CN115322997A - 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115322997A
CN115322997A CN202210557822.4A CN202210557822A CN115322997A CN 115322997 A CN115322997 A CN 115322997A CN 202210557822 A CN202210557822 A CN 202210557822A CN 115322997 A CN115322997 A CN 115322997A
Authority
CN
China
Prior art keywords
product
pgl
pcr
mcherry
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210557822.4A
Other languages
English (en)
Inventor
刘田田
李涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Original Assignee
Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM filed Critical Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority to CN202210557822.4A priority Critical patent/CN115322997A/zh
Publication of CN115322997A publication Critical patent/CN115322997A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，该方法为：制备KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物，最终HindIII/BglII双酶切中间载体pGL‑35S‑35S‑mCherry的回收产物，得到pBiflu荧光标签表达载体，还提供了应用，用于植物原生质体的转化，基因启动子转录活力的检测。

Description

一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用。
背景技术
黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein，YFP)是将绿色荧光蛋白(GFP)第203为苏氨酸突变体为色氨酸，可以稳定生色团在激发状态的偶极矩，使GFP的激发光和发射光波长均增加20nm。而增强型黄色荧光蛋白EYFP是YFP进一步改造成的增强黄色荧光蛋白，激发波长为514nm，发射波长为527nm。相对于YFP，EYFP荧光强度更强、荧光性质更稳定，是目前应用最为广泛的荧光蛋白之一。
mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚的红色荧光蛋白，被广泛用于标记和示踪某些分子和细胞组分。mCherry可以和其他荧光蛋白共同标记，且mCherry相对于其他单体荧光蛋白，具有卓越的光稳定性。mCherry的最大激发光为587nm，发射光为610nm，其对光致漂白耐受，荧光非常稳定。mCherry具有较快成熟速度，t0.5为15min，这在一些需要做出快速反应的实验非常重要，如启动子活性报告系统等。
荧光蛋白的主要应用包括：①活细胞标记：与荧光素/荧光素酶不同，荧光蛋白无需任何辅助因子，只需相应激光照射便能自发光；且荧光蛋白毒性较弱，适合标记活体细胞及组织。②作为报告基因和融合标签：将荧光蛋白基因连接到目的基因启动子后，通过检测荧光强度便可对该基因表达水平进行评估；或者将荧光蛋白作为标签，与目的蛋白融合表达，可用于目的蛋白表达定位、迁移、构象变化及分子相互作用检测。③荧光蛋白用于细胞筛选：将待分离细胞用不同荧光标记，通过流式细胞术富集同种荧光标记的细胞。
目前，用于检测基因启动子转录活性的方法是双荧光素酶报告基因系统，该系统是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，将目的基因转录原件克隆在萤火虫荧光素酶基因上游，构建荧光素酶报告质粒，转染细胞，通过荧光素酶活性高低评价转录活性。为了减少内在变化因素对实验的影响，同时转染带有海肾荧光素酶基因的质粒作为对照质粒，使结果不受实验条件变化的干扰。该系统用于基因转录活性检测存在许多缺陷：①两个质粒同时转染难以保证各组别间两质粒转染效率的同步，实验重复性不好。②双荧光素酶系统检测信号时需要破碎细胞或组织，无法在活细胞或组织内检测。③目前市面上的双荧光素酶报告基因检测试剂盒昂贵，且没有专门用于植物原生质体的检测质粒。
因此，在实际分子生物学研究中急需一种能用于植物原生质体检测基因转录活性的双荧光报告载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用，该pBiflu荧光标签表达载体可用于原生质体中基因启动子转录活力的检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，该方法为：
S1、在温度为37℃的条件下，用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体6h，1％琼脂糖凝胶分离，回收4.8Kb大小的条带，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；
S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，用特异性引物F1和特异性引物R1进行PCR反应克隆2×35S启动子，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1 1μL、特异性引物R1 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S3、利用同源重组方法将S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S连接产物，将所述pGL-35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S；
S4、在温度为37℃的条件下，将S3中得到的中间载体pGL-35S用XhoI/SalI双酶切6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.67Kb大小的条带，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物；
S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；
所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS；
S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收251bp大小的PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F2 1μL、特异性引物R2 1μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
S8、将S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.72Kb大小的产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物；
S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S-MCS-Nos连接产物，将所述pGL-35S-MCS-Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Nos；
S10、将S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos用EcoRI/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.97Kb大小的产物，得到EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物；
S11、克隆mCherry序列：以pmR-mCherry质粒为模板，以特异性引物F3和特异性引物R3为引物进行PCR反应克隆mCherry序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收711bp大小的PCR产物，得到mCherry序列的PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Master Mix 10μL，特异性引物F3 1μL、特异性引物R3 1μL、pmR-mCherry质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述特异性引物R3核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
S12、将S11中得到的mCherry序列的PCR回收产物的mCherry序列T4连接至S10中得到的EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的EcoRI/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-mCherry；
S13、克隆2×35S启动子序列：以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，以特异性引物F4和特异性引物R4为引物进行PCR反应克隆2×35S启动子序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F4 1μL、特异性引物R4 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述特异性引物R4核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
S14、将S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry用BamHI/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物；
S15、将S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物的2×35S启动子序列T4连接至S14中得到的到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物的BamHI/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-35S-mCherry；
S16、克隆EYFP-Nos序列：以pYFPLT质粒为模板，以特异性引物F5和特异性引物R5为引物进行PCR反应克隆EYFP-Nos序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收965bp大小的PCR产物，得到EYFP-Nos序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F5 1μL、特异性引物R5 1μL、pYFPLT质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸30s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述特异性引物R5核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
S17、将S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry用HindIII/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下5.51Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物；
S18、将S16中得到的EYFP-Nos序列PCR回收产物同源重组至S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物的HindIII/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pBiflu荧光标签表达载体连接产物；将所述pBiflu荧光标签表达载体连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到pBiflu荧光标签表达载体，命名为pBiflu荧光标签表达载体；所述pBiflu荧光标签表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
优选地，S1中用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的酶切体系为：KpnI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、pGL3 Basic载体10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S3中所述连接反应的反应体系为：2×HieffClone Enzyme Premix 5μL、S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物2μL、S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S4中所述酶切反应的体系为：酶切体系为：SalI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmartbuffer 5μL、S3中得到的中间载体pGL-35S 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S5中所述退火的反应体系为：多克隆位点MCS正向引物10μL、多克隆位点MCS反向引物10μL、灭菌超纯水补至100μL；
S6中所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物2μL、S5中得到的MCS退火引物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S8中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、SalI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S9中所述连接反应的反应体系为：2×HieffClone Enzyme Premix 5μL、S6中得到的EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物2μL、S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S10中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、BamHI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S12中所述连接反应的体系为：所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S10中所述EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物2μL、S11中所mCherry产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S14中所述酶切反应的体系为：BamHI酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S15所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S14中所述BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物2μL、S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
S17所述酶切反应的体系为：HindIII酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S18中所述连接反应的反应体系为：2×Hieff Clone Enzyme Premix 5μL、S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物2μL、S16中得到的EYFP-Nos启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
本发明还提供了上述制备的pBiflu荧光标签表达载体的应用，所述pBiflu荧光标签表达载体用于植物原生质体的转化，用于所述植物原生质体中基因启动子转录活力的检测。
优选地，所述植物原生质体包括拟南芥原生质体或者玉米原生质体。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的的pBiflu荧光标签表达载体框架较小，全长6500bp，适用于植物原生质体转化。且载体框架上含有高拷贝数的细菌的复制子(ori)，容易得到大量纯化的质粒用于原生质体转化。本发明的pBiflu荧光标签表达载体中EYFP上游的35S启动子(CaMV 35Spromoter enhanced)可替换为目的基因启动子，启动EYFP表达；与下游2×35S启动子表达的mCherry荧光强度作比值，用于植物原生质体中目的基因启动子转录活性检测。
2、本发明的pBiflu荧光标签表达载体可单独转染原生质体作为对照，通过与两个强启动子启动的EYFP/mCherry荧光比值作对比，可精确评估目的基因启动子的转录活力。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的实施例1的pGL3 Basic载体的物理图谱。
图2是本发明的实施例1制备的pBiflu荧光标签表达载体的物理谱图。
图3是本发明的实施例2的pBiflu荧光标签表达载体转化至拟南芥和玉米原生质体后的EYFP及mCherry发光图。
图4是本发明的实施例2的pBiflu荧光标签表达载体转化至拟南芥和玉米原生质体后的检测EYFP和mCherry的Western blotting图。
图5是本发明的实施例2的过表达拟南芥转录因子HY5的35Spro::HY5质粒与pBiflu-CHSpro报告载体共转化至拟南芥原生质体的EYFP与mCherry荧光图。
图6是本发明的实施例2的过表达拟南芥转录因子HY5的35Spro::HY5质粒与pBiflu-CHSpro报告载体共转化至拟南芥原生质体的EYFP与mCherry荧光强度统计图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，该方法为：
S1、在温度为37℃的条件下，用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体6h，1％琼脂糖凝胶分离，回收4.8Kb大小的条带，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；pGL3Basic载体的物理图谱如图1所示；
S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，用特异性引物F1和特异性引物R1进行PCR反应克隆2×35S启动子，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1 1μL、特异性引物R1 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S3、利用同源重组方法将S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S连接产物，将所述pGL-35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S；
S4、在温度为37℃的条件下，将S3中得到的中间载体pGL-35S用XhoI/SalI双酶切6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.67Kb大小的条带，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物；
S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；
所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS；
S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收251bp大小的PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F2 1μL、特异性引物R2 1μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
S8、将S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.72Kb大小的产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物；
S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S-MCS-Nos连接产物，将所述pGL-35S-MCS-Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Nos；
S10、将S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos用EcoRI/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.97Kb大小的产物，得到EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物；
S11、克隆mCherry序列：以pmR-mCherry质粒为模板，以特异性引物F3和特异性引物R3为引物进行PCR反应克隆mCherry序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收711bp大小的PCR产物，得到mCherry序列的PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Master Mix 10μL，特异性引物F3 1μL、特异性引物R3 1μL、pmR-mCherry质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述特异性引物R3核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
S12、将S11中得到的mCherry序列的PCR回收产物的mCherry序列T4连接至S10中得到的EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的EcoRI/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-mCherry；
S13、克隆2×35S启动子序列：以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，以特异性引物F4和特异性引物R4为引物进行PCR反应克隆2×35S启动子序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F4 1μL、特异性引物R4 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述特异性引物R4核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
S14、将S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry用BamHI/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物；
S15、将S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物的2×35S启动子序列T4连接至S14中得到的到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物的BamHI/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-35S-mCherry；
S16、克隆EYFP-Nos序列：以pYFPLT质粒为模板，以特异性引物F5和特异性引物R5为引物进行PCR反应克隆EYFP-Nos序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收965bp大小的PCR产物，得到EYFP-Nos序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F5 1μL、特异性引物R5 1μL、pYFPLT质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸30s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述特异性引物R5核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
S17、将S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry用HindIII/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下5.51Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物；
S18、将S16中得到的EYFP-Nos序列PCR回收产物同源重组至S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物的HindIII/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pBiflu荧光标签表达载体连接产物；将所述pBiflu荧光标签表达载体连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到pBiflu荧光标签表达载体(物理图谱如图2所示)；所述pBiflu荧光标签表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
S1中用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的酶切体系为：KpnI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、pGL3 Basic载体10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S3中所述连接反应的反应体系为：2×HieffClone Enzyme Premix 5μL、S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物2μL、S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S4中所述酶切反应的体系为：酶切体系为：SalI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmartbuffer 5μL、S3中得到的中间载体pGL-35S 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S5中所述退火的反应体系为：多克隆位点MCS正向引物10μL、多克隆位点MCS反向引物10μL、灭菌超纯水补至100μL；
S6中所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物2μL、S5中得到的MCS退火引物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S8中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、SalI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S9中所述连接反应的反应体系为：2×HieffClone Enzyme Premix 5μL、S6中得到的EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物2μL、S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S10中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、BamHI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S12中所述连接反应的体系为：所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S10中所述EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物2μL、S11中所mCherry产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S14中所述酶切反应的体系为：BamHI酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S15所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S14中所述BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物2μL、S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
S17所述酶切反应的体系为：HindIII酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S18中所述连接反应的反应体系为：2×Hieff Clone Enzyme Premix5μL、S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物2μL、S16中得到的EYFP-Nos启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
实施例2
本实施例为实施例1制备的pBiflu荧光标签表达载体的应用，所述pBiflu荧光标签表达载体用于植物原生质体的转化，用所述pBiflu荧光标签表达载体构建目标基因启动子驱动的表达系统，用于研究启动子与反式作用因子互作调控目标基因转录活性，用于所述植物原生质体中基因启动子转录活力的检测。
(1)利用PEG介导的方法将pBiflu荧光标签表达载体转化至拟南芥和玉米原生质体，用于检测pBiflu荧光标签表达载体在原生质体中的表达情况。
将转化后的拟南芥和玉米原生质体在激光共聚焦显微镜488nm激发光和561nm下观察EYFP和mCherry发光情况，如图3，可见视野里基本所有的细胞都能发光，图3中左侧为黄色荧光蛋白EYFP发光图片(EYFP)，中间为明场的mCherry发光图片(mCherry)，右侧为细胞明场图片(三图共用同一标尺，标尺为50μm)。
将转化后的拟南芥和玉米原生质体在25℃黑暗培养16h后，150g离心3min收集原生质体，用终浓度1×loading buffer重悬原生质体，95℃，5min，SDS-PAGE胶分离，Westernblotting检测，使用GFP为Abbkine(ABM40124)，使用mCherry抗体为Abbkine(9D3)，EYFP和mCherry蛋白的检测结果如图4。说明实施例1制备的pBiflu荧光标签表达载体可以在植物原生质体体系中成功同时表达EYFP和mCherry蛋白，可作为报告系统检测目标基因启动子转录活性。
(2)克隆拟南芥AtCHS(AT5G13930)基因的启动子CHSpro(CHS基因CDS区上游2000bp序列)，通过同源重组将CHSpro连接至实施例1制备的pBiflu荧光标签表达载体的KpnI/HindIII之间，得到pBiflu-CHS pro的报告载体，用于鉴定CHS启动子转录活性。利用PEG介导的方法将pBiflu-CHSpro报告载体单独，或者与过表达转录因子HY5的表达载体35Spro::HY5共转化至拟南芥原生质体。
25℃黑暗培养16h后，在激光共聚焦显微镜488nm激发光和561nm下观察EYFP和mCherry发光情况。如图5，可见视野里基本所有的细胞都能发光，图5中左侧为黄色荧光蛋白EYFP发光图片(EYFP)，中间为明场(Bright filed)的mCherry发光图片(mCherry)，右侧为细胞明场图片(三图共用同一标尺，标尺为50μm)。
利用Image J软件对单个细胞EYFP和mCherry荧光强度进行统计，计算EYFP/mCherry相对荧光强度。如图6所示，共转化HY5的表达载体35Spro::HY5和pBiflu-CHSpro报告载体样品的EYFP/mCherry荧光比值显著高于单独转化pBiflu-CHSpro报告载体的样品。图6中的**表示差异达极显著水平(p<0.01,Student’s t-Test)。说明转录因子HY5能够激活CHS基因启动子CHSpro的转录活性，实施例1中构建的pBiflu荧光标签表达载体能够应用于基因转录活性研究。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南中医药大学
<120> 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用
<130> 2022.3.23
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 1
gaacatttct ctatcgatag gtaccgagct ctcgtgccag c 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 2
cttacttaga tcgcagatct cgagagagat agatttgtag ag 42
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 3
tcgagctgca ggctagcaag cttgagctca cgcgtagatc tggatccgaa ttcg 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 4
tcgacgaatt cggatccaga tctacgcgtg agctcaagct tgctagcctg cagc 54
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 5
cgcgtagatc tggatccgaa ttccgttcaa acatttggca 40
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 6
ctctcaaggg catcggtcga ccccgatcta gtaacatag 39
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 7
cgcggatcca tggtgagcaa gggcgag 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 8
ccggaattcc tacttgtaca gctcgtc 27
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 9
ggaagatctg agctctcgtg ccagc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 10
cgcggatcct cagcgtgtcc tctcc 25
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 11
ctcgagctgc aggctagcaa gcttgccacc atggtgagca agggcgagg 49
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 12
gccaaatgtt tgaacggaat tcttacttgt acagctcgtc c 41
<210> 13
<211> 6500
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial synthesis）
<400> 13
ggtaccgagc tctcgtgcca gctgcattaa tgaatcgggc caacgcgcgg ggagaggcgg 60
tttgcgtatt ggctagagca gcttgccaac atggtggagc acgacactct cgtctactcc 120
aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg 180
gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg 240
acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc 300
gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 360
gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgaacatggt 420
ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag 480
ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc 540
agctatctgt cacttcatca aaaggacggt agaaaaggaa ggtggcacct acaaatgcca 600
tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga 660
tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa 720
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc 780
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa 840
tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctcgagctgc aggctagcaa gcttgccacc 900
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 960
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 1020
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 1080
ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 1140
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 1200
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 1260
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 1320
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 1380
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 1440
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 1500
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 1560
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 1620
gaattccgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 1680
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 1740
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 1800
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 1860
tctatgttac tagatcgaga tctgagctct cgtgccagct gcattaatga atcgggccaa 1920
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggc tagagcagct tgccaacatg gtggagcacg 1980
acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg 2040
agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 2100
gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg 2160
ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 2220
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 2280
attgatgtga acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca 2340
gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc 2400
ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa ggacggtaga aaaggaaggt 2460
ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc 2520
gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt 2580
ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac 2640
gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg 2700
gagaggacac gctgaggatc catggtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 2760
aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 2820
atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 2880
accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 2940
tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 3000
gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 3060
caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 3120
ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 3180
cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 3240
gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 3300
ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 3360
accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 3420
ctgtacaagt aggaattccg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 3480
gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata 3540
attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa 3600
ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg 3660
cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg ggtcgaccga tgcccttgag agccttcaac 3720
ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc 3780
ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac 3840
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3900
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3960
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4020
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4080
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4140
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 4200
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4260
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4320
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4380
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4440
aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4500
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4560
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 4620
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 4680
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 4740
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 4800
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 4860
ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 4920
tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 4980
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 5040
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 5100
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 5160
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 5220
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 5280
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 5340
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 5400
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 5460
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 5520
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 5580
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 5640
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 5700
gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgcgcc 5760
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 5820
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 5880
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 5940
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 6000
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 6060
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 6120
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 6180
ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 6240
ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag cccaagctac catgataagt 6300
aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca ataaaatatc tttattttca 6360
ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc tctccatcaa 6420
aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag tgcaggtgcc 6480
agaacatttc tctatcgata 6500

Claims (4)

1.一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，其特征在于，该方法为：
S1、在温度为37℃的条件下，用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体6h，1％琼脂糖凝胶分离，回收4.8Kb大小的条带，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；
S2、以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，用特异性引物F1和特异性引物R1进行PCR反应克隆2×35S启动子，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F1 1μL、特异性引物R1 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S3、利用同源重组方法将S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S连接产物，将所述pGL-35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S；
S4、在温度为37℃的条件下，将S3中得到的中间载体pGL-35S用XhoI/SalI双酶切6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.67Kb大小的条带，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物；
S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；
所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-MCS连接产物；将所述pGL-35S-MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS；
S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收251bp大小的PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F2 1μL、特异性引物R2 1μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
S8、将S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.72Kb大小的产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物；
S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL-35S-MCS-Nos连接产物，将所述pGL-35S-MCS-Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-MCS-Nos；
S10、将S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos用EcoRI/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，用DNA凝胶回收试剂盒回收3.97Kb大小的产物，得到EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物；
S11、克隆mCherry序列：以pmR-mCherry质粒为模板，以特异性引物F3和特异性引物R3为引物进行PCR反应克隆mCherry序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收711bp大小的PCR产物，得到mCherry序列的PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Master Mix 10μL，特异性引物F3 1μL、特异性引物R31μL、pmR-mCherry质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述特异性引物R3核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
S12、将S11中得到的mCherry序列的PCR回收产物的mCherry序列T4连接至S10中得到的EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的EcoRI/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-mCherry；
S13、克隆2×35S启动子序列：以pRGEB32Bar-Cas9质粒为模板，以特异性引物F4和特异性引物R4为引物进行PCR反应克隆2×35S启动子序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收864bp大小的PCR产物，得到2×35S启动子序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F4 1μL、特异性引物R4 1μL、pRGEB32Bar-Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述特异性引物R4核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
S14、将S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry用BamHI/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物；
S15、将S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物的2×35S启动子序列T4连接至S14中得到的到BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物的BamHI/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL-35S-35S-mCherry连接产物；将所述pGL-35S-35S-mCherry连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL-35S-35S-mCherry；
S16、克隆EYFP-Nos序列：以pYFPLT质粒为模板，以特异性引物F5和特异性引物R5为引物进行PCR反应克隆EYFP-Nos序列，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，用DNA凝胶回收试剂盒回收965bp大小的PCR产物，得到EYFP-Nos序列PCR回收产物；
所述PCR反应的体系为：2×KOD Mix 10μL，特异性引物F5 1μL、特异性引物R5 1μL、pYFPLT质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；
所述PCR反应的程序为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸30s，扩增40个循环；68℃延伸10min；
所述特异性引物F5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述特异性引物R5核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
S17、将S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry用HindIII/BglII双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下5.51Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物；
S18、将S16中得到的EYFP-Nos序列PCR回收产物同源重组至S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物的HindIII/BglII位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pBiflu荧光标签表达载体连接产物；将所述pBiflu荧光标签表达载体连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到pBiflu荧光标签表达载体，命名为pBiflu荧光标签表达载体；所述pBiflu荧光标签表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2.根据权利要求1所述的一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法，其特征在于，S1中用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的酶切体系为：KpnI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmartbuffer 5μL、pGL3 Basic载体10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S3中所述连接反应的反应体系为：2×Hieff Clone Enzyme Premix 5μL、S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物2μL、S2中得到的2×35S启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S4中所述酶切反应的体系为：酶切体系为：SalI酶1μL、XhoI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S3中得到的中间载体pGL-35S 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S5中所述退火的反应体系为：多克隆位点MCS正向引物10μL、多克隆位点MCS反向引物10μL、灭菌超纯水补至100μL；
S6中所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL-35S的回收产物2μL、S5中得到的MCS退火引物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S8中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、SalI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S6中得到的中间载体pGL-35S-MCS 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S9中所述连接反应的反应体系为：2×Hieff Clone Enzyme Premix 5μL、S6中得到的EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL-35S-MCS的回收产物2μL、S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S10中所述酶切反应的体系为：EcoRI酶1μL、BamHI酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S9中得到的中间载体pGL-35S-MCS-Nos 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S12中所述连接反应的体系为：所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S10中所述EcoRI/BamHI双酶切中间载体pGL-35S-MCS-Nos的回收产物2μL、S11中所mCherry产物1μL、灭菌超纯水补至10μL；
S14中所述酶切反应的体系为：BamHI酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S12中得到的中间载体pGL-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S15所述连接反应的体系为：T4连接缓冲液1μL、T4连接酶1μL、S14中所述BamHI/BglII双酶切中间载体pGL-35S-mCherry的回收产物2μL、S13中得到的2×35S启动子序列PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
S17所述酶切反应的体系为：HindIII酶1μL、BglII酶1μL、Cutsmart buffer 5μL、S15中得到的中间载体pGL-35S-35S-mCherry 10μL、灭菌超纯水补至50μL；
S18中所述连接反应的反应体系为：2×Hieff Clone Enzyme Premix 5μL、S17中得到的HindIII/BglII双酶切中间载体pGL-35S-35S-mCherry的回收产物2μL、S16中得到的EYFP-Nos启动子PCR回收产物1μL、灭菌超纯水补至10μL。
3.一种如权利要求1或2制备的pBiflu荧光标签表达载体的应用，其特征在于，所述pBiflu荧光标签表达载体用于植物原生质体的转化，用于所述植物原生质体中基因启动子转录活力的检测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物原生质体包括拟南芥原生质体或者玉米原生质体。
CN202210557822.4A 2022-05-21 2022-05-21 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用 Pending CN115322997A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210557822.4A CN115322997A (zh) 2022-05-21 2022-05-21 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210557822.4A CN115322997A (zh) 2022-05-21 2022-05-21 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115322997A true CN115322997A (zh) 2022-11-11

Family

ID=83915817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210557822.4A Pending CN115322997A (zh) 2022-05-21 2022-05-21 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115322997A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604947A (zh) * 2011-01-24 2012-07-25 华中农业大学 猪脂肪组织特异性嵌合启动子
CN109022467A (zh) * 2018-09-20 2018-12-18 中山大学 新型多功能双荧光素酶报告基因质粒
CN111454946A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 郑州轻工业学院 一种脂肪酸诱导型启动子及其应用
CN113265427A (zh) * 2021-06-02 2021-08-17 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种iPSC分化动态监控系统
CN114107369A (zh) * 2021-12-02 2022-03-01 河南农业大学 一种myc标签融合表达载体的制备方法及其应用
CN114134170A (zh) * 2021-12-02 2022-03-04 河南农业大学 一种ha标签融合表达载体的制备方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604947A (zh) * 2011-01-24 2012-07-25 华中农业大学 猪脂肪组织特异性嵌合启动子
CN109022467A (zh) * 2018-09-20 2018-12-18 中山大学 新型多功能双荧光素酶报告基因质粒
CN111454946A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 郑州轻工业学院 一种脂肪酸诱导型启动子及其应用
CN113265427A (zh) * 2021-06-02 2021-08-17 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种iPSC分化动态监控系统
CN114107369A (zh) * 2021-12-02 2022-03-01 河南农业大学 一种myc标签融合表达载体的制备方法及其应用
CN114134170A (zh) * 2021-12-02 2022-03-04 河南农业大学 一种ha标签融合表达载体的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RITTER, LM等: "Lentiviral expression of GAD6(7) and CCK promoter-driven opsins to target interneurons in vitro and in vivo", JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 18, no. 1, pages 27 - 37 *
ROZHIN PENJWEINI等: "Intracellular imaging of metmyoglobin and oxygen using new dual purpose probe EYFP-Myoglobin-mCherry", JOURNAL OF BIOPHOTONICS *
陈伟: "小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定", 中国实验血液学杂志, vol. 20, no. 3, pages 740 - 743 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113025512A (zh) 一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素d3的酿酒酵母菌的构建方法及应用
CN114736893B (zh) 一种可以实现线粒体dna上a/t到g/c编辑的方法
CN114957448B (zh) 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用
CN114874927B (zh) 一株高产重组蛋白的酵母基因工程菌及其构建方法和应用
CN115322997A (zh) 一种pBiflu荧光标签表达载体的制备方法及其应用
CN110484517A (zh) 一种用于制备弱毒的裂谷热病毒的组合物及制备方法，rvfv减毒疫苗
US6174722B1 (en) In-vitro transcription processes for screening natural products and other chemical substances
CN113832091B (zh) 一种表达双价杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌工程菌、其构建方法及应用
CN101659967B (zh) 用于生产转基因猪的piggyBac转座载体及其构建方法
CN109468338A (zh) 一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法
CN102703474A (zh) 一种新布尼亚病毒np蛋白的编码序列及其应用
CN108949793B (zh) 一种表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用
CN113201517B (zh) 一种胞嘧啶单碱基编辑器工具及其应用
CN101481703A (zh) 禽源启动子表达载体及其构建方法与应用
CN114959107A (zh) 基于RAA-CRISPR-Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒
KR101146335B1 (ko) 알파태아단백 인헨서 및 프로모터의 조절을 받아 리포터 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 알파태아단백 발현의 증가 또는 감소 유도 물질을 스크리닝하는 방법
CN114438163B (zh) 真菌筛选试剂、筛选方法、试剂盒及应用
CN108085371B (zh) 判断pcr结果是否为假阳性的方法
CN106754755B (zh) 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用
CN113493855B (zh) 一种基于RAA-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒
CN106754756B (zh) 一种用于非人灵长类神经细胞快速标记的西门利克森林病毒复制子及应用
CN111218475A (zh) 一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法
CN114875047A (zh) 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用
CN101463361B (zh) 双表达盒的表达载体及其制备方法与应用
CN114959110A (zh) 基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination