CN113736790B - 一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA，所述sgRNA位于鸭hnRNPA3基因第五外显子上，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA对应的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了一种包含上述sgRNA的表达载体，所述表达载体为CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述表达载体命名为lentiCRISPR‑v2‑Blast。本发明进一步提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系及其构建方法和应用。本发明首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系，本发明中的hnRNPA3基因敲除细胞系能够成为鸭源病毒扩增和研究的重要工具，尤其是有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。

Description

一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是在细菌和古生物菌中发现的获得性免疫系统，此系统能够实现对特定基因进行定点切割。其中，基于链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统由于元件组成简单[功能单元：Cas9蛋白和sgRNA(single-guide RNA)]，相对效率高，因此成为目前广泛应用的基因编辑系统。当生物体基因组中出现由CRISPR/Cas9系统带来的双链DNA断裂(doublestrand break,DSB)后，细胞会通过自身的修复机制同源重组(Homology directedrepair,HDR)或非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)对损伤的双链DNA进行修复，由于修复过程中可能在连接处引入突变，因此通常利用这种特点实现对靶基因进行基因编辑，尤其是基因敲除。
慢病毒系统是以HIV-1为基础发展起来的一种基因转导工具。此系统能够在体内外介导分裂和非分裂细胞的有效转导和稳定表达。由于CRISPR/Cas9系统发挥功能需要Cas9蛋白和sgRNA的稳定表达，因此利用慢病毒载体将CRISPR/Cas9系统整合到宿主基因组中，能够稳定的发挥CRISPR/Cas9的功能，从而实现对靶基因的稳定敲除。
鸭坦布苏病毒(TMUV)属于黄病毒科黄病毒属，主要感染鸭，引起鸭的鸭坦布苏病毒病。鸭感染后表现为采食量下降、拉绿色稀粪、产蛋量急剧下降等临床症状。鸭坦布苏病毒病的特点是发病急、传播快，给养鸭业造成巨大的经济损失。因此，对鸭坦布苏病毒的研究非常重要。但是由于目前鸭源的基因敲除细胞系较少，通常只能实现基因敲低和基因过表达，而无法完全将基因敲除，不能提供用于病毒体外研究的鸭源基因敲除细胞系。并且由于鸭坦布苏病毒在现有细胞系中的扩增水平较低，没有合适的基因敲除细胞系严重影响了对鸭坦布苏病毒感染鸭细胞模型的研究。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的没有适合用于鸭坦布苏病毒研究的鸭源基因敲除细胞系，不利于对鸭坦布苏病毒进行深入研究的问题，提供一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA，所述sgRNA位于鸭hnRNPA3基因第五外显子上，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA对应的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种包含上述sgRNA的表达载体，所述表达载体为CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述表达载体命名为lentiCRISPR-v2-Blast。
优选地，所述表达载体的构建方法为：人工合成sgRNA序列和sgRNA对应的上、下游引物序列，经退火后形成双链DNA；将双链DNA与经过BsmBⅠ酶切的载体lentiCRISPR-v2连接，获得表达载体lentiCRISPR-v2-Blast；所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系，所述细胞系为利用上述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast敲除鸭hnRNPA3基因获得的单克隆细胞株，所述细胞系为稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
本发明进一步提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
S1、表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的构建、转化、筛选、PCR鉴定及测序验证；所述PCR鉴定的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
S2、将S1中构建的表达载体lentiCRISPR-v2-Blast与辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G共同转染HEK293T细胞，获得重组慢病毒；
S3、杀稻瘟菌素S(Blasticidin S,BS)用于筛选基因敲除阳性细胞的浓度的确定；
S4、将S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞及筛选单克隆细胞。
优选地，所述S2中，所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast、辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G的质量比为4：3：1。
优选地，所述S3中，分别用浓度为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的BS培养永生化鸭胚成纤维细胞，据此来确定BS筛选基因敲除阳性细胞的浓度。
进一步优选，所述S4中，用S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞，感染48h后加入S3中确定筛选浓度的BS进行加压筛选；将筛选后存活的细胞稀释并进行单克隆筛选，将筛选出的阳性单克隆细胞进行蛋白质免疫印迹验证；同时继续使用BS维持对阳性单克隆细胞的筛选，从而获得敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
本发明进一步提供了上述敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系在鸭源传代细胞系生产上的应用。
本发明进一步提供了上述敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系在制备hnRNPA3基因参与鸭坦布苏病毒(TMUV)生命周期研究的细胞模型上的应用。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明利用CRISPR/Cas9系统从传代的鸭胚成纤维细胞中敲除鸭hnRNPA3基因，从基因和蛋白水平的检测都证实已经成功敲除鸭hnRNPA3基因，首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系，本发明中的hnRNPA3基因敲除细胞系能够成为鸭源病毒扩增和研究的重要工具。
二)本发明通过RT-qPCR表明本发明所构建的hnRNPA3基因敲除细胞系感染鸭坦布苏病毒(TMUV)后较亲代鸭胚成纤维细胞中病毒基因组水平更高,说明敲除hnRNPA3基因的细胞系能够显著提高鸭坦布苏病毒(TMUV)的扩增水平；利用TMUV翻译系统表明hnRNPA3基因敲除细胞系能够促进TMUV基因组的翻译，有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。
附图说明
图1为靶向鸭hnRNPA3基因的sgRNA及表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒示意图；
图2为不同浓度的杀稻瘟菌素用于基因敲除阳性细胞筛选的细胞生长图；
图3为敲除鸭hnRNPA3基因阳性单克隆细胞免疫印迹(WB)验证图；
图4为RT-qPCR评价鸭hnRNPA3基因敲除细胞对TMUV增殖影响的结果图；
图5为利用TMUV翻译系统评价鸭hnRNPA3基因敲除对TMUV RNA翻译的影响结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
质粒、细胞、病毒：lentiCRISPR-v2质粒购自Addgene，编号#83480；质粒pCMV-VSV-G购自Addgene，编号#8454；质粒psPAX2购自Addgene，编号#12260；永生化鸭胚成纤维细胞(DEF)购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；DH5α感受态细胞由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供、HEK293T细胞购自于武汉普诺赛生命科技有限公司；鸭坦布苏病毒(TMUV)由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供。
1.表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒的构建
靶向鸭hnRNPA3基因的sgRNA及表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒示意图如图1所示。用BsmBⅠ内切酶线性化lentiCRISPR-v2载体，线性化体系与程序如下：BsmBI 1μL，lentiCRISPR-v2质粒1μg，NEB Buffer3.1 5ul，用灭菌水补足到50ul；酶切条件为55℃30min；酶切完成后回收后备用。
人工合成sgRNA序列SEQ ID NO.1和sgRNA对应的上、下游引物序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；将sgRNA寡核苷酸退火成双链。利用DNA连接酶与线性化载体lentiCRISPR-v2-Blast连接，反应体系与程序如下：载体质粒1μL，退火后的sgRNA 1μl，Solution I 5μl，灭菌水3μL；反应条件为16℃1h，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布在含氨苄抗性的LB固体培养基中37℃过夜培养。之后挑取单菌落至含氨苄抗性的固体培养基中，以序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物进行PCR扩增后电泳鉴定菌落，电泳阳性的菌落在含氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养，然后抽提质粒并进行测序验证，获得表达载体lentiCRISPR-v2-Blast，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6。同时抽提辅助质粒pCMV-VSV-G和psPAX2。sgRNA及引物序列详见表1。
表1
Figure BDA0003303505080000051
Figure BDA0003303505080000061
2.重组慢病毒包装及浓缩
将HEK293T细胞接种至10cm细胞培养皿，待细胞长到70％-80％进行转染，将构建好的lentiCRISPR-v2-blast质粒与辅助质粒pCMV-VSV-G和psPAX2共同转染HEK293T细胞，其中lentiCRISPR-v2-blast，psPAX2和pCMV-VSV-G的质量比为4：3：1，转染6-8h后换液。转染60h后，收取细胞培养皿中的上清液，用滤膜过滤去除细胞杂质，4℃、12000rpm离心3h。离心后，弃上清，用200ul的Opti-MEM培养基重悬病毒沉淀，获得重组慢病毒悬液用于后续感染。
3.杀稻瘟菌素S(Blasticidin S,BS)用于筛选基因敲除阳性细胞的浓度的确定
为了后续使用BS筛选可能的基因敲除的阳性细胞，首先要确定永生化鸭胚成纤维细胞(DEF)中BS筛选曲线。将永生化DEF传至6孔板，待细胞密度达到70％-80％时，在各孔中依次加入不同浓度的BS(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml)。每隔24h观察细胞的存活情况，据此来确定BS最佳的使用浓度。死亡细胞呈圆形漂浮于培养基上，活细胞呈梭形贴壁生长。筛选结果表明，8μg/ml的BS可以在加药三天后杀死全部DEF细胞，因此使用此浓度作为后续的筛选浓度。结果如附图2所示。
4.重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞及筛选单克隆细胞
设置试验组和对照组，试验组和对照组均取生长良好的永生化DEF接种于6cm细胞培养皿。试验组细胞密度达到80％时，根据病毒滴度接种慢病毒；对照组不感染病毒。48h后，试验组和对照组均换上含5％FBS的DMEM培养基，同时加入8μg/ml的BS筛选，每3天换液一次，直至对照组细胞全部死亡。
将上述试验组中感染重组慢病毒的永生化DEF消化成细胞悬液，取100ul细胞悬液用DMEM稀释10倍，再取稀释后的细胞悬液20μl，加入等体积的0.4％台盼蓝染液混匀，加入细胞计数室，静置数分钟后进行活细胞计数。将细胞稀释成100个cell/10ml，接种于96孔板中，每3天换液一次，7天后将单克隆细胞传代至24孔板。待24孔板中细胞长满后，扩大培养到两个24孔板中，其中一个24孔板用于蛋白免疫印迹(WB)验证，为9-1clone组；设立对照组为未感染重组慢病毒的亲代鸭胚成纤维细胞(naive DEF)组，WB验证试验结果如附图3所示。将另一个24孔板用于后续的扩大培养，由24孔板传代至6孔板，单克隆细胞在6孔板中生长时加入BS加压维持筛选，6孔板长满后，继续扩大培养并冻存，获得敲除鸭hnRNPA3基因的传代鸭胚成纤维细胞系。
实施例2
验证hnRNPA3敲除细胞系上TMUV增殖情况
设立试验组9-1clone和对照组DEF(IM)，试验组将实施例1中制备的hnRNPA3基因敲除的DEF接种到12孔板中，每组设置三个重复；对照组将等量的亲代鸭胚成纤维细胞(naive DEF)接种到12孔板中，每组设置三个重复。待试验组和对照组的细胞密度达到80-90％时，分别感染等量的TMUV，感染24h后，弃去上清，利用Trizol法对总RNA进行抽提，并将其反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(RT-qPCR)，检测试验组和对照组中TMUV E基因相对于内参基因β-actin的表达情况，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为内参基因β-actin的引物；以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为TMUV E基因的引物。RT-qPCR引物如表2所示。结果如附图4所示，hnRNPA3基因敲除细胞可以显著促进了TMUV在细胞模型上的增殖。
表2
Figure BDA0003303505080000071
Figure BDA0003303505080000081
实施例3
验证hnRNPA3敲除细胞系上TMUV病毒RNA翻译情况
设立试验组9-1clone和对照组DEF(IM)，试验组将实施例1中制备的hnRNPA3基因敲除的DEF接种到24孔板中，每组设置四个重复；对照组将等量的naive DEF接种到24孔板中，每组设置四个重复。待密度达到80-90％时，分别转染TMUV翻译系统5’UTR-Rluc-3’UTR，转染4h后，弃去上清，收取细胞样品，检测细胞内Rluc水平，即代表了TMUV基因组翻译情况。结果表明，如图5所示，hnRNPA3基因的敲除可以显著促进TMUV RNA在鸭胚成纤维细胞上的翻译水平。
综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9系统从传代的鸭胚成纤维细胞中敲除鸭hnRNPA3基因，首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系。实施例2中RT-qPCR的结果表明在感染等量的鸭坦布苏病毒(TMUV)后，本发明所构建的hnRNPA3基因敲除细胞系较亲代鸭胚成纤维细胞中的病毒基因组水平更高，说明敲除hnRNPA3基因的细胞系能够显著提高鸭坦布苏病毒(TMUV)的扩增水平；实施例3中利用TMUV翻译系统表明hnRNPA3基因敲除细胞系能够促进TMUV基因组的翻译，本发明提供的hnRNPA3基因敲除细胞系有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
                         序列表
<110>  四川农业大学
<120>  一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用
<141>  2021-10-14
<160>  10
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  23
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<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
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<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt  60
ggcaccgagt cggtgctttt ttgaattcgc tagctaggtc ttgaaaggag tgggaattgg 120
ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg 180
aggggtcggc aattgatccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga 240
tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt 300
agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg accggttcta 360
gagcgctgcc accatggaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt 420
gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg 480
caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg 540
cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa 600
gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag 660
cttcttccac agactggaag agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca 720
ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta 780
ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct 840
ggccctggcc cacatgatca agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc 900
cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt 960
cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact 1020
gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg 1080
cctgttcgga aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt 1140
cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga 1200
caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct 1260
gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc 1320
cctgagcgcc tctatgatca agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa 1380
agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa 1440
gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat 1500
caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga 1560
ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct 1620
gggagagctg cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa 1680
ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc 1740
caggggaaac agcagattcg cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg 1800
gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac 1860
caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga 1920
gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa 1980
gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa 2040
ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga 2100
ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga 2160
tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct 2220
ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct 2280
gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata 2340
caccggctgg ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg 2400
caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct 2460
gatccacgac gacagcctga cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca 2520
gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg 2580
catcctgcag acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc 2640
cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa 2700
cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct 2760
gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct 2820
gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta 2880
cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt 2940
gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt 3000
gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa 3060
gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt 3120
catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga 3180
ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat 3240
caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg 3300
cgagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc 3360
cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta 3420
cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta 3480
cttcttctac agcaacatca tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga 3540
gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa 3600
gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa 3660
aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag 3720
cgataagctg atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag 3780
ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa 3840
actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa 3900
gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat 3960
caagctgcct aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc 4020
tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct 4080
gtacctggcc agccactatg agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca 4140
gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt 4200
ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa 4260
gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac 4320
caatctggga gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta 4380
caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta 4440
cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacaag cgacctgccg ccacaaagaa 4500
ggctggacag gctaagaaga agaaagatta caaagacgat gacgataagg gatccggcgc 4560
aacaaacttc tctctgctga aacaagccgg agatgtcgaa gagaatcctg gaccggccaa 4620
gcctttgtct caagaagaat ccaccctcat tgaaagagca acggctacaa tcaacagcat 4680
ccccatctct gaagactaca gcgtcgccag cgcagctctc tctagcgacg gccgcatctt 4740
cactggtgtc aatgtatatc attttactgg gggaccttgt gcagaactcg tggtgctggg 4800
cactgctgct gctgcggcag ctggcaacct gacttgtatc gtcgcgatcg gaaatgagaa 4860
caggggcatc ttgagcccct gcggacggtg ccgacaggtg cttctcgatc tgcatcctgg 4920
gatcaaagcc atagtgaagg acagtgatgg acagccgacg gcagttggga ttcgtgaatt 4980
gctgccctct ggttatgtgt gggagggcta aacgcgttaa gtcgacaatc aacctctgga 5040
ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 5100
tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 5160
ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag 5220
gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc 5280
caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga 5340
actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa 5400
ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac 5460
ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 5520
tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 5580
gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcgtcga ctttaagacc aatgacttac 5640
aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt 5700
cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag 5760
atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc 5820
ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga 5880
tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gggcccgttt aaacccgctg 5940
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 6000
ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 6060
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 6120
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc 6180
tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc 6240
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 6300
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 6360
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 6420
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 6480
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 6540
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 6600
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg 6660
aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 6720
agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 6780
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 6840
cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 6900
ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga 6960
ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg tatatccatt 7020
ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat 7080
aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca 7140
ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg 7200
acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg 7260
cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg 7320
acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc 7380
cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg 7440
ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg acacgtgcta cgagatttcg 7500
attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct 7560
ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 7620
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 7680
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 7740
gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 7800
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 7860
cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 7920
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 7980
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 8040
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 8100
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 8160
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 8220
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 8280
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 8340
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 8400
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 8460
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 8520
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 8580
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 8640
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 8700
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 8760
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 8820
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 8880
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 8940
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 9000
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 9060
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 9120
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 9180
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 9240
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 9300
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 9360
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 9420
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 9480
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 9540
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 9600
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 9660
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 9720
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 9780
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 9840
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 9900
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcga cggatcggga gatctcccga 9960
tcccctatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatct 10020
gctccctgct tgtgtgttgg aggtcgctga gtagtgcgcg agcaaaattt aagctacaac 10080
aaggcaaggc ttgaccgaca attgcatgaa gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct 10140
gcttcgcgat gtacgggcca gatatacgcg cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 10200
aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 10260
aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 10320
taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 10380
agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 10440
cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 10500
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 10560
tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 10620
gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 10680
caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 10740
aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 10800
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 10860
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 10920
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 10980
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 11040
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 11100
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 11160
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 11220
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 11280
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 11340
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 11400
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 11460
aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa 11520
ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag 11580
agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc 11640
ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga 11700
caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa 11760
cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct 11820
gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc 11880
atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt 11940
tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata 12000
cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa 12060
ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata 12120
aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt 12180
tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 12240
accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 12300
gacagatcca ttcgattagt gaacggatcg gcactgcgtg cgccaattct gcagacaaat 12360
ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga 12420
aagaatagta gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac 12480
aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga gatccagttt ggttaattaa 12540
ggtaccgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 12600
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aaaggacgaa acaccgacgc gtccatcaac cttatg                         12816
<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
gatcacagcc ctggcacc                                                18
<210>  8
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<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  9
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<210>  10
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  10
gggcgttatc acgaatcta                                               19

Claims (9)

1.一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA位于鸭hnRNPA3基因第五外显子上，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；所述sgRNA对应的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。
2.一种包含权利要求1所述的sgRNA的表达载体，其特征在于，所述表达载体为CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述表达载体命名为lentiCRISPR-v2-Blast。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法为：人工合成sgRNA序列和sgRNA对应的上、下游引物序列，经退火后形成双链DNA；将双链DNA与经过BsmBⅠ酶切的载体lentiCRISPR-v2连接，获得表达载体lentiCRISPR-v2-Blast；所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示。
4.一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系，其特征在于，所述细胞系为利用权利要求3所述的表达载体lentiCRISPR-v2-Blast敲除鸭hnRNPA3基因获得的单克隆细胞株，所述细胞系为稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
5.根据权利要求4所述的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的构建、转化、筛选、PCR鉴定及测序验证；所述PCR鉴定的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示；
S2、将S1中构建的表达载体lentiCRISPR-v2-Blast与辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G共同转染HEK293T细胞，获得重组慢病毒；
S3、杀稻瘟菌素S用于筛选基因敲除阳性细胞的浓度的确定；
S4、将S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞及筛选单克隆细胞。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述S2中，所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast、辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G的质量比为4：3：1。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述S3中，分别用浓度为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的杀稻瘟菌素S培养永生化鸭胚成纤维细胞，据此来确定杀稻瘟菌素S筛选基因敲除阳性细胞的浓度。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述S4中，用S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞，感染48h后加入S3中确定筛选浓度的杀稻瘟菌素S进行加压筛选；将筛选后存活的细胞稀释并进行单克隆筛选，将筛选出的阳性单克隆细胞进行蛋白质免疫印迹验证；同时继续使用杀稻瘟菌素S维持对阳性单克隆细胞的筛选，从而获得敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
9.权利要求4所述的敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系在制备hnRNPA3基因参与鸭坦布苏病毒生命周期研究的细胞模型上的应用。
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