CN111218475A

CN111218475A - 一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法

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Publication number: CN111218475A
Application number: CN201811421283.1A
Authority: CN
Inventors: 刘兰军; 张勇侠; 陈宗香; 高雅丽; 康庄
Original assignee: CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2020-06-02

Abstract

本发明提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株反向遗传学方法，包括如下步骤：(1)病毒全长质粒pT7MV_sw和辅助质粒与哺乳动物细胞混合；(2)电击转染；(3)培养细胞，收获病毒；所述全长质粒包含T7启动子和麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组或反基因组序列；所述辅助质粒包括pT7‑SWN(带有T7启动子和麻疹N蛋白编码序列)、pT7‑SWP(带有T7启动子和麻疹P蛋白编码序列)、pT7‑SWL(带有T7启动子和麻疹L蛋白编码序列)、pT7‑T7RNAP(带有T7启动子和T7RNA聚合酶编码序列)、pCDIBP‑T7RNAP(带有CMV启动子和T7RNA聚合酶编码序列)。本发明能成功拯救出麻疹Schwarz/Moraten疫苗株，具有很好的应用前景。

Description

一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法

技术领域

本发明涉及病毒反向遗传学领域，特别涉及一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的拯救系统和方法。

背景技术

麻疹病毒(Measlesvirus,Mev)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，基因组全长为15894个核苷酸[1]。1954年Enders和Peebles 在人、猴肾细胞培养物上分离成功第一株麻疹病毒野毒株Edmonston，并在组织培养物中连续传代[2]。由于麻疹具有极强的感染性，因此在接触前接种麻疹疫苗是控制麻疹唯一合理的方法。

Edmonston野毒株是当前世界上广泛使用的麻疹减毒疫苗株的来源株，例如AIK-C，Zagreb，Schwarz以及Moraten疫苗株[3]。Edmonston野毒株在人肾细胞、羊膜细胞、鸡胚细胞上传代适应，因传代次数不同产生两种麻疹减毒株Edmonston A和B。1963年，默克公司上市销售全球第一个麻疹疫苗 Edmonston B株，该疫苗于1975年退市。减毒株Edmonston A和B分别在鸡胚细胞上继续传代及鸡胚细胞上低温传代适应获得更为减毒的Schwarz和Moraten疫苗株。GSK公司麻腮风水痘四联苗中的麻疹疫苗株Schwarz共传156 代，默克公司麻腮风水痘四联苗中的麻疹疫苗株Moraten共传128代，研究表明，两个疫苗株序列在核苷酸及蛋白质水平完全一致[4]。目前， Schwarz/Moraten疫苗株是世界范围内最广泛使用的麻疹疫苗株[5]。

为了获得性状稳定的疫苗，通常采取反向遗传学的方法制备减毒活病毒。该方法通常将病毒株全长cDNA与编码蛋白N、P、L的基因克隆在T7启动子控制的质粒上，将全长质粒及辅助质粒共转染宿主细胞，质粒需在T7RNA 聚合酶的作用下进行转录完成病毒的拯救。T7RNA聚合酶通常通过转染可表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒或能稳定表达T7RNA聚合酶的工程化细胞提供。

将重组痘病毒转入T7RNA聚合酶获得的工程化细胞用于疫苗生产，后期纯化时无法彻底去除重组痘病毒，无法满足GMP对病毒候选疫苗临床应用的要求，因此采用该方法拯救所得病毒不能用于疫苗的开发和生产。

可持续表达T7RNA聚合酶的工程化细胞拯救重组病毒无需引入重组痘病毒，但在使用过程中也受到一定的限制。一方面，构建并维持能稳定表达 T7RNA聚合酶工程细胞存在一定的难度；另一方面，构建所得的工程化细胞基因组序列在原有细胞基础上有插入，为保证疫苗临床应用的安全性，将工程化细胞应用到疫苗的开发、生产过程中需要经过验证，验证工程化细胞并将其用于疫苗的生产难度较大。因此，对于需要在人类身上进行临床试验进行评估的候选疫苗的开发，在其病毒株的生产过程中使用能表达T7RNA聚合酶的病毒或工程化细胞，都会使得整个疫苗从开发到临床应用过程复杂化，加大批准难度。

综上，使用常规的病毒拯救体系无法满足麻疹Schwarz/Moraten株疫苗开发的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救系统和拯救方法。

首先，本发明提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救系统，其特征在于，它包括病毒全长质粒pT7MV_SW和辅助质粒；

所述全长质粒包含T7启动子、以及麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组或反基因组序列；

所述辅助质粒包括pT7-SWN、pT7-SWP、pT7-SWL、pT7-T7RNAP和pCDIBP- T7RNAP；

所述pT7-SWN是带有T7启动子和麻疹N蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-SWP是带有T7启动子和麻疹P蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-SWL是带有T7启动子和麻疹L蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-T7RNAP是带有T7启动子和T7RNA聚合酶编码序列的质粒；

所述pCDIBP-T7RNAP是带有CMV增强子序列、CMV启动子序列和T7RNA 聚合酶编码序列的质粒；

进一步地，所述麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组序列的5’端或反基因组的3’端还连接有锤头核酸酶序列；所述锤头核酸酶序列如SEQ ID NO.1 所示。

进一步地，所述麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组序列的3’端或反基因组的5’端还连接有丁型肝炎病毒核酶序列；所述丁型肝炎病毒核酶序列如 SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救方法，包括如下步骤：

(1)将前述病毒全长质粒pT7MV_SW和辅助质粒与哺乳动物细胞混合；

(2)电击转染；

(3)培养细胞，收获病毒。

前述方法中，所述pT7MV_SW、pT7-SWN、pT7-SWP、pT7-SWL、pT7-T7RNAP和 pCDIBP-T7RNAP的用量比例为12:8:4:1:2:4。

所述方法中哺乳动物细胞为CEF、BHK、293T、BSR、CHO、MRC-5、WI-38、 HEK 293、EB66和Vero细胞中的一种。

所述方法中，哺乳动物细胞优选为Vero细胞。

进一步地，所述哺乳动物细胞数目不低于10⁵个；所述pT7MV_SW用量不低于3微克。

更进一步地，所述哺乳动物细胞数目不低于5×10⁵个；所述pT7MV_SW用量不低于12微克。

更进一步地，步骤(2)的电转是在直径为2mm的BioRad电转杯中进行的，电转参数为：指数波、140V、950μF电击1次。

本发明还提供了前述拯救方法所制备的麻疹Schwarz/Moraten疫苗株在制备麻疹疫苗中的用途。

本发明可以达到如下有益效果：

本发明拯救出的麻疹Schwarz/Moraten疫苗株具有较高的稳定性，继代 2次后，其传代滴度稳定在5.5～6.5lgCCID₅₀/mL范围。

本发明拯救出的麻疹Schwarz/Moraten疫苗株还具有很强的增殖能力，其第四代后的第24小时到第144小时，滴度可以从约2.5lgCCID₅₀/mL提高到7.5lgCCID₅₀/mL。

本发明拯救出的麻疹Schwarz/Moraten疫苗株还具有良好的免疫原性，其能顺利诱导小鼠产生抗麻疹病毒MV_S191和MV_SW的中和抗体，中和抗体滴度大于1：320，与麻疹疫苗株MV_s191所诱导的中和抗体效价无显著差别。

本发明的病毒拯救方法，能成功拯救出大量有良好免疫原性的麻疹 Schwarz/Moraten疫苗株，且避免了现有技术中重组痘病毒带来的潜在危害，也免于花费大量时间和精力构建工程化稳定表达T7RNA聚合酶的细胞，具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是载体pT7-MCS2的鉴定结果。

图2是麻疹毒株Schwarz全长构建示意图。

图3是pT7MV_SW酶切鉴定结果。

图4是pT7-SWN、pT7-SWP及pT7-SWL质粒NcoI-NotI双酶切鉴定结果。

图5是拯救病毒MVsw感染Vero细胞(A)、CEC细胞(B)后的显微观察图。

图6是P1-P10代麻疹病毒MVsw传代滴度统计图。

图7是P4代麻疹病毒MVsw的生长曲线。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

(一)细胞及质粒

P141代Vero细胞；CEC细胞；麻疹疫苗株沪191(MV_S191)；pT7-IRES His- C DNA质粒(Takara公司)：带有T7启动子、IRES序列和His-C标签；

pT7-T7RNAP质粒：带有T7启动子和T7RNA聚合酶序列表达T7RNA聚合酶质粒；

pCDIBP-T7RNAP质粒：带有CMV启动子、CMV增强子、T7RNA聚合酶的表达T7RNA聚合酶的质粒，优选地，其序列如SEQ ID NO.3所示；

麻疹病毒沪191株pT7-IRES-L前载体：以pT7-IRES His-C DNA质粒为骨架、携带麻疹病毒沪191株L基因质粒。

(二)主要试剂

高纯度病毒RNA提取试剂盒购自Roche公司；

高保真DNA聚合酶 T4 DNA连接酶、限制性内切酶等购自NEB公司；随机引物、Superscript III反转录酶购自Invitrogen公司；pGEM-T载体连接试剂盒、胶回收试剂盒购自 Promega公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；琼脂糖、DNA marker购自 Takara公司；MEM、FBS培养液购自Gibco公司；其他试剂均为国产试剂。

实施例1麻疹schwarz疫苗株（MV_SW)拯救

1全长质粒及辅助质粒构建

1.1载体pT7-IRES His-C DNA改造

改造：以pT7-IRES His-C DNA载体为模板，pT7mk-IRES-NotI:

AGCGGCCGCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC(SEQ ID NO.4)，pT7-IRES-

NheI:TAGCTAGCAAGCTTGGCGTAATCATG(SEQ ID NO.5)为引物PCR扩增获得载体骨架，胶回收PCR片段。由金唯智公司合成限制性内切酶多克隆位点NheI- AscI-SacII-KasI-BamHI-SpeI-KpnI-NcoI-NotI核苷酸序列MCS2，MCS2通过NheI和 NotI酶切位点与载体PCR扩增产物连接，改造后的载体命名为pT7-MCS2。

鉴定：使用多克隆位点上的内切酶SacII和载体单一酶切位点SspI酶切载体pT7-MCS，酶切后的长度为600bp和2400bp(图1)，表明多克隆序列MCS2 被成功构建到pT7-IRESHis-C中。

1.2全长质粒克隆构建

参照麻疹毒株Schwarz的基因组序列(GenBank:FJ211590.1)，将Schwarz 全长cDNA序列15384bp分成F1-F7序列共7个片段，由金唯智公司分段合成，其中F1片段序列的5′端插入T7启动子以及HamRz(锤头核酸酶序列，序列如 SEQ ID NO.1所示)。F7片段序列的3′端插入T7终止子以及HdvRz(丁型肝炎病毒核酶序列，序列如SEQ ID NO.2所示)，Schwarz全长分段构建示意图见图 2。

将基因片段F1-F7分别克隆至载体pT7-MCS2上(得到pT7-MCS2-F1—pT7- MCS2-F7共7个重组质粒。7个重组质粒依据酶切位点按顺序拼接麻疹毒株 Schwarz全长cDNA，构建流程如下：将pT7-MCS2-F1质粒中F1片段通过酶切位点AscI-SacII克隆至pT7-MCS2-F2质粒，得到质粒pT7MV_SW-F12。将pT7-MCS2-F4 质粒中F4片段通过酶切位点BamHI-SpeI克隆至pT7-MCS2-F3质粒，得到质粒 pT7MV_SW-F34。将pT7-MCS2-F5质粒中F5片段通过酶切位点SpeI-KpnI克隆至 pT7-MCS2-F6，得到质粒pT7MV_SW-F56。将pT7-MCS2-F7质粒中F7片段通过酶切位点NcoI-NotI克隆至pT7-MCS2-F7质粒，得到质粒pT7MV_SW-F567。将 pT7MV_SW-F567质粒中F567片段通过酶切位点SpeI-NotI克隆至pT7MV_SW-F34质粒，得到质粒pT7MV_SW-F34567。将pT7MV_SW-F34567质粒中F34567片段通过酶切位点KasI-NotI克隆至pT7MV_SW-F12质粒，构建质粒pT7MV_SW，对最终构建的 pT7MV_SW进行酶切鉴定。

酶切鉴定：使用BamHI、NdeI和EcoRI分别对pT7MV_SW进行酶切鉴定，结果能得到酶切条带(图3)，证明全长质粒构建成功。

1.3辅助质粒构建

辅助质粒都是以pT7-IRES His-C DNA载体为骨架，将编码麻疹的N蛋白 (SWN)、P蛋白(SWP)和L蛋白(SWL)的DNA序列分别插入得到。具体地：

辅助质粒pT7-SWN。通过NcoI、BamHI、SpeI三个酶切位点把MVN分为两段(1～67bp(BamHI)、68～1578bp)连入pT7-IRES His-C DNA载体。

辅助质粒pT7-SWP。SWP片段用NcoI、XbaI双酶切，然后连入pT7-IRES His-C DNA载体构建pT7-SWP表达质粒。

辅助质粒pT7-SWL。SWL片段分两段(1～300bp(EcoRI)及剩下的部分)分别构建，1～300bp(EcoRI)片段与麻疹病毒沪191株序列一致，利用已构建麻疹病毒沪191株pT7-IRES-L前载体，将SWL剩余部分用EcoRI和SalI连入 pT7-IRES-L前载体。

鉴定：使用NcoI和NotI双酶切鉴定pT7-SWN、pT7-SWP及pT7-SWL质粒，发现酶切条带(图4)，表明辅助质粒pT7-SWN、pT7-SWP及pT7-SWL构建成功。

2病毒拯救

将5×10⁵个P141代Vero细胞用电转缓冲液充分混匀悬浮，加入12μg pT7- MV_SW、8μg pT7-SWN、4μg pT7-SWP、1μg pT7-SWL、2μg pT7-T7RNAP及4μg pCDIBP-T7RNAP混匀。混合物转入直径为2mm的BioRad电转杯，指数波、 140V、950μF电击1次。电转染后将细胞移入T25瓶，补加5ml 10％ NBS/MEM，5％CO₂ 37℃培养24h后换液，继续培养到细胞病变约80～90％后将转染细胞及上清混合物反复冻融3次，收获拯救病毒MV_SW。拯救病毒接种单层P141代Vero细胞，37℃培养3-4d后收获P2代病毒。

观察：将P2代病毒置于Vero细胞或CEC细胞上传代培养，发现：Vero细胞培养3d～5d病变达到80％以上，CEC细胞培养5d～7d病变达到80％以上；MVsw 在Vero及CEC细胞培养的病变典型特征是少部分为单个细胞肿胀，继而感染周围其他细胞，导致大片细胞出现以肿胀为主的病变，大部分为相邻细胞融合形成典型的合胞体型病变(图5)。

鉴定：按Roche高纯度病毒RNA取试剂盒说明书提取Vero和CEC上P2代病毒MVsw的基因组RNA，利用随机引物将RNA逆转录为cDNA，并以此cDNA为模板，用引物MA6-S：ATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT(SEQ ID NO.6)，MA6-R： ATTGATGCACAATTGGCTATTAGG(SEQ IDNO.7)扩增，扩增产物进行T克隆，挑选2个阳性克隆送金唯智公司测序。测序结果显示：Vero和CEC上P2代病毒 MVsw扩增片段序列与疫苗株Schwarz的理论序列一致。

3病毒滴度测定

采用终点稀释法检测病毒滴度，用Reed-Muench法计算细胞半数感染剂量(CCID₅₀)。拯救病毒MV_SW在150代内的Vero细胞上传代培养，取P1-P10代病毒，于-20℃冻融一次收集病毒液。病毒液用含2％NBS的MEM进行10倍系列稀释，每稀释度病毒液100μL/孔接种至96孔板培养的Vero细胞中，每个稀释度接种8个孔，置37℃，5％CO₂条件下培养7天判定结果。

如图6所示，P1代为Vero电转拯救出的MVsw病毒，滴度低于4.5 lgCCID₅₀/mL，但经过再次传代滴度则提升，连续传代按MOI为0.03接种T225 瓶的Vero细胞，吸附接种，33℃吸附0.5h后补加含2％NBS的MEM，使T225瓶的终体积为40ml，33℃条件下培养4天收毒。连续传代至P10代，滴度稳定在 5.5～6.5lgCCID₅₀/mL。

4生长曲线测定

在Vero细胞上传至第4代的MV_SW用含2％NBS的MEM适当稀释病毒液，按 MOI为0.03接种T225瓶的Vero细胞，吸附接种，33℃吸附0.5h后补加含2％NBS 的MEM，使T225瓶的终体积为40ml，33℃条件下培养。在感染后24h、48h、 72h、96h、120h、144h、168h分别取T225瓶内的培养液上清0.5ml。用终点稀释法检测感染性滴度。以时间为横坐标，滴度为纵坐标，绘制病毒生长曲线。

如图7所示，P4代拯救病毒MV_SW生长快速，在接种144h内呈现连续增长的趋势。

实施例2麻疹schwarz疫苗株拯救系统

本系统用于拯救麻疹schwarz疫苗株。

1.拯救系统组成

拯救系统各组分如表1所示。其中N质粒、P质粒及L质粒带有T7启动子。

表1麻疹schwarz疫苗株拯救系统的组成

名称	用量(μg)
		schwarz疫苗株全长质粒	12
schwarz疫苗株N质粒	8
		schwarz疫苗株P质粒	4
schwarz疫苗株L质粒	1
		pCDIBP-T7RNAP质粒	4
pT7-T7RNAP质粒	2

2.拯救系统的用法

1)将上述每种质粒按量与悬于电转缓冲液中的5×10⁵个vero细胞混匀，移入伯乐公司(BioRad)2mm直径电转杯中，设置电转参数：指数波、 140V、950μF电击1次，电击1次。

2)将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

3)按照实际需要收毒，即可。

为了证明本发明方法能拯救出具有免疫原性的麻疹疫苗株，将实施例1 中拯救出的疫苗株用于小鼠免疫实验，具体见如下实验例。

实验例小鼠免疫实

1.方法

1.1小鼠免疫

将40只昆明小鼠随机分为4组：拯救麻疹Schwarz疫苗株(滴度6.25 lgCCID₅₀/ml)组、麻疹疫苗S191株(滴度5.0lgCCID₅₀/ml)组和空白对照组，每组10只。小鼠经腹腔注射，注射1mL/每只小鼠，免疫2次，间隔21d(免疫程序如表2所示)。末次免疫14d后经心脏穿刺采血，分离血清，56℃灭活 30min，测定血清中和抗体效价。对照组免疫MEM培养基。

表2免疫程序

1.2血清交叉保护中和效价测定

采用微量细胞病变(CPE)抑制法测定中和抗体效价。将病毒滴度已知的麻疹疫苗S191疫苗株及麻疹病毒Schwarz株稀释到2×10³CCID₅₀/mL，待测血清按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320系列稀释，50μL/孔加至96孔板内，每个稀释度设8个复孔；待测血清分别与等体积麻疹S191疫苗株及拯救麻疹Schwarz疫苗株病毒混合，37℃，5％CO₂孵箱中和1h。每孔加入100μL细胞浓度为10⁵个/mL的Vero细胞，37℃，5％CO₂培养7d后，观察CPE。将能抑制50％CPE的最高稀释度判定为抗体的中和效价，以稀释倍数的倒数表示，计算待测血清中和抗体效价。

2.结果

如表3所示，拯救病毒MV_SW株能够顺利在小鼠中诱导抗麻疹病毒MV_S191和MV_SW的中和抗体，中和抗体滴度均大于1：320。麻疹沪191疫苗株诱导的免疫血清可中和拯救的MV_SW病毒，中和抗体滴度大于1：320。小鼠免疫两针获得免疫血清中和病毒的抗体效价，拯救MV_SW疫苗株与麻疹沪191疫苗株相比免疫原性没有显著差异。

表3中和抗体滴度

以上实施例和实验例表明，本发明的病毒拯救方法，能成功拯救麻疹 Schwarz/Moraten疫苗株，且避免了现有技术中重组痘病毒带来的潜在危害，也免于花费大量时间和精力构建工程化稳定表达T7RNA聚合酶的细胞，具有很好的应用前景。

参考文献

[1]Bhattacharjee S,Yadava PK.Measles virus:background and oncolyticvirotherapy[J].Biochem Biophys Rep 2018,(13):58-62.

[2]Enders JF,Peebles TC.Propagation in tissue cultures ofcytopathogenic agentsfrom patients with measles[J].Proc Soc Exp Biol Med1954,86(2):277–286.

[3]Mühlebach MD.Vaccine platform recombinant measles virus[J].virusgenes,2017,53(5):733-740.

[4]Tillieux S L,Halsey W S,Sathe G M,et al.Comparative analysis ofthe complete nucleotide seq uencesof measles,mumps and rubella strain genomescontained in Priorix-Tetra and ProQuad li ve attenuated combined vaccines[J].Vaccine,2009,27(16):2265-2273.

[5]Moss WJ.Measles[J].Lancet,2017,390(10111):2490-2502.

部分序列

。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法

<130> GY014-18P1710

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 239

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> HamRz

<400> 1

taatacgact cactataggg ccaactttgt ttggtctgat gagtccgtga ggacgaaacc 60

cgggtcacca aacaaagttg ggtaaggata gttcaatcaa tgatcatctt ctagtgcact 120

taggattcaa gatcctatta tcagggacaa gagcaggatt agggatatcc gagatggcca 180

cacttttaag gagcttagca ttgttcaaaa gaaacaagga caaaccaccc attacatca 239

<210> 2

<211> 293

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> HdvRz

<400> 2

accctaatcc tgccctaggt ggttaggcat tatttgcaat atattaaaga aaactttgaa 60

aatacgaagt ttctattccc agctttgtct ggtggccggc atggtcccag cctcctcgct 120

ggcgccggct gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacgcg 180

gccgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 240

caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt ttt 293

<210> 3

<211> 7381

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-T7RNAP

<400> 3

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 960

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgc caccatgaac accatcaata 1740

ttgccaagaa cgacttttct gatatcgagc tggccgctat tccattcaat acactggctg 1800

accactacgg agagcggctg gcccgcgaac agctggctct ggagcatgaa agctatgaga 1860

tgggagaagc ccgattcagg aagatgtttg agaggcagct gaaagctggg gaagtggcag 1920

acaacgcagc cgctaagcca ctgattacca cactgctgcc caaaatgatc gccagaatta 1980

atgattggtt cgaggaagtg aaggcaaaac gaggaaagag gcctaccgcc ttccagtttc 2040

tgcaggagat caagccagaa gctgtggcat acatcaccat caagactacc ctggcatgcc 2100

tgacaagcgc cgacaacaca actgtgcagg cagtcgcttc cgcaatcgga cgagctattg 2160

aggacgaagc acgctttggg agaatccggg atctggaggc caagcacttc aagaaaaacg 2220

tggaggaaca gctgaacaag agggtggggc atgtctataa gaaggccttc atgcaggtgg 2280

tcgaggccga catgctgtca aagggactgc tgggaggaga ggcctggagc tcctggcaca 2340

aagaagatag catccatgtg ggagtccgct gcatcgagat gctgattgaa tctactggga 2400

tggtgagtct gcaccgacag aacgccggcg tggtcggaca ggactctgag acaatcgaac 2460

tggctcccga gtatgccgaa gctattgcaa ctagagccgg agctctggca gggatcagtc 2520

caatgttcca gccctgcgtg gtccccccta agccttggac tggcatcacc gggggcggat 2580

actgggctaa tggaaggaga ccactggcac tggtgcgaac acactctaag aaagccctga 2640

tgagatacga ggatgtctat atgcccgaag tgtataaggc catcaacatt gctcagaata 2700

cagcatggaa aattaacaag aaagtgctgg ccgtcgctaa tgtgatcact aagtggaaac 2760

attgtcccgt ggaggacatc cctgccattg aacgggagga actgcctatg aagccagagg 2820

acatcgatat gaaccctgaa gctctgaccg catggaagcg cgcagccgct gcagtgtaca 2880

gaaaggataa agcccggaag tcccggcgca tttctctgga gttcatgctg gaacaggcca 2940

acaagtttgc taatcacaaa gcaatctggt tcccctacaa catggactgg cgcggacgag 3000

tctatgccgt gagcatgttc aaccctcagg ggaatgatat gacaaagggc ctgctgactc 3060

tggctaaggg gaaaccaatt gggaaggagg gctactattg gctgaaaatc cacggggcca 3120

attgcgctgg cgtcgacaag gtgccattcc ccgagaggat caagttcatc gaggaaaacc 3180

atgaaaatat tatggcatgt gccaagtctc ccctggagaa cacatggtgg gccgaacagg 3240

atagtccttt ctgctttctg gccttctgtt ttgagtacgc tggagtgcag caccatgggc 3300

tgagttataa ttgctccctg ccactggcct ttgacggctc ttgtagtgga atccagcact 3360

tctccgcaat gctgagggat gaggtcggag gaagagcagt gaacctgctg ccatctgaga 3420

cagtgcagga catctacggc attgtcgcca agaaagtgaa tgagatcctg caggctgacg 3480

caattaacgg gactgataat gaggtggtca ccgtcacaga tgaaaacact ggcgagatca 3540

gcgaaaaggt gaaactggga accaaggccc tggctggaca gtggctggca tacggagtca 3600

cccgctcagt gacaaagcga agcgtgatga ccctggctta tggcagcaaa gagttcggct 3660

tcaggcagca ggtgctggaa gacaccatcc agccagccat tgattccgga aaggggctga 3720

tgtttacaca gcccaaccag gccgctggct acatggccaa gctgatctgg gagtcagtga 3780

gcgtcacagt ggtcgcagcc gtggaagcta tgaattggct gaagtccgct gcaaaactgc 3840

tggccgctga ggtgaaggac aagaaaactg gcgaaattct gaggaaaaga tgcgccgtcc 3900

actgggtgac ccctgatgga ttcccagtgt ggcaggagta taagaaaccc atccagacca 3960

gactgaacct gatgttcctg ggccagtttc ggctgcagcc tacaatcaac actaataagg 4020

acagtgagat tgatgctcat aaacaggaat cagggattgc acctaatttt gtgcacagcc 4080

aggacggctc ccatctgcgg aagactgtgg tctgggctca cgagaaatac ggcatcgaat 4140

ccttcgcact gattcatgac tcttttggaa ccatcccagc cgatgcagcc aacctgttca 4200

aggctgtccg cgagactatg gtggacacct acgaaagttg tgatgtgctg gccgacttct 4260

atgatcagtt tgctgaccag ctgcacgagt cacagctgga taagatgccc gcactgcctg 4320

ccaaaggcaa cctgaatctg agagacatcc tggagtccga tttcgcattt gcctgactcg 4380

aggatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4440

cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4500

tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg 4560

tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa 4620

gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc cttattccat agaaaagcct 4680

tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc 4740

taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct cctctcctga ctactcccag 4800

tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat ccctcgacct gcagcccaag cttggcgtaa 4860

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 4920

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 4980

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gcggatccgc 5040

atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 5100

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 5160

ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 5220

taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 5280

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 5340

caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatccgctgc attaatgaat cggccaacgc 5400

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5460

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 5520

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5580

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5640

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 5700

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 5760

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 5820

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 5880

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 5940

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6000

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6060

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6120

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6180

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6240

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 6300

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 6360

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 6420

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 6480

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 6540

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 6600

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 6660

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 6720

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 6780

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 6840

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 6900

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 6960

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 7020

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 7080

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 7140

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 7200

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 7260

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 7320

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgggtcgac attgattatt 7380

g 7381

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pT7mk-IRES-NotI

<400> 4

agcggccgct gatgcggtat tttctcctta c 31

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pT7-IRES-NheI

<400> 5

tagctagcaa gcttggcgta atcatg 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> MA6-S

<400> 6

atgggtctca aggtgaacgt ct 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> MA6-R

<400> 7

attgatgcac aattggctat tagg 24

Claims

1.一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救系统，其特征在于，它包括病毒全长质粒pT7MV_SW和辅助质粒；

所述全长质粒是包含T7启动子、以及麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组或反基因组序列的质粒；

所述辅助质粒包括pT7-SWN、pT7-SWP、pT7-SWL、pT7-T7RNAP和pCDIBP-T7RNAP；

所述pT7-SWN是带有T7启动子和麻疹N蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-SWP是带有T7启动子和麻疹P蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-SWL是带有T7启动子和麻疹L蛋白编码序列的质粒；

所述pT7-T7RNAP是带有T7启动子和T7RNA聚合酶编码序列的质粒；

所述pCDIBP-T7RNAP是带有CMV增强子序列、CMV启动子序列和T7RNA聚合酶编码序列的质粒。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组序列的5’端或反基因组的3’端还连接有锤头核酸酶序列；所述锤头核酸酶序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组序列的3’端或反基因组的5’端还连接有丁型肝炎病毒核酶序列；所述丁型肝炎病毒核酶序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1～3所述病毒全长质粒pT7MV_SW和辅助质粒与哺乳动物细胞混合；

(2)电击转染；

(3)培养细胞，收获病毒。

5.如权利要求4所述的拯救方法，其特征在于，所述pT7MVSW、pT7-SWN、pT7-SWP、pT7-SWL、pT7-T7RNAP和pCDIBP-T7RNAP的用量比例为12:8:4:1:2:4。

6.如权利要求4所述的反向遗传学方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞为CEF、BHK、293T、BSR、CHO、MRC-5、WI-38、HEK 293、EB66和Vero细胞中的一种。

7.如权利要求4所述的拯救方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为Vero细胞。

8.如权利要求4所述的拯救方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞数目不低于10⁵个；所述pT7MV_SW用量不低于3微克。

9.如权利要求4所述的拯救方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞数目不低于5×10⁵个；所述pT7MV_SW用量不低于12微克。

10.如权利要求4所述的拯救方法，其特征在于：步骤(2)的电转是在直径为2mm的BioRad电转杯中进行的，电转参数为：指数波、140V、950μF电击1次。

11.权利要求4～10所述拯救方法所制备的麻疹Schwarz/Moraten疫苗株在制备麻疹疫苗中的用途。