KR101146335B1 - 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents
알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
하나 이상의 구체예는 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 구체예에 따른 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 간암 발병에 관한 분자생물학적 연구 및 간암 유발 후보 물질 및 간암세포의 증식을 저해하는 후보 물질의 스크리닝을 가능하게 하여 간암 치료에 관한 연구에 이용할 수 있다.
알파태아단백, 간암, 스크리닝
Description
하나 이상의 구체예는 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
세계적으로 간암은 연간 발병률이 전체 암의 4％ 정도이며, 우리나라에서는 위암에 이어 폐암과 비슷한 발생률을 보이고, 사망률에 있어서도 폐암, 위암과 함께 높은 비율을 보이고 있는 국가적으로 간과할 수 없는 중요 질환이다. 한국인 간암의 70％는 B형 간염바이러스 감염에 기인하고, C형 간염바이러스에 의한 것이 13％ 정도, 기타가 18％ 정도를 차지한다고 알려져 있다.
알파태아단백(α-fetoprotein)은 정상적인 태아의 간 조직, 난황 낭 또는 태 아의 위 장관에서 만들어지는 단백질로, 태아나 임산부에서 존재하지만, 대개 정상 성인에게는 나타나지 않는 단백질이다. 그러나, 간암 세포에서 발현되어 높은 농도로 증가하므로, 간암 진단의 보조적 지표로 사용되며, 간암의 치료 정도 및 재발 여부 등의 검사에 이용된다. 또한, 산모의 혈액에서 그 양을 측정하여 태아의 비정상적인 발달을 알아볼 수 있는 수단으로도 사용되고 있다.
관련 기술은 간암 세포에 간암 치료용 화합물 후보군을 접촉시켜 간암 관련 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 단백질의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 간암 치료용 화합물의 스크리닝 방법을 기재하고 있다. 그러나, 기존에 사용하던 방법은 간암 세포로부터 간암 관련 단백질을 추출하여 그 함량을 측정하여야 하므로 그 과정이 복잡하고, 실험동물로부터 조직을 채취하여야 하므로 침습적인 검사가 될 수 밖에 없다. 특히, 간암 치료용 화합물 후보군들 중, 생체 내에서 일어나는 대사를 통해 만들어진 대사물이 간암 세포에 영향을 미치는 경우에 대해서는 스크리닝이 불가능하다는 한계가 있다.
따라서, 알파태아단백을 증가시키는 간암을 유발하는 물질 및 간암세포의 증식을 저해하는 물질, 특히 생체 적합성이 있는 물질을 효과적으로 스크리닝하기 위한 생체 모델 동물이 필요한 실정이다.
일 구체예는, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 제공하는 것이다.
다른 구체예는, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 구체예는, 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입된 마우스의 수정란(수탁번호 KCTC 11544BP)을 제공한다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호(SV40 late polyadenylation signal) 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진다. 보다 구체적으로, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 2,220 bp 위치의 1,653개의 뉴클레오티드이고, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터는 21 bp 위치의 2,143개의 뉴클레오티드이며, 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신 호 부위는 3,904 bp 위치의 222개의 뉴클레오티드이다.
용어 "알파태아단백(α-fetoprotein)"은 정상적인 태아의 간 조직, 난황 낭 또는 태아의 위 장관에서 만들어지는 단백질로, 간암의 발생과 관련하여 혈액 내에서 증가하는 종양지표로 이용 될 수 있다. 따라서, 알파태아단백의 증가 여부는, 예를 들어, 간암의 조기 발견, 간암의 경과 관찰, 간암 치료 효과 판정 또는 간암 재발 여부의 추적에 사용될 수 있다. 한편, 알파태아단백이 증가하는 주요 질환으로는 예를 들어, 원발성 간세포암, 전이성 간암, 간 전이가 없는 위암, 췌장암 등의 암 외에도 간염, 간경변증 또는 선천성 담도폐색증이 있다.
용어 “작동적으로 연결된(operatively linked)”은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 한편, 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 마우스의 수정란에 도입된 후, 마우스의 염색체 내에 삽입되어 있는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 포함된 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 부위는 상업적으로 구입한 벡터로부터 당업자에게 널리 알려진 방법에 따라 정제될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 포함되어 재조합 벡터로 제작될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업자에게 널리 알려진 방법에 따라 제작될 수 있으며, 제작된 재조합 벡터(예를 들어, 도 1에 개시된 pAFP-fLuc)는 세포에 도입되어, 알파태아단백의 발현 여부를 측정하는 데 사용될 수 있다.
다른 구체예는, 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 염색체에 포함하고, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 상기 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 제공한다.
일 구체예에 따른 상기 형질 전환 마우스는 하기 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 데 이용되며, 하기 형질 전환 마우스의 제조 방법을 통해 제작된다.
상기 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 알파태아단백에 의해 전사가 조절되는 인헨서 및 프로모터 하에 작동적으로 연결된 것으로 전사 활성을 용이하게 측정할 수 있는 어떠한 폴리뉴클레오티드도 가능하다. 상기 리포터 단백질은 당업계에 널리 알려진 것으로, 루시퍼라아제(luciferase), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein), 단순 헤르페스 제1형 티미딘 키나제(herpes simplex virus type 1 thymidine kinase) 및 인간 소듐 요오드 심포터(human sodium iodide symporter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들어, 루시퍼라아제를 사용하는 경우, 루시페린을 기질로 사용하여 발생하는 발광신호를 생체 발광 영상 기계를 통해 용이하게 생체 내에서 루시퍼라아제의 발현 여부를 확인할 수 있다.
또 다른 구체예는, 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 마우스의 수정란에 도입시키는 단계; 상기 수정란을 발생시켜 자손 마우스를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 자손 마우스의 염색체로부터 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하여 형질 전환 마우스를 선별하는 단계를 포함하는 형질 전환 마우스의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에 따른 형질 전환 마우스의 제조 방법을 상세히 설명하면, 먼저, 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 마우스의 수정란에 도입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드 절편은 예를 들어, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
이후, 준비된 폴리뉴클레오티드 절편을 마우스의 수정란의 핵에 미세주입하고, 이를 대리모의 수란관에 이식하여 자손 마우스를 수득한다. 이들 수득한 자손 마우스 중에서 형질 전환된 마우스를 선별하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드 절편이 마우스의 염색체에 제대로 삽입되었는지 여부를 확인한다. 상기 폴리뉴클레오티드 절편의 삽입 여부는 예를 들어, 삽입한 폴리뉴클레오티드 절편 내의 염기 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 형질 전환 마우스 후보군의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행하는 방법을 통해 확인할 수 있다.
한편, 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입된 마우스로부터, 알파태아단백이 발현되는 조건 하(예를 들어, 1일령의 형질 전환 마우스에서 루시퍼라아제 발현 여부의 측정)에서 루시퍼라아제가 발현됨을 확인하여, 그 수정란을 2009년 8월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11544BP).
다른 구체예는, 상기 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 시험 물질을 투여하는 단계; 및 상기 형질 전환 마우스의 세포에서 리포터 단백질 발현의 증가 여부를 측정하는 단계를 포함하는 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 탐색된 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 간암 유발 후보 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법에 의하면, 우선 상기 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 분석하고자 하는 시험 물질을 투여시킨다. 상기 시험 물질의 투여는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여)를 할 수 있다. 상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험 물질”은 알파태아단백을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사량 또는 알파태아단백의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 시험 물질이 투여된 형질 전환 마우스에서 리포터 단백질 발현의 증가 여부를 측정한다. 측정 결과, 리포터 단백질 발현이 증가되는 것이 측정되면, 상기 시험 물질은 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질로 판정될 수 있다. 또한, 알파태아단백은 간암 세포에서 많이 발현이 되므로, 상기 탐색된 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질은 간암 유발 후보 물질로 결정할 수 있다.
리포터 단백질 발현양 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 리포터 단백질로써 루시퍼라아제가 사용된 경우에는 루시페린 투여 후, 생체 발광 영상 기계를 이용하여 루시퍼라아제 발현에 의한 발광 정도를 신호로 용이하게 검출할 수 있다.
또 다른 구체예는, 상기 형질 전환 마우스에 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 투여하는 단계; 상기 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 시험 물질을 투여하는 단계; 및 상기 형질 전환 마우스의 세포에서 리포터 단백질 발현의 감소 여부를 측정하는 단계를 포함하는 알파태아단백 발현의 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 탐색된 감소 유도 물질을 간암세포의 증식을 저해하는 후보 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 방법에 의하면, 우선 상기 형질 전환 마우스에 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 투여시킨다. 알파 태아단백 발현의 증가 유도 물질은 기존에 당업자에게 알려진 물질 또는 상기 일 구체예에 따른 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질의 스크리닝 과정을 통해 탐색된 물질일 수 있다.
이후, 상기 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 시험 물질을 투여한다. 상기 시험 물질의 투여에 관한 설명은 상기 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 스크리닝하는 방법에 기재된 방법과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이어서, 시험 물질이 투여된 형질 전환 마우스에서 리포터 단백질 발현의 감소 여부를 측정한다. 측정 결과, 리포터 단백질 발현이 감소되는 것이 측정되면, 상기 시험 물질은 알파태아단백 발현의 감소 유도 물질로 판정될 수 있다. 또한, 알파태아단백은 간암 세포에서 많이 발현이 되므로, 상기 탐색된 알파태아단백 발현의 감소 유도 물질은 간암 세포의 증식을 저해하는 후보 물질로 결정할 수 있다.
한편, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 리포터 단백질의 발현 여부는 형질 전환 마우스를 희생시키지 않고 확인할 수 있다. 예를 들어, 리포터 단백질로써 루시퍼라아제를 사용하는 경우에는 생체발광 영상 기계를 이용하여 루시페린을 형질 전환 마우스에 직접 투여하여 발생하는 발광신호를 검출하게 되므로, 형질 전환 마우스의 희생 없이 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 동일 개체에서 지속적으로 스크리닝할 수 있다. 또는, 마우스를 희생하여 기관을 적출 한 후, 그 기관의 세포로부터 상기 리포터 단백질의 발현 여부를 측정할 수도 있다. 이러한 경우, 상기 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 형질 전환 마우스의 세포는 간 세포일 수 있다.
하나 이상의 구체예에 따른 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 간암 발병에 관한 분자생물학적 연구 및 간암 유발 후보 물질 및 간암세포의 증식을 저해하는 후보 물질의 스크리닝을 인 비보에서 가능하게 하여 간암의 발병, 치료 및 치료 예후에 관한 연구에 이용할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제 발현 재조합 벡터의 제작
인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)는 pDRIVE-AFP/hAFP(Invivogen, USA)로부터 5' 위치에 제한 효소 MluI의 인식 염기 서열을 포함하는 프라이머(서열번호 3) 및 3' 위치에 제한 효소 XhoI의 인식 염기 서열을 포함하는 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 증폭하였으며, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 크기는 2,143 bp였다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 MluI과 XhoI 제한 효소를 처리하여 각각 점착성 말단(sticky end)를 갖도록 하였다. 이후, MluI 과 XhoI 제한 효소로 처리한 pGL3-Basic 벡터 (Promega co, GenBank No. U47295, 4,818bp) 및 상기 증폭된 폴리뉴클레오티드를 리가아제를 사용하여 연결(ligation)하여 재조합 벡터를 제작하였다. 제작한 재조합 벡터를 pAFP-fLuc으로 명명하였다(도 1). 상기 재조합 벡터는 염기 서열 분석(바이오닉스, 한국)을 통하여 클로닝이 제대로 이루어졌는지 여부를 확인하였다.
실험에 사용된 세포주의 알파태아단백 분비 유무를 확인하기 위하여 HuH-7과 사람태아신장세포주 293A를 6-웰 플레이트에 웰당 각각 2 X 105 과 1 X 105 씩 준비하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 우태아혈청이 없는 배지로 바꾸어준 뒤 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양상등액으로부터 알파태아단백 분비 함량을 측정하였다. 293A의 배양상등액에서는 0.268 ng/day/105/㎖의 알파태아단백 함량이 측정되었고, HuH-7의 배양상등액에서는 2133.95 ng/day/105/㎖의 알파태아단백 함량이 측정되었다(n=3) (표 1). HuH-7에서 분비되는 알파태아단백의 측정된 양과 비교해 보았을 때, 293A는 알파태아단백을 분비하지 않는 세포주임을 알 수 있었다.
| 세포주 | 알파태아단백의 농도(ng/day/105/㎖) |
| HuH7 | 2133.95 ± 92.801 |
| 293A | 0.268 ± 0.135 |
알파태아단백 양성인 간암세포에 도입된 재조합 벡터 pAFP-fLuc로부터 루시퍼라아제의 발현이 효과적으로 일어나는지 여부를 확인하였다 (도 2). 알파태아단백 양성인 간암세포(HuH-7)와 알파태아단백 음성인 사람태아신장 세포주 293A에 대조군 벡터인 pCMV-fLuc 또는 재조합 벡터인 pAFP-fLuc를 각각 도입한 후, 루시퍼라아제의 활성을 측정하였다. HuH-7을 상기 두 종류의 벡터로 각각 형질 전환시킨 결과, pAFP-fLuc으로 형질 전환된 HuH-7에서의 루시퍼라아제의 활성이 pCMV-fLuc으로 형질 전환된 HuH-7과 비교하였을 때 약 81.5%에 해당하는 활성을 나타냈고, 알파태아단백 양성 간암세포에서 알파태아단백 프로모터의 활성이 강력한 프로모터로 알려진 CMV 프로모터의 활성과 비슷한 것으로 나타났다. 이에 반해, 293A에 pCMV-fLuc 또는 pAFP-fLuc를 도입한 경우에는, pAFP-fLuc으로 형질 전환된 293A에서의 루시퍼라아제 활성이 pCMV-fLuc로 형질 전환시킨 293A의 40.5%에 해당하는 활성이 측정되었다. 이러한 결과로부터, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터가 재조합된 벡터 pAFP-fLuc는 알파태아단백 양성인 세포주(HuH-7)에 형질 전환되었을 때 효과적으로 루시퍼라아제 활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
2:
알파태아단백
인헨서
및 프로모터의 조절을 받는
루시퍼라아제
발현 형질 전환 마우스의 생산
상기 실시예 1에서 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 활성이 확인된 pAFP-fLuc 재조합 벡터를 제한 효소 MluI 및 SalI으로 처리한 후, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 그에 작동적으로 연결된 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편(3,796bp)을 잘라내어 정제하고, 상기 폴리뉴클레오티드 절편을 C57BL 마우스의 수정란에 미세주입(microinjection)하였다. 이후, 상기 폴리뉴클레오티드 절편을 미세주입한 수정란을 대리모의 수란관에 삽입한 후 봉합하였다. 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편이 염색체 내에 삽입되었는지 확인하기 위해, 태어난 마우스 자손의 꼬리로부터 추출한 게놈 DNA 및 프라이머 쌍(서열번호 5 및 서열번호 6)을 사용하여 유전자를 증폭한 다음, 전기 영동을 수행하였다 (도 3). 도 3에서 나타난 바와 같이, PCR 수행 결과 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편이 염색체에 삽입된 마우스 자손은 770 bp에서 증폭되어 나타났다. 이로부터, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제 발현 형질 전환 마우스를 선별할 수 있었으며, 그 결과 총 110마리의 마우스 자손 중에서 11마리의 양성 형질 전환 마우스를 수득하였다 (자성: 3마리, 웅성: 8마리). 한편 상기 수행한 PCR 조건은 다음과 같다: DNA 변성을 위해 94℃에서 5분; DNA 절편의 증폭을 위해 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분을 35회 반복하고; 마지막으로, 추가 연장을 위해 72℃에서 10분. 또한, 상기 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편이 도입된 수정란을 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2009년 8월 6일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11544BP).
실시예
3: 형질 전환 마우스에서
루시퍼라아제
발현 양상 분석
상기 실시예 2에서 수득한 양성의 형질 전환 마우스(웅성 #39)를 야생형 자성 C57BL 마우스와 교배하여 7마리의 자손을 얻었다. 1일령 마우스 자손에게 루시페린(luciferin)을 복강에 150 mg/kg로 주사한 후 IVIS-200 (Xenogen)을 사용하여 루시퍼라아제 발현 여부를 확인하였다. 그 결과 7마리의 자손 중 3마리의 자손에서 루시퍼라아제가 발현되었음을 확인할 수 있었다. 7마리 중 3마리가 표현형이 양성으로 나타난 것은 멘델 법칙에 일치하는 결과였다. 또한, 대조군으로 야생형 C57BL 웅성 마우스와 자성 마우스를 교배시켜 얻은 1일령 마우스 자손에서 루시퍼라아제의 발현 여부를 확인하기 위한 영상을 촬영한 결과, 어느 부위에도 루시퍼라아제가 발현되지 않았음을 확인하였다 (도 4).
상기 1일령 양성 형질 전환 마우스에서 루시퍼라아제 활성이 나타난 조직의 위치를 확인하기 위하여, 마우스를 희생시킨 후, 폐, 심장, 간, 위 및 장을 각각 적출하여 루시퍼라아제 발현 여부를 확인하였다 (도 5). 그 결과, 야생형 마우스로부터 수득한 마우스 자손은 상기 모든 장기에서 루시퍼라아제가 발현하지 않았으나, 양성의 형질 전환 마우스(웅성 #39)를 교배하여 얻은 1일령 마우스 자손은 간 조직에서 루시퍼라아제 활성이 측정되었으며, 나머지 장기(허파, 심장, 위, 장)에서는 루시퍼라아제 활성이 나타나지 않았다.
또한, 상기 양성 형질 전환 마우스의 자손에서 생후 시간이 지남에 따라 루시퍼라아제의 발현이 어떻게 변화하는지 여부를 분석하였다. 1일령, 5일령 및 10일령의 형질 전환 마우스의 루시퍼라아제 발현 여부를 촬영한 결과, 1일령의 마우스에서 가장 강한 루시퍼라아제 활성이 있음을 확인할 수 있었으며, 10일령의 마우스에서는 루시퍼라아제의 활성이 거의 사라짐을 확인할 수 있었다(도 6). 또한, 성체 마우스에서는 루시퍼라아제 활성이 없음을 확인하였다.
1일령의 형질 전환 마우스 및 야생형 마우스로부터 각각 간 조직을 적출하여, 그로부터 각각 전체 RNA를 추출하였다. 이후, 루시퍼아라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍(서열번호 7 및 서열번호 8)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 형질 전환 마우스의 간 조직으로부터 추출한 RNA를 주형으로 한 시료에서만 증폭 산물이 확인되었다 (도 7). 상기 결과로부터, 형질 전환 마우스의 간 조직에서 루시퍼라아제가 발현되었으며, 야생형 마우스의 간 조직에서는 루시퍼라아제가 발현되지 않았음을 확인할 수 있었다.
도 1은 일 구체예에 따른 루시퍼라아제을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 포함하는 재조합 벡터 pAFP-fLuc의 지도를 나타낸다.
도 2는 재조합 벡터 pAFP-fLuc 또는 대조군 벡터 pCMV-fLuc를 각각 알파태아단백 발현 양성인 간암 세포주(HuH-7) 또는 알파태아단백 발현 음성인 사람태아신장암세포주 (293A)에 각각 도입한 후, 루시퍼라아제의 발현 정도를 측정한 그래프를 나타낸다.
도 3은 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받는 루시퍼라아제 발현 형질 전환 마우스를 선별하기 위한 PCR 결과의 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 4는 1일령인 형질 전환 마우스의 루시퍼라아제 발현 여부를 확인한 사진을 나타낸다.
도 5는 1일령인 형질 전환 마우스 및 야생형 마우스로부터 적출한 폐, 심장, 간, 위 및 장 조직으로부터 루시퍼라아제 발현 여부를 확인한 사진을 나타낸다.
도 6은 양성 형질 전환 마우스의 자손에서 생후 시간에 따른 루시퍼라아제의 발현 여부를 분석한 사진을 나타낸다.
도 7은 1일령인 형질 전환 마우스의 간 조직으로부터 추출한 RNA를 주형으로 한 RT-PCR 결과의 전기 영동 사진을 나타낸다.
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alpha-fetoprotein enhancer and promoter, method for preparation
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<210> 1
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<220>
<223> recombinant plasmid pAFP-fLuc
<400> 1
ggtaccgagc tcttacgcgt cttagaaata tgggggtagg ggtggtggtg gtaattctgt 60
tttctcccca taggtgagat aagcattggg ttaaatgtgc tttctctctc tccctctcct 120
ttcttaagaa ttaagggaca gactatgggc tggaggactt tgaggatgtc tgtctcataa 180
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tatttctatt tatttatgct tgtgacaaat gttttgttcg ggaccacagg aatcacaaag 540
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gtgaatattt gaaaacattt tcaactaacc aaccacccaa tccaacaaac aaaaaatgaa 840
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aaatcagatt gaattatttg cctgtcatac agctaataat tgaccataag acaattagat 1140
ttaaattagt tttgaatctt tctaatacca aagttcagtt tactgttcca tgttgcttct 1200
gagtggcttc acagacttat gaaaaagtaa acggaatcag aattacatca atgcaaaagc 1260
attgctgtga actctgtact taggactaaa ctttgagcaa taacacatat agattgagga 1320
ttgtttgctg ttagtataca aactctggtt caaagctcct ctttattgct tgtcttggaa 1380
aatttgctgt tcttcatggt ttctcttttc actgctatct atttttctca accactcaca 1440
tggctacaat aactgtctgc aagcttatga ttcccaaatg tctatctcta gcctcaatct 1500
tgttccagaa gataaaaagt agtattcaaa tgcacatcaa cgtctccact tggagggctt 1560
aaagacgttt caacatacaa accggggagt tttgcctgga atgtttccta aaatgtgtcc 1620
tgtagcacat agggtcctct tgttccttaa aatctaatta cttttagccc agtgctcatc 1680
ccacctatgg ggagatgaga gtgaaaaggg agcctgatta ataattacac taagtcaata 1740
ggcatagagc caggactgtt tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca 1800
aaactgaaca tgtacttagt tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct 1860
ttatccaggc cactagagtt tgaggagaat atttgttata tttgcaaaat aaaataagtt 1920
tgcaagtttt ttttttctgc cccaaagagc tctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa 1980
ccgctatgct gttaattatt gacaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag 2040
taacagatat accaacaaaa ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa 2100
gaatttcagc atgattttcc atattgtgct tccaccactg ccaataacaa aataactagc 2160
aacctcgaga tctgcgatct aagtaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacca 2220
tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa 2280
ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg 2340
cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg 2400
ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat 2460
gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg 2520
cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt 2580
cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa 2640
aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat taccagggat 2700
ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat gaatacgatt 2760
ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac tcctctggat 2820
ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc 2880
atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg 2940
ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc 3000
gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca 3060
agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga 3120
ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta 3180
aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg 3240
ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg 3300
cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa 3360
cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt 3420
atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg 3480
gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc ctgaagtctc 3540
tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc ttgctccaac 3600
accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc 3660
ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag atcgtggatt 3720
acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg tttgtggacg 3780
aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag atcctcataa 3840
aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aattctagag tcggggcggc cggccgcttc 3900
gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 3960
aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 4020
gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 4080
tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc 4140
cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc 4200
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gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 4380
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 4440
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 4500
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 4560
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 4620
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 4680
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 4740
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 4800
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 4860
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 4920
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 4980
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 5040
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 5100
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 5160
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 5220
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 5280
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cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 5700
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 5760
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ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 5880
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 5940
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 6000
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 6060
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 6120
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 6180
atttccccga aaagtgccac ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 6240
ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 6300
tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 6360
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gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 6480
ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 6540
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agcggccgca ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa 6840
tcgatagtac taacatacgc tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa 6900
taggctgtcc ccagtgcaag tgcaggtgcc agaacatttc tctatcgata 6950
<210> 2
<211> 2143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment including enhancer and promoter of human
alpha-fetoprotein
<400> 2
cttagaaata tgggggtagg ggtggtggtg gtaattctgt tttctcccca taggtgagat 60
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gactatgggc tggaggactt tgaggatgtc tgtctcataa cacttgggtt gtatctgttc 180
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gaggggatag atcattttca tgatatatga gaaaaattaa aaatcagatt gaattatttg 1080
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tctaatacca aagttcagtt tactgttcca tgttgcttct gagtggcttc acagacttat 1200
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aagcttatga ttcccaaatg tctatctcta gcctcaatct tgttccagaa gataaaaagt 1500
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tgttccttaa aatctaatta cttttagccc agtgctcatc ccacctatgg ggagatgaga 1680
gtgaaaaggg agcctgatta ataattacac taagtcaata ggcatagagc caggactgtt 1740
tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca aaactgaaca tgtacttagt 1800
tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct ttatccaggc cactagagtt 1860
tgaggagaat atttgttata tttgcaaaat aaaataagtt tgcaagtttt ttttttctgc 1920
cccaaagagc tctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa ccgctatgct gttaattatt 1980
gacaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag taacagatat accaacaaaa 2040
ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa gaatttcagc atgattttcc 2100
atattgtgct tccaccactg ccaataacaa aataactagc aac 2143
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying polynucleotide including enhancer
and promoter of human alpha-fetoprotein
<400> 3
gatcacgcgt gcttagaaat atgggggtag 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying polynucleotide including enhancer
and promoter of human alpha-fetoprotein
<400> 4
gatcctcgag gttgctagtt attttgttat tg 32
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for identifying polynucleotide encoding luciferase
under regulation of alpha-fetoprotein enhancer and promoter
<400> 5
aataggcata gagccaggac t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for identifying polynucleotide encoding luciferase
under regulation of alpha-fetoprotein enhancer and promoter
<400> 6
aacgcgccca acaccggcat a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for identifying polynucleotide encoding luciferase
<400> 7
ggcctttatg aggatctctc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for identifying polynucleotide encoding luciferase
<400> 8
cgccttgatt gacaaggatg g 21
Claims (11)
- 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입된, 수탁번호 KCTC 11544BP인 마우스의 수정란.
- 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호(SV40 late polyadenylation signal) 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 염색체에 포함하고, 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 상기 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스.
- 제2항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 단순 헤르페스 제1형 티미딘 키나제 및 인간 소듐 요오드 심포터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질 전환 마우스.
- 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 인간의 알파태아단백 인헨서 및 프로모터 및 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 하류에 연결된 SV40 폴리아데닐화 신호 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 절편을 마우스의 수정란에 도입시키는 단계; 상기 수정란을 발생시켜 자손 마우스를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 자손 마우스의 염색체로부터 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하여 형질 전환 마우스를 선별하는 단계를 포함하는 형질 전환 마우스의 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 단순 헤르페스 제1형 티미딘 키나제 및 인간 소듐 요오드 심포터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제2항 또는 제3항의 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 시험 물질을 투여하는 단계; 및 상기 형질 전환 마우스의 세포에서 리포터 단백질 발현의 증가 여부를 측정하는 단계를 포함하는 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 세포는 간 세포인 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 탐색된 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 간암 유발 후보 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제2항 또는 제3항의 형질 전환 마우스에 알파태아단백 발현의 증가 유도 물질을 투여하는 단계; 상기 형질 전환 마우스에 분석하고자 하는 시험 물질을 투여하는 단계; 및 상기 형질 전환 마우스의 세포에서 리포터 단백질 발현의 감소 여부를 측정하는 단계를 포함하는 알파태아단백 발현의 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 세포는 간 세포인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 탐색된 감소 유도 물질을 간암세포의 증식을 저해하는 후보 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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