CN108085371B - 判断pcr结果是否为假阳性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，先估算出在PCR体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n；所述内参模板和目标基因模板高度同源，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性。本发明根据目标基因模板分子数量加入适量的内参模板，一方面能够压制污染信号，其抗污染能力可以达到Southern blot的级别，另一方面，本发明通过简单的PCR技术就可以对转基因阳性进行鉴定，可信度高，成本低廉。

Description

判断PCR结果是否为假阳性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及判断PCR结果是否为假阳性的方法。

背景技术

PCR反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点是能在生物体外将微量的DNA大幅增加。PCR技术具有高灵敏性，得到了广泛的应用，但是作为基因检测的必备方案，也存在着缺点，因为其过于灵敏，容易被环境中微量DNA污染，出现假阳性，例如在转基因检测的实验中，因为经常扩增gus,hyg等标记基因，一段时间过后，在不加任何模板的情况下依然能够扩增出这些片段，这是很多生物实验室遇到的头疼的问题，以至于检测结果不可信，不得不再依赖于southern blot技术作为最终的转基因阳性鉴定标准。而southern blot的实验技术要求高，增加实验成本。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，通过前期添加相对少量的内参阳性模板用于压制污染信号，然后对PCR结果进行进一步的分析判断结果是否可信。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

判断PCR结果是否为假阳性的方法，先估算出如果在目标基因存在的情况下，在PCR 体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的加入用于压制污染，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n，n为2～1000的自然数；

所述内参模板和目标基因模板高度同源，两者只有个别碱基的差别，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性；当阴性样品被目标模板污染，且污染量不超过预期目标模板数量的1/n，则得到的为可信结果。

优选地，根据添加DNA模板的体积、浓度、以及分子量估算出在PCR体系内将要加入的所述目标基因模板分子数量。例如，检测转基因水稻中是否为阳性转基因植株，水稻基因组DNA浓度X ng/ul可以通过分光光度计测得，水稻基因组约466000000bp，1bp长度的DNA的平均分子量约为650；添加1ul的浓度为X的基因组做模板，添加的目标基因分子的数量N＝X*6.02*10²³/(650*466000000*1000000000),N＝1987*X(约等于2000X) 个；同理内参模板的量可以通过换算获得。

优选地，所述n为3～10。内参模板的加入是为了压制污染，对污染的抵抗能力与设计时使用的内参模板相对于预期目标基因模板的分子数量决定的。如果内参模板加入较多，可以更强的压制污染信号，但是也可能会出现对模板量预估不准的情况下产生假阴性的现象；如果内参模板加入的太少则抗污染能力减弱，优选地设置n＝3～10比较合理,对于目标模板量1/3的污染即使使用southern blot的鉴定方法也无法进行准确鉴定。所以此方案抗污染能力可以到达Southern blot的级别。要想提高抗污染的能力需要尽可能的提高加入目标基因模板的浓度以便可以加入更多的内参模板数量。

优选地，所述测序分析的方法采用一代测序或者二代测序方法。

优选地，采用一代测序方法，将测序得到的峰值数据以及作为参比差异序列的同源序列一起提交给计算机程序进行比对，统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值即代表了所述同源序列的数量比值；所述同源序列为所述内参模板和目标基因模板。

优选地，所述计算机程序进行比对的方法包括：先根据提交的参比差异序列算出所有差异位点，记录这些差异位点的具体碱基和在序列中的位置；然后根据这些位置信息在测序结果文件数据中找出这些位置上4种碱基的信号强度，并记录；统计所有差异位点上不同碱基的信号强度；对每个位点的信号强度进行均一化；统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值代表了起始体系中各同源序列的数量比值。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供一种判断PCR结果是否为假阳性的方法，根据目标基因模板分子数量加入适量的内参模板，一方面能够压制污染信号，其抗污染能力可以达到Southern blot的级别，另一方面，本发明通过简单的PCR技术就可以对转基因阳性进行鉴定，可信度高，成本低廉。

附图说明

图1为实施例1构建的pUC18-HYG(m)载体示意图。

图2为实施例1中hyg(m)扩增后进行电泳的琼脂糖电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例以确定水稻转基因植株是否为阳性举例。

1，提取转基因水稻基因组DNA，浓度约为500ng/ul。

转基因水稻用潮霉素筛选，所以检测潮霉素基因(Hyg)是否在基因组上作为判断转基因是否成功的依据。

2，构建含有阳性内参模板片段的载体。

Hyg上的原始片段如SEQ ID NO.1所示，作为目标基因模板；合成突变后的Hyg片段(hyg(m))序列如SEQ ID NO.2所示，作为内参模板。

用如下引物，如序列表SEQ ID NO.3～4所示，可以同等效率的扩增Hyg目标基因模板和Hyg(m)内参模板：

Hyg-F:acaagccaaccacggcctcc

hyg-R:atcgctgcggccgatcttag

构建的pUC18-HYG(m)载体如图1所示，构建的具体流程如下：

合成如下一对hyg(m)引物，如序列表SEQ ID NO.5～6所示：

hyg(m)(+):cagtAagcttacaagccaaccacggcctcc

hyg(m)(-):cgatGgatccatcgctgcggccgatcttag

构建1个50ul体系的PCR反应:

Total:50ul

Sum:1

H₂O:34ul

buffer:5ul

Mg²⁺:4ul

dNTP:2ul

P+:2ul

P-:2ul

taq:2U

Template:1ul

PCR程序为：

94℃for 5min；

94℃for 30s，50℃for 45s，72℃for 22s，30个循环；

72℃for 10min，16℃for 30min。

PCR扩增后，进行电泳，1.5％琼脂糖电泳图如图2所示，然后分别将：360bp的电泳片段切下，放在同一个体系中进行溶胶回收,回收程序见具体厂家的试剂盒说明书,用总体积30ul的水溶解回收DNA(回收产物标记为：rDNAh1)，检测无误后与载体进行连接。

①载体酶切体系：

total:20ul

Sum:1

H₂O:12ul

Buffer:2ul

HindIII:1ul

BamHI:1ul

pUC18_19:4ul

酶切程序：37℃for 1h。

②rDNAh1酶切体系：

total:20ul

Sum:1

H₂O:12ul

Buffer:2ul

HindIII:1ul

BamHI:1ul

rDNAh1:4ul

酶切程序：37℃for 1h。

将步骤①的载体酶切物和本步骤回收片段酶切产物合并一起用PCR纯化试剂盒纯化 (纯化产物标记为P-rDNAh1)用于下一步的连接反应

③连接反应体系

total:10ul

Sum:1

H₂O:5.5ul

Buffer:1ul

T4-ligase:1ul

连接反应程序：20℃for 1h。

将连接产物转化感受态，步骤为：将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)转化涂抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。

构建好的载体(pUC18-HYG(m))全序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

3，制备基因组和pUC18-HYG(m)载体的混合样品，基因组拷贝数量:pUC18-HYG(m)＝10:1

水稻基因组DNA浓度通过分光光度计测得为500ng/ul，水稻基因组约466000000bp， 1bp长度的双链DNA的平均分子量约为650；添加1ul的浓度为X ng/ul的基因组做模版，添加的目标基因模板分子数量N＝X*6.02*10²³/(650*466000000*1000000000),N＝1987*X (约等于2000X)个，所以对于500ng/ul的水稻基因组DNA,每ul模版约含有1987*500 个目标基因拷贝；pUC18-HYG(m)载体大小为3022bp，每ul浓度为X ng/ul质粒DNA含有分子的数量为：1987*X*466 000 000/3022＝306400397*X个DNA分子。提取的pUC18-HYG(m)质粒载体的浓度为100ng/ul，所以要配制含有目标基因模板拷贝数量：pUC18-HYG(m)分子数量＝10:1的体系需要添加100ng/ul的pUC18-hyg(m)质粒体积为：

1987*500/10/(306400397*100)＝3.2*10^-6ul。相当于取3.2ul质粒稀释到1L水里然后取 1ul加入PCR体系。

4，PCR扩增体系：

Total:50ul

Sum:1

H₂O:34ul

buffer:5ul

Mg²⁺:4ul

dNTP:2ul

hyg-F:2ul

hyg-R:2ul

taq:2U

genome DNA:1ul

pUC18-hyg(m)DNA:1ul(稀释后)

PCR程序为：

94℃for 5min；

94℃for 30s，50℃for 45s，72℃for 22s，30个循环；

72℃for 10min，16℃for 30min。

扩增完毕进行电泳，每个泳道都将看到明亮的300bp左右的电泳条带，将PCR产物进一步测序分析(二代测序)，如果PCR产物以目标基因模板(Hyg原始序列)产物为主，则说明为阳性植株，如果以内参模板(hyg(m)序列)产物为主，则说明为阴性植株。

实施例2

本实施例以确定小麦转基因植株是否为真正的阳性植株举例。

小麦基因组约17 000 000 000bp，每ul 500ng/ul小麦基因组DNA约含有N＝500*6.02*10²³/(650*17000000000*1000000000)＝54*500＝27000个拷贝。添加阳性内参模板的分子数量为基因组数量的1/10时，需要添加100ng/ul的pUC18-HYG(m)质粒

27000/10/(306400397*100)＝8.7*10^-8ul，或者简单的计算方法为：3.2*10^-6*

466M/17000M＝8.7*10^-8ul(466M为水稻基因组大小，17000M为小麦基因组大小，3.2*10^-6为同等条件下检测水稻时添加的参比质粒体积)。扩增完毕后真正阳性植株的判断方法与具体实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，所述的进一步测序分析采用一代测序方法。

本实施例以两株转基因水稻植株为例，两株水稻分别记为Hygm1植株和Hygm2植株，其上均含有目标基因模板(序列如SEQ ID NO.1所示)和内参模板(序列如SEQ ID NO.2所示)。

Hygm1植株：最终获得的PCR产物进行一代测序，获得测序结果文件hygm1.ab1，将测序得到的峰值数据以及作为参比差异序列的所述同源序列(内参模板和目标基因模板SEQ ID NO.1～2)一起提交给计算机程序进行比对，结果输出如下表所示：

表1

Hygm2植株：最终获得的PCR产物进行一代测序，获得测序结果文件hygm1.ab1，将测序得到的峰值数据以及作为参比差异序列的所述同源序列(内参模板和目标基因模板SEQ ID NO.1～2)一起提交给计算机程序进行比对，结果输出如下表所示：

表2

表1～2中，注：碱基_A：目标基因模板(hyg)中的差异位点对应的碱基；碱基_B：内参模板(hyg(m))中的差异位点对应的碱基；峰值_A：目标基因模板(hyg)上差异位点碱基信号强度值；峰值_B：内参模板(hyg(m))上差异位点碱基信号强度值；均一化值_A：目标基因模板(hyg)上差异位点碱基信号强度均一化后的值；均一化值_B：内参模板(hyg(m)) 上差异位点碱基信号强度均一化后的值。

根据提交的参比差异序列算出所有差异位点，记录这些差异位点的具体碱基和在序列中的位置，得到共17个差异位点；然后根据这些位置信息在测序结果文件数据中找出这些位置上4种碱基的信号强度，并记录；统计所有差异位点上不同碱基的信号强度；对每个位点的信号强度进行均一化；统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值代表了起始体系中各同源序列的数量比值。

Hygm1植株计算结果显示A(Hyg)：B(Hyg(m))的相对数量比值＝26；说明PCR产物以hyg(目标基因模板)为主，Hygm1植株为阳性植株。

Hygm2植株计算结果显示A(Hyg)：B(Hyg(m))的相对数量比值＝0.09；说明PCR产物以 hygm(内参模版)为主，植株为阴性植株(假阳性)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾德士生物科技有限公司

<120> 判断PCR结果是否为假阳性的方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> Hyg上的原始片段

<400> 1

acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg aatccccgaa 60

catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca ggacattgtt 120

ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg cccaaagcat 180

cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca cagtttgcca 240

gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag tgtattgacc 300

gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg ccgcagcgat 360

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 突变后的Hyg片段（hyg(m)）

<400> 2

acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg aatccccgaa 60

catcgcctcg ctccagtcaa tgtccgctgt tatgccgcca ttgtgcgtca ggacaatgtt 120

ggacccgaaa tccccgtgca cgtggtgccg gtcttcgggg gagtcctcgg cccatagcat 180

caggtcatcg agagccagcg cgacggacgc actcacggtg tcgtccaaca cagtttggca 240

gtgatacaca tgggcatcag cattcgcgca tatgaaatca cgccatgtag tgtattgacc 300

gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg ccgcagcgat 360

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列Hyg-F

<400> 3

acaagccaac cacggcctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列hyg-R

<400> 4

atcgctgcgg ccgatcttag 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列hyg(m)(+)

<400> 5

cagtaagctt acaagccaac cacggcctcc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列hyg(m)(-)

<400> 6

cgatggatcc atcgctgcgg ccgatcttag 30

<210> 7

<211> 3022

<212> DNA

<213> 载体（pUC18-HYG(m)）全序列

<400> 7

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttacaagc caaccacggc 420

ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag 480

tcaatgtccg ctgttatgcc gccattgtgc gtcaggacaa tgttggaccc gaaatccccg 540

tgcacgtggt gccggtcttc gggggagtcc tcggcccata gcatcaggtc atcgagagcc 600

agcgcgacgg acgcactcac ggtgtcgtcc aacacagttt ggcagtgata cacatgggca 660

tcagcattcg cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg 720

aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag cgatggatcc ccgggtaccg 780

agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 840

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 900

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 960

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 1020

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 1080

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 1140

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 1200

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 1260

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 1320

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 1380

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 1440

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 1500

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 1560

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1620

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1680

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1740

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1800

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 1860

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 1920

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1980

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 2040

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 2100

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 2160

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 2220

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 2280

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 2340

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 2400

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 2460

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 2520

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 2580

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2640

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2700

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2760

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2820

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2880

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2940

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 3000

cgtatcacga ggccctttcg tc 3022

Claims (5)

1.判断PCR结果是否为假阳性的方法，其特征在于，先估算出如果在目标基因存在的情况下，在PCR体系内将要加入的目标基因模板分子数量；然后根据目标基因模板分子数量向PCR体系内添加内参模板，所述内参模板的加入用于压制污染，所述内参模板的分子数量控制在目标基因模板分子数量的1/n，n为2～1000的自然数；

所述内参模板和目标基因模板高度同源，两者只有个别碱基的差别，使得PCR引物能够以相同效率扩增内参模板和目标基因模板，然后对扩增结果进行测序分析；当扩增结果以目标基因片段为主，说明样品为阳性；当扩增结果以内参模板为主，则说明样品为阴性；当阴性样品被目标模板污染，且污染量不超过预期目标模板数量的1/n，则得到的为可信结果，

根据添加DNA模板的体积、浓度、以及分子量估算出在PCR体系内将要加入的所述目标基因模板分子数量，目标基因分子的数量N＝(体积*浓度*N_A)/分子量，其中分子量＝单位长度碱基对的平均分子量*碱基对长度，其中N_A为阿伏伽德罗常量6.02*10²³，同理内参模板的量可以通过换算获得。

2.根据权利要求1所述的判断PCR结果是否为假阳性的方法，其特征在于，所述n为3～10。

3.根据权利要求1所述的判断PCR结果是否为假阳性的方法，其特征在于，所述测序分析的方法采用一代测序或者二代测序方法。

4.根据权利要求3所述的判断PCR结果是否为假阳性的方法，其特征在于，采用一代测序方法，将测序得到的峰值数据以及作为参比差异序列的同源序列一起提交给计算机程序进行比对，统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值即代表了所述同源序列的数量比值；所述同源序列为所述内参模板和目标基因模板。

5.根据权利要求4所述的判断PCR结果是否为假阳性的方法，其特征在于，所述计算机程序进行比对的方法包括：先根据提交的参比差异序列算出所有差异位点，记录这些差异位点的具体碱基和在序列中的位置；然后根据这些位置信息在测序结果文件数据中找出这些位置上4种碱基的信号强度，并记录；统计所有差异位点上不同碱基的信号强度；对每个位点的信号强度进行均一化；统计每个序列所有差异位点的平均强度，各序列平均信号强度的比值代表了起始体系中各同源序列的数量比值。

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