Exp. Med. 177:1663-1674]에 설명된 방법으로 수행하였다.
Th2-특이적이고, 유도 가능한 IL-4 발현은 Th2 세포에서 157bp 정도로 작은 가장 인접한 IL-4 프로모터에 의해 유도된다는 것은 이미 공지되어 있다(참고 문헌: Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405). 코트랜스펙션 실험에서, 도 3A에 요약된 결과는, Th1 클론 AE7에서 c-Maf의 전위적 발현이 T 세포 수용체를 두루 자극한 후, IL-4 프로모터 수용체의 실질적인 활성을 유도한다는 것을 입증한다. 대조군 빈 벡터를 단독으로 사용할 경우와 비교하여, 상기의 활성 유도가 약 5 배 넘게 관찰되었다. 여기에 사용된 AE7 서브클론에서 가장 인접한(-157 내지 +58) IL-4 프로모터 서열을 함유하는 수용체 구성물의 발현이 미리 관찰되지 않았음에도 불구하고, 소량의 IL-4 mRNA가 AE7의 다른 서브클론에서 RT-PCR에 의해 검출될 수 있음이 입증되었다. IL-4를 생성하지 못하는 세포에서 IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시키는 c-Maf의 능력을 더욱 정밀하게 시험하기 위해, 동일한 시험을 B 림프종 세포 라인, M12에서 수행하였다. 정상적인 B 세포 및 B 림프종 세포는 IL-4를 생성하지 않는다. 코트랜스펙션 실험의 대표적인 결과는 도 3B에 설명되어 있으며, 3개의 독립적인 실험을 하기 표 1에 요약하였다.
CAT 활성(유도 배수)
플라스미드 PMA/아이오노마이신 실험 Ⅰ* 실험 Ⅱ 실험 Ⅲ
pMEX-NeoI/pREP4 - 1 1 1
+ 7.6 1 1.4
pMEX-Maf/pREP4 - 95 5 18.6
+ 186 7 37
pMEX-c-Fos/pREP4 - 2.7 1 0.8
+ 7.6 1.2 1
pMEX-JunD/pREP4 - ND* 0.9 0.5
+ ND 1.4 1.9
pMEX-NeoI/pREP4-NF-Atp - 14.2 1.6 0.3
+ 41.2 3.5 0.3
pMEX-Maf/pREP4-NF-Atp - 136 54 26.3
+ 138 100 54.7
pMEX-c-Fos/pREP4-NF-Atp - 7.4 1.6 3
+ 15.4 1.9 6.1
*실험 Ⅰ에서, 20mg의 세포 용해물을 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 실험 Ⅱ 및 Ⅲ에서는, 단지 5mg의 용해물만 1 시간 동안 인큐베이션시켜, c-Maf와 NF-ATp사이의 공동작용을 나타나게 했다.**ND = 수행하지 않음
M12 B 림프종 세포에서의 결과는 Th1 클론에서의 발견을 확실히 하였다. M12 세포에서 IL-4 프로모터의 실질적인 활성을 유도하는 c-Maf의 전위적 발현은 PMA/Ca++ 이온투과담체로 자극되거나 자극되지 않는다. 대조군 벡터의 트렌스펙션과 비교할 경우, 비자극된 M12 세포에서는 평균 약 50배의 유도가 관찰되었다. 핵 및 다른 AP-1 패밀리 일원으로의 NF-AT의 전좌를 유도하는 PMA/Ca++ 이온투과담체로의 M12 세포 자극은 IL-4 프로코터의 기본적인 활성을 증가시키지만, c-Maf에 의한 프로모터 활성에서의 현저한 유도는 여전히 존재한다(평균 약 25배)(참고 문헌: Flanagan, W.M. (1991) Nature 352:803-807; Jain, J. et al. (1993) Nature 365:352-355). C-Maf는 NF-AT 멀티머에 의해 유도된 대조군 수용체를 트랜스액티베이팅시키지 않으며, 이는 트랜스액티베이션의 특이성을 입증하는 것이다.
다른 AP-1 패밀리 일원과 대립하는 c-Maf의 특이성에 대한 대조군으로서, c-Fos 및 c-Jun 단백질은 또한 pMEX-NeoI의 포유동물 발현 벡터 및 IL-4 수용체 플라스미드중의 c-Fos 및 JunD를 코드화하는 쥐과 동물의 완전한 길이의 cDNA를 이용하여 M12 세포에서 과다발현되었다. IL-4 프로모터 활성은 M12 세포에서 이러한 두가지의 AP-1 패밀리 일원의 과다발현에 의해 달성되지 않았다. 따라서, c-Maf는 M12B 세포에서 IL-4 유전자 전사를 유도하는 유일한 능력을 갖는다. 또한, 간암세포 라인 HepG2에서 c-Maf의 강요된 발현은 또한 IL-4 프로모터 트랜스액티베이션을 유도하였다. 이러한 실험은 c-Maf 네거티브 Th1 또는 B 세포 또는 비림프성 세포(예를 들어, 간암 세포 라인)에 c-Maf를 제공하는 것은 세포가 IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시킬 수 있게 한다.
NF-AT 단백질은 IL-2 및 IL-2 시토카인 둘 모두의 조절에서 아주 중요한 것으로 알려져 있다. NF-ATp는 상기 계의 분리된 첫 번째 요소이다(참고 문헌: McCaffrey, P.G. et al. (1993) Science 262:750-754). AE7 및 M12 세포 둘 모두는 내인성 NF-ATp 단백질을 가지지만, 그럼에도 불구하고 IL-4를 전사하지 않는다. 따라서, NF-ATp가 선택적인 IL-4 유전자 전사를 설명할 수 없지만, 비자극된 또는 자극된 M12 세포에서 NF-ATp의 과다발현이 c-maf에 의해 IL-4 프로모터의 트랜스액티베이션을 추가로 증가시키는 지의 여부를 시험하는 것이 흥미로왔다. M12 세포는 IL-4 수용체 구성물, 및 NFAPp 발현 벡터(pREP4-NF-ATp, 이는 또한 하이그로마이신 내성 유전자) 단독 또는 NFAPp 발현 벡터와 c-Maf 발현 벡터로 코트랜스펙팅되었다. M12 세포에서 NF-ATp 단독의 과다발현은 IL-4 프로모터의 다소 적당한 트랜스액티베이션을 유도하였다. 이러한 트랜스액티베이션은 c-Maf의 전위적 발현에 의해 현저하게 증가되었으며, 이러한 증가는 부가적인 것이 아니라, 공동적인 것이다(도 3B 및 표 Ⅰ 참조). 이와 반대로, c-Fos 과다발현은 NF-ATp에 의해 달성된 적당한 트랜스액티베이션을 추가로 증가시키지는 않았다. 이러한 결과는 c-maf 및 NF-ATp가 상호작용하여 c-maf에 의해 제공된 조직 특이적인 IL-4 유도의 최대치를 달성한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: C-Maf의 전위적 발현이 B 림프종에서 내인성 IL-4 유전자의 전사를 활성화시킨다.
실시예 3에서 입증된 바와 같이, c-Maf는 Th1, B 및 비림프성 세포의 일시적인 트랜스펙션 분석에서 IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시킨다. IL-4를 생성하지 못하는 세포에서 c-maf의 발현이 내인성 IL-4의 전사를 활성화시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, B 림프종 M12를 c-maf, NF-ATp, 또는 이들 둘 모두를 코드화하는 발현 벡터, 또는 대조군으로서 NF-ATp를 갖거나 갖지 않는 junD로 안정하게 트랜스펙팅하였다. 안정한 트랜스펙션을 위해서, M12 세포를 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 트랜스펙팅하였다. 트랜스펙팅된 세포를 400 ㎍/ml 농도의 네오마이신(GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) 및 하이그로마이신(Calbiochem, Corp.)을 각각 첨가하기 전에 48시간 동안 완전 배지에서 회수하였다. 트랜스펙트된 세포에 하루 걸러 새로운 배지로 보충해주었다.
안정하게 트랜스펙팅된 M12 세포를 24시간 후에 채취된 동밀도의 상층액을 플레이팅하여, ELISA로 시토카인을 측정하였다. ELISA를 실시예 2에 설명된 방법으로 수행하였다. 도 4에 도시된 이 결과는 이러한 실험에서, c-maf, junD 또는 NF-ATp 단독으로 트랜스펙팅된 M12 세포는 ELISA에 의해 측정가능한 IL-4를 생성하지 못했다는 것을 입증하였다. 그런, c-maf와 NF-ATp 둘 모두로 안정하게 트랜스펙팅된 M12 세포는 낮은 수준이지만 ELISA에 의해 검출가능한 수준의 IL-4를 생성하였다. 이러한 결과는 상기 트랜스펙팅된 세포의 RNA의 RT-PCR에 의해 확인되었다. 이와 반대로, 이러한 세포는 검출가능한 IL-2를 생성하지 못했다. c-maf 및 NF-ATp 둘 모두의 요구는 M12세포에서 일시적인 트랜스펙션 실험에서 나타난 IL-4 프로모터의 트랜스액티베이션에 대한 이러한 인자들의 공동적인 효과와 일맥 상통하다. 이와 반대로, Th2 세포에서 IL-4 발현을 증가시킬 수 있는 AP-1 패밀리 일원, junD 단독으로, 또는 NF-ATp와 함께 트랜스텍팅된 세포는 IL-4 생성을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 조직 특이적인 내인성 IL-4 생성을 유도하는 c-Maf의 필수적이고 선택적인 역할을 입증해 준다.
실시예 5: IL-4 프로모터 사이트를 Th1 클론이 아닌 Th2 클론 추출물로 풋프린팅하였다.
실시예 3 및 4에 설명된 실험은 IL-4의 조직 특이적인 발현을 조정하는 c-maf의 명백한 기능적 역할을 입증하였다. 또한, c-maf 전사는 Th1 세포가 아닌 Th2 세포에서 발현된다. 그런, DNA-단백질 복합물은 Th2 세포로부터 준비된 핵 추출물을 이용할 경우, 전기이동 시프트 분석(electrophoretic mobility shift assay)(EMSA)에 의해 검출되지 않았다. Th2 핵 추출물의 단백질이 MARE 또는 근접한 서열에 결합할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, DANseⅠ 풋프린팅의 더욱 정밀한 기술을 이용하였다. 두가지의 Th2 클론(D10, CDC35) 및 두가지의 Th1 클론(AE7, S53)을 항-CD3 항체에 결합하는 플레이트를 갖는 T 세포 수용체와 결찰시켜 활성화시키고, 핵 추출물을 0시간(비자극된), 2 시간 및 6시간 후에 준비하였다. 그 후, DNAseⅠ 풋프린팅 분석을 클레노우(Klenow) 말단-표지된 IL-4 프로모터 단편(-157 내지 +58)을 이용하여 표준 방법에 따라 수행하였다. 상기 결과는 도 5A에 도시되어 있다. Th1 및 Th2 세포 둘 모두로부터의 자극된 추출물은 이전에 설명된 바와 같이 두 개의 NF-AT 사이트, 및 NF-AT 사이트 말단의 AP-1 사이트 업스트림에서 풋프린팅되었으며(참고 문헌: Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553), 이는 IL-2 및 IL-4 프로모터 둘 모두를 조절하는 NF-AT 및 AP-1 단백질의 입증된 기능과 일맥 상통하다(참고 문헌: Rooney, J. et al. (1995) Immunity 2:545-553; Rooney, J. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:6299-6310). 게다가, 자극된 Th2 및 비자극된 Th1 세포로부터의 추출물이 사용될 경우, 방사능 사진 검사로 잔기 -28 및 -29에서 비코딩 가닥에 과민한 영역이 나타났다. 비자극된 Th 세포 추출물은 이러한 영역을 풋프린팅하지 않았다. 관찰된 Th2 풋프린트는 구별하기 어려웠지만, 두 실험에서 재생산 가능하며, Th2 세포에서 IL-4 프로모터 활성에 중요한 것으로 이전에 입증된 사이트에 위치한다(참고 문헌: Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405). 풋프린트 분석에 의해 검출된 것으로서의 IL-4 프로모터에 이용된 사이트의 개략적인 요약도는 도 5B에 도시되어 있다. 이러한 결과는 이전에 기능적으로 중요하다고 알려진 가장 인접한 IL-4 프로모터의 사이트가 활성화된 Th1 세포에서가 아니라 활성화된 Th2 세포에서 이용됨을 나타낸다.
실시예 6: 재조합 c-maf가 IL-4 프로모터의 MARE 사이트에 결합한다.
Th2 특이적 풋프린트는 c-maf 반응 요소(MARE)를 함유하지 않는다. 그러나, 가장 인접한 IL-4 프로모터의 실험은 가장 인접한 NF-AT 사이트(잔기 -56 내지 -51)의 다운스트림 바로 가까이에 반쪽 c-maf 결합 사이트(MARE)(잔기 -42 내지 -37)를 밝혀냈다(도 5B에 개략적으로 도시됨). 이러한 사이트의 돌연변이는 Th2 세포에서 IL-4 프로모터의 활성을 폐지시킨다는 것이 이미 입증되었다(참고 문헌: Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405). c-Maf가 상기 사이트에 결합하는지를 측정하기 위해, b-zip 도메인(아미노산 171-371)을 함유하는 절단된 c-Maf 재조합 단백질을 E.coli에서 발현시키고, S-Tag 아가로스 칼럼에서 정제하고, 방사능표지된 MARE 올리고누클레오티드를 전기이동 시프트 분석에 이용하였다.
재조합 c-Maf에 대한 발현 벡터는 c-Maf(Kurschner C. and Morgan, J.I. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:246-254)의 아미노산 잔기 171 내지 371을 코드화하는 cDNA를 pET29의 NotI 사이트로 삽입함으로써 구조화시켰다. 절단된 c-Maf 단백질을 T7 중합효소에 의해 BL21(DE3)종에서 발현시켰다. 1mM의 IPTG를 첨가함으로써 세포를 유도하고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 유도된 세포를 1 X 결합/세척 완충제(20mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100)로 분해시키고, 초음파 분해하였다. 그 후, 사용 지시에 따라 S-Tag 정제 키트(Purification Kit)(노바겐(Novagen))를 이용하여 수용성 분획으로부터 c-Maf 단백질을 정제하였다. 두가지의 추가적이 단백질, 즉 NF-ATp 및 c-Jun을 EMSA 분석에 사용하였다. 쥐과 동물의 NF-ATp의 Rel 도메인을 함유하는 재조합 NF-ATp를 시험관내에서 전사/복사 벡터 TP7-NF-ATp를 이용하여 발현시켰으며, 상기 벡터는 쥐과 동물 NF-ATp의 Rel 도메인을 코드화하는 cDNA 단편을 함유한다. c-Jun 발현 벡터, 즉 pGEM-c-Jun는 pGEM4의 PstI 사이트에 쥐과 동물 c-Jun의 전체 길이의 cDNA를 삽입함으로써 구조화시켰다. 1㎍의 각각의 플라스미드 DNA를 T7 프로모터로부터 전사시키고, TnT 커플링된 전사/복사 키드(위스콘신 메디신에 소재한 프로메가)(Promega, Madision, WI)를 이용하여 토끼 망상적혈구 용해질에서 복제시켰다.
전기영동적 이동성 시프트 분석(EMSA)을 하기와 같이 수행하였다. 100ng의 이중 가닥 올리고누클레오티드 말단을 T4 폴리누클레오티드 키나아제(뉴저지 피스카타웨이에 소재한 파마시아 LKB 바이오테크놀로지, 인코포네이티드)를 이용하여 γ32P-dATP(델라웨어, 윌닝턴에 소재한 듀폰 NEN 연구 프로덕트)로 표지시켰다. 표지된 이중 가닥 올리고누클레오티드를 15 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔로 분별하고, 37℃에서 밤새 1 X TE로 현탁분리하고, 에탄올로 침전시켰다. 결합 분석은 0.5 ㎍의 재조합 단백질 또는 4㎕의 시험관내에서 복제된 생성물, 500 ng의 폴리(dl-dC), 및 HEPEs 20 mM(pH 7.9), KCl 100mL, 5% 글리세롤, EDTA 1mM, DTT 5mM, 0.1% NP-40 및 BSA 0.5mg/ml로 구성된 15㎕ 부피중의 프로브 20,000 cpm을 이용하여 실온에서 20분 동안 수행하였다. 그 후, 샘플을 0.5 X TBE를 함유하는 4% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분별하였다.
EMSA에 사용된 쥐과 동물 IL-4 프로모터로부터 유도된 올리고누클레오티드를 하기와 같다:
-59 내지 -27: 5'-CTCATTTTCCCTTGGTTTCAGCAACTTTAACTC-3' (서열 번호: 1);
-79 내지 -60: 5'-ATAAAATTTTCCAATGTAAA-3' (서열 번호: 2); 및
-88 내지 -61: 5'-TGGTGTAATAAAATTTTCCAATGTAAA-3' (서열 번호: 3).
EMSA에 사용된 MARE 올리고누클레오티드의 서열은 5'- GGAATTGCTGACTCAGCATTACT -3'(서열 번호: 4)이다. 모든 올리고누클레오티드를 각각의 역 상보적인 가닥으로 어닐링하여, 이중 가닥의 올리고누클레오티드를 형성시켰다.
재조합 c-Maf의 EMSA의 결과는 도 6에 도시되어 있다. 재조합 c-Maf 단백질은 콘센서스(consensus) MARE 올리고누클레오티드 및 IL-4 프로모터에 존재하는 NF-AT 사이트 및 MARE를 함유하는 33bp의 올리고누클레오티드 모두에 잘 결합한다. 결합은 비표지된 상동체와 경쟁적이지만, 프로브를 억제하지는 않는다. 또한, c-Maf는 재조합 NF-ATp가 잘 결합하는 단지 NF-AT 표적 서열을 함유하는 올리고누클레오티드에는 결합하지 않았다. IL-4 프로모터 프로브에 결합하는 c-Maf의 능력은 특이적인데, 그 이유는 시험관내에서 복제된 c-Jun 단백질은 상기 올리고누클레오티드에 결합하지 않았기 때문이다. c-Jun 단백질은 기능적인데, 그 이유는 이들이 코어 TRE 사이트를 함유하는 콘센서스 MARE에 결합할 수 있기 때문이다. 이러한 결과는 다른 AP-1 패밀리 일원(c-Jun)이 아닌 c-Maf가 가장 인접한 IL-4 프로모터내의 MARE 사이트에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
NF-AT 단백질은 AP-1 패밀리 일원 단백질과 협동적으로 상호작용하여, EMSA에서 IL-2 및 IL-4 프로모터 DNA상의 더 높은 이동 복합물을 형성한다(참고 문헌: Jain, J. (1993) Nature 365:353-355; Rooney, J. et al.(1995) Immunity 2:545-553). c-maf와 상호작용할 수 있는 이러한 NF-AT 단백질은 이전의 실시예에 설명된 기능적 실험에 의해 제시되었다. c-Maf가 DNA의 존재하에 NF-AT와 상호작용하는지의 여부를 측정하기 위해, 재조합 NF-ATp 및 c-Maf 단백질을 각각 또는 같이 NF-AT 및 인접한 MARE 사이트 둘 모두를 함유하는 33bp의 올리고누클레오티드와 EMSA에 이용하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 각각의 단백질은 단독으로 IL-4 프로모터 DNA에 결합하였다. 재조합 c-Maf 플러스 재조합 NF-ATp 단백질은 이러한 복합물을 생성하며, 추가로, 더 높은 이동 복합물을 형성하였다. c-Jun 및 NF-ATp 단백질이 사용될 경우, 더 높은 이동 복합물은 관찰되지 않았으며, 이는 c-Jun이 이 사이트에 결합하지 못하는 것과 일맥 상통하다. 이러한 결과는 c-Maf가 이미 Th2 세포에서 기능적으로 중요하다고 여겨진 가장 인접한 Il-4 프로모터에 위치한 서열에 시험관내에서 특이적으로 결합할 수 있고, 다른 AP-1 단백질, c-Maf가 시험관내에서 NF-AT 단백질과 상호작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: IL-4 프로모터를 트랜스액티베이팅시키는 c-Maf의 능력을 MARE 및 Th-2 특이적 풋프린트에 맵핑하다
TATA 요소의 바로 인접한 업스트림에 위치한 IL-4 프로모터의 필수적인 영역은 높은 분해 돌연변이원을 특징으로 한다(참고 문헌: Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405). 이러한 33bp 영역(-59 내지 -28)의 돌연변이원은 다중 사이트가 Th2 세포에서 유도가능한 IL-4 전사를 필요로한다는 것을 입증하였다. 이러한 사이트는 NF-AT 표적 서열, Th2 추출물에 의해 풋프린팅된 영역, 및 MARE로서 현재 인지된 것을 포함한다. 이러한 영역이 교차되어 생성된 4개 염기 쌍 링커-스캐닝 돌연변이를 포함하는 일련의 IL-4 수용체 유전자 구성물을 생체내 M12 세포에서 c-Maf에 의해 이용된 표적 서열을 맵핑하는데 이용하였다. 이러한 세포는 c-maf 발현 벡터 및 이러한 일련의 돌연변이 IL-4 프로모터 구성물로 코트랜스펙팅되었다. 이 결과는 도 7A에 도시되어 있다. MARE의 돌연변이(돌연변이 3 및 4) 또는 Th2 풋프린트에 의해 규정된 사이트(돌연변이 2)는 트랜스펙팅된 c-maf의 능력을 폐기시키거나(돌연변이 2 및 4), 부분적으로 폐기시켜(돌연변이 3), IL-4 전사를 유도하였다. c-maf 트랜스액티베이션을 감소시키는데 적당한 효과물은 NF-AT 서열을 분열시키는 돌연변이 8에서 관찰되었으며, 이는 내인성 NF-ATp의 M12 세포의 존재 및 이전의 실시예에서 입증된 NF-ATp와 c-maf사이의 공동 작용과 일맥 상통하다. 돌연변이 6 및 7은 현저한 효과가 없는 반면, 돌연변이 5는 트랜스액티베이션 능력을 강화시키고, 이는 Th2 세포에서 이전에 관찰된 것과 일맥 상통하다(참고 문헌: Hodge, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:6397-6405). 트랜스액티베이션 데이터는 상기 33bp의 영역을 함유하는 올리고누클레오티드 및 객관적인 경쟁물로서 돌연변이 올리고누클레오티드의 이러한 일련의 동일물을 프로브로서 사용하는 재조합 c-Maf 단백질로 수행한 EMSA와 일맥 상통하다. EMSA 실험의 결과는 도 7B에 도시되어 있다. 이러한 실험은 c-Maf가 가장 인접한 IL-4 프로모터의 MARE에 특이적으로 결합하거나, 트랜스액티베이팅시키고, 인접한 Th2에 특이적 요소가 c-Maf의 결합 및 기능 둘 모두에 직접적으로 관련있음을 나타낸다.
실시예 8: 효모 2-혼성 상호작용 트랩 분석(Yeast Two-Hybrid Interaction Trap Assay)을 이용한 NIP45 cDNA의 분리
효모 2-혼성 상호작용 트랩 분석을 이용하여, NF-ATp의 RHD에 직접적으로 결합할 수 있는 단백질을 분리하였다. NF-ATp(RHD)-Gal4 융합 단백질을 효모 2-혼성 분석에서 "베이트(bait)"로서 사용하기 위해 쥐과 동물 NF-ATp의 900bp의 단편(McCaffrey, P.G. et al. (1993) Science 262:750-754)을 클로닝하고, 아미노산 228 내지 520을 벡터 pEG202의 BamHI 사이트(Gyuris, J. et al. (1993) Cell 75:791-803)로 스패닝함으로써 준비하였다. 프레임에서, NF-AT(p) 폴리펩티드 서열의 Gal4 서열로의 프레임 융합을 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 상기 베이트는 플라스미드 pJG4-5에서 구조화된 쥐과 동물 T 세포 라인 D10으로부터 제조된 cDNA를 스크리닝하는데 이용하여, 당분야에 공지된 기술(Gyuris, J. et al. (1993) Cell 75:791-803)을 이용하여 베이트와 상호작용하는 폴리펩티드를 코드화하는 클론을 선택하였다.
높은 수준의 β-갈락토시다아제 활성을 나타내는 것으로서 NF-ATp(RHD)-Gal4 베이트에 대한 명백히 높은 친화도를 가지며, 류신 프로토프로피를 공급할 수 있는 융합 단백질을 코드화하는 상호작용물질의 한 부류를 분리하고, 이를 NIP45(NF-AT 상호작용 단백질 45(NF-AT Interacting Protein 45))라고 명명하였다. 도 8에 NIP45 플라스미드, 및 NF-ATp-RHD 베이트 또는 대조군 베이트(Max-Gal4, CDK2-Gal4 및 대조군 벡터 pEG202, 에피토프 표지된 Gal4 단백질만 발현)를 LacZ 수용체 플라스미드 pSH18과 함께 공동형질전환시킨 효모 클로니(각각의 플라스미드 조합에 대한 대표물 3가지)가 도시되어 있다. 상기 효모 클로니를 적당한 배지에서 선택하고, Xgal을 함유하고, 탄소 공급원 갈락토오스가 억제되지 않은 플레이트상에 스포팅하였다. 효모 콜로니는 NIP45 플라스미드와 공동형질전환되어, NF-ATp-RHD 베이트는 파란색이었으며, 이는 LacZ 수용체 플라스미드(NIP-45/NF-ATp-RHD 상호작용을 나타냄)의 발현을 입증하는 것이며, 반면, 효모 콜로니가 NIP45 플라스미드로 형질전환되면, 대조군 베이트는 백색이며, 이는 NIP45와 대조군 베이트와 상호작용이 발생하지 않았음을 나타낸다. 또한, 형질전환물을 류신이 없는 갈락토오스 함유 배지 및 단지 NIP45 플라스미드만을 함유한 배지에서에서 시험한 결과, NF-ATp-RHD 베이트가 생장하였으며, 이는 추가로 NIP45와 NF-ATp-RHD의 특이적 상호작용을 나타낸다. 2-혼성화 분석에 의해 분리된 NIP45 cDNA는 1.9kb DNA 단편이었다.
실시예 9: 생체내 포유동물 세포에서 NIP45와 NF-ATp의 상호작용
생체내에서 NF-ATp와 특이적으로 상호작용하는 NIP45 폴리펩티드의 능력을 포유동물 세포에서 시험하였다. 효모 2-혼성 시스템(실시예 8에 설명됨)에서 선택된 1.9kb의 NIP45 cDNA 삽입물을, 코딩 영역을 인플루엔자 헤모글루티닌(HA) 펩티드로부터의 에피토프 표지에 융합시키는 포유동물 발현 벡터 즉, 벡터 pCEP4-HA(Herrscher, R.f. et al. (1995) Genes Dev. 9:3068-3082)내로 서브클로닝하여, 발현 벡터 NIP45-HA를 제조하였다. 그 후, 이렇게 표지된 구조물을 NF-ATp 발현 플라스미드를 이용하여 HepG2 세포(낮은 수준의 NF-ATp 발현)내로 코트랜스펙팅하였다. 대조군으로서, 또한 HepG2 세포를 NF-ATp 구조물에 대한 부모 발현 벡터(즉, NF-ATp 삽입물이 없는 발현 벡터)와 함께 NIP45-HA로 코트랜스펙팅시키거나, 에피토프 표지된 NIP45의 융합 프레임 이외의 것과 함께 NF-ATp 발현 벡터로 코트랜스펙팅시켰다. 용해물을 트랜스텍팅된 세포로부터 준비하였고, 항-NF-ATp 항체로 면역침전시켰다. 그 후, 웨스턴 블롯 분석을 항-NF-ATp 또는 항-HA 항체를 이용한 면역침전된 물질상에서 수행하였다.
이러한 실험의 결과는 도 9에 도시되어 있다. HA-특이적 단클론성 항체(mAb)를 이용한 이러한 샘플의 웨스턴 블롯 분석은 면역침전에 이용된 항-NF-ATp 항체가 HA-표지된 NIP45 폴리펩티드와 공동면역침전됨을 입증하였다. 단지 NIP45-HA와 트랜스펙팅된 레인(중간 레인)은 이러한 세포에 존재하는 낮은 수준의 내인성 NF-ATp를 나타닌다. 면역침전된 HA-표지된 NIP45 단백질의 양은 이러한 상호작용(오른쪽 레인)을 입증하는 NF-ATp 발현 플라스미드와의 코트랜스펙션에 의해 추가로 증가되었다. 비처리된 용형물의 웨스턴 블롯 분석은 NIP45-HA 폴리펩티드의 상당량이 NIP45-HA 항-NF-ATp 항체의 공동면역침전에 대해 시험된 샘플에서 발현되었다. 추가로, 정상적인 토끼 혈청을 이용한 면역침전을 수행할 경우, NF-ATp 또는 HA 표지된 단백질에 대한 면역반응 물질은 검출되지 않았다. 이러한 실험은 NF-AT 및 NIP45가 생체내 포유동물 세포에서 물리적으로 관련되어 있음을 입증한다.
실시예 10: NIP45 cDNA의 구조적 분석
2-혼성 분석(실시예 1에 설명됨)을 이용하여 분리된 클론으로부터 1.9kb의 NIP45 cDNA 삽입물을 D10.G4 T 세포 람다 zap Ⅱ cDNA 라이브러리(스트라타진(Stratagene))을 스크리닝하는데 이용하여, 전체 길이의 클론을 확인하였다. 약 8 x 105클론을 함유하는 라이브러리의 스크리닝은 대체로 원래의 분리물보다 5' 말단쪽으로 더 멀리 확장되지 않은 7개의 혼성 클론을 산출하였다. 그러나, 가장 긴 클론(2.8kb)의 서열 분석은 5' 말단에서 원래 클론에 대한 동일성을 입증하였다. 원래의 1.9kb cDNA 분리물 및 가장 긴 2.8kb cDNA 분리물의 구조는 도 10과 비교된다. 2.8kb cDNA 분리물은 원래 클론의 5'말단으로부터 868bp 다운스트림에 위치한 180bp의 추가적인 단편을 포함한다. 이러한 180 누클레오티드 단편의 말단에서 접합 서열은 스플라이싱된 인트론을 의미하며, 이러한 영역내에서 누클레오티드 서열의 개념 복제는 프레임내의 정지 코돈을 밝혀냈다. 이러한 클론에서 추가적인 많은 서열은 3' 말단에 있으며, 뒤에 폴리-A+테일이 오는 넓은 3' 비복제된 영역을 나타내었다(도 10 참조). 이러한 넓은 3' 비복제된 영역은 많은 유전자에서 관찰되었다. 작은 인트론의 스플라이싱 및 단일의 큰 오픈 리딩 프레의 복제로 인해, 2.8kb cDNA 클론이 원래 1.9kb 분리물의 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 것으로 예상된다.
누클레오티드 및 1.9kb cDNA 분리물의 예상되는 아미노산 서열이 도 11에 도시되어 있다(각각 서열 번호:5 및 6). 상기 코딩 영역은 첫 번째 개시 코돈으로부터 프레임내의 첫 번째 정지 코돈까지를 도시한 것이다. 누클레오티드 및 아미노산 위치는 제 1 서열의 오른쪽에 나타냈다. 1.9kb 누클레오티드 서열의 개념적 복제는 45 Kd의 분자량을 갖는 412 아미노산의 폴리펩티드로 예상되었으며, 이를 NF-AT 상호작용 단백질 45(NF-AT Interacting Protein 45)(NIP45)로 명명하였다. NIP45의 아미노산 서열의 검사는 N-말단에서 아주 기본적인 도메인을 나타냈으며, 32개의 아미노산중 13개는 기본 아미노산이다. 이러한 영역을 도 11에서 밑줄로 표시하였다. 이러한 기본적인 영역은 도 13에 도시된 소수성 플롯에서 친수성 스트레치로서 나타난다.
실시예 11: NIP45 mRNA의 조직 발현
상이한 쥐과 동물 조직으로부터의 RNA의 노던 블롯 분석을 수행하여, NIP45 mRNA의 조직 발현을 연구하였다. 다양한 조직으로부터 10㎍의 총 RNA를 아가로스 겔에서 변성시키면서 분리하고, 블롯팅하고, 방사선 표지된 1,4kb NIP45 cDNA 단편과 혼성화시켰다. 샘플을 에티듐 브로마이드 형광을 비교하여 RNA의 동량 로딩에 대해 조정하였다. 노던 블롯 분석의 결과는 도 13에 도시되어 있다. 혼성화는 약 3.1kb의 전사를 나타내었으며, 이는 가장 긴 cDNA 클론의 크기에 상당하는 것이다. 고환으로부터의 RNA는 추가적인 1.4Kb 혼성화 종을 함유한다. NIP45 전사의 가장 높은 수준은 비장, 흉선 및 고환에서 발견되었다. 림프성 기관에서 가장 우선적인 발현은 면역 시스템에서 NIP45에 대한 특이적 기능을 나타낼 수 있다. T 세포 cDNA 라이브러리에서 낮은 정도의 혼성화 시그날 및 NIP45 cDNA 클론의 드문 발생은 NIP45 RNA가 비교적 메시지가 적다는 것음 나타낸다.
실시예 12: NIP45의 서브셀룰라(subcellular) 편재화
에피토프 표지된 NIP45의 서브셀룰라 편재화는 간접적 면역형광에 의해 측정되었다. BHK 세포를 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 HA-에피토프 표지된 NIP45(pCEP4-HA)를 코드화하는 1㎍의 발현 구조물로 트랜스펙팅하였다(Heald, R. et al. (1993) Cell 74:463-474 참조). 트랜스펙팅된 세포를 밤새 인큐베이션시키고, 고정시키고, 문헌[Heald, R. et al. (1993) 상기에 언급된 문헌]에 설명된 방식으로 투과시키고, 항-HA mAb 12CA5(뵈링거 만하임) 플러스 당나귀 항-마우스 항체로 표지된 인도카르보시아닌(잭슨 이뮨리서취)으로 프로빙한 후, 염료 호치스트(Hoechst) 33258로 카운터스테이닝(counterstain)하였다. 결과는 도 14A 내지 B에 도시되어 있다. DNA 염색 염료 호치스트 33258로 카운터스테이닝한 것(도 14B 참조)과 비교하여, NIP45의 핵 염색을 제 2 시약으로 표지된 인도카르보시아닌으로 관찰하였다(도 14A 참조). 형광 패턴은 NIP45가 핵 전체에 분포되어 있음을 나타낸다. 또한, 이러한 패턴은 NF-AT4로 트랜스펙팅되고, 아이오노마이신으로 자극된 세포에서 관찰한 것과 일치한다(Shibasaki, F. et al. (1996) Nature 382:370-373; 하기 참조). PMA 및/또는 아이오노마이신으로의 자극은 상기 NIP45의 서브셀룰라 편재화에 영향을 끼치지 않았다.
대조군 실험을 또한 NF-AT4로 트랜스펙팅된 BHK 세포상에서 수행하였다. 세포를 배양 배지에서 밤새 인큐베이션시키고, 곧바로 고정시키거나, 고정시키기 전에 10분 동안 1mM의 아이노마이신으로 자극한 후, 상기에 설명된 방식으로 수행하였다. 결과는 도 14C 내지 F에 도시되어 있다. 비자극된(도 14C 및 14D) 또는 아이오노마이신으로 처리된(도 14E 및 14F) NF-AT4 트랜스팩턴트를 항-NF-AT4 특이적 항체로 프로빙한후, 제 2 시약으로 표지된 인도카르보시아닌 및 호치스트 33258로 처리하였다. 인도카르보시아닌 형광은 비자극된 트랜스펙턴트(도 14C)에서 세포질에 위치한 NF-AT4에 대한 염색 패턴 및 자극된 세포(도 14E)에서 핵에 위치한 NF-AT4에 대한 염색 패턴을 보여주고 있다. 인접한 패널(도 14D 및 14F 각각)은 호치스트 33258로 염색된 핵 검출을 위해 노출된 동일한 부분을 보여준다.
NF-AT4의 핵 전좌상에서 NIP45의 효과를 또한 연구하였다. HepG2 세포를 NF-At4 또는 NF0AT4 플러스 NIP45로 트랜스펙팅한후, 다음날 1μM의 아이오노마이신으로 0. 2, 4, 8 또는 15분 동안 자극하였다. 한 샘플에서, 세포를 15분 동안 아이오노마이신으로 자극한 후, 새로운 배지로 세척하고, 추가로 15분을 방치하였다(표 1에서 "15분 + 15분"으로 나타냄). 이러한 분석은 핵 보유 인자로서의 NIP45의 기능을 실험하기 위한 것이다. 15분은 NF-AT4가 세포질로 이동하기에 충분한 시간으로 여겨진다(참고 문헌: Shibasaki, F. et al. (1996) Nature 382:370-373). 그 후, 모든 샘플을 고정시키고, 상기에 설명된 바와 같이 NF-AT4의 전좌에 대해 면역형광으로 분석하였다. 결과를 하기 표 2에 요약하였다. 세포질에서 NF-AT4의 서브셀룰라 편재화는 (-)로 표시하였고, NF-AT4의 핵 전좌는 (+)로 표시하였다.
NF-AT4의 핵 전좌
시간 아이오노마이신 아이오노마이신 + NIP45
0 분 - -
2 분 +/- +/-
4 분 +/- +/-
8 분 + +
15 분 + +
15분 + 15분 - -
NIP45의 존재하에 NF-AT4의 핵 유입 또는 배출의 비가 차이가 없다는 것은 세포내 칼슘 수준 변화에 반응하는 NF-AT4의 핵 트래피킹(trafficking)이 외원의 NIP45의 과다발현에 영향을 받지않음을 나타내는 것이다.
실시예 13: 유전자 발현 조절에서 NIP45의 기능적 활성
NF-AT 유도된 전사에서 NIP45의 기능적 역할을 시험하기 위해, NIP45를 HepG2 세포에서 높은 수준으로 발현시켰다. HepG2가 적은 수준의 내인성 NF-AT를 갖기 때문에, 이를 선택하였으며, NF-AT 패밀리 일원 단백질의 전위적 발현은 외원의 자극의 부재하에 이러한 세포 라인에서 NF-AT 유도된 전사를 트랜스액티베이팅시키는 것으로 나타났다(참고 문헌: Hoey, T. et al. (1995) Immunity 2:461-472). HepG2 세포를 IL-3 유전자로부터의 3X NF-AT-CAT 수용체(참고 문헌: Venkataraman, L. et al. (1994) Immunity 1:189-196) 및 NIP45 및 NF-AT 패밀리 일원(NF0ATp, NF-ATc, NF-AT3, NF-AT4)에 대한 대조군 또는 발현 플라스미드로 트랜스펙팅시켰다. HepG2 세포를 상기에 언급된 호이, 티.(Hoey, T.)등의 문헌에 설명된 DEAE-덱스트란 방법으로 트랜스펙팅하고, CAT 분석을 표준 방법론에 따라 수행하였다. 결과는 도 15에 도시되어 있다. 각각의 조합물에 대한 대표적인 분석은 각각의 그룹에 대한 관련된 CAT 활동을 나타내는 막대 그래프에 나타나 있다. 유도 배수는 CAT 수용체 및 각각의 부모 발현 벡터로 트랜스펙팅된 세포의 CAT 활성을 표준화함으로써 계산하였다. 값은 이러한 대조군 트랜스펙션을 초과하는 CAT 발현의 상대적 수준을 나타낸다. 모든 트랜스펙션을 도시된 대표적으로 한 방사능사진으로 3번 이상 수행하였다.
3X NF-AT-CAT 수용체를 갖는 HepG2 세포로의 단독 NIP45의 트랜스펙션은 NIP45가 NF-AT 표적 서열을 트랜스액티베이팅하기 위해 자신이 활성화한다는 것을 입증하는 CAT 발현에서 현저한 증가를 유도하지 않았다. NF-ATp 단독의 과다발현은 NF-AT-CAT 수용체의 상당한 트랜스액티베이션(벡터 대조군을 6배 초과)을 유도하며, 이는 이전의 보고와 일맥 상통하다(참고 문헌: Hoey, T. et al. (1995) 상기에 언급된 문헌). NIP45 플러스 NF-ATp의 코트랜스펙션은 NF-ATp 단독으로의 트랜스펙션된 것과 비교하여 CAT 활성이 4 내지 5배 증가하였으며, 벡터 단독으로 트랜스펙션된 것과 비교하여 25 내지 30배가 증가하였다. 돌연변이 3X NF-AT-CAT 수용체 또는 대조군 MHC 클래스 Ⅱ 프로모터 리포터가 사용될 경우, 이러한 증가는 관찰되지 않으며, 따라서, 이는 이들의 표적 사이트가 특이적이라는 것을 입증한다. NIP45 cDNA에 의해 코딩된 폴리펩티드 생성물이 이렇게 강화된 트랜스액티베이션을 초래한다는 것을 확인하기 위해, 누클레오티드 50에서 2개의 염기를 제거하여, 코딩 영역에서 프레임 시프트 돌연변이를 유발시켰다. 이러한 변화는 아미노산 13 및 추가적인 22 잔기 후의 폴리펩티드의 말단에서 미스센스 돌연변이의 도입을 유발한다. 상기 NIP45ㅿ 구조물을 이용하는 분석은 NF-ATp의 존재 또는 부재하에 NF-AT 수용체를 트랜스액티베이팅시키는 것을 실패했음을 입증하며, 따라서, 관찰된 강화된 트랜스액티베이션이 NIP45 cDNA로부터 발현된 폴리펩티드 때문이라는 것을 확인하였다. 트랜스액티베이션 실험을 또한 극적인 결과보다는 작지만 이와 유사한 B 세포 라인 M12 및 T 세포 클론 D10에서 수행하였으며, 이는 이러한 후의 세로 라인에서 내인성 NIP45 또는 NF-ATp의 더 높은 수준 때문일 수 있다. 이러한 실험은 NIP45가 실질적으로 그리고, 본질적으로 NF-ATp에 의해 유도된 전사를 가능하게 하며, 활성은 NF-ATp와의 상호작용을 필요로하다는 것을 입증하였다.
NF-AT 단백질은 RHD내에서 약 70%의 동일물을 공유하며, NIP45가 또한 다른 NF-AT 패밀리 일원과 상호작용할 수 있다는 가능성을 증가시킨다. 이러한 시험을 위해, NIP45를 NF-ATc, NF0AT3 또는 NF-AT4 플러스 3X NF-AT-CAT 수용체 플라스미드를 코드화하는 상기 발현 구조물로서 코트랜스펙팅하였다. 모든 NF-AT 패밀리 일원이 다른 수준이기는 하지만 HepG2 세포에서 과다발현될 경우, NF-AT/AP1 사이트의 3개의 복제물을 함유하는 수용체 유전자를 트랜스액티베이팅시킬 수 있다는 것은 이미 입증되어 있다(참고 문헌: Hoey, T. et al. (1995) 상기에 언급된 문헌). NIP45의 부재하에, NF-ATp는 NF-AT-CAT 수용체의 가장 영향력 있는 트랜스액티베이터이며, 이어서, NF-ATc 및 NF-AT3가 약한 트랜스액티베이션을 가지며, 이어서 NF-AT4가 더 약한 트랜스액티베이션을 가지며, 이는 상기 데이터와 일맥 상통하다(참고 문헌: McCaffrey, P.G. et al. (1993) Science 262:750-754). NF-ATc, NF-AT3 또는 NF-AT4가 NIP45로 코트랜스펙팅될 경우, NIP45는 실질적으로 NF-ATc 및 NF-AT3 유도된 트랜스액티베이션을 가능하게 하며, 약한 NF-AT4 조절된 트랜스액티베이션을 가능하게 한다(도 15). HepG2 세포에서 NF-ATc와의 상호 협동은 NIP45가 효모 세포에서 NF-ATc RHD 베이트와 상호작용한다는 관찰결과와 일맥 상통하다. 총체적으로, NIP45 과다발현은 4NF-ATc에 의한 트랜스액티베이션의 4배 증가, NF-AT3에 의해 유도된 트랜스액티베이션에션에서는 3배 증가, NF-AT4에 의해 유도된 전사에서는 2배 증가를 유도하였다. NF-AT 패밀리 일원의 RHD의 서열 보존의 높은 정도를 제공하는, 모든 NF-AT 패밀리 일원의 활동을 가능하게 하는 NIP45의 능력은 놀라운 것은 아니다. NF-AT RHD 도메인의 서열 비교는 카르복실 말단의 서열 동일성과 비교하여, 아미노 말단 부분에서 더 높은 수준의 서열 동일성을 나타낸다(참고 문헌: Hoey, T. et al. (1995) 상기에 언급된 문헌). 따라서, NIP45/NF-AT 상호작용 사이트가 RHD의 5' 부분에 위치하는 것으로 여겨진다.
NF-AT 결합 사이트의 다중 복제물을 함유하는 수용체 구조물이 NF-AT 및 NIP45에 의한 트랜스액티베이션을 측정하기 위한 정밀한 방법을 제공하지만, 본 발명자들은 NIP45가 천연 NF-AT 의존 프로모터의 환경에서 기증적인지를 측정하기 위해 연구하였다. IL-4 발현이 아주 조직 특이적이며, T 세포의 Th2 서브셋 및 매스트(mast) 세포에 제한적이다. IL-4 프로모터는 IL-4의 발현에 중요하다고 여겨지는 다중 NF-AT 결합 사이트를 함유한다(참고 문헌: Roone, J. W. et al. (9\1995) Immunity 2:473-483). 또한, 프로토-종양유전자 c-Maf는 IL-4의 조직 특이적 발현과 관련되어 있음을 나타내었다(실시예 3 및 4). 따라서, IL-4 프로모터는 HepG2 세포 라인에서는 활동적이지 않지만, NF-ATp 및 c-Maf의 도입에 의해 활성화될 수 있다. 상기에 설명대로 수행된 코트랜스펙션 실험에서, HepG2 세포를 IL-4-CAT 수용체 구성물(IL-4 프로모터의 -732bp 확장), 및 발현 NIP45, NF-ATp 및 c-Maf에 대한 벡터 또는 대조군으로 트랜스펙팅하였다. NIP45에 대한 대조군은 아미노산 13에서 프레임 시프트 돌연변이다. NF-ATp 및 c-Maf에 대한 대조군은 각각 빈 발현 벡터 pREP4 및 pMEX이다(참고 문헌: Ho, I.C. et al. (1996) Cell 85:973-983). 이러한 실험 결과는 도 16에도시되어 있다(대표적인 CAT 분석 및 막대 그래프는 도 15로서 설명되어 있음). 상기 데이터는 NF-ATp 및 c-Maf와 NIP45의 유입은 NF-Atp 및 c-Maf 단독으로 유입된 것의 IL-4 프로모터의 활동과 비교하여 IL-4 프로모터 활동이 추가적으로 9배 증가하였음을 나타낸다. NIP45는 또한 트랜스펙팅된 NF-ATp의부재하에 IL-4 프로모터의 활성을 증가시키며, 이는 내인성 NF-ATp와의 상호작용에 기인한 것으로 여겨진다.
실시예 14: 내인성 IL-4 생성물에서 NF-ATp 및 c-Maf의 일시적인 과발현
NIP45, NF-ATp 및 c-Maf의 조합물이 일반적으로 IL-4를 생성하지 않는 세포에 의해 내인성 IL-4 발현을 유도하는데 충분한지의 여부를 측정하기 위해, M12 B 림프종 세포를 NIP45 또는 pCI 벡터 대조군과 NF-ATp 및 c-Maf에 대한 발현 플라스미드로 일시적으로 코트랜스펙팅하였다. 975 μF, 280V에서의 일렉트로포레이션 전에 실온에서 10분 동안 0.4ml의 PBS중의 3 x 106세포를 5㎍의 각각의 플라스미드와 인큐베이팅함으로써, M12 세포를 상기에 언급된(Ho, I.C. et al. (1996) Cell 85:973-983)것으로서의 일렉트로포레이션으로 일시적으로 트랜스펙팅시켰다. 72 시간 후에 채취된 상층액중 IL-4의 수준을 시중에서 구입가능한 IL-4 ELISA(파르민겐(Pharmingen))으로 측정하고, 문헌[Ho, I.C. et al. (1996) 상기에 언급됨]에 설명된 것과 같은 변형을 제외하고는 처리 지시에 따라 수행하였다. 일시적인 트랜스펙션의 4개의 독립적인 세트를 처리하고, 배양 상층액으로의 IL-4의 분비를 분석하였다. 4개의 독립적인 트랜스펙션중 하나로부터의 대표적인 실험의 결과는 도 17에 도시되어 있다. 트랜스펙션의 각각의 세트에 있어서, NIP45의 포함은 IL-4 생성물의 극적인 증가를 유도하였다. NIP45로 트랜스펙팅된 세포는 NIP45를 제공받지 못한 세포보다 50 내지 200배 더 많은 내인성 IL-4를 생성하였으며, IL-4 생성물은 검출 한도에 근접했다.
실시예 15: p18 mRNA의 발현은 시험관내에서 T 헬퍼 세포 분화동안 하향조절된다.
Maf 계 단백질 p18은 트랜스액티베이팅 도메인을 함유하는 c-Maf의 아미노산 2/3이 결핍된 "작은 마프(mafs)"의 한 요소이다. 정상적인 T 헬퍼 세포가 Th2 표현형으로 분화되는 중에 p18 전사의 발현을 조사하기 위해서, 시험관내 분화 실험을 실시예 2에 설명된 방법으로 수행하였다. 천연 비장 세포(Th 프리커서(Thp) 세포)를 시토카인 및 항-시토카인 항체(Th1에 대한 IFNγ 및 항-IL-4, 및 Th2에 대한 항-INFγ)의 존재하에, 항-CD3로 처리함으로써 Th1 또는 Th2 경로에 따라 유도하였다. 자극후의 다양한 시점(0, 1, 3, 5 또는 7일)에서 채취된 분화하는 세포의 노던 블롯 분석을 수행하여, p18 및 c-maf 전사의 발현을 분석하였다. 시험관내 실험에서의 분화된 Th2 세포에서 c-maf 및 p18에대한 결과는 도 18에 도시되어 있다. 상기에 언급된 결과들과 일맥 상통하게, c-maf 전사의 발현은 0일째에서 낮은 수준이거나 검출할 수 없었으나, Th2 경로에 따라 분화된 세포와 같이 증가되었다. 이와 반대로, p18의 발현은 0일째(즉, 비분화된 T 세포)에서 검출됐으나, Th2 경로에 따라 분화된 세포와 같이 실질적으로 검출불가능한 수준까지 감소하였다. 이러한 결과는 p18 발현이 Th2 표현형으로 분화되는 동안 정상적인 T 헬퍼 세포에서 하향조절됨을 나타낸다.
실시예 16: p18은 IL-4 프로모터 활성을 억제시킨다.
p18 발현이 IL-4 프로모터 활성에 영향을 끼치는 지의 여부를 조사하기 위해, 코트랜스펙션 실험을 M12B 림프종 세포에서 수행하였다. 이러한 실험에 이용된 방법은 실시예 3에 설명된 것과 동일하다. IL-4 프로모터/CAT 수용체 유전자 구성물을 c-Maf 발현 벡터, p18 발현 벡터 또는 c-Maf와 p18 발현 벡터 둘 모두를 M12 세포에 트랜스펙팅하였다. CAT 분석의 대표적인 결과는 도 19에 도시되어 있다. c-Maf 단독의 발현(5㎍의 플라스미드)은 IL-4 프로모터 구성물의 활성을 유도하였으며(도 19의 레인2 참조), M12 세포의 검출가능한 CAT 활성에 의해 증명되었다. c-Maf를 갖는 p18 발현 벡터(2.5, 5 또는 10㎍)의 공동발현은 CAT 활성을 감소시키고(도 19의 레인 3, 4 및 5레인 참조), 관찰된 CAT 활성에서 더 많은 감소를 유도하는 p18의 양을 증가시켰다. M12 세포의 p18의 단독 발현은 세포에서 검출가능한 CAT 활성을 유도하지 않았다(도 19의 6레인 참조). 이러한 결과는 p18이 c-Maf에 의해 자극되는 IL-4 프로모터 활성을 억제할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 17: c-Maf를 과발현하는 형질전환된 마우스
본 실시예는 형질전환된 마우스의 T 세포에서 c-Maf 단백질을 과다발현을 설명하는 것이다. c-maf 형질전화된 구성물의 개략적인 도면이 도 20에 도시되어 있다. 이러한 구성물은 4kb의 마우스 c-maf cDNA 및 마우스 c-maf 유전자의 제 1 인트론을 포함한다. c-maf cDNA의 발현은 c-maf 제 1 인트론의 5'말단에 유동적으로 연결된 CD4 프로모터/인헨서 조절 영역에 의해 조정되어, 구성물에서 T 세포 특이적 발현을 제공한다. SV40 폴리아데닐레이션 사이트는 c-maf cDNA의 3'말단에 연결되어 있다. 이러한 c-maf 형질전환된 구성물을 수정된 마우스 난모세포에 미세주입시키고, 형질전환된 마우스를 표준 공정에 따라 준비하였다.
c-maf 형질전환된 동물의 표현형을 많은 상이한 분석을 이용하여 와일드형 동물의 발현형과 비교하였다. 첫 번째, 림프성 기관(림프절, 비장 및 흉선)에서 세포의 총수를 측정하였으며, 이 결과는 도 21에 도시되어 있다. 이러한 실험은 와일드형 마우스와 비교할 경우 c-maf 형질전환된 마우스에서, 관찰된 모든 3가지의 림프성 기관의 세포 수 감소가 나타남을 입증하였다. 다음으로, 풍부한 특이적 흉선세포 집단을 혈구계산을 이용하여 c-maf 형질전환된 마우스와 와일드형 마우스를 비교하였다. 이중 파지티브(CD4+또는 CD8+), 이중 네거티브(CD4-CD8-), 및 단일 파지티브 흉선세포(CD4+또는 CD8+)의 양을 측정하였다. 또한 CD4 대 CD8 세포의 비를 측정하였다. 결과는 표 3에 요약되어 있다.
c-Maf 형질전환된 마우스에서 풍부한 특이적 흉선세포 집단
CD4-CD8- CD4+CD8+ CD4+ CD8+ CD4/CD8+
야생형 4.2 ± 0.6 71.6 ± 9.5 8.5 ± 1.6 2.8 ± 0.6 3.2 ± 0.8
형질전환형 2.8 ± 0.6 11.8 ± 8.7 3.8 ± 0.8 2.0 ± 0.6 2.0 ± 0.2
이러한 결과는 와일드형 마우스와 비교하여, c-maf 형질전환된 마우스가 이중 파지티브 흉선세포의 수가 극적으로 감소됐음을 입증한다. 게다가, c-maf 형질전환된 마우스에서는 CD4+단일 파지티브 흉선세포의 수가 현저하게 감소되었다. 최종적으로, c-maf 형질전환된 마우스 및 와일드형 마우스의 혈청에서, IgE의 기본적 수준을 측정하였다. 결과는 도 22에 도시되어 있다. 이러한 실험은 c-maf 형질전환 마우스가 와일드형 마우스와 비교하여 혈청 IgE의 증가된 기본 수준을 나타냄을 입증한다.
상기에 설명된 c-maf 형질전환된 마우스의 표현형(소위 작은 비장 및 흉선, 감소된 수의 이중 파지티브 흉선세포, 및 단일 파지티브 CD4+ 흉선세포, 및 증가된 기본 수준의 혈청 IgE)이 IL-4 과다발현체 형질전환된 마우스에 설명된 표현형과 아주 유사하다(참고 문헌: Tepper et al. (1990) Cell 62:457; and Lewis et al. (1991) J. Exp. Med. 173:89).
균등물
당업자는 본 발명의 특이적 구체예에 대한 많은 균등물을 인지하거나, 단지 일정한 실험을 이용해서 이를 확일할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함된다.
(1) 일반적 사항:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 프레지던트 앤드 펠로우스 오브 하바드 칼리지
(B) 스트리트: 124 마운틴 오번 스트리트
(C) 도시: 캠브리지
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 02138
(ii) 발명의 명칭: 전사 인자 활성을 변조시킴으로써 T 세포 서브셋을 조절하기 위한 방법 및 조성물
(iii) 서열의 수: 6
(iv) 연락처
(A) 수신인: 라히브 & 칵필드
(B) 스트리트: 60 스테이트 스트리트, 슈트 510
(C) 도시: 보스톤
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 02109-1875
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원번호: PCT/US
(B) 출원일:
(C) 분류기호:
(vi) 우선 출원 상황:
(A) 출원번호: US 08/636,602
(B) 출원인: 1996년 4월 23일
(C) 분류기호:
(vi) 우선 출원 상황:
(A) 출원번호: US 08/755,592
(B) 출원일: 25-NOV-1996
(C) 분류기호:
(vi) 우선 출원 상황:
(A) 출원번호: US 08/755,584
(B) 출원일: 25-NOV-1996
(C) 분류기호:
(viii) 변리사/대리인 상황:
(A) 성명: 카라, 캐더린 제이.
(B) 등록번호: P41,106
(C) 참고/서류 번호: HUI-021CPPC
(ix) 통신처:
(A) 전화: (617)227-7400
(B) 팩스: (617)227-5941
(2) 서열번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 33
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 올리고누클레오티드
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 올리고누클레오티드
(2) 서열번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 올리고누클레오티드
(2) 서열번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 23
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 올리고누클레오티드
(2) 서열번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1946
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재위치: 13..1248
(2) 서열번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 412
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질

Claims (87)

  1. 세포를 전사 인자의 발현 또는 활성을 변조시키는 작용제와 접촉시켜 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인의 생성을 변조시키는 것을 포함하는, 세포에 의해 T 헬퍼 타입 2(Th2) 관련된 시토카인의 생성을 변조시키는 방법으로서, 전사 인자가 활성화된 T 세포의 핵 인자(NF-AT) 패밀리 단백질과 공동적으로 작용하여 Th-2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 전사 인자가 Th2 특이적 전사 인자임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 전사 인자가 maf 패밀리 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, maf 패밀리 단백질이 c-Maf임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, maf 패밀리 단백질이 작은 maf 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 작은 maf 단백질이 p18임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 전사 인자가 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 전사 인자가 NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인과 상호작용함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 전사 인자가 NIP45임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 세포내에서 작용하여 전사 인자의 발현 또는 활성을 변조시킴을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 전사 인자를 코드화하는 핵산 분자이며, 핵산 분자가 세포에서의 전사 인자의 발현에 적합한 형태로 세포내에 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 세포내 결합 분자임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 세포가, Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 1가지 이상의 추가의 전사 인자의 활성을 변조시키는 1가지 이상의 추가의 작용제와 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 1가지 이상의 추가의 전사 인자가 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서, Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절에 기여하는 1가지 이상의 추가의 전사 인자를 코드화하는 1가지 이상의 추가의 핵산 분자가 세포내에 도입됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 1가지 이상의 추가의 전사 인자가 NF-AT 패밀리 단백질, NF-AT 상호작용 단백질, maf 패밀리 단백질 및 AP-1 패밀리 단백질로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 헬퍼 타입 1(Th1) 세포, B 세포 또는 비림프성 세포임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 Th2 관련된 시토카인의 생성이 자극됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 Th2 관련된 세포의생성이 억제됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, Th2 관련된 시토카인이 인터루킨-4임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 세포를 피검체에게 투여하여, 피검체내에서 T 헬퍼 타입 1(Th1) 또는 T 헬퍼 타입2(Th2) 세포의 발달을 변조시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 림프성 세포내에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동적으로 결합되는 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  23. 제 22항에 있어서, 조절 서열이 T 세포에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도함을 특징으로 하는 벡터.
  24. 제 22항에 있어서, 조절 서열이 B 세포에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도함을 특징으로 하는 벡터.
  25. 조혈성 간세포에서 특이적으로 maf 패밀리 단백질의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동적으로 결합되는 maf 패밀리 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  26. maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포로서, 림프성 세포인 숙주 세포.
  27. 제 26항에 있어서, T 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  28. 제 26항에 있어서, B 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  29. maf 패밀리 단백질을 코드화하는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포로서, 조혈성 간세포인 숙주 세포.
  30. NIP45 또는 이것의 생물학적 활성 부분을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  31. 서열번호 6의 아미노산 서열과 60% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함하고, NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인과 상호작용하는 단백질을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  32. 제 31항에 있어서, 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열과 70% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  33. 제 31항에 있어서, 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열과 80% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  34. 제 31항에 있어서, 단백질이 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  35. 엄격 조건하에서 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화되는 길이가 15 누클레오티드 이상인 단리된 핵산 분자.
  36. 제 35항에 있어서, 자연발생적인 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  37. 제 36항에 있어서, 마우스 NIP45를 코드화함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  38. 제 36항에 있어서, 사람 NIP45를 코드화함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  39. 서열번호 5의 누클레오티드 서열의 코딩 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  40. 제 39항에 있어서, 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  41. 서열번호 6의 아미노산 서열을 코드화하는 단리된 핵산 분자.
  42. NIP45 융합 단백질을 코드화하는 단리된 핵산 분자.
  43. 제 30항의 핵산 분자에 대해 안티센스인 단리된 핵산 분자.
  44. 서열번호 5의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 코딩 가닥에 안티센스인 단리된 핵산 분자.
  45. 제 44항에 있어서, 서열번호 5의 누클레오티드 서열의 코딩 가닥의 코딩 영역에 안티센스임을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  46. 제 44항에 있어서, 서열번호 5의 누클레오티드 서열의 코딩 가닥의 비코딩 영역에 안티센스임을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  47. 제 30항 내지 제 46항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  48. 제 47항에 있어서, 재조합 발현 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  49. 제 47항 또는 제 48항에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  50. NIP45 단백질이 생성될 때까지 적합한 배지에서 제 49항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, NIP45 단백질 제조 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 배지 또는 숙주 세포로부터 NIP45 단백질을 단리시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  52. 단리된 NIP45 단백질 또는 이것의 생물학적 활성 부분.
  53. 서열번호 6의 아미노산 서열과 60% 이상이 상동인 아미노산 서열을 포함하고, NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인과 상호작용하는 단리된 단백질.
  54. 제 53항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열과 70% 이상이 상동임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  55. 제 53항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열과 80% 이상이 상동임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  56. 제 53항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상이 상동임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  57. 비-NIP45 폴리펩티드에 작동적으로 결합되는 NIP45 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  58. 서열번호 6에 도시된 아미노산 서열중 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 NIP45의 항원성 펩티드로서, NIP45의 에피토프를 포함하여, 펩티드에 대해 유도된 항체가 NIP45와 특이적인 면역 복합체를 형성하는 펩티드.
  59. NIP45 단백질과 특이적으로 결합하는 항체.
  60. 제 59항에 있어서, 단클론성 항체임을 특징으로 하는 항체.
  61. 제 59항에 있어서, 검출성 물질과 커플링됨을 특징으로 하는 항체.
  62. 제 59항 내지 제 61항중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  63. NIP45 단백질을 코드화하는 트랜스유전자를 갖는 세포를 함유하는 사람 이외의 형질전환된 동물.
  64. 제 63항에 있어서, 변화된 내인성 NIP45 유전자를 갖는 세포를 함유함을 특징으로 하는 동물.
  65. maf 패밀리 단백질을 코드화하는 트랜스유전자를 갖는 세포를 함유하는 사람 이외의 형질전환된 동물.
  66. 제 65항에 있어서, maf 패밀리 단백질이 동물의 T 세포에서 우선적으로 발현됨을 특징으로 하는 동물.
  67. 활성화된 T 세포의 핵 인자(NF-AT) 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 방법으로서,
    NF-AT 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 활성을 갖는 지시제 조성물을 제공하는 단계;
    지시제 조성물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    지시제 조성물 내의 전사 인자의 활성에 대한 시험 화합물의 효과를 결정하여, NFAT 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 전사 인자가 maf 패밀리 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, maf 패밀리 단백질이 c-Maf임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 68항에 있어서, maf 패밀리 단백질이 작은 maf 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 67항에 있어서, 전사 인자가 NF-AT 패밀리 단백질과 상호작용함을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71항에 있어서, 전사 인자가 NIP45임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 67항에 있어서, 지시제 조성물이 림프성 세포임을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 림프성 세포가 Th2 세포임을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 67항에 있어서, 지시제 조성물이 효모 세포임을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 67항 내지 제 75항중 어느 한 항에 있어서, 지시제 조성물이 지시제 세포를 포함하고, 지시제 세포가 (i) 전사 인자 및 (ii) 전사 인자에 반응하는 리포터 유전자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서, 지시제 세포가 i) 전사 인자를 코드화하는 재조합 발현 벡터, 및 ii) 리포터 유전자에 작동적으로 결합된 Th2 관련된 시토카인 유전자의 조절 서열을 포함하는 벡터를 함유하며,
    a) 지시제 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    b) 시험 화합물의 존재하에서 지시제내의 리포터 유전자의 발현의 수준을 결정하는 단계; 및
    c) 시험 화합물의 존재하에서 지시제 세포내의 리포터 유전자의 발현의 수준을 시험 화합물의 부재하에서 지시제 세포 내의 리포터 유전자의 발현의 수준과 비교하여, 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 67항 내지 제 72항중 어느 한 항에 있어서, 지시제 조성물이 (i) 전사 인자 및 (ii) 전사 인자가 결합하는 DNA 분자의 제제형을 포함하며,
    a) 지시제 조성물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    b) 시험 화합물의 존재하에서 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용 정도를 결정하는 단계; 및
    c) 시험 화합물의 존재하에서 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용의 정도와 시험 화합물의 부재하에서 전사 인자와 DNA 분자의 상호작용의 정도를 비교하여, 전사 인자의 활성을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 전사 인자가 maf 패밀리 단백질이고, DNA 분자가 maf 반응 요소(MARE)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 67항 내지 제 75항중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자와 상호작용하는 Th2 세포를 확인하는 방법으로서,
    지시제 조성물은 i) 전사 조절 서열에 작동적으로 결합된 리포터 유전자 및ii) NFAT 패밀리 단백질과 공동 작용하여 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현을 변조시키는 전사 인자를 포함하는 제 1 융합 단백질을 코드화하는 제 1 키메라 유전자를 포함하는, 지시제 세포이고,
    시험 화합물은 제 2 키메라 유전자의 라이브러리를 포함하며, 이 라이브러리는 Th2 세포로부터 유도된 단백질을 포함하는 제 2 융합 단백질을 코드화하고,
    리포터 유전자의 발현은 제 1 융합 단백질, 제 2 융합 단백질 및 전사 조절 서열 사이의 상호작용에 민감하며;
    지시제 조성물내의 전사 인자에 대한 시험 화합물의 효과는 지시제 세포내의 리포터 유전자의 발현의 수준을 결정하여, 전사 인자와 상호작용하는 Th2 세포로부터의 단백질을 포함하는 시험 화합물을 확인함으로써 결정됨을 특징으로 하는 방법.
  81. NIP45와 NF-AT 패밀리 단백질의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인하는 방법으로서,
    a) 시험 화합물의 존재 및 부재하에서 (i) NIP45 또는 이것의 NF-AT 상호작용 부분; 및 (ii) NF-AT 패밀리 단백질 또는 이것의 NIP45 상호작용 부분을 조합시키는 단계;
    b) 시험 화합물의 존재 및 부재하에서 (i) 및 (ii) 사이의 상호작용의 정도를 결정하는 단계; 및
    c) NIP45과 NF-AT 패밀리 단백질 사이의 상호작용을 변조시키는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, NF-AT 패밀리 단백질의 NIP45 상호작용 부분이 NF-AT 패밀리 단백질의 Rel 상동성 도메인을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 81항에 있어서, 성분 (i)과 성분 (ii) 사이의 상호작용의 정도가, 성분 (i) 또는 성분 (ii)를 검출성 물질로 표지시키고, 비표지된 성분 (i) 또는 성분 (ii)를 단리시키고, 비표지된 성분 (i) 또는 성분 (ii)과 관련되는 표지된 성분 (i) 또는 성분 (ii)의 양을 정량함으로써 결정됨을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 67항 내지 제 75항 또는 제 81항 내지 제 83항중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응에 대한 화합물의 효과를 결정하는 것을 추가로 포함하여, 면역 반응을 변조시키는 화합물을 확인함을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 84항에 있어서, 면역 반응에 대한 화합물의 효과가 Th2 관련된 시토카인 유전자의 발현에 대한 화합물의 효과를 결정함으로써 결정됨을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 85항에 있어서, Th2 관련된 시토카인 유전자가 인터루킨-4 유전자임을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 84항에 있어서, 면역 반응에 대한 관심있는 화합물의 효과가 T 헬퍼 타입 1(Th1) 또는 T 헬퍼 타입 2(Th2) 세포의 발달에 대한 화합물의 효과를 결정함으로써 결정됨을 특징으로 하는 방법.
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