KR101629353B1 - 구제역 a형 표준 백신주의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

구제역 A형 표준 백신주의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법{Foot and mouth disease virus expressing P1-protective antigen of A type vaccine strain and the manufacturing method}

본 발명은 구제역 A형 표준 백신주의 방어항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 매우 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 이러한 특성 때문에 축산물의 국가간 교역에 있어 발생유무는 가장 중요한 점검요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다 (한국공개특허 제10-2011-0038380).

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) O형 중에서도 약 8가지 이상의 여러 지역형이 있다 (대한수의사학회지 제48권제12호, pp. 702-724, 2012). 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 하지만, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 한다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 결과가 좋으리라는 보장도 없다.

또한, 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)는 대부분 동물에 병원성을 나타내는 병원체이다. 여러번의 계대 등 여러 연구자들의 시도에서도 병원성이 유지되기 때문에 현재까지 구제역바이러스에 대한 병원성이 줄어든 약독화 백신으로 사용되는 것은 국제적으로는 금기시된 일이다.

구제역에 대해 약독화 바이러스를 사용하는 것은 병원성의 회복에 대한 문제점을 안고 있으며 또한 생독백신을 사용하면 야외 감염된 구제역 바이러스와 구분이 어려운 단점이 있어 구제역 발생시 효과적으로 접종하여 방역하는 체계를 구축하기 어렵다.

따라서, 기존의 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 신속하게 개발하여 사용할 수 있도록 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들어져야 할 것이다.

A 혈청형은 서로 다른 특성을 지닌 3개의 지역형이 존재한다. 백신주인 A22/ Iraq는 ASIA 지역형에 속하지만, ASIA 지역형 간에서도 항원의 변이가 심해 야외 상황에서 공격접종에 모든 바이러스에 방어되기 어렵고, 발생 상황에 따라 적절한 백신을 선정하여 백신 접종해야만 질병 확산억제가 가능하므로 (Korean J. Vet. Serv. 32(4) : 315~323 (2009)), 이에 대처하기 위해서는 적절한 구제역 백신 바이러스가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 A형 ASIA 지역형에 대한 표준 백신주에 대해 적절하게 방어하기 위하여 구제역 바이러스 O manisa 백신주의 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로 A형 표준 백신주 (A22/Iraq)에 대한 구조단백질 유전자를 전체 유전자가 삽입된 벡터 내에서 구조단백질을 치환시켜 A형 ASIA 지역형 바이러스에 대해 방어할 수 있는 방어 단백질을 발현하는 새로운 재조합 구제역 바이러스를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 세계적으로 구제역 A형의 표준 바이러스 백신주로 이용되고 있고, ASIA 지역형의 방어에 주로 높은 선택성이 있으며, 적합한 A22/Iraq 구제역 바이러스의 P1 유전자가 삽입됨으로써. 아시아 지역에 널리 유행하고 있는 구제역 A형에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아시아 지역에 널리 유행하고 있는 구제역 A형에 대한 방어능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 한국 주변에 발생되는 동아시아 중국 또는 대만 등에서 발생하는 바이러스 지역형을 효과적으로 방어할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 구제역 A형 표준 백신주의 방어 단백질 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pO1m-A22Iraq-P1)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 적어도 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버(GenBank Accession No.) AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하는 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다..

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계, 및 (3) 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

상기에서 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계는 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하는 상기 (3) 단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 상기 백신은 생백신이거나 약독화된 백신일 수 있고, 상기 백신을 제조하는 방법은 통상적인 백신의 제조방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드 pO-Manisa의 제작

구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다.

상기에서, PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25cycle, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

도 1은 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 것이다.

<실시예 2> P1 부위가 치환된 재조합 구제역 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드(pO-Manisa) 중에서, 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 A형 표준 백신주인 A22/Iraq 바이러스(GenBank Accession No. AY593763)의 방어 항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여, 재조합 유전자가 삽입된 서열번호 1의 플라스미드(pO1m-A22Iraq-P1)를 제작하였다.

상기 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 다음과 같이 실시하여 치환시켰다.

서열번호 2의 정방향 프라이머(5'-GGAGCCGGGCAATCCAGTCCGGCGACT-3') 및 서열번호 3의 역방향 프라이머(5'-TTGTTTTGCAGGTGCAATGATCTTCTGT-3')를 이용하여, A22/Iraq 바이러스(GenBank Accession No. AY593763)의 P1 유전자를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10ul), 10mM dNTPs (1ul), Phusion enzyme (2U/ul, 0.5ul), 멸균증류수 (35.5ul)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 60초간 25cycle, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

서열번호 4의 정방향 프라이머(5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCG-3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머(5'-CTTGAGCCTTTTCTGGACCTTTGTTTTCCA-3')를 이용하여, Omanisa 유전자에서 P1 유전자가 제거된 벡터를 PCR에 의하여 증폭시켰다.

이때, 상기 PCR 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10ul), 10mM dNTPs (1ul), Phusion enzyme (2U.ul, 0.5ul), 멸균증류수 (35.5ul)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25cycle, 최종 72℃ 10분으로 반응시켰다.

그 후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응 (TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pO1m-A22Iraq-P1)된 것을 확인하였다.

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pO1m-A22Iraq-P1)를 제한효소로 반응시킨 뒤, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK21(어린 햄스터 신장) 세포에서 증식시키고, BHK21 세포 및 IBRS-2(돼지 신장) 세포에서 세포 변성 효과를 확인하였다.

도 2는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도로서, pOm-A22-P1은 구제역 바이러스 O형 Manisa 전체 유전자에서 3B 부위의 일부가 결실되고, 방어 항원 P1 부위가 구제역 A형 표준 백신주(A22/Iraq)의 P1 부위로 치환된 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 구제역 A형 표준 백신주의 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.

도 4는 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다. 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 간이항원키트(PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조 단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다.

도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 여러 세포에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원 발현능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Foot and mouth disease virus expressing P1-protective antigen of A type vaccine strain and the manufacturing method <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant plasmid pO1m-A22Iraq-P1 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660 agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720 tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780 cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840 tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900 ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960 cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020 cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080 gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140 ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200 cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260 ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320 aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380 actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440 tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500 accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560 gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620 cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680 agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740 actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800 atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860 gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920 ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980 aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040 ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100 actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160 tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220 aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280 gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340 cagaaaaggc tcaagggagc cgggcaatcc agtccggcga ctgggtcgca gaaccagtca 2400 ggcaacactg ggagtattat taacaactac tacatgcaac agtaccagaa ctccatggac 2460 acccaattag gtgacaacgc tataagcgga ggctccaatg agggatccac ggacacaact 2520 tccacccaca caaccaacac tcagaacaac gactggtttt caaagcttgc cagttctgct 2580 ttcagcggtc ttttcggcgc ccttctcgcc gataagaaga ccgaggagac cactctcctc 2640 gaggaccgca ttctcaccac ccgcaacggg cacaccacct ccacaaccca atcgagtgtg 2700 ggagtcacgt acgggtactc cacccaggaa gatcatgttt ccggacctaa cacatctggt 2760 ttggagacgc gggtggtgca ggcagaaaga tttttcaaga agcacctgtt tgattggaca 2820 ccggacaaag cttttgggca cttagagaag ttggaacttc ccactgacca caagggagtc 2880 tacggacact tggtggactc atttgcatac atgagaaatg gctgggacgt ggaggtgtcc 2940 gctgttggca accagtttaa cggcgggtgt ctcctggtgg ccatggtccc tgaatggaaa 3000 gagttcaccc cgcgtgagaa gtaccagctc actttgtttc cacaccagtt catcagcccc 3060 agaaccaaca tgactgccca catcgtagtc ccgtaccttg gtgtgaacag gtacgaccag 3120 tataagaagc acaaaccctg gacgctggtt gtgatggtgg tctcaccgct caccaccaac 3180 actgttagtg caggacaaat caaggtttat gccaacattg ccccgactca cgttcacgtg 3240 gccggcgagc tcccctcgaa agaggggatt gtaccggtcg cttgttcgga cgggtacggt 3300 ggcttggtga caacagaccc aaaaacagct gaccctgttt atggtatggt gtacaacccc 3360 cccaggacaa actaccccgg gcggttcaca aacctgttgg atgtggctga ggcctgcccc 3420 acctttctct gtttcgacga agggaaaccg tacgttgtga caagaacgga cgagcagcgt 3480 cttctggcca agttcgacgt ctctcttgct gcaaagcaca tgtcaaacac ctacctttca 3540 gggatagcac agtactacgc acagtactct ggtaccatca acctgcactt catgtttacc 3600 ggctccacgg attcaaaagc ccgctacatg gtggcgtacg ttccacccgg tgtggagaca 3660 ccgccggaca cgcctgagaa agctgcacac tgcatccatg ctgagtggga cacagggttg 3720 aactccaagt ttactttctc tatcccgtac gtgtctgccg cagattacgc gtacactgcg 3780 tctgatgtgg cagaaacaac aaacgtacag ggatgggtct gcatatacca aattacacac 3840 gggaaagctg aacaagacac tctggttgtg tcggctagcg ccggcaagga ctttgagttg 3900 cgcctcccga ttgacccccg ctcacaaacc actaccaccg gggagtctgc agaccctgtc 3960 accaccactg ttgaaaacta cggcggtgag acacaagtcc aacgacgtca gcacaccgac 4020 gttactttca taatggacag atttgtaaag atacaaaact tgaaccccac acatgtcatt 4080 gacctcatgc aaacccacca acacgggttg gtaggtgccc tgttacgtgc tgctacgtac 4140 tacttctctg acctggagat tgtggtacgc catgacggta acctaacctg ggtacccaat 4200 ggagcacccg aggcagctct gtctaacacg ggcaacccca ccgcctacct caaggcacca 4260 tttacgaggc tcgcgctccc ctacaccgcg ccacaccgcg tgttggcaac agtgtacaac 4320 gggacgagca agtactccgc aggtggtacg ggcagacggg gcgacctagg gcctctcgcg 4380 gcgagggtcg ccgctcagct tcctgcttct ttcaactttg gtgcaattca agccacgacc 4440 atccacgagc tcctcgtgcg catgaagcgt gccgaactct actgccccag accactgttg 4500 gcagtggagg tgtcgtctca agacagacac aaacagaaga tcattgcacc tgcaaaacaa 4560 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg ggagatgtgg agtccaaccc tgggcccttc 4620 ttcttctccg acgtcaggtc aaatttctca aaactggtag aaaccatcaa tcagatgcag 4680 gaggacatgt caacaaaaca cgggcctgac tttaaccggt tggtgtccgc atttgaggaa 4740 ttggccactg gagtgaaggc tatcagggcc ggtctcgacg aggccaaacc ctggtacaaa 4800 ctcatcaagc tcctgagccg cttgtcgtgc atggccgctg tagcagcacg gtcaaaggac 4860 ccagtccttg tggccatcat gctggctgac accggtcttg agattctgga cagcaccttt 4920 gtcgtgaaga agatctccga ctcgctctcc agtctctttc acgtgccggc ccccgtcttc 4980 agtttcggag ccccgattct gttggccggg ttggtcaaag tcgcctcgag tttcttccgg 5040 tccacacccg aagaccttga gagagcagaa aaacagctca aagcacgtga cattaacgac 5100 atattcgcca ttctcaagaa cggcgagtgg ctggtcaagc tgatccttgc catccgcgac 5160 tggatcaaag cgtggatcgc ctcagaagaa aagtttgtca ccatgacgga cttggtgcct 5220 ggtatccttg aaaagcagcg ggatctcaac gacccgagta agtacaagga agccaaggag 5280 tggctcgaca acgcgcgcca ggcgtgtttg aagagcggga acgttcacat tgccaatttg 5340 tgcaaagtgg tcgccccggc acccagcaag tcgagacccg aacccgtggt cgtttgcctc 5400 cgcggcaaat ccggccaggg gaagagtttc cttgcgaacg tgctcgcgca agcaatctcc 5460 acccacttca ccggcagaac tgattcggtt tggtactgcc cgcctgaccc tgaccacttc 5520 gacggttaca accagcagac cgttgtcgtg atggacgatt tgggccagaa ccccgatggc 5580 aaggacttca agtacttcgc ccagatggtt tcgaccacgg ggttcatccc gcccatggcc 5640 tcgcttgagg acaaaggcaa gcctttcaac agcaaagtca tcattgctac caccaacctg 5700 tactcgggtt tcaccccgag aacaatggtg tgtcctgacg cgctgaaccg gaggttccac 5760 tttgacatcg acgtgagtgc caaggacggg tacaaagtta acaacaaatt ggacataatc 5820 aaagctcttg aagacaccca caccaaccca gtggcgatgt tccaatacga ctgtgccctt 5880 ctaaacggta tggcagttga aatgaagaga atgcaacagg atatgttcaa gcctcaacca 5940 cccctccaga acgtgtacca actcgttcac gaggtgattg aacgggtcga gctccacgag 6000 aaggtgtcga gccacccgat tttcaaacag atatcaattc cttcccaaaa gtctgtgttg 6060 tacttcctca ttgagaaagg ccaacacgaa gcagcaattg aattctttga gggaatggtg 6120 catgactcca tcaaggaaga gctccggccc ctcatccaac agacctcatt tgtgaaacgc 6180 gcttttaagc gcctgaagga aaactttgag actgttgccc tgtgtttgac tcttttggca 6240 aacatagtga tcatgatccg cgagactcgc aagagacaac agatggtgga cgatgcagtg 6300 aatgactaca ttgagaaggc aaacatcacc acagatgaca agactcttga cgaggcggaa 6360 aagaaccctc tagagaccag cggtgccagc actattggtt tcagagagag aactctcccg 6420 gggcacaagg cgagcgatga cgtgagctcc gagcccgcca aacccgtgga ggaccgacca 6480 caagctgaag ggccctacgc cggaccactt gagcgtcaga aacctctgag agtgaaaacc 6540 aagttgccac aacaggaggg accctacgct ggcccgatgg atagacagaa accgttgaaa 6600 gtgagagcaa gagccccggt cgtgaaggag ggaccctacg agggaccggt gaagaagcct 6660 gtcgctttga aagtgaaagc caagaacttg attgtcactg agagtggtgc cccaccgacc 6720 gacttgcaga agatggtcat gggcaacact aagcctgttg agctcatcct cgacgggaag 6780 acggtagcca tctgctgtgc taccggagtg tttggcactg cctacctcgt acctcgtcac 6840 ctcttcgcgg agaagtacga caagataatg ttggacggta gagccatgac agacagtgac 6900 tacagagtgt ttgagtttga gattaaagta aaaggacagg acatgctctc agacgctgca 6960 ctcatggtgc ttcaccgtgg gaaccgcgtg agagacatca cgaaacattt tcgtgacaca 7020 gcaagaatga agaaaggcac ccccgttgtc ggtgtgatca acaacgccga cgttgggaga 7080 ctgattttct ctggagaggc ccttacctac aaagacattg tagtgtgcat ggatggagac 7140 accatgccgg gcctgtttgc ctacagagcc gccaccaagg ctggttactg cgggggagcc 7200 gttctcgcca aggacggagc cgacacattc atcgttggca cccactccgc aggtggtaac 7260 ggagttggat actgctcgtg cgtgtccagg tccatgctcc tgaaaatgaa ggcacacatt 7320 gaccctgaac cacaccacga ggggttgatt gttgatacca gagatgtgga agagcgcgtg 7380 catgtcatgc gtaaaaccaa gcttgcaccc accgtggcac acggtgtgtt taaccctgaa 7440 tttggtcccg ctgccttgtc caacaaggac ccgcggctga acgaaggggt tgtcctcgat 7500 gaagtcatct tctccaaaca caagggagac acgaaaatgt ctgaggagga caaagcgctg 7560 ttccgccgct gcgctgccga ctacgcgtcg cacttgcaca gcgtgctggg gacggcaaat 7620 gccccattga gcatctatga ggccatcaaa ggcgtcgacg ggctcgatgc catggagccg 7680 gacaccgcgc ccggcctccc ctgggccctc caggggaaac gccgtggtgc gttgattgac 7740 ttcgagaacg gcacggtcgg acccgaagtc gaggctgccc taaagctcat ggagaaaaga 7800 gagtacaaat ttgcttgcca gaccttcctg aaagacgaga ttcgtccgat ggaaaaagta 7860 cgtgctggca agactcgcat tgtcgacgtt ttgcccgtgg aacacattct ttacaccagg 7920 atgatgattg gcagattctg tgctcaaatg cacacaaaca atggaccgca gattggctca 7980 gcggtcggtt gcaatcctga tgttgattgg caaagatttg gcacacattt tgctcagtac 8040 agaaacgtgt gggatgtgga ctattcggcc tttgatgcta accactgcag tgacgcaatg 8100 aacatcatgt ttgaggaggt atttcgcaca gacttcggtt tccacccaaa tgctgagtgg 8160 attctgaaga ctcttgtgaa cacggagcac gcctatgaga acaaacgtat cactgttgag 8220 ggcgggatgc cgtctggctg ttccgcgaca agcatcatca acacaatttt gaacaacatt 8280 tatgtgctct acgctcttcg tagacactat gagggagttg agctggacac ctacaccatg 8340 atctcctacg gagatgacat cgtggttgca agtgactacg atctggattt tgaggctctc 8400 aaaccccact tcaaatctct tggtcaaacc atcactccag ctgacaaaag cgacaaaggt 8460 tttgttcttg gtcactccat taccgatgtc actttcctca aaagacactt ccacatggac 8520 tatggaactg ggttttacaa acctgtgatg gcctcaaaga ccctcgaggc cattctctcc 8580 tttgcacgcc gtgggaccat acaggagaag ttgatctccg tggcaggact cgccgtccac 8640 tcaggacctg acgagtaccg gcgtctcttt gagcccttcc agggtctctt cgagattcca 8700 agctacagat cactttacct gcgttgggtg aacgccgtgt gcggtgacgc ataatccctc 8760 agatgtcaca attggcagaa agactctgag gcgagcgacg ccgtaggagt gaaaagcccg 8820 aaagggcttt tcccgcttcc tattccaaaa aaaaaaaaaa aaaactagtt ctagagcggc 8880 cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg 8940 cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 9000 acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 9060 cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 9120 attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 9180 cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 9240 caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 9300 caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 9360 ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 9420 cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 9480 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 9540 tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 9600 gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 9660 ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 9720 ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 9780 gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 9840 aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 9900 tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 9960 ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 10020 tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 10080 aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 10140 tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 10200 ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 10260 gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 10320 gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 10380 taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 10440 tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 10500 ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 10560 tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 10620 ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 10680 tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 10740 ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 10800 aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 10860 actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 10920 aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 10980 tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 11040 aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 11100 11100 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 ggagccgggc aatccagtcc ggcgact 27 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 ttgttttgca ggtgcaatga tcttctgt 28 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 cttgagcctt ttctggacct ttgttttcca 30

Claims (9)

1. 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 부위 중에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자가, 진뱅크 억세션 넘버 AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환되고, 도 3의 개열지도를 갖는 재조합 플라스미드 pO1m-A22Iraq-P1로부터 생산된 재조합 구제역 바이러스로서,
   상기 재조합 플라스미드 pO1m-A22Iraq-P1이 서열번호 1의 염기서열을 갖고,
   상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 2356 번째 염기 내지 4560 번째 염기의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
5. (1). 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계;
   (2). 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드에서, 상기 구제역 O형 백신주 Manisa의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자를, 진뱅크 억세션 넘버 AY593763의 염기서열을 갖는 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환시켜, 재조합 유전자가 삽입된 서열번호 1의 재조합 플라스미드를 구축하는 단계로서, 상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원으로서 VP1 내지 VP4로 구성된 P1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 2356 번째 염기 내지 4560 번째 염기의 염기서열을 갖는 단계; 및
   (3). 상기 (2) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R) 및 어린 햄스터 신장 세포(BHK21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 상기 구제역 A형 표준 백신주의 방어 항원이 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 삭제

Images