CN114736893A - 一种可以实现线粒体dna上a/t到g/c编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑的方法。一种用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，分别包含12个融合half‑DddA的糖基化酶骨架载体，24个融合half‑DddA的核酸内切酶骨架载体，以及4个融合half‑DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体。利用本发明载体系统可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑。本发明可以用来构建A/T到G/C的线粒体DNA致病突变动物模型，推进线粒体疾病的致病机制的研究和治疗方案的探索。

Description

一种可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑的方法
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，是一种可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑的方法。
背景技术
线粒体疾病是一类严重危害人类健康可致残致死的母性遗传疾病，如线粒体脑肌病、共济失调等。线粒体疾病常由细胞核基因突变和线粒体DNA突变引起，特别地，针对线粒体DNA(mtDNA)突变造成的线粒体疾病更是束手无策，其中最重要的原因是缺少线粒体基因编辑工具构建线粒体疾病动物模型开展系统的分子机制研究和治疗方法探索。
由于RNA无法进入线粒体，因此现有的基于CRISPR的编辑工具无法用来编辑mtDNA。通过融合线粒体定位信号肽的限制性内切酶、mito-ZFN和mito-TALEN可以对突变的mtDNA引入DNA双链断裂(DSB)，以降低突变mtDNA的比例。然而，这些方法不能实现对mtDNA进行单个碱基的精准编辑，因此不能用来构建mtDNA突变动物疾病模型，也无法用于探索线粒体疾病的精准基因治疗。
细菌毒素蛋白的DddA功能域即DddAtox具有双链DNA脱氨基酶活性，通过和TALE相连形成胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE)，可以实现线粒体中定点C/G到T/A的突变，但是目前还不能在线粒体DNA上实现A/T到G/C的编辑。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE。
本发明的另一目的是提供该系统的应用。
本发明的又一目的是提供利用该系统实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的方法，通过双链DNA胞嘧啶脱氨基酶将编辑位点附近的胞嘧啶C脱氨基为脱氧尿嘧啶dU；进一步利用尿嘧啶糖基化酶或者核酸内切酶识别dU并切除，形成没有碱基的磷酸化位点AP，从而形成单链缺口Nick；接着利用单链DNA腺嘌呤脱氨酶将Nick对应位置旁边的腺嘌呤A编辑为次黄嘌呤I，线粒体DNA复制过程中将I识别为G，最终实现A/T到G/C的编辑。
作为本发明的一种优选,所述的方法中，通过任意1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和尿嘧啶糖基化酶基因的载体或者任意1个融合融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和核酸内切酶基因的载体，与融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因与单链DNA腺嘌呤脱氨基酶基因的载体配对组合后，均可实现A/T到G/C的编辑。
作为本发明的进一步优选,所述的方法包括以下步骤：
步骤1、根据所要编辑位点的DNA序列，设计两侧的TALE序列，按照Half DddAtox的配对方式选择任意1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和尿嘧啶糖基化酶基因的载体或者任意1个融合融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和核酸内切酶基因的载体，以及1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因与单链DNA腺嘌呤脱氨基酶基因的载体，通过Golden Gate克隆法将识别编辑位点的两段TALE序列分别连到选择的2个骨架载体上，形成线粒体腺嘌呤编辑器mtABE载体；组装完成的mtABE载体经过转化DH5α感受态、单克隆PCR验证、Sanger测序等步骤后，可获得正确组装的mtABE载体；
步骤2、将正确组装mtABE质粒按照Half DddAtox的配对方式转染所要编辑的细胞，通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，编辑后的细胞通过Sanger测序或高通量测序检测mtABE编辑效率，对编辑的细胞进一步培养可以获得稳定线粒体DNA突变的细胞；
其中,所述的Half DddAtox的配对方式为G1333N和G1333C配对，G1397N和G1397C配对。
用于所述的线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE,包含以下40个骨架载体，分别为12个融合half-DddA的糖基化酶骨架载体，24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体，以及4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体；所述的12个融合half-DddA的糖基化酶骨架载体，分别为：4个Half-DddA-eUNG载体、4个Half-DddA-hUDG载体和4个Half-DddA-eUdgX载体；所述的24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体，包括：4个Half-DddA-eNei载体、4个Half-DddA-hNEIL2载体、4个Half-DddA-eNth载体、4个Half-DddA-hNTHL1载体、4个Half-DddA-eXthA载体和4个Half-DddA-NTG1载体；所述的4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体，包括：4个Half-DddA-TadA(8e)载体。
本发明将DddAtox在第1333位氨基酸位置和第1397位氨基酸位置分割产生的4种half DddAtox，分别将half DddAtox和糖基化酶(UNG/UDG/UdgX)、核酸内切酶(Nei/NEIL2/Nth/NTHL1/XthA/NTG1)或者腺嘌呤脱氨基酶(TadA-8e)融合，因此分别有12个糖基化酶骨架载体、24个核酸内切酶骨架载体和4个腺嘌呤脱氨基酶骨架载体。
作为本发明的一种优选，所述的融合half-DddA的糖基化酶骨架载体、融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体以及融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体是将各自的核心基因序列放在TALE骨架载体所得，所述的TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为线粒体定位信号(MTS)、TALE-N端136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C端41个氨基酸的核苷酸序列、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件；TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为本发明的一种优选，所述的融合half-DddA的糖基化酶骨架载体是将由4个half DddAtox和3个尿嘧啶糖基化酶eUNG、hUDG、eUdgX分别组合形成12核心基因片段插入TALE骨架载体上的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；4个half DddAtox的核苷酸序列分别如SEQID NO：2-5；3个糖基化酶的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6-8所示；3个糖基化酶的氨基酸序列分别如Seq ID NO：16-18所示。
作为本发明的一种优选，所述的融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体是将由4个half DddAtox和6个核酸内切酶基因eNei、hNEIL2、eNth、hNTHL1、eXthA、NTG1分别组合形成24个核心基因片段插入TALE骨架载体上的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体上的4个half DddAtox的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-5；6个核酸内切酶的核苷酸序列如：SEQ ID NO：9-14；6个核酸内切酶的氨基酸序列如Seq ID NO：19-24所示。
作为本发明的一种优选，所述的融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体是将由4个half DddAtox和单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e基因分别组合形成4个核心基因片段插入基础骨架载体的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体上的4个half DddAtox的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-5；腺嘌呤脱氨TadA-8e的核苷酸序列如：SEQ ID NO：15；TadA-8e对应的氨基酸序列如Seq ID NO：25所示。
其他的糖基化酶和或者核酸内切酶组合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶和单链DNA腺嘌呤脱氨基酶进行组合也能实现A/T到G/C的编辑。
作为本发明的进一步优选，所有骨架载体匹配于一种TALE组装系统(可以使用CN113403341A中公开的一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统)，骨架载体毒素基因ccdb两侧分别含有Bsa I酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接识别特定DNA序列的TALE序列。
本发明所述的mtABE编辑系统用于线粒体DNA的A/T到G/C编辑的应用。
作为本发明的一种优选，选择本发明系统中所述的任意一个所述的糖基化酶骨架载体或者所述的核酸内切酶载体与对应的一个所述的腺嘌呤脱氨基酶载体进行组合形成mtABE对，将其转染到所要编辑的细胞，通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，实现细胞线粒体DNA由A/T到G/C的编辑。
本发明所述的mtABE编辑系统在制备线粒体DNA的A/T到G/C编辑的试剂中的应用。
本发明所述的mtABE编辑系统在构建细胞或者动物线粒体疾病模型中的应用。
将mtABE系统转染细胞后，可以对编辑位点实现A/T到G/C的编辑，在细胞中具体的编辑过程包括：
(a)通过TALE定位到特定DNA序列上，利用mtABE对中的两个Half-DddA组合成完整的DNA脱氨基酶DddA将编辑位点附近的胞嘧啶C进行脱氨基形成脱氧尿嘧啶dU；
(b)利用尿嘧啶糖基化酶或者核酸内切酶识别dU并进行切除，形成没有碱基的磷酸化位点AP；
(c)利用腺嘌呤脱氨酶将AP位点修复形成的单链缺口Nick附近的腺嘌呤A编辑为次黄嘌呤I，接着通过线粒体DNA的复制实现A/T到G/C的编辑。
为了实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑，相对于Mok BY等报道的TALE-DddAtox可以实现线粒体DNA的C/G到T/A编辑(Nature.2020Jul；583(7817):631-637.)，本发明开发的新型线粒体DNA编辑系统mtABE可以实现A/T到G/C的编辑，已实现了线粒体DNA上A/T到G/C的高效编辑。
如Seq ID NO：16-18所示的三个糖基化酶、如Seq ID NO：19-24所示的6个核酸内切酶、如Seq ID NO：25所示单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e或他们的突变体在制备线粒体DNA编辑工具中的应用。
编码Seq ID NO：16-18所示的三个糖基化酶的基因、编码Seq ID NO：19-24所示的6个核酸内切酶的基因、编码Seq ID NO：25所示单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e的基因或他们的突变体在制备线粒体DNA编辑工具中的应用。
本发明可以获得有益效果如下：
本发明可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑。
本发明可以用来构建A/T到G/C的线粒体DNA致病突变动物模型，推进线粒体疾病的致病机制的研究。
本发明可以用来潜在应用治疗线粒体DNA突变引起的线粒体疾病。
附图说明
图1糖基化酶或者核酸内切酶和腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e工作配对的模式图。
图2以糖基化酶UNG和TadA-8e组合对线粒体DNA进行A/T到G/C编辑的原理示意图。
图3mtABE编辑系统的糖基化酶骨架载体
图3带有线粒体定位信号(MTS)的不同分割类型的DddAtox，载体携带ccdb和不同糖基化酶(UNG、UDG和UdgX)基因元件，ccdb位于两个Bsa I酶切位点之间，载体上带有氨卞青霉素抗性元件。
图4mtABE编辑系统的核酸内切酶骨架载体
图4带有线粒体定位信号(MTS)的不同分割类型的DddAtox，载体携带ccdb和不同核酸内切酶(Nei、NEIL2、Nth、NTHL1、XthA和NTG1)基因元件，ccdb位于两个Bsa I酶切位点之间，载体上带有氨卞青霉素抗性元件。
图5mtABE编辑系统的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体
图5带有线粒体定位信号(MTS)的不同分割类型的DddAtox，载体携带ccdb和腺嘌呤脱氨基酶(TadA-8e)基因元件，ccdb位于两个Bsa I酶切位点之间，载体上带有氨卞青霉素抗性元件。
图6mtABE针对人A13514位点进行编辑的工作示意图
图6中所示在人线粒体DNA的A13514位点上，mtABE进行结合配对的工作示意图。
图7基于糖基化酶的mtABE在细胞上编辑效果分析
图7中所示在人线粒体DNA的A13514位点上，不同糖基化酶组合的编辑效率统计图。
图8基于核酸内切酶的mtABE在细胞上编辑效果分析
图8中所示在人线粒体DNA的A13514位点上，不同核酸内切酶组合的编辑效率统计图。
图9mtABE人线粒体DNA上A6175位点的编辑效率分析
图9中所示在人线粒体DNA的A6175位点上，高效组合的编辑效率统计图。
图10mtABE人线粒体DNA上T9185位点的编辑效率分析
图10中所示在人线粒体DNA的T9185位点上，高效组合的编辑效率统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明，借此对如何应用本发明实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑充分理解并据以实施。
下面结合附图对本发明进一步说明。本发明提供了一种可以实现线粒体DNA上A/T到G/C的编辑方法，该方法由mtABE系统实现，该系统包括：40个载体，可以选择不同的组合实现不同的编辑效果。
在本系统中，通过双链DNA胞嘧啶脱氨基酶引入特异的dU，通过糖基化酶或者核酸内切酶切除dU，进一步激活细胞内的碱基损伤修复系统，为单链DNA腺嘌呤A脱氨基酶的发挥工作了提供很好的时间窗口，从而实现高效精确的A/T到G/C的编辑，具有重要的创新价值。
实施例1
利用本发明mtABE系统进行线粒体DNA上A/T到G/C的编辑，在人细胞中模拟人线粒体疾病致病突变，具体方法如下：
(一)TALE序列的设计和mtABE的组装
选择人类线粒体DNA(参考序列版本：NC_012920.1)上A13514G致病突变位点，根据这个位点的附近的DNA序列，设计识别的TALE序列，左侧识别DNA序列：CCTCACAGGTTTCTACT；右侧识别DNA序列：GTTTGCGGTTTCGAT。对应的TALE序列左侧为A13514-L：ggagcaggtggtggccatcgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaggttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagtggtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcaattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgatagccagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgcaagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgcttccaatgggggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc；右侧的TALE序列，A13514-R：ggagcaggtggtggccatcgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaggttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagtggtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcaattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgatagccagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgcaagtaatgggggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc。通过匹配的TALE组装平台(可以用CN113403341A中公开的TALE组装的RVD文库进行组装)，过GoldenGate的方法分别组装到选择的mtABE骨架载体上。
将组装的产物转化DH5α并采用含有氨卞青霉素的固体LB培养板进行筛选，之后挑取单克隆并使用下述引物进行PCR鉴定。根据RVD数量，判断阳性的克隆，A13514-L是17个RVD大小应为1861bp，A13514-R是15个RVD大小应为1657bp。之后，采用Sanger测序进行分析，序列正确的阳性克隆提取质粒用于后续实验。(PCR鉴定和Sanger测序的引物序列为tgaccgcagtggaggcagtg和ttcactgcatccagcgcagg)
(二)在细胞中检测不同组合mtABE的编辑效率
HEK293FT细胞密度达到70-90％时，提前2小时换液，细胞计数后，取105个细胞用于细胞电转染(仪器：Lonza 4D-nucleofector)。将糖基化酶或者核酸内切酶对应的载体分别和4个腺嘌呤脱氨基酶载体进行配对组合(根据DddA的分割方式，按照1333的两个组合，1397分割的两个组合)并转染细胞，转细胞使用SF-Cell Line 4D-nucleofector X-kit电转细胞，质粒转染的量各为转染400ng。
电转染完成后，将细胞接入12孔板中并培养24小时，接着使用含有2μg/mL的嘌呤霉素进行细胞筛选，培养48小时后将细胞消化离心，并收取细胞用于检测DNA突变效率。
收取的细胞样品DNA提取方式如下：采用30μL的QuickExtractTM DNA ExtractionSolution(Lucigen)重选细胞，之后65℃加热45min，接着涡旋离心并使用98℃加热2min。
采用2×Green Taq Mix(Vazyme)扩增T载体或线粒体DNA上含有编辑位点的目的片段，之后用于Sanger测序；或采用Phanta Super-Fidelity DNA polymerase(Vazyme)及高通量测序建库引物进行高通量测序分析编辑效率。高通量测序的编辑效果如图7和图8所示。
(三)使用mtABE构建线粒体疾病致病突变
根据罕见病数据库中选择A6175和T9185两个线粒体疾病致病突变，A6175位点结合的DNA序列为：CCCCTAATAATCGGT和TGTTTATGCGGGGAA；T9185位点的结合的DNA序列为ACGTTTTCACACTTCT和CATTATGTGTTGTCGT。A6175位点的TALE序列为A6175-L：ggagcaggtggtggccatcgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaggttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagtggtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcaattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgatagccagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgcaagtaatgggggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc；A6175-R：ggagcaggtggtggccatcgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaggttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagtggtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcaattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgatagccagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgcaagtaatattggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc。T9185位点的TALE序列为T9185-L：ggagcaggtggtggccatcgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaggttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagtggtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcaattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgatagccagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgcaagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgcttccaatgggggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc；T9185-R：ggagcaggtggtggccatcgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaggttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagtggtagcgattgctagtaatattggtggcaaacaggctcttgagacggttcagcgcctccttccagttctctgtcaagcccacggactcaccccagatcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcaattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgatagccagtaatgggggtggcaaacaggctcttgagactgttcagcgccttctaccagttctctgtcaagcccacggcctgacgcccgagcaagttgtagcgattgctagtcatgacggtggcaaacaggctcttgaaaccgtccaacgccttctaccagttctctgtcaagcccacggactaaccccagcgcaagttgtagcgattgcaagtaacaatggtggcaaacaggctcttgaaaccgtacagcgcctactgccagttctctgtcaagcccacggtctgactccggagcaagttgtagcgattgcttccaatgggggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggc。
通过匹配的TALE组装平台(可以用CN113403341A中公开的TALE组装的RVD文库进行组装)，过Golden Gate的方法分别组装到选择的mtABE骨架载体NEIL2、UDG和TadA上，并获得正确的mtABE载体。将糖基化酶或者核酸内切酶的载体分别和4个腺嘌呤脱氨基酶载体进行配对组合(根据DddA的分割方式，按照1333的两个组合，1397分割的两个组合)并转染细胞，转细胞使用SF-Cell Line 4D-nucleofector X-kit电转细胞，质粒转染的量各为转染400ng。培养24h后使用2μg/mL的嘌呤霉素进行筛选细胞，筛选到72h后，换成不含嘌呤霉素的培养基进行培养，并对最终获得细胞进行测序分析编辑效率，编辑效果如图9和10所示，选择的NEIL2和UDG和TadA-8e组合分别都能在对应的编辑位点实现A/T到G/C的编辑。
上述说明示出并描述了发明的实施例，总之，本发明提供了一种新型线粒体DNA编辑器：mtABE。实验证实，本发明的一种新型线粒体DNA编辑器：mtABE能够成功的在人线粒体上实现A/T到G/C的编辑。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种可以实现线粒体DNA上A/T到G/C编辑的方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5922
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgccacct gacgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg 60
ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 120
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 180
tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 240
cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 300
acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 360
ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 420
tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 480
tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 540
ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 600
ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact 660
atagggagac aagctggcta gaccatgttg gggtttgtgg gtcgggtggc cgctgctccg 720
gcctccgggg ccttgcggag actcacccct tcagcgtcgc tgcccccagc tcagctctta 780
ctgcgggccg ctccgacggc ggtccatcct gtcagggact atgcggcgca aacatctgag 840
agcggcggag gcgggagccc cggcgcggcc gctgactaca aggatgacga cgataaaggt 900
agcgtggatc tacgcacgct cggctacagc cagcagcaac aggagaagat caaaccgaag 960
gttcgttcga cagtggcgca gcaccacgag gcactggtcg gccatgggtt tacacacgcg 1020
cacatcgttg cgctcagcca acacccggca gcgttaggga ccgtcgctgt caagtatcag 1080
gacatgatcg cagcgttgcc agaggcgaca cacgaagcga tcgttggcgt cggcaaacag 1140
tggtccggcg cacgcgctct ggaggccttg ctcacggtgg cgggagagtt gagaggtcca 1200
ccgttacagt tggacacagg ccaacttctc aagattgcaa aacgtggcgg cgtgaccgca 1260
gtggaggcag tgcatgcatg gcgcaatgca ctgacgggtg cccccctgaa cctgacccca 1320
gagaccggct tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga tttttgcggt 1380
ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtat gctatgaagc 1440
agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca tatatgatgt 1500
caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc tgcgtgccga 1560
acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta ttgaaatgaa 1620
cggctctttt gctgacgaga acaggggctg gtgaaatgca gtttaaggtt tacacctata 1680
aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgcccg 1740
ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg 1800
aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg 1860
ccagtgtgcc ggtgtccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg 1920
acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc tcccttatac 1980
acagccaggg tctctcgcgt tgaccaacga ccacctcgtc gccttggcct gcctcggcgg 2040
acgtcctgcg ctggatgcag tgaaaaaggg attgggaggc tccgctagcg cttaagtcta 2100
gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 2160
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 2220
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 2280
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 2340
atgcggtggg ctctatggct cgagggggtt ggggttgcgc cttttccaag gcagccctgg 2400
gtttgcgcag ggacgcggct gctctgggcg tggttccggg aaacgcagcg gcgccgaccc 2460
tgggactcgc acattcttca cgtccgttcg cagcgtcacc cggatcttcg ccgctaccct 2520
tgtgggcccc ccggcgacgc ttcctgctcc gcccctaagt cgggaaggtt ccttgcggtt 2580
cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc actagtaccc tcgcagacgg 2640
acagcgccag ggagcaatgg cagcgcgccg accgcgatgg gctgtggcca atagcggctg 2700
ctcagcaggg cgcgccgaga gcagcggccg ggaaggggcg gtgcgggagg cggggtgtgg 2760
ggcggtagtg tgggccctgt tcctgcccgc gcggtgttcc gcattctgca agcctccgga 2820
gcgcacgtcg gcagtcggct ccctcgttga ccgaatcacc gacctctctc cccaggggga 2880
tccaccggag cttaccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 2940
cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 3000
caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 3060
gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt 3120
ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 3180
ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 3240
gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca 3300
gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 3360
ggtgcccgcc ttcctggaaa cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 3420
cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg 3480
caagcccggt gcctgacgcc cgccccacga cccgcagcgc ccgaccgaaa ggagcgcacg 3540
accccatgca tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 3600
ctttctagag tcggggcggc cggccgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt 3660
ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 3720
ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 3780
ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc 3840
tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac 3900
ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc 3960
ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac 4020
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 4080
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 4140
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4200
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4260
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4320
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg 4380
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4440
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4500
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4560
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4620
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4680
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4740
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 4800
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 4860
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 4920
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 4980
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 5040
ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgggacccac gctcaccggc 5100
tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 5160
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 5220
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 5280
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 5340
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 5400
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 5460
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 5520
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 5580
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 5640
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 5700
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 5760
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 5820
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 5880
gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aa 5922
<210> 2
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctcctacg ccctgggccc atatcagatc tctgccccac agctgccagc atacaacgga 60
cagaccgtgg gcacattcta ctatgtgaat gacgccggcg gcctggagtc taaggtgttt 120
agctccggcg gctctggagg cagc 144
<210> 3
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaaccccct accctaacta tgccaatgca ggacacgtgg agggacagag cgccctgttc 60
atgcgggata acggcatctc cgagggcctg gtgttccaca acaatcccga gggcacctgc 120
ggcttttgcg tgaacatgac cgagacactg ctgcccgaga atgccaagat gacagtggtg 180
ccacctgagg gagcaatccc tgtgaagaga ggcgccaccg gcgagacaaa ggtgtttacc 240
ggcaactcta atagccctaa gtccccaaca aagggcggct gctctggagg cagc 294
<210> 4
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctcctacg ccctgggccc atatcagatc tctgccccac agctgccagc atacaacgga 60
cagaccgtgg gcacattcta ctatgtgaat gacgccggcg gcctggagtc taaggtgttt 120
agctccggcg gcccaacccc ctaccctaac tatgccaatg caggacacgt ggagggacag 180
agcgccctgt tcatgcggga taacggcatc tccgagggcc tggtgttcca caacaatccc 240
gagggcacct gcggcttttg cgtgaacatg accgagacac tgctgcccga gaatgccaag 300
atgacagtgg tgccacctga gggatctgga ggcagc 336
<210> 5
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaatccctg tgaagagagg cgccaccggc gagacaaagg tgtttaccgg caactctaat 60
agccctaagt ccccaacaaa gggcggctgc tctggaggca gc 102
<210> 6
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaacgaac tgacctggca cgacgtgctg gccgaagaga agcagcagcc ctatttcctt 60
aacaccctgc agaccgtggc cagcgagcgg cagagcggcg tgaccatcta ccccccacag 120
aaagacgtgt ttaacgcctt ccgcttcaca gagctgggcg acgtgaaggt ggtgatcctg 180
ggccaggacc cctaccacgg ccccggccag gcccatggtc tggccttcag cgtgcggccc 240
ggcatcgcca tcccccccag cctgctgaac atgtataagg agctggaaaa caccatcccc 300
ggcttcaccc ggcccaatca cggctacctg gagagctggg cgcggcaggg cgtgctgctg 360
ctcaacaccg tgctgacggt acgggccggc caggcgcata gccacgccag cctgggctgg 420
gagacattca ccgataaggt gatcagcctg atcaaccagc accgggaggg cgtggtgttt 480
ctgctgtggg gcagccatgc ccagaagaaa ggcgccatca tcgacaagca gcggcatcat 540
gtgctgaaag ccccccaccc cagccccctt agcgcccacc ggggcttctt cggctgcaac 600
catttcgtgc tggccaatca gtggctggaa caacggggcg aaacccccat tgactggatg 660
cccgtgttgc ccgccgagag cgag 684
<210> 7
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcccgcaacg tgcccgtggg ctttggagag agctggaaga agcacctcag cggggagttc 60
gggaaaccgt attttatcaa gctaatggga tttgttgcag aagaaagaaa gcattacact 120
gtttatccac ccccacacca agtcttcacc tggacccaga tgtgtgacat aaaagatgtg 180
aaggttgtca tcctgggaca ggatccatat catggaccta atcaagctca cgggctctgc 240
tttagtgttc aaaggcctgt tccgcctccg cccagtttgg agaacattta taaagagttg 300
tctacagaca tagaggattt tgttcatcct ggccatggag atttatctgg gtgggccaag 360
caaggtgttc tccttctcaa cgctgtcctc acggttcgtg cccatcaagc caactctcat 420
aaggagcgag gctgggagca gttcactgat gcagttgtgt cctggctaaa tcagaactcg 480
aatggccttg ttttcttgct ctggggctct tatgctcaga agaagggcag tgccattgat 540
aggaagcggc accatgtact acagacggct catccctccc ctttgtcagt gtatagaggg 600
ttctttggat gtagacactt ttcaaagacc aatgagctgc tgcagaagtc tggcaagaag 660
cccattgact ggaaggagct g 681
<210> 8
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctggggccc aggatttcgt gccccacacc gccgatctgg ccgagctggc cgccgccgcc 60
ggcgagtgcc ggggctgcgg gctgtacagg gacgccacac aggccgtgtt cggggccggc 120
gggaggagcg ccaggatcat gatgatcggc gaacagcccg gcgataagga ggatctggcc 180
gggctgccct tcgtgggccc cgccgggcgg ctcctggatc gggccctgga ggccgccgac 240
atcgaccggg acgccctgta cgtgacaaac gccgtgaagc acttcaagtt cacaagggcc 300
gccggaggca agcggaggat ccacaagacc ccctccagga ctgaggtggt ggcctgccgg 360
ccctggctga tcgccgagat gacaagcgtg gagcccgacg tggtggtgct gctgggggcc 420
accgccgcca aggccctgct ggggaacgat ttcagggtga cccagcacag aggggaggtc 480
ctgcacgtag acgacgtgcc tggcgacccc gccctggtgg ccactgtaca ccccagcagc 540
ctgctcaggg ggcccaagga ggaaagggag tccgccttcg ccgggctcgt ggatgacctg 600
agggtggccg ccgatgtccg gccc 624
<210> 9
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcgggtcca tgaacaaggc caagaggctg gagatcctga ccaggctgag agagaacaac 60
ccccacccca ccactgagct gaacttcagc tcccccttcg agctgctgat cgccgtgctg 120
ctgagcgccc aggccacaga tgtctccgtg aacaaggcca ccgccaagct gtaccccgtc 180
gctaacacac ccgccgccat gctcgagctg ggcgtggagg gggtgaaaac ttacatcaag 240
accatcggcc tgtacaactc caaggccgag aacatcatca agacctgccg gatcctgctg 300
gagcagcaca acggggaggt ccccgaggac cgggccgccc tggaggccct gccaggggtg 360
gggcgcaaga cagccaacgt ggtgctgaac actgccttcg gctggcccac aatcgccgtg 420
gatacacaca ttttcagggt gtgcaaccgg acccagttcg cccccggcaa gaacgtggag 480
caggtggagg agaagctgct gaaggtggtg cccgccgagt ttaaggtgga ctgtcaccac 540
tggctgatcc tgcacgggcg gtatacctgc atcgcccgga agcctcggtg cgggagctgc 600
attattgagg acctgtgcga gtacaaggag aaggtggaca tt 642
<210> 10
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccagaagggc cgttggtgag gaaatttcac catctggtgt ccccctttgt gggtcagcag 60
gtggtcaaga cagggggcag cagtaagaag ctacagcccg ccagcctgca gtctctgtgg 120
ctccaggaca cccaggtcca tggaaagaaa ttattcctta gatttgatct agatgaagaa 180
atggggcccc ctggcagcag cccaacacca gagcctccac aaaaagaagt gcagaaggaa 240
ggggctgcgg acccaaagca ggtcggggag cccagcgggc agaagaccct tgatggatcc 300
tcacggtctg cagagctcgt cccccagggc gaggatgatt ctgagtattt ggagagagac 360
gcccctgcag gagatgctgg gaggtggctg cgtgtcagct ttggtttgtt tggcagcgtt 420
tgggtgaacg atttctccag agccaagaaa gccaacaaga ggggggactg gagggaccct 480
tccccgaggt tggtcctgca ctttggtggt ggtggcttcc tggcatttta taattgtcag 540
ttgtcttgga gctcttcccc agtggtcaca cccacctgtg acatcctgtc tgagaagttc 600
catcgaggac aagccttaga agctctaggc caggctcagc ctgtctgcta tacactgctg 660
gaccagagat acttctcagg gctagggaac atcattaaga atgaagcctt gtacagagct 720
gggatccatc ccctttctct cggttcagtc ctgagtgcct cgcgtcggga ggtcctggtg 780
gatcacgtgg tggagttcag tacagcctgg ctgcagggca agttccaagg cagaccgcag 840
cacacacagg tctaccagaa agaacagtgc cctgctggcc accaggtcat gaaggaggcg 900
tttgggcccg aagatgggtt acagaggctc acctggtggt gcccgcagtg ccagccccag 960
ttgtcagagg agccagagca gtgccagttc tcc 993
<210> 11
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcgggtcca tgcccgaggg gcctgagatc cggcgggccg ccgataacct ggaggccgcc 60
attaagggga agcccctgac tgatgtgtgg ttcgcctttc cccagctcaa gccctaccag 120
agccagctga tcggccagca cgtcacccac gtggagacac ggggcaaggc cctgctgact 180
cactttagca acgacctgac cctctactcc cacaaccagc tgtacggggt gtggagggtc 240
gtcgacacag gcgaggagcc ccagaccaca cgggtgctcc gggtgaagct gcagaccgcc 300
gataagacca tcctcctgta cagcgcctcc gacatcgaga tgctgacccc tgagcagctg 360
acaacccacc ccttcctgca gcgggtgggc cctgacgtgc tggatcctaa cctgacaccc 420
gaggtggtga aggagcggct gctgagccct aggtttagaa accggcagtt cgccggactg 480
ctcctggatc aggccttcct cgccgggctg gggaactacc tccgggtgga gatcctgtgg 540
caggtgggcc tgaccgggaa ccacaaggcc aaggatctca acgccgccca gctggacgcc 600
ctggcacacg ccctgctgga gatcccccgg tttagctacg ccaccagggg ccaggtcgat 660
gagaacaaac atcacggggc cttgtttagg tttaaagtgt ttcataggga tggcgaacct 720
tgtgagaggt gtggctccat cattgagaaa accacactgt cctccaggcc attttactgg 780
tgccccggct gccagcac 798
<210> 12
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaccgcct tgagcgcgag gatgctgacc cggagccgga gcctgggacc cggggctggg 60
ccgcgggggt gtagggagga gcccgggcct ctccggagaa gagaggctgc agcagaagcg 120
aggaaaagcc acagccccgt gaagcgtccg cggaaagcac agagactgcg tgtggcctat 180
gagggctcgg acagtgagaa aggtgagggg gctgagcccc tcaaggtgcc agtctgggag 240
ccccaggact ggcagcaaca gctggtcaac atccgtgcca tgaggaacaa aaaggatgca 300
cctgtggacc atctggggac tgagcactgc tatgactcca gtgccccccc aaaggtacgc 360
aggtaccagg tgctgctgtc actgatgctc tccagccaaa ccaaagacca ggtgacggcg 420
ggcgccatgc agcgactgcg ggcgcggggc ctgacggtgg acagcatcct gcagacagat 480
gatgccacgc tgggcaagct catctacccc gtcggtttct ggaggagcaa ggtgaaatac 540
atcaagcaga ccagcgccat cctgcagcag cactacggtg gggacatccc agcctctgtg 600
gccgagctgg tggcgctgcc gggtgttggg cccaagatgg cacacctggc tatggctgtg 660
gcctggggca ctgtgtcagg cattgcagtg gacacgcatg tgcacagaat cgccaacagg 720
ctgaggtgga ccaagaaggc aaccaagtcc ccagaggaga cacgcgccgc cctggaggag 780
tggctgccta gggagctgtg gcacgagatc aatggactct tggtgggctt cggccagcag 840
acctgtctgc ctgtgcaccc tcgctgccac gcctgcctca accaagccct ctgcccggcc 900
gcccagggcc tg 912
<210> 13
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcgggtcca tgaagttcgt gagcttcaac atcaacgggc tgagggccag gccccaccag 60
ctggaggcca tcgtggagaa gcaccagccc gatgtgatcg ggctgcagga gacaaaggtg 120
cacgacgaca tgttccctct ggaggaggtg gccaagctgg ggtacaacgt gttttaccac 180
gggcagaagg gccactacgg cgtggccctg ctgaccaagg agacacccat cgccgtgagg 240
cgggggttcc ccggcgatga tgaggaagcc cagcggcgga tcatcatggc cgagatcccc 300
tccctgctgg gcaacgtcac agtgatcaac ggctacttcc cccaggggga gagcagggac 360
catcccatta agttccccgc caaggcccag ttctaccaga acctgcagaa ctacctggag 420
actgagctga agagggataa ccccgtgctg atcatggggg acatgaacat tagccccacc 480
gatctggaca ttgggatcgg cgaggagaac aggaagaggt ggctgcggac cggcaagtgc 540
tcgttcctgc ccgaggagcg ggagtggatg gataggctga tgagctgggg cctggtggac 600
accttcaggc acgccaaccc ccagacagcc gataggttct cctggttcga ttacagaagt 660
aagggctttg atgataacag agggctgaga attgatcttc tgctggcctc ccagcctttg 720
gctgagtgtt gcgtggaaac aggaattgat tatgagatta gatcaatgga gaaacctagc 780
gatcacgccc cagtgtgggc cacatttcgg agg 813
<210> 14
<211> 1206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcgggtcca tgcagaagat tagcaagtac agcagcatgg ccatcctgag gaagcggccc 60
ctggtcaaga ccgagacagg ccccgagagc gagctgctgc ccgagaagag gacaaagatt 120
aagcaggagg aggtggtgcc ccagcccgtg gatattgatt gggtgaagag cctgcctaac 180
aagcagtact tcgagtggat cgtggtgcgg aacggcaacg tgcctaacag gtgggccaca 240
cccctggacc cctccatcct ggtgacaccc gcctccacaa aggtgcccta caagttccag 300
gaaacctacg ccaggatgag ggtgctgagg tccaagatct tggccccagt ggatattatc 360
ggggggagca gcatccccgt gactgtggcc agcaagtgcg ggatcagtaa ggagcagatc 420
agcccaaggg actaccggct gcaggtgctg ctcggcgtga tgctgagctc ccagaccaag 480
gacgaggtga ccgccatggc catgctgaac atcatgaggt actgcatcga tgagctgcac 540
tccgaggagg gcatgaccct ggaggccgtg ctgcagatta acgagactaa gctggacgag 600
ctgatccact ccgtggggtt ccacacccgg aaggccaagt acatcctgag cacatgcaag 660
atcctgcagg atcagttcag ctccgatgtg cccgccacaa tcaacgagct gctgggcctg 720
cctggggtgg ggcctaagat ggcttacctg acactccaga aggcctgggg caagattgag 780
gggatctgcg tggacgtgca tgtggatcgg ctgacaaagc tgtggaagtg ggtggatgcc 840
cagaagtgca agactcctga ccagactagg acacagctcc agaactggct ccccaagggc 900
ctgtggacag agattaacgg gctgctggtg gggttcgggc agatcattac caagtcccgg 960
aacctcggcg acatgctgca gtttctgcct ccagatgacc ctaggtccag cctggattgg 1020
gacctgcaga gccagctcta taaggagatt cagcagaaca tcatgtccta ccccaagtgg 1080
gtgaagtacc tggagggcaa gcgggagctg aacgtggagg ccgagatcaa cgtgaagcac 1140
gaggaaaaga ccgtggagga gacaatggtg aagctggaga acgatatctc cgtgaaggtg 1200
gaggat 1206
<210> 15
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgaggtgg agttttccca cgagtactgg atgagacatg ccctgaccct ggccaagagg 60
gcacgcgatg agagggaggt gcctgtggga gccgtgctgg tgctgaacaa tagagtgatc 120
ggcgagggct ggaacagagc catcggcctg cacgacccaa cagcccatgc cgaaattatg 180
gccctgagac agggcggcct ggtcatgcag aactacagac tgattgacgc caccctgtac 240
gtgacattcg agccttgcgt gatgtgcgcc ggcgccatga tccactctag gatcggccgc 300
gtggtgtttg gcgtgaggaa ctcaaaaaga ggcgccgcag gctccctgat gaacgtgctg 360
aactaccccg gcatgaatca ccgcgtcgaa attaccgagg gaatcctggc agatgaatgt 420
gccgccctgc tgtgcgattt ctatcggatg cctagacagg tgttcaatgc tcagaagaag 480
gcccagagct ccatcaac 498
<210> 16
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Asn Glu Leu Thr Trp His Asp Val Leu Ala Glu Glu Lys Gln Gln
1 5 10 15
Pro Tyr Phe Leu Asn Thr Leu Gln Thr Val Ala Ser Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Gly Val Thr Ile Tyr Pro Pro Gln Lys Asp Val Phe Asn Ala Phe Arg
35 40 45
Phe Thr Glu Leu Gly Asp Val Lys Val Val Ile Leu Gly Gln Asp Pro
50 55 60
Tyr His Gly Pro Gly Gln Ala His Gly Leu Ala Phe Ser Val Arg Pro
65 70 75 80
Gly Ile Ala Ile Pro Pro Ser Leu Leu Asn Met Tyr Lys Glu Leu Glu
85 90 95
Asn Thr Ile Pro Gly Phe Thr Arg Pro Asn His Gly Tyr Leu Glu Ser
100 105 110
Trp Ala Arg Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Thr Val Leu Thr Val Arg
115 120 125
Ala Gly Gln Ala His Ser His Ala Ser Leu Gly Trp Glu Thr Phe Thr
130 135 140
Asp Lys Val Ile Ser Leu Ile Asn Gln His Arg Glu Gly Val Val Phe
145 150 155 160
Leu Leu Trp Gly Ser His Ala Gln Lys Lys Gly Ala Ile Ile Asp Lys
165 170 175
Gln Arg His His Val Leu Lys Ala Pro His Pro Ser Pro Leu Ser Ala
180 185 190
His Arg Gly Phe Phe Gly Cys Asn His Phe Val Leu Ala Asn Gln Trp
195 200 205
Leu Glu Gln Arg Gly Glu Thr Pro Ile Asp Trp Met Pro Val Leu Pro
210 215 220
Ala Glu Ser Glu
225
<210> 17
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Arg Asn Val Pro Val Gly Phe Gly Glu Ser Trp Lys Lys His Leu
1 5 10 15
Ser Gly Glu Phe Gly Lys Pro Tyr Phe Ile Lys Leu Met Gly Phe Val
20 25 30
Ala Glu Glu Arg Lys His Tyr Thr Val Tyr Pro Pro Pro His Gln Val
35 40 45
Phe Thr Trp Thr Gln Met Cys Asp Ile Lys Asp Val Lys Val Val Ile
50 55 60
Leu Gly Gln Asp Pro Tyr His Gly Pro Asn Gln Ala His Gly Leu Cys
65 70 75 80
Phe Ser Val Gln Arg Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Leu Glu Asn Ile
85 90 95
Tyr Lys Glu Leu Ser Thr Asp Ile Glu Asp Phe Val His Pro Gly His
100 105 110
Gly Asp Leu Ser Gly Trp Ala Lys Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Ala
115 120 125
Val Leu Thr Val Arg Ala His Gln Ala Asn Ser His Lys Glu Arg Gly
130 135 140
Trp Glu Gln Phe Thr Asp Ala Val Val Ser Trp Leu Asn Gln Asn Ser
145 150 155 160
Asn Gly Leu Val Phe Leu Leu Trp Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Lys Gly
165 170 175
Ser Ala Ile Asp Arg Lys Arg His His Val Leu Gln Thr Ala His Pro
180 185 190
Ser Pro Leu Ser Val Tyr Arg Gly Phe Phe Gly Cys Arg His Phe Ser
195 200 205
Lys Thr Asn Glu Leu Leu Gln Lys Ser Gly Lys Lys Pro Ile Asp Trp
210 215 220
Lys Glu Leu
225
<210> 18
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Gly Ala Gln Asp Phe Val Pro His Thr Ala Asp Leu Ala Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Gly Glu Cys Arg Gly Cys Gly Leu Tyr Arg Asp Ala
20 25 30
Thr Gln Ala Val Phe Gly Ala Gly Gly Arg Ser Ala Arg Ile Met Met
35 40 45
Ile Gly Glu Gln Pro Gly Asp Lys Glu Asp Leu Ala Gly Leu Pro Phe
50 55 60
Val Gly Pro Ala Gly Arg Leu Leu Asp Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asp
65 70 75 80
Ile Asp Arg Asp Ala Leu Tyr Val Thr Asn Ala Val Lys His Phe Lys
85 90 95
Phe Thr Arg Ala Ala Gly Gly Lys Arg Arg Ile His Lys Thr Pro Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Val Val Ala Cys Arg Pro Trp Leu Ile Ala Glu Met Thr
115 120 125
Ser Val Glu Pro Asp Val Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Ala Ala Lys
130 135 140
Ala Leu Leu Gly Asn Asp Phe Arg Val Thr Gln His Arg Gly Glu Val
145 150 155 160
Leu His Val Asp Asp Val Pro Gly Asp Pro Ala Leu Val Ala Thr Val
165 170 175
His Pro Ser Ser Leu Leu Arg Gly Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ser Ala
180 185 190
Phe Ala Gly Leu Val Asp Asp Leu Arg Val Ala Ala Asp Val Arg Pro
195 200 205
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Gly Ser Met Asn Lys Ala Lys Arg Leu Glu Ile Leu Thr Arg Leu
1 5 10 15
Arg Glu Asn Asn Pro His Pro Thr Thr Glu Leu Asn Phe Ser Ser Pro
20 25 30
Phe Glu Leu Leu Ile Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Ala Thr Asp Val
35 40 45
Ser Val Asn Lys Ala Thr Ala Lys Leu Tyr Pro Val Ala Asn Thr Pro
50 55 60
Ala Ala Met Leu Glu Leu Gly Val Glu Gly Val Lys Thr Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gly Leu Tyr Asn Ser Lys Ala Glu Asn Ile Ile Lys Thr Cys
85 90 95
Arg Ile Leu Leu Glu Gln His Asn Gly Glu Val Pro Glu Asp Arg Ala
100 105 110
Ala Leu Glu Ala Leu Pro Gly Val Gly Arg Lys Thr Ala Asn Val Val
115 120 125
Leu Asn Thr Ala Phe Gly Trp Pro Thr Ile Ala Val Asp Thr His Ile
130 135 140
Phe Arg Val Cys Asn Arg Thr Gln Phe Ala Pro Gly Lys Asn Val Glu
145 150 155 160
Gln Val Glu Glu Lys Leu Leu Lys Val Val Pro Ala Glu Phe Lys Val
165 170 175
Asp Cys His His Trp Leu Ile Leu His Gly Arg Tyr Thr Cys Ile Ala
180 185 190
Arg Lys Pro Arg Cys Gly Ser Cys Ile Ile Glu Asp Leu Cys Glu Tyr
195 200 205
Lys Glu Lys Val Asp Ile
210
<210> 20
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Pro Glu Gly Pro Leu Val Arg Lys Phe His His Leu Val Ser Pro Phe
1 5 10 15
Val Gly Gln Gln Val Val Lys Thr Gly Gly Ser Ser Lys Lys Leu Gln
20 25 30
Pro Ala Ser Leu Gln Ser Leu Trp Leu Gln Asp Thr Gln Val His Gly
35 40 45
Lys Lys Leu Phe Leu Arg Phe Asp Leu Asp Glu Glu Met Gly Pro Pro
50 55 60
Gly Ser Ser Pro Thr Pro Glu Pro Pro Gln Lys Glu Val Gln Lys Glu
65 70 75 80
Gly Ala Ala Asp Pro Lys Gln Val Gly Glu Pro Ser Gly Gln Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Gly Ser Ser Arg Ser Ala Glu Leu Val Pro Gln Gly Glu Asp
100 105 110
Asp Ser Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Ala Pro Ala Gly Asp Ala Gly Arg
115 120 125
Trp Leu Arg Val Ser Phe Gly Leu Phe Gly Ser Val Trp Val Asn Asp
130 135 140
Phe Ser Arg Ala Lys Lys Ala Asn Lys Arg Gly Asp Trp Arg Asp Pro
145 150 155 160
Ser Pro Arg Leu Val Leu His Phe Gly Gly Gly Gly Phe Leu Ala Phe
165 170 175
Tyr Asn Cys Gln Leu Ser Trp Ser Ser Ser Pro Val Val Thr Pro Thr
180 185 190
Cys Asp Ile Leu Ser Glu Lys Phe His Arg Gly Gln Ala Leu Glu Ala
195 200 205
Leu Gly Gln Ala Gln Pro Val Cys Tyr Thr Leu Leu Asp Gln Arg Tyr
210 215 220
Phe Ser Gly Leu Gly Asn Ile Ile Lys Asn Glu Ala Leu Tyr Arg Ala
225 230 235 240
Gly Ile His Pro Leu Ser Leu Gly Ser Val Leu Ser Ala Ser Arg Arg
245 250 255
Glu Val Leu Val Asp His Val Val Glu Phe Ser Thr Ala Trp Leu Gln
260 265 270
Gly Lys Phe Gln Gly Arg Pro Gln His Thr Gln Val Tyr Gln Lys Glu
275 280 285
Gln Cys Pro Ala Gly His Gln Val Met Lys Glu Ala Phe Gly Pro Glu
290 295 300
Asp Gly Leu Gln Arg Leu Thr Trp Trp Cys Pro Gln Cys Gln Pro Gln
305 310 315 320
Leu Ser Glu Glu Pro Glu Gln Cys Gln Phe Ser
325 330
<210> 21
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gly Ser Met Pro Glu Gly Pro Glu Ile Arg Arg Ala Ala Asp Asn
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ala Ile Lys Gly Lys Pro Leu Thr Asp Val Trp Phe Ala
20 25 30
Phe Pro Gln Leu Lys Pro Tyr Gln Ser Gln Leu Ile Gly Gln His Val
35 40 45
Thr His Val Glu Thr Arg Gly Lys Ala Leu Leu Thr His Phe Ser Asn
50 55 60
Asp Leu Thr Leu Tyr Ser His Asn Gln Leu Tyr Gly Val Trp Arg Val
65 70 75 80
Val Asp Thr Gly Glu Glu Pro Gln Thr Thr Arg Val Leu Arg Val Lys
85 90 95
Leu Gln Thr Ala Asp Lys Thr Ile Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Asp Ile
100 105 110
Glu Met Leu Thr Pro Glu Gln Leu Thr Thr His Pro Phe Leu Gln Arg
115 120 125
Val Gly Pro Asp Val Leu Asp Pro Asn Leu Thr Pro Glu Val Val Lys
130 135 140
Glu Arg Leu Leu Ser Pro Arg Phe Arg Asn Arg Gln Phe Ala Gly Leu
145 150 155 160
Leu Leu Asp Gln Ala Phe Leu Ala Gly Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val
165 170 175
Glu Ile Leu Trp Gln Val Gly Leu Thr Gly Asn His Lys Ala Lys Asp
180 185 190
Leu Asn Ala Ala Gln Leu Asp Ala Leu Ala His Ala Leu Leu Glu Ile
195 200 205
Pro Arg Phe Ser Tyr Ala Thr Arg Gly Gln Val Asp Glu Asn Lys His
210 215 220
His Gly Ala Leu Phe Arg Phe Lys Val Phe His Arg Asp Gly Glu Pro
225 230 235 240
Cys Glu Arg Cys Gly Ser Ile Ile Glu Lys Thr Thr Leu Ser Ser Arg
245 250 255
Pro Phe Tyr Trp Cys Pro Gly Cys Gln His
260 265
<210> 22
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Met Thr Ala Leu Ser Ala Arg Met Leu Thr Arg Ser Arg Ser Leu Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ala Gly Pro Arg Gly Cys Arg Glu Glu Pro Gly Pro Leu Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Ala Ala Ala Glu Ala Arg Lys Ser His Ser Pro Val Lys
35 40 45
Arg Pro Arg Lys Ala Gln Arg Leu Arg Val Ala Tyr Glu Gly Ser Asp
50 55 60
Ser Glu Lys Gly Glu Gly Ala Glu Pro Leu Lys Val Pro Val Trp Glu
65 70 75 80
Pro Gln Asp Trp Gln Gln Gln Leu Val Asn Ile Arg Ala Met Arg Asn
85 90 95
Lys Lys Asp Ala Pro Val Asp His Leu Gly Thr Glu His Cys Tyr Asp
100 105 110
Ser Ser Ala Pro Pro Lys Val Arg Arg Tyr Gln Val Leu Leu Ser Leu
115 120 125
Met Leu Ser Ser Gln Thr Lys Asp Gln Val Thr Ala Gly Ala Met Gln
130 135 140
Arg Leu Arg Ala Arg Gly Leu Thr Val Asp Ser Ile Leu Gln Thr Asp
145 150 155 160
Asp Ala Thr Leu Gly Lys Leu Ile Tyr Pro Val Gly Phe Trp Arg Ser
165 170 175
Lys Val Lys Tyr Ile Lys Gln Thr Ser Ala Ile Leu Gln Gln His Tyr
180 185 190
Gly Gly Asp Ile Pro Ala Ser Val Ala Glu Leu Val Ala Leu Pro Gly
195 200 205
Val Gly Pro Lys Met Ala His Leu Ala Met Ala Val Ala Trp Gly Thr
210 215 220
Val Ser Gly Ile Ala Val Asp Thr His Val His Arg Ile Ala Asn Arg
225 230 235 240
Leu Arg Trp Thr Lys Lys Ala Thr Lys Ser Pro Glu Glu Thr Arg Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Glu Trp Leu Pro Arg Glu Leu Trp His Glu Ile Asn Gly
260 265 270
Leu Leu Val Gly Phe Gly Gln Gln Thr Cys Leu Pro Val His Pro Arg
275 280 285
Cys His Ala Cys Leu Asn Gln Ala Leu Cys Pro Ala Ala Gln Gly Leu
290 295 300
<210> 23
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Gly Ser Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala
1 5 10 15
Arg Pro His Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val
20 25 30
Ile Gly Leu Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu
35 40 45
Glu Val Ala Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly
50 55 60
His Tyr Gly Val Ala Leu Leu Thr Lys Glu Thr Pro Ile Ala Val Arg
65 70 75 80
Arg Gly Phe Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met
85 90 95
Ala Glu Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Val Thr Val Ile Asn Gly Tyr
100 105 110
Phe Pro Gln Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys
115 120 125
Ala Gln Phe Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys
130 135 140
Arg Asp Asn Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr
145 150 155 160
Asp Leu Asp Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg
165 170 175
Thr Gly Lys Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg
180 185 190
Leu Met Ser Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln
195 200 205
Thr Ala Asp Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp
210 215 220
Asp Asn Arg Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu
225 230 235 240
Ala Glu Cys Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met
245 250 255
Glu Lys Pro Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg
260 265 270
<210> 24
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Gly Ser Met Gln Lys Ile Ser Lys Tyr Ser Ser Met Ala Ile Leu
1 5 10 15
Arg Lys Arg Pro Leu Val Lys Thr Glu Thr Gly Pro Glu Ser Glu Leu
20 25 30
Leu Pro Glu Lys Arg Thr Lys Ile Lys Gln Glu Glu Val Val Pro Gln
35 40 45
Pro Val Asp Ile Asp Trp Val Lys Ser Leu Pro Asn Lys Gln Tyr Phe
50 55 60
Glu Trp Ile Val Val Arg Asn Gly Asn Val Pro Asn Arg Trp Ala Thr
65 70 75 80
Pro Leu Asp Pro Ser Ile Leu Val Thr Pro Ala Ser Thr Lys Val Pro
85 90 95
Tyr Lys Phe Gln Glu Thr Tyr Ala Arg Met Arg Val Leu Arg Ser Lys
100 105 110
Ile Leu Ala Pro Val Asp Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ile Pro Val Thr
115 120 125
Val Ala Ser Lys Cys Gly Ile Ser Lys Glu Gln Ile Ser Pro Arg Asp
130 135 140
Tyr Arg Leu Gln Val Leu Leu Gly Val Met Leu Ser Ser Gln Thr Lys
145 150 155 160
Asp Glu Val Thr Ala Met Ala Met Leu Asn Ile Met Arg Tyr Cys Ile
165 170 175
Asp Glu Leu His Ser Glu Glu Gly Met Thr Leu Glu Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ile Asn Glu Thr Lys Leu Asp Glu Leu Ile His Ser Val Gly Phe His
195 200 205
Thr Arg Lys Ala Lys Tyr Ile Leu Ser Thr Cys Lys Ile Leu Gln Asp
210 215 220
Gln Phe Ser Ser Asp Val Pro Ala Thr Ile Asn Glu Leu Leu Gly Leu
225 230 235 240
Pro Gly Val Gly Pro Lys Met Ala Tyr Leu Thr Leu Gln Lys Ala Trp
245 250 255
Gly Lys Ile Glu Gly Ile Cys Val Asp Val His Val Asp Arg Leu Thr
260 265 270
Lys Leu Trp Lys Trp Val Asp Ala Gln Lys Cys Lys Thr Pro Asp Gln
275 280 285
Thr Arg Thr Gln Leu Gln Asn Trp Leu Pro Lys Gly Leu Trp Thr Glu
290 295 300
Ile Asn Gly Leu Leu Val Gly Phe Gly Gln Ile Ile Thr Lys Ser Arg
305 310 315 320
Asn Leu Gly Asp Met Leu Gln Phe Leu Pro Pro Asp Asp Pro Arg Ser
325 330 335
Ser Leu Asp Trp Asp Leu Gln Ser Gln Leu Tyr Lys Glu Ile Gln Gln
340 345 350
Asn Ile Met Ser Tyr Pro Lys Trp Val Lys Tyr Leu Glu Gly Lys Arg
355 360 365
Glu Leu Asn Val Glu Ala Glu Ile Asn Val Lys His Glu Glu Lys Thr
370 375 380
Val Glu Glu Thr Met Val Lys Leu Glu Asn Asp Ile Ser Val Lys Val
385 390 395 400
Glu Asp
<210> 25
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Ile Asn
165

Claims (15)

1.一种用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的方法，其特征在于通过双链DNA胞嘧啶脱氨基酶将编辑位点附近的胞嘧啶C脱氨基为脱氧尿嘧啶dU；进一步利用尿嘧啶糖基化酶或者核酸内切酶识别dU并切除，形成没有碱基的磷酸化位点AP，从而形成单链缺口Nick；接着利用单链DNA腺嘌呤脱氨酶将Nick对应位置旁边的腺嘌呤A编辑为次黄嘌呤I，线粒体DNA复制过程中将I识别为G，最终实现A/T到G/C的编辑。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过任意1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和尿嘧啶糖基化酶基因的载体或者任意1个融合融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和核酸内切酶基因的载体，与融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因与单链DNA腺嘌呤脱氨基酶基因的载体配对组合后，均可实现A/T到G/C的编辑。
3.根据权利要求1或2所述的方法，特征在于包括以下步骤：
步骤1、根据所要编辑位点的DNA序列，设计两侧的TALE序列，按照Half DddAtox的配对方式选择任意1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和尿嘧啶糖基化酶基因的载体或者任意1个融合融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因和核酸内切酶基因的载体，以及1个融合双链DNA胞嘧啶脱氨基酶基因与单链DNA腺嘌呤脱氨基酶基因的载体，通过Golden Gate克隆法将识别编辑位点的两段TALE序列分别连到选择的2个骨架载体上，形成线粒体腺嘌呤编辑器mtABE载体；组装完成的mtABE载体经过转化DH5α感受态、单克隆PCR验证、Sanger测序等步骤后，可获得正确组装的mtABE载体；
步骤2、将正确组装mtABE质粒按照Half DddAtox的配对方式转染所要编辑的细胞，通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，编辑后的细胞通过Sanger测序或高通量测序检测mtABE编辑效率，对编辑的细胞进一步培养可以获得稳定线粒体DNA突变的细胞；
其中,所述的Half DddAtox的配对方式为G1333N和G1333C配对，G1397N和G1397C配对。
4.用于权利要求1-3中任一项所述的线粒体DNA的A/T到G/C编辑的方法的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，其特征在于包含且不仅限于以下40个骨架载体，分别为12个融合half-DddA的糖基化酶骨架载体，24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体，以及4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体；所述的12个融合half-DddA的糖基化酶骨架载体，分别为：4个Half-DddA-eUNG载体、4个Half-DddA-hUDG载体和4个Half-DddA-eUdgX载体；所述的24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体，包括：4个Half-DddA-eNei载体、4个Half-DddA-hNEIL2载体、4个Half-DddA-eNth载体、4个Half-DddA-hNTHL1载体、4个Half-DddA-eXthA载体和4个Half-DddA-NTG1载体；所述的4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体，包括：4个Half-DddA-TadA(8e)载体。
5.根据权利要求4所述用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，其特征在于所述的融合half DddAtox的糖基化酶骨架载体、融合half DddAtox的核酸内切酶骨架载体和融合half DddAtox的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体是将各自的核心基因序列插入到TALE骨架载体上所得，所述的TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为线粒体定位信号MTS序列、TALE-N端136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C端41个氨基酸的核苷酸序列、half DddAtox、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件；TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.根据权利要求5所述的用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，其特征在于所述的融合half DddAtox的糖基化酶骨架载体是将由4个halfDddAtox和尿嘧啶糖基化酶eUNG、hUDG、eUdgX的编码基因分别组合形成的核心基因序列插入TALE骨架载体的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；12个融合half-DddA的糖基化酶骨架载体上的4个half DddAtox的编码基因序列分别如SEQ ID NO：2-5；3个糖基化酶的氨基酸序列分别如Seq ID NO：16-18所示。
7.根据权利要求5所述的用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，其特征在于所述的融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体是将由4个halfDddAtox的核苷酸序列和核酸内切酶基因eNei、hNEIL2、eNth、hNTHL1、eXthA、NTG1分别组合形成24个核心基因片段插入TALE骨架载体的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；24个融合half-DddA的核酸内切酶骨架载体上的4个half DddAtox的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-5；6个核酸内切酶的氨基酸序列如Seq ID NO：19-24所示。
8.根据权利要求5所述的用于实现线粒体DNA的A/T到G/C编辑的线粒体DNA腺嘌呤编辑系统mtABE，其特征在于所述的融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体是将由4个halfDddAtox的核苷酸序列和单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e基因分别组合形成的核心基因序列插入TALE骨架载体的Nhe I酶和Pme I酶之间所得；4个融合half-DddA的腺嘌呤脱氨基酶骨架载体上的4个half DddAtox的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-5；TadA-8e对应的氨基酸序列如Seq ID NO：25所示。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的mtABE编辑系统，其特征在于，所有骨架载体匹配于一种TALE组装系统，骨架载体毒素基因ccdb两侧分别含有Bsa I酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接识别特定DNA序列的TALE序列。
10.权利要求4-8中任一项所述的mtABE编辑系统用于线粒体DNA的A/T到G/C编辑的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于选择权利要求4-8中所述的任意一个所述的糖基化酶骨架载体或者所述的核酸内切酶载体与对应的一个所述的腺嘌呤脱氨基酶载体进行组合形成mtABE对，将其转染到所要编辑的细胞，通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，实现细胞线粒体DNA由A/T到G/C的编辑。
12.权利要求4-8中任一项所述的mtABE编辑系统在制备线粒体DNA的A/T到G/C编辑的试剂中的应用。
13.权利要求4-8中任一项所述的mtABE编辑系统在构建细胞或者动物线粒体疾病模型中的应用。
14.如Seq ID NO：16-18所示的三个糖基化酶、如Seq ID NO：19-24所示的6个核酸内切酶、如Seq ID NO：25所示单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e或他们的突变体在制备线粒体DNA编辑工具中的应用。
15.编码Seq ID NO：16-18所示的三个糖基化酶的基因、编码Seq ID NO：19-24所示的6个核酸内切酶的基因、编码Seq ID NO：25所示单链DNA腺嘌呤脱氨基酶TadA-8e的基因或他们的突变体在制备线粒体DNA编辑工具中的应用。
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