CN115066255A - 合成的dna载体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含异源基因的分离的DNA载体，其中所述DNA载体没有可以消除体内持久性的细菌质粒DNA和/或细菌特征。本发明的特征还在于包括本发明的DNA载体的药物组合物(非免疫原性药物组合物)，其可用于在受试者中诱导异源基因的长期附加型表达。本发明涉及通过施用本发明的DNA载体治疗受试者的方法，包括治疗与靶基因的缺陷相关的障碍的方法。

Description

合成的DNA载体和使用方法
序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过援引以其全文并入的序列表。创建于2020年9月16日的所述ASCII副本被命名为51503-026WO2_Sequence_Listing_9.16.20_ST25，并且大小是18,453字节。
技术领域
总体而言，本发明特征在于合成的DNA载体。
背景技术
基因疗法涉及将异源基因转导到靶细胞中，以纠正受试者中障碍的潜在遗传缺陷。在过去的几十年中，已经开发了多种用于基因疗法的转导方法。例如，传统的细菌质粒DNA载体代表了一种通用的基因递送工具，但由于它们的细菌来源而存在局限性。质粒DNA载体包括细菌基因，例如抗生素抗性基因和复制起点。此外，质粒DNA载体包括细菌特征，例如CpG基序。此外，使用细菌表达系统生产质粒DNA载体涉及引入来自细菌宿主的污染杂质(例如内毒素或细菌基因组DNA和RNA)的风险，这可能例如通过转录沉默导致体内基因表达的丧失。
重组腺相关病毒(rAAV)载体在各种模型系统中具有高效基因转移的既定记录，现在正在作为多种人类疾病的治疗形式进行测试。rAAV载体的基因组可以作为环状附加体在体内(例如，在有丝分裂后细胞中)持续存在。感染后，单链rAAV DNA在细胞核中转化为双链环状DNA，并在细胞的生命周期内以附加体形式持续存在。因此，AAV载体系统的一个实质性好处是能够在靶细胞中长期存在。另一方面，AAV载体可能涉及另外的缺点，例如约4.5Kb的有限包装容量、病毒蛋白的免疫原性和制造困难。
因此，该领域需要通用且有效的方法来增强基因表达的长期持久性，例如rAAV提供的方法，同时实现大的有效载荷并降低不利影响(例如炎症)的风险。
发明内容
本发明提供了复现rAAV载体的体内持久性的非病毒环状DNA载体。本发明的DNA载体是非免疫原性的，并且对AAV包装容量(约4.5Kb)不受限。本发明的特征还在于产生环状DNA载体的方法(例如，使用提供比传统的基于细菌的合成提高的制造效率的无细胞方法)、包括环状DNA载体的药物组合物，以及使用本文所述的载体例如用于诱导异源基因的持续附加型表达和用于治疗与缺陷基因相关的疾病的方法。
在一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其包括编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，DNA载体缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。治疗性替代蛋白可以是例如酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子。在一些实施例中，酶是表观遗传调节剂。在一些实施例中，表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其包括编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因。在一些实施例中，DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，DNA载体缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。抗原结合蛋白可以是抗体或其抗原结合片段。抗原结合蛋白可以结合细胞因子、生长因子或细胞表面蛋白(例如，肿瘤相关抗原)。在一些实施例中，抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK-9、磷脂酰丝氨酸、或骨硬化蛋白。抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和/或抗原结合片段(例如Fab、scFv、scFab等)。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，包括编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。生长因子可以是脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、集落刺激因子(CSF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-SCF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、色素上皮源性因子(PEDF)、转化生长因子(TGF；例如，TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、促性腺激素、或胰岛素样生长因子。白介素(IL)可以是IL-1(例如IL-1β)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。干扰素(IFN)可以是IFN-α或IFN-γ。凝血因子可以是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor)。神经保护因子可以选自由以下组成的组：神经营养因子(NT，例如NGF、BDNF、NT-3、NT-4或CNTF)、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，DNA载体缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。
所述障碍可以是眼部障碍，其是视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良)。视网膜营养不良可选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(leber’s congenitalamaurosis，LCA)、斯塔加特病(Stargardt Disease)、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、先天性静止性夜盲症1C型(CSNB-1C)、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征(stickler syndrome)、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征(Usher syndrome)、和瓦格纳综合征(Wagner syndrome)。在一些实施例中，障碍是癌症并且异源基因是CD40、CD40L、CD46、XCL1、MDA-7、IL-12、IL-24或OPCML(阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子)。在一些情况下，障碍可以是癌症并且异源基因是肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因可以是编码细胞内蛋白质的基因。肿瘤抑制基因可以是编码分泌的激素或发育信号的受体或信号转导器的基因，所述分泌的激素或发育信号抑制细胞增殖。肿瘤抑制基因也可以是编码检查点控制蛋白的基因。肿瘤抑制基因可以是编码促凋亡蛋白的基因。肿瘤抑制基因可以是编码DNA修复蛋白的基因。
在一些实施例中，障碍是凝血障碍，例如血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯·维勒布兰德疾病(von Willebrand’s disease)、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。凝血障碍的特征可以在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。在一些实施例中，凝血障碍的特征在于以下基因中的一种或多种中的突变：纤维蛋白原α(FGA)、纤维蛋白原β(FGB)、纤维蛋白原γ(FGG)、因子(F)F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、凝集素甘露糖结合1(LMAN1)、多种凝血因子缺乏2(MCFD2)、γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)或维生素K环氧化物还原酶复合亚基1(VKORC1)。
障碍可以是神经障碍，例如神经退行性疾病。神经退行性疾病可以选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化。神经退行性疾病可以是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病，例如多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。神经障碍可以是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病(例如，癫痫或偏头痛)。神经障碍可以是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍(childhood disorder)、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。在一些实施例中，神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
在一些实施例中，所述病症是溶酶体贮积障碍，例如泰-萨克斯病(Tay-Sachsdisease)、戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、庞贝病(Pompedisease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)或粘多糖贮积症(MPS)。
在一些实施例中，所述障碍是心血管障碍，例如退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。心血管障碍可以是选自由缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷组成的组的退行性心脏病。
障碍可以是免疫障碍，例如自身免疫性障碍。自身免疫性障碍可以是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
障碍可以是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。肝病可以是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
在一些实施例中，障碍是癌症，例如血癌(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤、和非霍奇金淋巴瘤)或实体组织癌(例如，肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌(gastric cancer)、食道癌、胃癌(stomachcancer)、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌、或脑癌)。在一些实施例中，异源基因编码转录因子，例如TSHZ2、HOXA2、MEIS2、HOXA3、HAND2、HOXA5、TBX18、PEG3、GLI2、CLOCK、HNF4A、VHL/HIF、WT-1、GSK-3、SPINT2、SMAD2、SMAD3或SMAD4。
在一些实施例中，障碍是隐性遗传障碍。在一些实施例中，障碍是孟德尔遗传性障碍。
在任何上述方面的一些实施例中，异源基因在选自由肝细胞、视网膜细胞、干细胞、神经细胞、肌肉细胞或血细胞组成的组的靶细胞中可表达。靶细胞可以是有丝分裂后细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是选自由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞组成的组的神经细胞。
在任何上述方面的一些实施例中，治疗性蛋白质被分泌到血液中(例如，当内源性表达时，蛋白质通常分泌到血液中)。
在任何上述方面的一些实施例中，DNA载体包括末端重复序列((例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列))或其部分(例如，两个A元件、B元件、C元件或D元件)，或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列))。在一些实施例中，末端重复序列的长度是至少10个碱基对(bp)(例如从10bp至500bp、从12bp至400bp、从14bp至300bp、从16bp至250bp、从18bp至200bp、从20bp至180bp、从25bp至170bp、从30bp至160bp，或从50bp至150bp，例如从10bp至15bp、从15bp至20bp、从20bp至25bp、从25bp至30bp、从30bp至35bp、从35bp至40bp、从40bp至45bp、从45bp至50bp、从50bp至55bp、从55bp至60bp、从60bp至65bp、从65bp至70bp、从70bp至80bp、从80bp至90bp、从90bp至100bp、从100bp至150bp、从150bp至200bp、从200bp至300bp、从300bp至400bp，或从400bp至500bp，例如10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、或更多)。在一些实施例中，DNA载体包括DD元件。
在任何上述方面的一些实施例中，DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包括启动子序列。
在任何上述方面的一些实施例中，DNA载体在所述一个或多个异源基因下游包括聚腺苷酸化位点。
在任何上述方面的一些实施例中，所述一个或多个异源基因包括反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其具有一个或多个治疗性核酸。这种分离的环状DNA载体缺乏复制起点和/或抗药性基因；缺乏重组位点；并且包含末端重复序列(例如，DD元件)。在一些实施例中，治疗性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或CRISPRi分子。在一些实施例中，末端重复序列(例如，DD元件)的长度为至少10bp。
在任何上述方面的一些实施例中，载体包括自杀基因。在任何上述方面的一些实施例中，DNA载体缺乏细菌质粒DNA。在一些实施例中，DNA载体包括一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。另外地或可替代地，DNA载体可以(a)缺乏免疫原性细菌特征；(b)缺乏RNA聚合酶停滞位点(RNA polymerasearrest site)；和/或(c)基本上没有CpG岛。
在任何上述方面的一些实施例中，异源基因的长度大于4.5Kb(例如，一个或多个异源基因，一起或各自单独地，长度是4.5Kb至25Kb、从4.6Kb至24Kb、从4.7Kb至23Kb、从4.8Kb至22Kb、从4.9Kb至21Kb、从5.0Kb至20Kb、从5.5Kb至18Kb、从6.0Kb至17Kb、从6.5Kb至16Kb、从7.0Kb至15Kb、从7.5Kb至14Kb、从8.0Kb至13Kb、从8.5Kb至12.5Kb、从9.0Kb至12.0Kb、从9.5Kb至11.5Kb，或从10.0Kb至11.0Kb，例如长度从4.5Kb至8Kb、从8Kb至10Kb、从10Kb至15Kb、从15Kb至20Kb或更大，例如长度从4.5Kb至5.0Kb、从5.0Kb至5.5Kb、从5.5Kb至6.0Kb、从6.0Kb至6.5Kb、从6.5Kb至7.0Kb、从7.0Kb至7.5Kb、从7.5Kb至8.0Kb、从8.0Kb至8.5Kb、从8.5Kb至9.0Kb、从9.0Kb至9.5Kb、从9.5Kb至10Kb、从10Kb至10.5Kb、从10.5Kb至11Kb、从11Kb至11.5Kb、从11.5Kb至12Kb、从12Kb至12.5Kb、从12.5Kb至13Kb、从13Kb至13.5Kb、从13.5Kb至14Kb、从14Kb至14.5Kb、从14.5Kb至15Kb、从15Kb至15.5Kb、从15.5Kb至16Kb、从16Kb至16.5Kb、从16.5Kb至17Kb、从17Kb至17.5Kb、从17.5Kb至18Kb、从18Kb至18.5Kb、从18.5Kb至19Kb、从19Kb至19.5Kb、从19.5Kb至20Kb、从20Kb至21Kb、从21Kb至22Kb、从22Kb至23Kb、从23Kb至24Kb、从24Kb至25Kb或更大，例如长度约4.5Kb、约5.0Kb、约5.5Kb、约6.0Kb、约6.5Kb、约7.0Kb、约7.5Kb、约8.0Kb、约8.5Kb、约9.0Kb、约9.5Kb、约10Kb、约11Kb、约12Kb、约13Kb、约14Kb、约15Kb、约16Kb、约17Kb、约18Kb、约19Kb、约20Kb或更大)。
在任何上述方面的一些实施例中，DNA载体是双链的。另外地或可替代地，双链载体可以是单体的和/或超螺旋的。
在一些实施例中，DNA载体是共价闭合的。
在另一个方面，本发明提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含多个前述方面中任一项的DNA载体。在一些实施例中，组合物(例如药物组合物)的多个DNA载体中的至少50％包括一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
在另一个方面，本发明提供了分离的线性DNA分子，其包括多个相同的扩增子(例如，多联体)，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括编码治疗性替代蛋白的异源基因。DNA分子缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，分离的线性DNA分子缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括限制酶位点，例如，其中每个限制酶位点位于异源基因和末端重复序列之间。治疗性替代蛋白可以是例如酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子。
在另一个方面，本发明提供了分离的线性DNA分子，其包括多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，分离的线性DNA分子缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括限制酶位点，例如，其中每个限制酶位点位于异源基因和末端重复序列之间。
在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。抗原结合蛋白可以结合细胞因子、生长因子或细胞表面蛋白(例如，肿瘤相关抗原)。在一些实施例中，抗原结合蛋白结合肿瘤坏死因子(TNF)、大T抗原(LT)、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、内皮单核细胞激活多肽II(EMAP-II)、GM-CSF、EGF、人表皮生长因子2(HER2)、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CC趋化因子受体4(CCR4)、叶酸受体、粘蛋白5AC、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/克欣9型(PCSK-9)、磷脂酰丝氨酸、或骨硬化蛋白。抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和/或抗原结合片段(例如Fab、scFv、scFab等)。
在另一个方面，本发明提供了分离的线性DNA分子，其包括多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中DNA分子缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，分离的线性DNA分子缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括限制酶位点，例如，其中每个限制酶位点位于异源基因和末端重复序列之间。
生长因子可以是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、M-CSF、GM-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。白介素可以是IL-1(例如IL-1β)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。干扰素可以是IFN-α或IFN-γ。凝血因子可以是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。神经保护因子可以选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。神经营养因子可以选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
在另一个方面，本发明提供了分离的线性DNA分子，其包括多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中DNA分子缺乏：(a)复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。例如，在一些实施例中，分离的线性DNA分子缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括限制酶位点，例如，其中每个限制酶位点位于异源基因和末端重复序列之间。
所述障碍可以是眼部障碍，其是视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良)。视网膜营养不良可以选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
在一些实施例中，障碍是凝血障碍，例如血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯·维勒布兰德疾病(von Willebrand’s disease)、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。凝血障碍的特征可以在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。在一些实施例中，凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
障碍可以是神经障碍，例如神经退行性疾病。神经退行性疾病可以选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化。神经退行性疾病可以是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病，例如多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。神经障碍可以是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病(例如，癫痫或偏头痛)。神经障碍可以是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍(childhood disorder)、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。在一些实施例中，神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
在一些实施例中，所述病症是溶酶体贮积障碍，例如泰-萨克斯病(Tay-Sachsdisease)、戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、庞贝病(Pompedisease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)或粘多糖贮积症(MPS)。
在一些实施例中，所述障碍是心血管障碍，例如退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。心血管障碍可以是选自由缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷组成的组的退行性心脏病。
障碍可以是免疫障碍，例如自身免疫性障碍。自身免疫性障碍可以是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
障碍可以是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。肝病可以是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
在一些实施例中，障碍是癌症，例如血癌(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤、和非霍奇金淋巴瘤)或实体组织癌(例如，肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌(gastric cancer)、食道癌、胃癌(stomachcancer)、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌、或脑癌)。
在一些实施例中，障碍是隐性遗传障碍。在一些实施例中，障碍是孟德尔遗传性障碍。
在另一个方面，本发明提供分离的线性DNA分子，其具有多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括一个或多个治疗性核酸。在一些实施例中，DNA分子(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；(b)缺乏重组位点；以及(c)包含末端重复序列。例如，在一些实施例中，分离的线性DNA分子缺乏复制起点、抗药性基因和重组位点。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括限制酶位点，例如，其中每个限制酶位点位于异源基因和末端重复序列之间。
在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括末端重复序列((例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列))或其部分(例如，两个A元件、B元件、C元件或D元件)，或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列))。在一些实施方案中，末端重复序列的长度是至少10个碱基对(bp)(例如从10bp至500bp、从12bp至400bp、从14bp至300bp、从16bp至250bp、从18bp至200bp、从20bp至180bp、从25bp至170bp、从30bp至160bp，或从50bp至150bp，例如从10bp至15bp、从15bp至20bp、从20bp至25bp、从25bp至30bp、从30bp至35bp、从35bp至40bp、从40bp至45bp、从45bp至50bp、从50bp至55bp、从55bp至60bp、从60bp至65bp、从65bp至70bp、从70bp至80bp、从80bp至90bp、从90bp至100bp、从100bp至150bp、从150bp至200bp、从200bp至300bp、从300bp至400bp，或从400bp至500bp，例如10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、或更多)。在一些实施例中，分离的线性DNA分子包括DD元件。在一些实施例中，分离的线性DNA分子在所述一个或多个异源基因上游包括启动子序列。在一些实施例中，分离的DNA分子在所述一个或多个异源基因下游包括聚腺苷酸化位点。在一些实施例中，所述一个或多个异源基因包括反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生任何实施例的分离的DNA载体的方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包括所述异源基因的分离的DNA载体。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生上述实施例中任一项的分离的DNA载体的方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因和末端重复序列；(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；(v)鉴定包括末端重复序列的质粒克隆；(vi)消化包括所述末端重复序列的所述质粒克隆以产生第二AAV基因组；(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生上述实施例中任一项的分离的DNA载体的无细胞方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因的分离的DNA载体。在一些实施例中，所述方法进一步包括对包括异源基因的分离的DNA载体进行柱纯化以从分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生上述实施例中任一项的分离的DNA载体的方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生上述实施例中任一项的分离的DNA载体的方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；(v)鉴定包括DD元件的质粒克隆；(vi)消化包括所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
在另一个方面，本发明提供了通过以下来产生上述实施例的分离的DNA载体的无细胞方法：(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的治疗性DNA载体。
在任何上述产生分离的DNA载体的方法的一些实施例中，AAV基因组包括末端重复序列((例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列))或其部分(例如，两个A元件、B元件、C元件或D元件)，或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列))。在一些实施方案中，末端重复序列的长度是至少10个碱基对(bp)(例如从10bp至500bp、从12bp至400bp、从14bp至300bp、从16bp至250bp、从18bp至200bp、从20bp至180bp、从25bp至170bp、从30bp至160bp，或从50bp至150bp，例如从10bp至15bp、从15bp至20bp、从20bp至25bp、从25bp至30bp、从30bp至35bp、从35bp至40bp、从40bp至45bp、从45bp至50bp、从50bp至55bp、从55bp至60bp、从60bp至65bp、从65bp至70bp、从70bp至80bp、从80bp至90bp、从90bp至100bp、从100bp至150bp、从150bp至200bp、从200bp至300bp、从300bp至400bp，或从400bp至500bp，例如10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、或更多)。在一些实施例中，末端重复序列包括DD元件。在一些实施例中，所述方法进一步包括对包括异源基因的分离的DNA载体进行柱纯化以从分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
在任何上述方法的一些实施例中，聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。聚合酶可以是Phi29 DNA聚合酶。
在另一个方面，本发明的特征在于药物组合物，其包含上述实施例中任一项的DNA载体和药学上可接受的载剂。药物组合物可以是非免疫原性的。
在另一个方面，本发明的特征在于通过向有需要的受试者施用任何上述实施例的分离的DNA载体或组合物(例如，药物组合物)在所述受试者中诱导异源基因的附加型表达(例如，持续附加型表达)的方法。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以治疗有效量向受试者施用任何上述实施例的分离的DNA载体或组合物(例如，药物组合物)来治疗所述受试者的障碍的方法。
可以重复施用分离的DNA载体或其组合物。可以全身施用分离的DNA载体或组合物。可以静脉内施用分离的DNA载体或组合物。可以局部施用分离的DNA载体或药物组合物。可以玻璃体内施用分离的DNA载体或药物组合物。在一些实施例中，障碍是眼部障碍。眼部障碍可以是孟德尔遗传性视网膜营养不良。眼部障碍可以是LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
在一些实施例中，全身施用分离的DNA载体或其组合物。在一些实施例中，障碍是凝血障碍(例如血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症)。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其包括一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。例如，包括一个或多个异源基因的分离的环状DNA载体可以缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)。另外地或可替代地，包括一个或多个异源基因的分离的环状DNA载体可以缺乏抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。在一些实施例中，包括一个或多个异源基因的分离的环状DNA载体可以缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)和抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。在一些实施例中，DNA分子缺乏细菌质粒DNA。在一些实施例中，DNA载体缺乏免疫原性细菌特征(例如，一个或多个细菌相关的CpG基序，例如，未甲基化的CpG基序，例如，CpG岛)。在一些实施例中，DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点(例如，RNA聚合酶II(RNAPII)停滞位点)。
在一些实施例中，分离的环状DNA载体包括编码治疗性蛋白质的一个或多个异源基因，所述治疗性蛋白质被配置为治疗孟德尔遗传性视网膜营养不良(例如，莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征)。例如，一个或多个异源基因可以是ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A和HMCN1。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其具有选自由以下组成的组的一个或多个异源基因：ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A和HMCN1，其中DNA载体缺乏复制起点和/或抗药性基因。在一些实施例中，一个或多个异源基因编码治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质被配置为治疗视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良、例如，选自由以下组成的组的视网膜营养不良：LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征)。
在另一个方面，本文提供了分离的环状DNA载体，其具有编码治疗性蛋白质(例如，抗体或其部分、生长因子、白介素、干扰素、抗凋亡因子、细胞因子或抗糖尿病因子)的一个或多个异源基因，其中DNA载体缺乏复制起点和/或抗药性基因。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其具有一个或多个异源基因，所述一个或多个异源基因包括反式剪接分子或其部分(例如，结合结构域)，其中DNA载体缺乏复制起点和/或抗药性基因。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的环状DNA载体，其包括一个或多个异源基因，所述一个或多个异源基因编码肝脏分泌的治疗性蛋白质，其中DNA载体缺乏复制起点和/或抗药性基因。在一些实施例中，治疗性蛋白质被分泌到血液中。
在另一个方面，本发明提供了分离的环状DNA载体，其包含一个或多个异源基因，其中所述DNA载体：(a)包括末端重复序列；以及(b)缺乏复制起点和/或抗药性基因。
在又另一方面，本发明提供了具有多个相同的扩增子的分离的线性DNA分子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码治疗性蛋白质(例如，被配置为治疗视网膜营养不良(例如孟德尔遗传性视网膜营养不良)的治疗性蛋白质)的异源基因，其中所述DNA分子缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。在一些实施例中，视网膜营养不良选自由以下组成的组：LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。在一些实施例中，一个或多个异源基因选自由以下组成的组：ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A和HMCN1。
在另一个方面，本发明提供了分离的线性DNA分子，其具有多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括的异源基因，所述异源基因选自由以下组成的组：ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A和HMCN1，其中所述DNA分子缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。在一些实施例中，异源基因编码治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质用于治疗视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良、例如，LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、AMD、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征)。
在另一个方面，本文提供了具有多个相同的扩增子的分离的线性DNA分子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括异源基因，所述异源基因编码抗体或其部分、凝血因子、酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、抗凋亡因子、抗肿瘤因子、细胞因子和抗糖尿病因子，其中所述DNA分子缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。
在又一方面，本发明的特征在于具有多个相同的扩增子的分离的线性DNA分子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括异源基因，所述异源基因包含反式剪接分子或其部分(例如，结合结构域)，其中所述DNA分子缺乏：(a)复制起点和/或抗药性基因；以及(b)重组位点。
在另一个方面，本发明提供了具有多个相同的扩增子的分离的线性DNA分子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括异源基因，所述异源基因编码肝分泌的治疗性蛋白质(例如，分泌到血液中的治疗性蛋白质)，其中所述DNA分子缺乏复制起点和/或抗药性基因。
在任何前述方面的一些实施例中，环状DNA载体或线性DNA分子进一步包括一个或多个末端重复序列((例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列))或其部分(例如，两个A元件、B元件、C元件或D元件)，或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列))。在一些实施例中，末端重复序列的长度是至少10个碱基对(bp)(例如从10bp至500bp、从12bp至400bp、从14bp至300bp、从16bp至250bp、从18bp至200bp、从20bp至180bp、从25bp至170bp、从30bp至160bp，或从50bp至150bp，例如从10bp至15bp、从15bp至20bp、从20bp至25bp、从25bp至30bp、从30bp至35bp、从35bp至40bp、从40bp至45bp、从45bp至50bp、从50bp至55bp、从55bp至60bp、从60bp至65bp、从65bp至70bp、从70bp至80bp、从80bp至90bp、从90bp至100bp、从100bp至150bp、从150bp至200bp、从200bp至300bp、从300bp至400bp，或从400bp至500bp，例如10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、或更多)。在一些实施例中，DNA载体包括DD元件)。
在另一个方面，本发明的特征在于分离的线性DNA分子，其包括多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包括异源基因，其中所述DNA分子：(a)包含末端重复序列(例如，任何上述末端重复序列)；以及(b)缺乏复制起点和/或抗药性基因。
在一些实施例中，环状DNA载体进一步包括异源基因(例如，一个或多个异源基因)。在一些实施例中，一个或多个异源基因的长度大于4.5Kb(例如，一个或多个异源基因，一起或各自单独地，长度是4.5Kb至25Kb、从4.6Kb至24Kb、从4.7Kb至23Kb、从4.8Kb至22Kb、从4.9Kb至21Kb、从5.0Kb至20Kb、从5.5Kb至18Kb、从6.0Kb至17Kb、从6.5Kb至16Kb、从7.0Kb至15Kb、从7.5Kb至14Kb、从8.0Kb至13Kb、从8.5Kb至12.5Kb、从9.0Kb至12.0Kb、从9.5Kb至11.5Kb，或从10.0Kb至11.0Kb，例如长度从4.5Kb至8Kb、从8Kb至10Kb、从10Kb至15Kb、从15Kb至20Kb或更大，例如长度从4.5Kb至5.0Kb、从5.0Kb至5.5Kb、从5.5Kb至6.0Kb、从6.0Kb至6.5Kb、从6.5Kb至7.0Kb、从7.0Kb至7.5Kb、从7.5Kb至8.0Kb、从8.0Kb至8.5Kb、从8.5Kb至9.0Kb、从9.0Kb至9.5Kb、从9.5Kb至10Kb、从10Kb至10.5Kb、从10.5Kb至11Kb、从11Kb至11.5Kb、从11.5Kb至12Kb、从12Kb至12.5Kb、从12.5Kb至13Kb、从13Kb至13.5Kb、从13.5Kb至14Kb、从14Kb至14.5Kb、从14.5Kb至15Kb、从15Kb至15.5Kb、从15.5Kb至16Kb、从16Kb至16.5Kb、从16.5Kb至17Kb、从17Kb至17.5Kb、从17.5Kb至18Kb、从18Kb至18.5Kb、从18.5Kb至19Kb、从19Kb至19.5Kb、从19.5Kb至20Kb、从20Kb至21Kb、从21Kb至22Kb、从22Kb至23Kb、从23Kb至24Kb、从24Kb至25Kb或更大，例如长度约4.5Kb、约5.0Kb、约5.5Kb、约6.0Kb、约6.5Kb、约7.0Kb、约7.5Kb、约8.0Kb、约8.5Kb、约9.0Kb、约9.5Kb、约10Kb、约11Kb、约12Kb、约13Kb、约14Kb、约15Kb、约16Kb、约17Kb、约18Kb、约19Kb、约20Kb或更大)。
在具有两个或更多个异源基因的环状DNA载体的实施例中，异源基因可以是相同基因或不同基因(例如，它们可以编码在功能上(例如，作为信号传导通路的一部分)或结构上相互作用的肽(例如，通过二聚化，例如抗体或其片段的重链和轻链))。
在一些实施例中，环状DNA载体的异源基因包括一个或多个反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
在一些实施例中，环状DNA载体是单体环状载体、二聚环状载体、三聚环状载体等。在一些实施例中，DNA载体是单体环状载体。在一些实施例中，环状DNA载体(例如单体环状载体)是双链的。在一些实施例中，环状DNA载体是超螺旋的(例如，单体超螺旋的)。
在一些实施例中，环状DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包括启动子序列。另外地或可替代地，环状DNA载体可以在所述一个或多个异源基因下游包括聚腺苷酸化位点。因此，在一些实施例中，环状DNA载体包括从5’到3’或从3’到5’有效地连接的以下元件：(i)启动子序列；(ii)一个或多个异源基因；(iii)聚腺苷酸化位点；以及(iv)末端重复序列(例如，一个或多个末端重复序列(例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列)或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列)))。
在另一个方面，本发明的特征在于产生分离的环状DNA载体(例如，本文所述的任何环状DNA载体)的方法。所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如，重组AAV(rAAV)基因组，例如AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和末端重复序列(例如，一个或多个末端重复序列(例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列)或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列)))；(ii)使用聚合酶(例如噬菌体聚合酶)介导的滚环扩增(例如等温聚合酶(例如噬菌体聚合酶)介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。在一些实施例中，所述方法进一步包括对分离的DNA载体进行柱纯化以从分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。超螺旋DNA可以是单体超螺旋DNA。在一些实施例中，开放松弛环状DNA在柱纯化中与超螺旋DNA分离并且可以被丢弃。在一些实施例中，异源基因是任何前述方面中描述的任何异源基因，例如，编码治疗性蛋白质的异源基因，所述治疗性蛋白质被配置为治疗视网膜营养不良的(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良、选自由以下组成的组的视网膜营养不良：LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB2、厄舍综合征、和瓦格纳综合症；包括以下中的一个或多个的异源基因：ABCA4、CEP290、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、IFT-172、C3、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、MYO7A、VCAN、USH2A和HMCN1；编码抗体或其部分、凝血因子、酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、抗凋亡因子、抗肿瘤因子、细胞因子和抗糖尿病因子的异源基因；和/或作为反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)的异源基因。
聚合酶可以是嗜热聚合酶或通过富含GC的残基具有高持续合成能力的聚合酶(例如，与参考聚合酶相比)。在一些实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶。在一些实施例中，噬菌体聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
在另一个方面，本发明提供了产生分离的环状DNA载体的方法，所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如，AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；(v)鉴定质粒克隆，所述质粒克隆包括末端重复序列(例如，一个或多个末端重复序列(例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列)或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列)))；(vi)消化包括所述末端重复序列的所述质粒克隆以产生第二AAV基因组；(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。在一些实施例中，用于产生环状DNA载体的方法中的聚合酶是噬菌体聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)。
在另一个方面，本发明的特征在于产生治疗性环状DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如，重组AAV(rAAV)基因组，例如AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和末端重复序列(例如，一个或多个末端重复序列(例如，一个或多个反向末端重复(ITR)序列(例如，两个ITR序列)或长末端重复(LTR)序列(例如，两个LTR序列)))；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述末端重复序列的分离的环状DNA载体。在一些实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)。在一些实施例中，所述方法进一步包括对分离的DNA载体进行柱纯化以从分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。超螺旋DNA可以是单体超螺旋DNA。在一些实施例中，开放松弛环状DNA在柱纯化中与超螺旋DNA分离并且可以被丢弃。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包括任何一种或多种上述环状DNA载体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物是非免疫原性的(例如，基本上没有细菌组分，例如细菌特征，例如CpG基序)。在一些实施例中，药物组合物基本上没有病毒颗粒。
在另一个方面，本发明的特征在于在有需要的受试者中诱导异源基因表达(例如，附加型表达)的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物(例如，非免疫原性药物组合物)，所述药物组合物包括任何上述环状DNA载体和药学上可接受的载剂。
在又一方面，本发明的特征在于使用本文所述的环状DNA载体和组合物(例如，前述方面的任何环状DNA载体或其组合物)的治疗方法。本发明包括治疗受试者的障碍(例如眼部障碍，例如视网膜营养不良，例如孟德尔遗传性视网膜营养不良)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的前述方面中任一项的药物组合物。在一些实施例中，重复施用药物组合物(例如，每天约两次、每天约一次、每周约五次、每周约四次、每周约三次、每周约两次、每周约一次、每月约两次、每月约一次、每六周约一次、每两个月约一次、每三个月约一次、每四个月约一次、每年约两次、每年约一次、或更少)。
在一些实施例中，局部(例如，眼部、(例如，玻璃体内)、肝内、脑内、肌内、通过雾化、皮内、透皮或皮下)施用药物组合物。在一些实施例中，受试者正在接受治疗莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
在另一个方面，本发明的特征在于非病毒的分离的DNA载体，其通过在没有细菌质粒DNA的DNA分子中包括双D(DD)元件来重现rAAV载体的体内持久性。因此，本文提供的DNA载体是非免疫原性的并且对约4.5Kb的AAV包装容量不受限。本发明的特征还在于产生含有DD的DNA载体的方法，包括含有DD的DNA载体的药物组合物，以及使用本文所述的载体例如用于诱导异源基因的附加型表达和用于治疗与缺陷基因相关的疾病的方法。
在一个方面，本发明提供了分离的DNA载体，其包括DD元件，其中所述DNA载体缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)和/或抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。例如，包括DD元件的分离的DNA载体可以缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)。另外地或可替代地，包括DD元件的分离的DNA载体可以缺乏抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。在一些实施例中，包括DD元件的分离的DNA载体可以缺乏复制起点(例如，细菌复制起点)和抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。在一些实施例中，DNA分子缺乏细菌质粒DNA。在一些实施例中，DNA载体缺乏免疫原性细菌特征(例如，一个或多个细菌相关的CpG基序，例如，未甲基化的CpG基序)。在一些实施例中，DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点(例如，RNA聚合酶II(RNAPII)停滞位点)。
在另一个方面，本发明的特征在于分离的DNA载体，其包括DD元件和细菌复制起点和/或抗药性基因(例如，作为细菌质粒的一部分)。
在任一前述方面的一些实施例中，DNA载体进一步包括异源基因(例如，一个或多个异源基因)。在一些实施例中，一个或多个异源基因的长度大于4.5Kb(例如，一个或多个异源基因，一起或各自单独地，长度是4.5Kb至25Kb、从4.6Kb至24Kb、从4.7Kb至23Kb、从4.8Kb至22Kb、从4.9Kb至21Kb、从5.0Kb至20Kb、从5.5Kb至18Kb、从6.0Kb至17Kb、从6.5Kb至16Kb、从7.0Kb至15Kb、从7.5Kb至14Kb、从8.0Kb至13Kb、从8.5Kb至12.5Kb、从9.0Kb至12.0Kb、从9.5Kb至11.5Kb，或从10.0Kb至11.0Kb，例如长度从4.5Kb至8Kb、从8Kb至10Kb、从10Kb至15Kb、从15Kb至20Kb或更大，例如长度从4.5Kb至5.0Kb、从5.0Kb至5.5Kb、从5.5Kb至6.0Kb、从6.0Kb至6.5Kb、从6.5Kb至7.0Kb、从7.0Kb至7.5Kb、从7.5Kb至8.0Kb、从8.0Kb至8.5Kb、从8.5Kb至9.0Kb、从9.0Kb至9.5Kb、从9.5Kb至10Kb、从10Kb至10.5Kb、从10.5Kb至11Kb、从11Kb至11.5Kb、从11.5Kb至12Kb、从12Kb至12.5Kb、从12.5Kb至13Kb、从13Kb至13.5Kb、从13.5Kb至14Kb、从14Kb至14.5Kb、从14.5Kb至15Kb、从15Kb至15.5Kb、从15.5Kb至16Kb、从16Kb至16.5Kb、从16.5Kb至17Kb、从17Kb至17.5Kb、从17.5Kb至18Kb、从18Kb至18.5Kb、从18.5Kb至19Kb、从19Kb至19.5Kb、从19.5Kb至20Kb、从20Kb至21Kb、从21Kb至22Kb、从22Kb至23Kb、从23Kb至24Kb、从24Kb至25Kb或更大，例如长度约4.5Kb、约5.0Kb、约5.5Kb、约6.0Kb、约6.5Kb、约7.0Kb、约7.5Kb、约8.0Kb、约8.5Kb、约9.0Kb、约9.5Kb、约10Kb、约11Kb、约12Kb、约13Kb、约14Kb、约15Kb、约16Kb、约17Kb、约18Kb、约19Kb、约20Kb或更大)。
在具有两个或更多个异源基因的实施例中，异源基因可以是相同基因或不同基因(例如，它们可以编码在功能上(例如，作为信号传导通路的一部分)或结构上相互作用的肽(例如，通过二聚化，例如抗体或其片段的重链和轻链))。
在一些实施例中，异源基因包括一个或多个反式剪接分子或其部分(例如，结合结构域)。
在一些实施例中，DNA载体是环状载体(例如，单体环状载体、二聚环状载体、三聚环状载体等)。在一些实施例中，DNA载体是单体环状载体。
在一些实施例中，DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包括启动子序列。另外地或可替代地，DNA载体可以在所述一个或多个异源基因下游包括多聚腺苷酸化位点。因此，在一些实施例中，DNA载体包括从5’到3’或从3’到5’有效地连接的以下元件：(i)启动子序列；(ii)一个或多个异源基因；(iii)聚腺苷酸化位点；以及(iv)DD元件。
在另一个方面，本发明的特征在于产生分离的DNA载体(例如，本文所述的任何DNA载体)的方法，所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如重组AAV(rAAV)基因组，例如AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用聚合酶(例如噬菌体聚合酶)介导的滚环扩增(例如等温聚合酶(例如噬菌体聚合酶)介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。聚合酶可以是嗜热聚合酶或通过富含GC的残基具有高持续合成能力的聚合酶(例如，与参考聚合酶相比)。在一些实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶。在一些实施例中，噬菌体聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
在另一个方面，本发明提供了产生分离的DNA载体的方法，所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如，AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；(v)鉴定包括DD元件的质粒克隆；(vi)消化包括所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。在一些实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)。
在另一个方面，本发明的特征在于产生治疗性DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：(i)提供包括环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括AAV基因组(例如重组AAV(rAAV)基因组，例如AAV附加体)，其中所述AAV基因组包括异源基因和DD元件；(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增(例如，等温聚合酶介导的滚环扩增)扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包括所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。在一些实施例中，聚合酶是噬菌体聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包括前述方面中任一项的DNA载体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物是非免疫原性的(例如，基本上没有非免疫原性组分，例如细菌特征，例如CpG基序)。在一些实施例中，药物组合物基本上没有病毒颗粒。
在另一个方面，本发明的特征在于在有需要的受试者中诱导异源基因表达(例如，附加型表达)的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物(例如，非免疫原性药物组合物)，所述药物组合物包括前述方面中任一项的DNA载体和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，在受试者的肝中诱导表达。肝可以分泌由异源基因编码的治疗性蛋白质(例如，进入血液)。
在又一方面，本发明的特征在于使用本文所述的DNA载体和组合物(例如，前述方面的任何载体或组合物)的治疗方法。本发明包括治疗受试者的障碍(例如眼部障碍，例如视网膜营养不良，例如孟德尔遗传性视网膜营养不良)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的前述方面中任一项的药物组合物。在一些实施例中，重复施用药物组合物(例如，每天约两次、每天约一次、每周约五次、每周约四次、每周约三次、每周约两次、每周约一次、每月约两次、每月约一次、每六周约一次、每两个月约一次、每三个月约一次、每四个月约一次、每年约两次、每年约一次、或更少)。
在一些实施例中，局部(例如，眼部、(例如，玻璃体内)、肝内、脑内、肌内、通过雾化、皮内、透皮或皮下)施用药物组合物。在其他实施例中，全身施用(例如，静脉内)药物组合物。在一些实施例中，受试者正在接受治疗莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
附图说明
图1是显示AAV2的末端重复序列(在这种情况下为双D(DD)元件)的形成的示意图。AAV2反向末端重复序列(ITR)长度为145bp，位于AAV基因组的每一端。ITR包含可以碱基配对并形成发夹状结构的反向序列(指定为A、B、C和D)。单ITR包含两个“A”、“B”和“C”区域，以及单“D”区域。两个ITR可以重组形成长度为165bp的DD元件，类似于单ITR，但现在包含两个“D”区域。
图2A-2I是显示各种AAV血清型的示例性ITR序列的一系列图示，其显示了ITR内A、B、C和D元件的位置和序列。图2A是AAV1 ITR的图示。图2B是AAV2 ITR的图示。图2C是AAV3ITR的图示。图2D是AAV4 ITR的图示。图2E是AAV5 ITR的图示。图2F是AAV6 ITR的图示。图2G是AAV7 ITR的图示。图2H是部分AAV8ITR的图示。图2I是部分AAV9 ITR的图示。
图3A是显示实例中描述的DD载体产生和表征过程的示例性步骤的流程图。第一步是生成或获得包含用于下游功能所需的表达盒(例如异源基因)的病毒rAAV载体。病毒在体外感染细胞并形成具有DD元件的环状双链附加体。在第二主要步骤中，从细胞中克隆环状rAAV基因组并测序以确认DD元件的存在。然后，这可用于生成基于质粒的模板，用于使用滚环扩增(步骤3和4)进行体外DD载体产生。最后一步是在进行体内研究之前在体外确认DD载体基因的表达。
图3B是显示实例中描述的合成的环状载体产生和表征过程的示例性步骤的流程图。第一步是生成或获得包含用于下游功能所需的表达盒(例如异源基因)的病毒rAAV载体。病毒在体外感染细胞并形成具有末端重复序列(在这种情况下为DD元件)的环状双链附加体。在第二主要步骤中，从细胞中克隆环状rAAV基因组并测序以确认DD元件的存在。然后，这可用于生成基于质粒的模板，用于使用滚环扩增(步骤3和4)进行体外DD载体产生。最后一步是在进行体内研究之前在体外确认DD载体基因的表达。
图4是显示在体外产生环状rAAV基因组的过程的示意图。用另外的AAV生产质粒(三重转染)转染具有目的rAAV基因组的质粒，以产生包含包装的基因组的rAAV病毒载体(血清型2)。由此产生的病毒感染HEK293T细胞，在所述细胞中产生环状rAAV基因组。
图5是显示用于检测rAAV环状基因组的滚环扩增反应的示意图。用不会在AAV基因组内切割的限制酶(在这种情况下为AvrII)消化总细胞DNA。然后用Plasmid-Safe DNA酶处理DNA，所述酶降解线性片段但保持环状双链DNA完整。消化反应用作使用随机引物和Phi29DNA聚合酶进行线性滚环扩增的模板。在扩增环状AAV附加体后产生大的线性多联体阵列。随后通过使用EcoRI的限制酶消化将线性阵列消化成单位长度的单体AAV基因组，EcoRI在单点切割AAV基因组。然后将单位长度的AAV基因组克隆到pBlueScript载体中以进行进一步的序列分析。
图6A-6J是显示各种AAV2末端重复序列(在这种情况下为DD元件)的示例性序列的一系列图示。图6A是标准DD元件的图示，所述标准DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、5’C元件、3’C元件、5’B元件、3’B元件、3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:9)。图6B是标准DD元件的图示，包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、5’B元件、3’B元件、5’C元件、3’C元件、3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:10)。图6C是没有B元件的DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、5’C元件、3’C元件、3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:11)。图6D是没有C元件的DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、5’B元件、3’B元件、3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:12)。图6E是没有B和C元件的DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:13)。图6F是没有A、B和C元件的DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件和3’D元件(SEQ IDNO:14)。图6G是DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、5’C元件、代替3’A元件的核酸序列和3’D元件(SEQ ID NO:15)。图6H是DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、与3’A元件重叠的5’C元件和3’D元件(SEQ ID NO:16)。图6I是DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、部分5’A元件、部分3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:17)。图6J是DD元件的图示，所述DD元件包括以5’到3’配置有效地连接的5’D元件、5’A元件、部分3’A元件和3’D元件(SEQ ID NO:18)。
图7是显示质粒衍生的环状模板的产生的示意图。质粒TG-18首先用EcoRI消化以释放包含末端重复序列(DD元件；表示为蝴蝶结)的线性rAAV基因组。线性片段的末端连接在一起形成双链环。
图8是在模板形成过程的不同步骤中含有DNA条带的琼脂糖凝胶的照片。泳道1是从pBlueScript载体释放的线性DNA片段。该片段包含CMV启动子、eGFP cDNA、BGHpA和末端重复序列(DD元件)。泳道2是来自泳道1的线性片段自连接的结果。存在多种DNA形式，包括由一个或多个DNA片段连接产生的各种大小的环状和线性DNA。泳道3显示了用plasmid-safe DNA酶处理后剩余的DNA，所述DNA酶降解线性而非环状DNA。
图9是显示分析Phi29扩增末端重复序列(DD元件)的保真度的过程的示意图。细菌衍生的环状DD载体用作使用随机引物和Phi29 DNA聚合酶进行线性滚环扩增的模板。在扩增环状AAV附加体后产生大的线性多联体阵列。随后通过限制酶消化来消化线性阵列以评估DD元件的存在。SwaI酶在DD元件的任一侧切割以产生244-bp的片段。AhdI酶在DD元件内切割一次，并将多联体消化成2.1Kb的单位长度片段。
图10是显示经扩增的DNA的Swat消化结果的琼脂糖凝胶照片。从1ng或6ng TG-18质粒模板扩增的DNA用SwaI消化以产生244-bp片段(泳道2和3，箭头)。这是从原始TG-18质粒载体(泳道1)释放的相同大小的片段。还包括从缺乏DD元件的质粒模板扩增的DNA(TG-dDD)，所述质粒模板是通过使用SwaI消化从TG-18中去除DD元件而产生的(泳道4和5)。
图11是显示经扩增的DNA的AhdI消化的琼脂糖凝胶照片。AhdI在DD元件中切割一次。从1ng或6ng TG-18质粒模板扩增的DNA用AhdI消化以产生2.1-kb片段(泳道1和2，箭头)。还包括从缺乏DD元件的质粒模板扩增的DNA(TG-dDD；泳道3和4)。该DNA不应该用AhdI消化，因为它不含DD元件。
图12A是显示细菌质粒衍生的模板的自连接的示意图。首先用EcoRI消化具有含末端重复序列的载体(此处为含DD元件的载体)的质粒以释放线性rAAV基因组，该基因组在基因序列内含有以蝴蝶结表示的有末端重复序列(DD元件)。线性片段的末端连接在一起形成双链环。
图12B是琼脂糖凝胶的照片，显示模板形成过程的不同步骤中的DNA。泳道1是从pBlueScript载体释放的线性DNA片段。该片段包含CMV启动子、eGFP cDNA、BGHpA和DD元件。泳道2是来自泳道1的线性片段自连接的结果。存在多种DNA形式，包括由一个或多个DNA片段连接产生的各种大小的环状和线性DNA。泳道3显示了用plasmid-safe DNA酶处理后剩余的DNA，所述DNA酶降解线性而非环状DNA。
图13A是显示由Phi29聚合酶产生线性多联体的示意图。图11A和11B中显示的细菌衍生的模板用作使用随机引物和Phi29 DNA聚合酶的线性RCA的模板。在扩增环状AAV附加体后产生大的线性多联体阵列。随后通过使用EcoRI的限制酶消化将线性阵列消化成单位长度的单体AAV基因组。
图13B是显示大小分级的经消化的DNA的琼脂糖凝胶的照片。
图14A是体外衍生的rAAV基因组的示意图，该基因组已经从线性形式自连接成环状产物。
图14B是琼脂糖凝胶的照片，显示了图14A所示的所得单体环状DNA载体。大部分DNA是单体超螺旋环状DNA。
图15A是显示用图14B中表征的合成的载体转染的细胞的GFP荧光的显微照片。使用Spectramax MiniMax300成像细胞仪检测荧光。
图15B是显示用含有rAAV基因组的原始质粒转染的细胞的GFP荧光的显微照片。使用Spectramax MiniMax300成像细胞仪检测荧光。
图16是蛋白质印迹的照片，显示用以下转染的细胞的GFP表达：仅pBS(泳道1)、体外产生的TG-18衍生的DD载体(泳道2)、体外产生的TG-18衍生的没有DD元件的载体(泳道3)、质粒衍生的TG-18衍生的DD载体(泳道4)、和质粒衍生的TG-18衍生的没有DD元件的载体(泳道5)。显示抗微管蛋白染色的条带显示为对照。
图17是显示使用滚环扩增产生合成的DNA载体的示例性方法的示意图。该过程包括柱纯化以从超螺旋DNA单体中分离开环DNA分子。
具体实施方式
本发明的特征在于以类似于AAV载体的方式提供静止细胞(例如，有丝分裂后细胞)的长期转导的非病毒DNA载体。本发明部分基于体外(例如，无细胞)系统的开发，以通过等温滚环扩增和连接介导的环化(例如，与细菌表达和位点特异性重组相反)合成地产生环状AAV样DNA载体(例如，包含末端重复序列，例如DD元件的DNA载体)。本方法允许在环状AAV样DNA载体的生产中提高可扩展性和制造效率。此外，通过这些方法产生的载体旨在克服与质粒DNA载体相关的许多问题，例如以下中讨论的问题：Lu等人,Mol.Ther.[分子疗法]2017,25(5):1187-98，其通过引用以其全文并入本文。例如，通过消除或减少CpG岛和/或细菌质粒DNA序列(如RNAPII停滞位点)的存在，可以减少或消除转录沉默，从而增加异源基因的持久性。此外，通过消除免疫原性组分(例如，细菌内毒素、DNA或RNA，或细菌特征，例如CpG基序)的存在，降低了刺激宿主免疫系统的风险。这些益处在治疗某些障碍，例如视网膜营养不良(例如，孟德尔遗传性视网膜营养不良)中特别有利。
因此，本发明的载体包括合成的DNA载体，其：(i)基本上没有细菌质粒DNA序列(例如RNAPII停滞位点、复制起点和/或抗性基因)和其他细菌特征(例如免疫原性CpG基序)；和/或(ii)可以完全在试管中合成和扩增(例如，不需要在细菌中复制，例如不需要细菌复制起点和细菌抗性基因)。在一些实施例中，载体包含AAV载体的DD元件特征。本发明允许用具有异源基因的DNA载体转导靶细胞(例如视网膜细胞)，该载体的行为类似于AAV病毒DNA(例如，具有低转录沉默和增强的持久性)，而不需要病毒本身。
I.定义
除非另有定义，否则在本文中使用的科技术语具有与属于本发明的普通技术人员以及针对公开文件的引用所通常理解的相同的含义，这些公开文件对技术人员提供了关于在本申请中使用的许多术语的一般性指导。如果此处所述的定义与参考出版物的定义有任何冲突，应以此处提供的定义为准。
如本文所用，术语“环状载体”或“环状DNA载体”是指环状形式的核酸分子。这种环状形式通常能够通过滚环扩增被扩增成多联体。如本文所用，在其末端具有结合的链(例如，共价缀合的主链，例如，通过发夹环或其他结构)的线性双链核酸不是环状载体。术语“环状DNA载体”在本文中可与术语“共价闭合的环状DNA载体”互换使用(参见例如实例2)。如本文所述，本领域技术人员将理解此类环状载体可包括以超螺旋和复杂DNA拓扑共价闭合的载体。
如本文所用，“孟德尔遗传性视网膜营养不良”是指遵循具有可变外显率(即，完全或降低的外显率)的孟德尔遗传模式的视网膜障碍。孟德尔遗传性视网膜营养不良可能是由于(a)一个等位基因的单突变(如在显性障碍中)或(b)每个等位基因中的单突变(如在隐性障碍中)。突变可以是点突变、插入、缺失或剪接变体突变。示例性孟德尔遗传性视网膜营养不良包括莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。孟德尔遗传性视网膜营养不良不包括具有多种遗传关联(其综合了发展疾病的可能性)的多因素障碍，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)。
如本文所用，术语“重组位点”是指作为位点特异性重组的产物的核酸序列，其包括对应于第一重组酶附着位点的一部分的第一序列和对应于第二重组酶附着位点的一部分的第二序列。杂合重组位点的一个示例是attR，它是位点特异性重组的产物并且包括对应于attP的一部分的第一序列和对应于attB的一部分的第二序列。可替代地，重组位点可以由Cre/Lox重组产生。因此，由Cre/Lox重组产生的载体(例如，包括LoxP位点的载体)包括如本文所用的重组位点。产生重组位点的其他位点特异性重组事件包括，例如，λ整合酶、FLP重组酶和Kw重组酶。由非位点特异性重组事件(例如，ITR介导的分子间重组)产生的核酸序列不是本文定义的重组位点。
如本文所用，术语“治疗性替代蛋白”是指结构上与正常(例如，健康)个体内源表达的蛋白质相似(例如，结构上相同)的蛋白质。可以将治疗性替代蛋白质施用于患有与待替代的蛋白质的功能障碍(或缺乏)相关的障碍的个体。在一些实施例中，治疗性替代蛋白纠正由编码蛋白质的基因中的突变(例如，点突变、插入突变、缺失突变或剪接变体突变)引起的蛋白质缺陷。治疗性替代蛋白质不包括非内源性蛋白质，例如与病原体相关的蛋白质(例如，作为疫苗的一部分)。治疗性替代蛋白可以包括酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子。在一些情况下，治疗性替代蛋白是单基因的。
如本文所用，术语“治疗性核酸”是指与受试者中的分子(例如，蛋白质或核酸)结合(例如，杂交)以赋予其治疗效果(即，不必被转录或翻译)的核酸。治疗性核酸可以是DNA或RNA，例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、CRISPR分子(例如，指导RNA(gRNA))、寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)、适体或DNA疫苗。在一些实施例中，治疗性核酸可以是非炎性或非免疫原性治疗性核酸。
如本文所用，术语“末端重复序列”是指核酸分子的具有以下核苷酸序列的一部分，其中所述序列在核酸分子的相邻部分中重复。这些序列可以以相同或相反的取向重复(例如分别为ABCDABCD或ABCDDCBA)。在一些实施例中，例如，末端重复序列可以是或衍生自反向末端重复序列(ITR)或长末端重复序列(LTR)(例如，其连接产物和/或部分)。ITR衍生的末端重复序列可以具有重复的A元件、B元件、C元件和/或D元件(其中A、B、C和D元件由SEQID NO:31-37定义并在图2A-2H中描绘)。例如，图6A-6J中的每一个是末端重复序列，并且所有DD元件(例如，SEQ ID NO:9或10)是末端重复序列的示例。末端重复序列可以具有由同源重组(例如，分子间同源重组或分子内同源重组)产生的结构。单个末端重复序列本身不会形成发夹。
术语“反向末端重复”或“ITR”是指存在于AAV和/或重组AAV(rAAV)中的一段核酸，其可以形成T形回文结构，这是完成AAV裂解和潜伏生命周期所必需的，如Muzyczka和Berns,Fields Virology[领域病毒学]2001,2:2327-2359中所述。术语“双D元件”和“DD元件”在本文中可互换使用，是指一种类型的末端重复序列，所述末端重复序列是在同一核酸链上具有5’D元件(即，与选自由SEQ ID NO:1、19、21、23、25、27、29、38和40组成的组的核酸序列具有至少80％同源性(例如，80％、85％、90％、95％或100％同源性)的核酸序列)和3’D元件(即，与选自由SEQ ID NO:8、20、22、24、26、28、30、39和41组成的组的核酸序列具有至少80％同源性(例如，80％、85％、90％、95％或100％同源性)的核酸序列)的DNA结构。在一些实施例中，5’D元件与SEQ ID NO:1的核酸序列100％同源和/或3’D元件与SEQ ID NO:8的核酸序列100％同源。DD元件可以通过连接来自相同分子(分子内重组)或不同分子(分子间重组)的两个AAV反向末端重复(ITR)来产生，如图1所示。这种连接可以发生在任何AAV血清型的ITR之间，其示例性结构显示在图2A-2I中。DD元件在单核酸链上包含两个D元件，并且可以包括另外的元件，例如一个或多个A、B和/或C元件，或其一个或多个部分，其有效地连接所述核酸链的5’D元件3’末端与3’D元件的5’末端。在一些实施例中，在5’D元件的3’末端和3’元件的5’末端之间不存在异源基因。衍生自AAV2的示例性DD元件的序列由图6A-6J中的每一个显示。可以使用来自其他AAV血清型(例如，AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9)的DD元件。下面提供了来自AAV血清型1-7的代表性5’和3’D元件。
表1.来自AAV血清型1-7的代表性5’和3’D元件
Figure BDA0003648562500000351
Figure BDA0003648562500000361
术语“异源基因”是指不作为病毒基因组的一部分自然存在的基因。例如，异源基因可以是哺乳动物基因，例如，治疗性基因(例如，编码治疗性替代蛋白、抗原结合蛋白等的基因)，例如，编码治疗性蛋白质的哺乳动物基因。在一些实施例中，异源基因编码靶细胞和/或受试者中有缺陷或不存在的蛋白质或其部分(例如，治疗性替代蛋白质)。在一些实施例中，异源基因包含一个或多个外显子，所述外显子编码在靶细胞和/或受试者中有缺陷或不存在的蛋白质。例如，在一些实施例中，异源基因包括一个或多个反式剪接分子或其部分(例如，结合结构域)，例如，如WO2017/087900中所述，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，异源基因包括治疗性核酸，例如治疗性RNA(例如，微小RNA)。
如本文所用，“反式剪接分子”具有三个主要元件：(a)结合结构域(例如寡核苷酸，例如反义寡核苷酸)，其通过将反式剪接分子拴系到其靶基因(例如前mRNA)来赋予特异性；(b)剪接结构域(例如，具有3’或5’剪接位点的剪接结构域)；以及(c)被配置为反式剪接到靶基因上的编码序列，其可以替换靶基因中的一个或多个外显子(例如，一个或多个突变的外显子)。
术语“启动子”是指调节与启动子可操作连接的异源基因转录的序列。启动子提供足以指导转录的序列和/或有效转录所需的RNA聚合酶和其他转录因子的识别位点，并可以指导细胞特异性表达。除了足以指导转录的序列之外，本发明的启动子序列还可以包括参与调节转录的其他调控元件的序列(例如，增强子、科扎克序列和内含子)。本领域已知且可用于本文所述的病毒载体的启动子的示例包括CMV启动子、CBA启动子、smCBA启动子和衍生自免疫球蛋白基因、SV40或其他组织特异性基因的那些启动子。通过混合和匹配已知的调节元件产生功能性启动子的标准技术是本领域已知的。“截短的启动子”也可以由启动子片段或通过混合和匹配已知调节元件的片段产生；例如smCBA启动子是CBA启动子的截短形式。
如本文所用，如果组合物在治疗相关剂量中不引发可测量的炎症应答(例如，与toll样受体信号传导相关的表型)，则载体或组合物(例如，含有本发明的DNA载体的药物组合物)“基本上没有”免疫原性组分，例如免疫原性细菌特征。筛选组合物是否存在免疫原性组分的方法包括根据本领域已知的方法进行体外和体内动物测定。在一些实施例中，基本上没有免疫原性组分的载体或组合物是非免疫原性的。
如本文所用，术语“非免疫原性”是指载体或组合物在治疗相关剂量中不引发可测量的炎症应答(例如，与toll样受体信号传导相关的表型)。筛选组合物是否存在免疫原性组分的方法包括根据本领域已知的方法进行体外和体内动物测定。例如，用于确定载体或组合物是否是非免疫原性的合适的体外测定包括在存在载体或组合物的情况下培养人外周血单核细胞(PBMC)或人PBMC衍生的骨髓细胞(例如，单核细胞)，并且八小时后测量培养物中IL-1β、IL-6和/或IL-12的量。如果相对于阴性对照，含有载体或组合物的样品中IL-1β、IL-6和/或IL-12的浓度没有增加，则载体或组合物是非免疫原性的。
如本文所用，“多联体”是指包含相同或基本上相同的核酸序列(例如，亚基)的通常串联连接的多个拷贝的核酸分子。
如本文所用，术语“分离的”是指人工产生的。在一些实施例中，关于DNA载体，术语“分离的”是指DNA载体，其是：(i)体外扩增的(例如，在无细胞环境中)，例如，通过滚环扩增或聚合酶链式反应(PCR)；(ii)通过分子克隆重组产生的；(iii)纯化的，如通过限制性核酸内切酶切割和凝胶电泳分级分离，或柱层析；或(iv)通过例如化学合成而合成的。分离的DNA载体是易于通过本领域众所周知的重组DNA技术操作的载体。因此，包含在其中已知5’和3’限制性位点或已公开聚合酶链式反应(PCR)引物序列的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但在其天然宿主中以其天然状态存在的核酸序列不是。分离的DNA载体可以是基本上纯化的，但不是必须的。
如本文所用，“载体”是指能够将异源基因携带到靶细胞中的核酸分子，其中异源基因随后可以在靶细胞中复制、加工和/或表达。在靶细胞或宿主细胞处理载体的基因组后(例如，通过生成DD元件)，基因组不被视为载体。
如本文所用，产生DNA载体的“无细胞方法”是指不依赖于需要任何DNA包含在宿主细胞(例如细菌(例如，大肠杆菌)宿主细胞)内的方法，以促进该方法的任何步骤。例如，无细胞方法发生在一个或多个合成容器(例如，玻璃管或塑料管或其他容器)内的适当溶液(例如，缓冲溶液)中，其中可以添加酶和其他试剂以促进DNA扩增、修饰和分离。
如本文所用，“靶细胞”是指表达靶基因并且被载体感染或打算被感染的任何细胞。载体可以感染受试者中驻留的靶细胞(原位)或培养中的靶细胞。在一些实施例中，本发明的靶细胞是有丝分裂后细胞。靶细胞包括脊椎动物和无脊椎动物细胞(以及动物来源的细胞系)。脊椎动物细胞的代表性示例包括哺乳动物细胞，例如人、啮齿动物(例如大鼠和小鼠)和有蹄类动物(例如牛、山羊、绵羊和猪)。靶细胞包括眼细胞，例如视网膜细胞。可替代地，靶细胞可以是干细胞(例如，多能细胞(即，细胞，其后代可以分化成几种受限细胞类型，例如造血干细胞或其他干细胞)或全能细胞(即，细胞，其后代可以成为生物体中的任何细胞类型，例如胚胎干细胞和体干细胞，例如造血细胞))。在又其他实施例中，靶细胞包括卵母细胞、卵子、胚胎的细胞、受精卵、精细胞和来自各种器官或组织的体细胞(非干细胞)成熟细胞，例如肝细胞、神经细胞、肌肉细胞和血液细胞(例如淋巴细胞)。
“宿主细胞”是指任何含有目的DNA载体的细胞。如本披露所述，宿主细胞可用作DNA载体的受体。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”可以指已经用异源基因(例如，通过本文所述的DNA载体)转染的细胞。可以理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单个亲代细胞的子代可能不一定在形态上或在基因组或总DNA互补序列方面与原始亲代完全相同。
如本文所用，术语“受试者”包括需要本文所述的治疗或预防方法的任何哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。需要这种治疗或预防的其他哺乳动物包括狗、猫或其他驯养动物、马、家畜、实验室动物，包括非人灵长类动物等。受试者可以是雄性或雌性。在一个实施例中，受试者患有由靶基因突变引起的疾病或障碍。在另一个实施例中，受试者有患上由靶基因突变引起的疾病或障碍的风险。在另一个实施例中，受试者已表现出由靶基因突变引起的疾病或障碍的临床症状。受试者可以是治疗或预防疗法可能有益的任何年龄。例如，在一些实施例中，受试者是0-5岁、5-10岁、10-20岁、20-30岁、30-50岁、50-70岁、或超过70岁。
如本文所用，载体或其组合物的“有效量”或“有效剂量”是指当根据选定的施用形式、途径和/或时间表递送至细胞或生物体时足以实现期望的生物学和/或药理作用的量。如本领域普通技术人员将理解的，特定载体或组合物的有效的绝对量可以根据诸如期望的生物学或药理学终点、待递送的药剂、靶组织等因素而变化。本领域普通技术人员将进一步理解“有效量”可以与细胞接触或以单剂量或通过使用多剂量施用于受试者。
如本文所用，术语“持久性”是指基因在细胞中可表达的持续时间。DNA载体的持久性，或DNA载体内异源基因的持久性，可以相对于参考载体(在细菌中产生的对照载体(例如，在细菌中产生或具有本发明的载体中不存在的一种或多种细菌特征的环状载体))使用本领域已知的任何基因表达表征方法进行量化。在一些实施例中，对照载体缺乏DD元件。另外地或可替代地，可以在施用载体后的任何给定时间点量化持久性。例如，在一些实施例中，如果在施用载体后六个月原位检测到其表达，则本发明的DNA载体的异源基因在施用后持续至少六个月。在一些实施例中，如果基因的转录在施用后三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、二年，或更长的时间是可检测的，则所述基因在靶细胞中“持续”。在一些实施例中，如果在施用后一段给定的时间(例如，施用后三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、两年或更长时间)后原始表达水平的任何可检测比例(例如，原始表达水平的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少70％，至少100％)仍然存在，则称所述基因持续存在。
如本文所用，“突变”是指导致有缺陷(例如，无功能的、功能降低的、功能异常的、少于产生的正常量的)的蛋白质产物的任何异常核酸序列。突变包括碱基对突变(例如，单核苷酸多态性)、错义突变、移码突变、缺失、插入和剪接突变。
如本文所用，术语“与突变相关的障碍”或“与障碍相关的突变”是指障碍与突变之间的相关性。在一些实施例中，已知或怀疑与突变相关的障碍完全或部分、或直接或间接地由突变引起。例如，具有突变的受试者可能有患上障碍的风险，并且该风险可能另外取决于其他因素，例如其他(例如，独立的)突变(例如，在相同或不同的基因中)，或环境因素。
如本文所用，术语“免疫障碍”是指免疫系统功能障碍，其特征在于免疫功能受损(活性不足)(例如，无法对外来或致病性抗原产生合适的免疫应答)或活性过度的免疫功能(例如，无法区分内源性“自身”抗原与外来或致病性抗原，从而导致例如异常炎症、慢性感染和/或自身免疫)。免疫障碍不包括正常的免疫应答(例如，正常的炎症、感染和病原体清除)。因此，例如，疫苗不是本文定义的免疫障碍的治疗。
如本文所用，术语“治疗”或其语法派生词被定义为减少疾病的进展、降低疾病症状的严重性、延缓疾病症状的进展、消除疾病症状或延迟疾病的发作。
如本文所用，术语“预防”障碍或其语法派生词定义为降低疾病发作的风险，例如，作为对处于发展与突变相关的障碍的风险中的受试者的预防性治疗。根据本领域已知的或本文描述的任何合适的方法，通过鉴定与障碍相关的突变，可以将受试者表征为“处于发展障碍的风险中”。在一些实施例中，处于发展障碍的风险中的受试者具有与该障碍相关的一种或多种突变。另外的或可替代地，如果受试者具有障碍家族史，则受试者可被表征为“处于发展障碍的风险中”。
如在本文所述的方法中使用的，术语“施用”或其语法派生词是指将组合物或离体处理的细胞递送至有需要的受试者，例如，在靶向的基因中具有突变或缺陷的受试者。例如，在以眼部细胞为靶的一个实施例中，所述方法包括通过视网膜下注射将组合物递送至感光细胞或其他眼部细胞。在另一个实施例中，可以采用玻璃体内注射到眼部细胞或通过睑静脉注射到眼部细胞。在另一个实施例中，静脉内施用组合物。鉴于本披露内容，本领域技术人员可以选择其他施用方法。
术语“药学上可接受的”是指对哺乳动物如人施用是安全的。在一些实施例中，药学上可接受的组合物由联邦或州政府的监管机构批准或列在美国药典或其他公认的药典中用于动物，更具体地用于人类。
术语“载剂”是指与本发明的载体或组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。合适的药物载剂的示例描述于“Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]”，麦克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州,第2版,2005。
术语“一个(a)”和“一种(an)”的意思是“一个(种)或多个(种)”。例如，“一个基因”被理解为代表一个或多个这样的基因。因此，术语“一个(a)”和“一种(an)”、“一个或多个一个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”是指与参考值变化±10％以内的值。
对于各种来源或参考文献之间定义的任何冲突，应以此处提供的定义为准。
II.载体
本文提供了特征在于异源基因的合成的DNA载体。DNA载体可以进一步包括双D(DD)元件。具有DD元件的合成的DNA载体可以例如以类似于AAV载体的方式作为附加体在细胞内(例如，在静止细胞中，例如有丝分裂后细胞中)持续存在。本文提供的载体可以是裸DNA载体，不含病毒载体(例如病毒蛋白)和细菌质粒DNA固有的组分，例如免疫原性组分(例如免疫原性细菌特征(例如CpG岛或CpG基序))或另外地或以其他方式与降低的持久性相关的组分(例如，CpG岛或CpG基序)。
进一步提供了合成的环状DNA载体，其特征在于没有复制起点和/或抗药性基因的异源基因，本文称为环状DNA载体。本发明提供了合成地产生的环状DNA载体。
本发明的合成的环状DNA载体可以例如以类似于AAV载体的方式作为附加体在细胞内(例如，在静止细胞中，例如有丝分裂后细胞中)持续存在。本文提供的载体可以是裸DNA载体，不含病毒载体(例如病毒蛋白)和细菌质粒DNA固有的组分，例如免疫原性组分(例如免疫原性细菌特征(例如CpG基序))或另外地或以其他方式与降低的持久性相关的组分(例如，CpG岛)。例如，在一些实施例中，载体包含DNA，其中至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或基本上全部)的DNA缺乏细菌质粒DNA的一个或多个元件，例如免疫原性组分(例如免疫原性细菌特征(例如CpG基序))或另外或以其他方式与降低的持久性相关的组分(例如，CpG岛)。在一些实施例中，DNA的至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或基本上全部)缺乏CpG甲基化。在一些实施例中，载体包含DNA，其中所述DNA至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或基本上全部)缺乏细菌甲基化特征，例如Dam甲基化和Dcm甲基化。例如，在一些实施例中，载体包含DNA，其中至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或基本上全部)的GATC序列是未甲基化的(例如，通过Dam甲基化酶)。另外地或可替代地，载体含有DNA，其中至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或基本上全部)的CCAGG序列和/或CCTGG序列是未甲基化的(例如，通过Dcm甲基化酶)。
在关于每个上述载体的一些实施例中，DNA载体在体内是持久的(例如，环状性和非细菌性质(即，通过体外(例如，无细胞)合成)与DNA载体的异源基因的长期转录或表达相关)。在一些实施例中，环状DNA载体的持久性比参考载体(例如，在细菌中产生或具有不存在于本发明的载体中的一个或多个细菌特征的环状载体)大5％至50％、大50％至100％、1倍至5倍或5倍至10倍(例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大)。在一些实施例中，本发明的环状DNA载体持续一周到四周、从一个月到四个月、从四个月到一年、从一年到五年、从五年到二十年、或从二十年到五十年(例如，至少一周、至少两周、至少一个月、至少四个月、至少一年、至少两年、至少五年、至少十年、至少二十年、至少三十年、至少四十年、或至少五十年)。在一些实施例中，DNA载体包括DD元件，其可能与增加的持久性有关。
DNA载体可以是环状DNA载体。环状DNA载体可以是单体的、二聚体的、三聚体的、四聚体的、五聚体的、六聚体的等。优选地，环状DNA载体是单体的。在其他优选的实施例中，环状DNA载体是单体的超螺旋环状DNA分子。在一些实施例中，DNA载体带有切口。在一些实施例中，DNA载体是开环的。在一些实施例中，DNA载体是双链环状的。
另外地或可替代地，DNA载体可以包括DD元件。在某些实施例中，DNA载体(例如环状DNA载体，例如单体环状DNA载体)包括在5’至3’方向上有效地连接的：(i)5’D元件，(ii)异源基因，和(iii)3’D元件。在一些实施例中，DNA载体包含在5’至3’方向上有效地连接的：(i)5’D元件，(ii)启动子，(iii)异源基因，和(iv)3’D元件。在一些实施例中，DNA载体包含在5’至3’方向上有效地连接的：(i)5’D元件，(ii)启动子，(iii)异源基因，(iv)聚腺苷酸化位点，和(v)3’D元件。
例如，DNA载体可以包括以5’至3’方向有效地连接的：(i)5’A元件，(ii)5’D元件，(iii)异源基因，(iv)3’D元件，和(v)5’A元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)5’A元件，(ii)5’D元件，(iii)启动子，(iv)异源基因，(v)3’D元件，和(vi)5’A元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)5’A元件，(ii)5’D元件，(iii)启动子，(iv)异源基因，(v)聚腺苷酸化位点，(vi)3’D元件，和(vii)5’A元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)5’C元件，(ii)5’A元件，(iii)5’D元件，(iv)异源基因，(v)3’D元件，(vi)3’A元件，和(vii)3’B元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)5’C元件，(ii)5’A元件，(iii)5’D元件，(iv)启动子，(v)异源基因，(vi)3’D元件，(vii)3’A元件，和(viii)3’B元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)5’C元件，(ii)5’A元件，(iii)5’D元件，(iv)启动子，(v)异源基因，(vi)聚腺苷酸化位点，(vii)3’D元件，(viii)3’A元件，和(ix)3’B元件。
在一些实施例中，DNA载体包括具有核酸序列的DD元件，所述DD元件在相同的核酸(例如，DNA)链上具有至少5’D元件和3’D元件。例如，在一些实施例中，DNA载体包括以5’至3’方向有效地连接的：(i)异源基因和(ii)DD元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)启动子，(ii)异源基因，和(iii)DD元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)异源基因，(ii)聚腺苷酸化位点，和(iii)DD元件。在一些实施例中，DNA载体在5’至3’方向上包括：(i)启动子，(ii)异源基因，(iii)聚腺苷酸化位点，和(iv)DD元件。
末端重复序列
在本发明的一些实施例中，本文提供的载体和组合物包括末端重复序列，其可以衍生自例如ITR、LTR或例如作为环化的结果的其他末端结构。末端重复序列的长度可以是至少10个碱基对(bp)(例如从10bp至500bp、从12bp至400bp、从14bp至300bp、从16bp至250bp、从18bp至200bp、从20bp至180bp、从25bp至170bp、从30bp至160bp，或从50bp至150bp，例如从10bp至15bp、从15bp至20bp、从20bp至25bp、从25bp至30bp、从30bp至35bp、从35bp至40bp、从40bp至45bp、从45bp至50bp、从50bp至55bp、从55bp至60bp、从60bp至65bp、从65bp至70bp、从70bp至80bp、从80bp至90bp、从90bp至100bp、从100bp至150bp、从150bp至200bp、从200bp至300bp、从300bp至400bp，或从400bp至500bp，例如10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp、50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp、70bp、71bp、72bp、73bp、74bp、75bp、76bp、77bp、78bp、79bp、80bp、81bp、82bp、83bp、84bp、85bp、86bp、87bp、88bp、89bp、90bp、91bp、92bp、93bp、94bp、95bp、96bp、97bp、98bp、99bp、100bp、101bp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、110bp、111bp、112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bp、149bp、150bp、或更多)。
在本发明的一些实施例中，合成的载体的末端重复序列可以是DD元件(例如，衍生自和/或包含ITR的一个或多个部分的DD元件)。DD元件在单个DNA分子上包含两个D元件。在一些实施例中，两个D元件被约125个核酸分开。DD元件可以衍生自任何血清型的AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。
在一些实施例中，DD元件包括彼此直接连接的两个D元件，例如，在图6F所示的配置中。因此，在一些实施例中，DD元件具有SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施例中，DD元件与SEQ ID NO:14的核酸序列80％、82.5％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％或100％同源。
在其他实施例中，本发明的DD元件具有至少一个将5’D元件与3’D元件分开的另外元件，例如一个或多个A元件；一个或多个B元件；和/或一个或多个C元件，其可以以任何合适的顺序排列。例如，在一些实施例中，DD元件包括以5’至3’配置有效地连接的：(i)5’D元件(即，与SEQ ID NO:1、19、21、23、25、27、29、38或40中任一项的核酸序列具有至少80％的同源性(例如，80％、85％、90％、95％或100％同源性)的核酸序列；(ii)一个或多个内部核酸(例如，非异源核酸)，和(iii)3’D元件(即，与SEQ ID NO:8、20、22、24、26、28、30、39或41中任一项的核酸序列具有至少80％的同源性(例如，80％、85％、90％、95％或100％同源性)的核酸序列。在一些实施例案中，(ii)的一个或多个核酸是1-125个核酸、2-100个核酸、5-80个核酸、或10-50个核酸，例如1-20个核酸、20-40个核酸、40-60个核酸、60-80个核酸、80-100个核酸、或100-125个核酸，例如1-5个核酸、5-10个核酸、10-15个核酸、15-20个核酸、20-25个核酸、25-30个核酸、30-35个核酸、35-40个核酸、40-45个核酸、45-50个核酸、50-55个核酸、55-60个核酸、60-65个核酸、65-70个核酸、70-75个核酸、75-80个核酸、80-85个核酸、85-90个核酸、90-95个核酸、95-100个核酸、100-105个核酸、105-110个核酸、110-115个核酸、115-120个核酸、120-125个核酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、或125个核酸)。
在一些实施例中，除了两个A元件(例如，5’A元件(例如，SEQ ID NO:2)和3’A元件(例如，SEQ ID NO:7))、两个B元件(例如，5’B元件(例如，SEQ ID NO:5)和3’B元件(例如，SEQ ID NO:6))以及两个C元件(例如，SEQ ID NO:1-8)，DD元件还包含两个D元件(例如，5’D元件(例如，SEQ ID NO:1、19、21、23、25、27、29、38或40)和3’D元件(例如，SEQ ID NO:8、20、22、24、26、28、30、39或41))。SEQ ID NO:1-8的核酸序列可以按5’至3’方向的顺序有效地连接，例如如图6A所示。因此，在一些实施例中，DD元件包含SEQ ID NO:9的核酸序列。可替代地，SEQ ID NO:1-8可以以任何合适的顺序有效地连接。例如，在一些实施例中，DD元件包含SEQ ID NO:10的核酸序列。在特定实施例中，SEQ ID NO:1和8(即，两个D元件)在D元件内的其余元件和/或核酸的侧翼。
SEQ ID NO:1-8的元件可以各自彼此直接连接或间接连接(例如，有效地连接)，例如，SEQ ID NO:1-8可以在5’至3’方向有效地连接。可替代地，可以有一个或多个核酸分隔一个或多个有效地连接的元件，如图6A和6B所示。在一些实施例中，DD元件包含1-100个另外的核酸(例如，3-50个核酸，例如3-10个核酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个另外的核酸)，所述另外的核酸位于5’D元件和3’D元件之间(例如在一、二、三、四、五或更多个以下元件对之间：5’D元件和5’A元件、5’D元件和5’B元件、5’D元件和3’B元件、5’D元件和5’C元件、5’D元件和3’C元件、5’D元件和3’A元件、5’D元件和3’D元件、5’A元件和5’B元件、5’A元件和3’B元件、5’A元件和5’C元件、5’A元件和3’C元件、5’A元件和3’A元件、5’A元件和3’D元件、5’B元件和3’B元件、5’B元件和5’C元件、5’B元件和3’C元件、5’B元件和3’A元件、5’B元件和3’D元件、3’B元件和5’C元件、3’B元件和3’C元件、3’B元件和3’A元件、3’B元件和3’D元件、5’C元件和3’C元件、5’C元件和3’A元件、5’C元件和3’D元件、3’C元件和3’A元件、3’C元件和3’D元件或3’A元件和3’D元件)。
另外的核酸可以用作例如限制性位点，如图6A和6B中的AhdI位点所示。
在一些实施例中，元件A、B或C(例如，SEQ ID NO:2-7)中的一种或多种不存在。例如，图6C显示了AAV2衍生的没有B元件的DD元件。因此，在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:11具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。图6D显示了没有C元件的DD元件。因此，在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:12具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。在一些实施例中，DD元件不包括B或C元件，例如图6E所示。因此，在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:13具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。
可替代地，元件A、B或C(例如，SEQ ID NO:2-7)中的一个或多个可以被不同的核酸序列替换，例如在图6G中，其显示了合适的DD元件，所述DD元件具有不同的核酸序列代替其3’A元件。因此，在一些实施例中，DD元件包含SEQ ID NO:1-3和8。在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:15具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。
在一些实施例中，一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个)核酸在两个相邻元件之间重叠。例如，在其中第一元件的3’-末端的一个或多个核酸与连接到其3’末端的第二元件的5’-末端的一个或多个核酸匹配的一些实施例中，重叠核酸不需要重复。这种DD元件的示例示于图6H中，其中5’C元件的3’末端与3’A元件的5’末端重叠。因此，在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:16具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。
5’和3’D元件之间的核酸序列可以是5’或3’A元件、5’或3’B元件或5’或3’C元件中的任何一个或多个的部分。在特定实施例中，DD元件包括一个或多个部分A元件，例如在图6I和6J中所示。部分A元件可以包含具有六个或更多个连续匹配核酸的核酸序列，如SEQ IDNO:2或7(例如，6-40、8-35、10-30或15-25，例如6，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续匹配核酸)。在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:17具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。在一些实施例中，本发明的DD元件可以具有与SEQ ID NO:18具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸序列。
AAV2衍生的DD元件及其子元件的示例性核酸序列提供于下表2中。
表2.DD元件及其子元件的示例性核酸序列
Figure BDA0003648562500000481
异源基因
本发明的任何载体(例如，含有DD元件、具有环状结构或两者的DNA载体)可用于将异源基因插入靶细胞。如本文所公开的，可以通过本发明的载体将广泛的异源基因递送至靶细胞。在一些实施例中，异源基因被配置为转染具有与疾病相关的突变的靶细胞，所述疾病可以通过异源基因(例如，编码治疗性蛋白质(例如，靶细胞和/或受试者中有缺陷或缺失的蛋白质)的基因)的表达来治疗。
在这种情况下，异源基因可以编码眼部蛋白(例如CEP290、ABCA4、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、C3、IFT172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、SNRNP200、RP1、MYO7A、PRPF8、VCAN、USH2A和HMCN1)全部或部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)。其他示例性治疗性蛋白质包括一种或多种选自由以下组成的组的多肽：白介素、干扰素、抗凋亡因子、细胞因子、抗糖尿病因子、抗凋亡剂、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌的蛋白质、神经保护因子或神经营养因子。治疗性蛋白质可包括BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、GM-CSF、促性腺激素、IFN、IFN-α、IFN-γ、IFG-1、M-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、TGF-B2、TNF、催乳素、生长激素、XIAP1、I-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10、病毒IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17和/或IL-18。
异源基因可以编码神经保护因子(例如Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.beta.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10)的全部或部分。示例性的神经营养因子是NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
在一些情况下，异源基因是与选自由以下组成的组的障碍相关的异源基因：眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病。
用于治疗凝血障碍的异源基因包括纠正凝血因子或一组凝血因子中的缺陷的基因，例如选自由以下组成的组的一种或多种凝血因子：纤维蛋白原、凝血酶原、促凝血酶原激酶、因子V、因子VII(因子VIIa)、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。在一些情况下，异源基因编码纤维蛋白原、凝血酶原、促凝血酶原激酶、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。例如，在一些情况下，编码纤维蛋白原的异源基因是FGA、FGB或FGG；编码凝血酶原的异源基因是F2；编码因子V的异源基因是F5；编码因子VII的异源基因是F7；编码因子VIII的异源基因是F8；编码因子IX的异源基因是F9；编码因子X的异源基因是F10；编码因子XII的异源基因是F11；编码因子XII的异源基因是F12；编码因子XIII的异源基因是F13A或F13B。在一些情况下，异源基因是LMAN1或MCFD2。可替代地，异源基因可以编码参与任何前述凝血因子的翻译后修饰的酶。
编码目的多肽的其他异源基因可以作为本发明载体的一部分被包括，包括例如，促进转基因动物生长的生长激素、或胰岛素样生长因子(IGF)、α-抗胰蛋白酶、促红细胞生成素(EPO)、凝血系统的因子VIII、因子IX、因子X、和因子XI、LDL(低密度脂蛋白)受体、GATA-1、等等。核酸序列可以包括自杀基因，所述自杀基因编码例如，凋亡或凋亡相关酶和基因，包括AlF、Apaf、(例如，Apaf-1、Apaf-2、或Apaf-3)APO-2(L)、APO-3(L)、凋亡素、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-x.sub.L、Bcl-x.sub.S、bik、CAD、钙蛋白酶、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11)、或颗粒酶B、ced-3、ced-9、神经酰胺、c-Jun、c-Myc、CPP32、crm A、细胞色素c、D4-GDP-DI、Daxx、CdR1、DcR1、DD、DED、DISC、DNA-PK.sub.CS、DR3、DR4、DR5、FADD/MORT-1、FAK、Fas、Fas-配体CD95/fas(受体)、FLICE/MACH、FLIP、胞影蛋白、fos、G-肌动蛋白、Gas-2、凝溶胶蛋白、糖皮质激素/糖皮质激素受体、颗粒酶A/B、hnRNP C1/C2、ICAD、ICE、JNK、核纤层蛋白A/B、MAP、MCL-1、Mdm-2、MEKK-1、MORT-1、NEDD、NF-κB、NuMa、p53、PAK-2、PARP、穿孔素、PITSLRE、PKC-δ、pRb、早老素、prICE、RAIDD、Ras、RIP、鞘磷脂酶、SREBP、来自单纯疱疹的胸苷激酶、TNF-α、TNF-α受体、TRADD、TRAF2、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、转谷氨酰胺酶、U1 70kDa snRNP、YAMA、等等。
在一些实施例中，异源基因编码抗体或其部分、片段或变体。抗体包括能够与抗原结合的片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、二-scFv、sdAb(单结构域抗体)和(Fab’)2(包括化学连接的(Fab’)2)。用木瓜蛋白酶消化抗体产生了各自含有单一抗原-结合位点的两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段)和残留的Fc片段(此名称反映了其易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段，该片段仍能交联抗原。抗体还包括嵌合抗体和人源化抗体。此外，对于本文提供的所有抗体构建体，还考虑了具有来自其他生物体的序列的变体。因此，如果披露了抗体的人版本，本领域技术人员将理解如何将基于人序列的抗体转化为小鼠、大鼠、猫、狗、马等序列。抗体片段还包括单链scFv、串联二-scFv、双抗体、串联三-sdcFv、微型抗体等的任一方向。在一些实施例中，例如当抗体是scFv时，异源基因的单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。抗体片段还包括纳米抗体(例如，sdAb，一种具有单个单体结构域的抗体，例如一对重链可变结构域，没有轻链)。多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体等)在本领域中是已知的并且被考虑为本发明的异源基因的表达产物。
在一些实施例中，异源基因编码肿瘤抑制基因的全部或部分(例如，编码控制进展到细胞周期的特定阶段的细胞内蛋白质(例如，RB1)的基因；编码用于抑制细胞增殖的分泌激素或发育信号的受体或信号转导器(例如，腺瘤性结肠息肉病毒蛋白(APC))的基因；编码检查点控制蛋白(例如，乳腺癌1型易感蛋白(BRCA1)、p16(INK4)或p14(ARF))的基因，该蛋白响应DNA损伤或染色体缺陷触发细胞周期停滞；编码诱导细胞凋亡的蛋白质(例如，PUMA、NOXA和BIM)的基因；或编码参与修复DNA错误的蛋白质(例如，DNA错配修复蛋白2(MSH2))的基因。
在一些实施例中，异源基因编码转录因子(例如，主调节剂，例如，与疾病相关的主调节剂)丧失的功能的全部或部分。在一些实施例中，异源基因是TSHZ2、HOXA2、MEIS2、HOXA3、HAND2、HOXA5、TBX18、PEG3、GLI2、CLOCK、HNF4A、VHL/HIF、WT-1、GSK-3、SPINT2、SMAD2、SMAD3或SMAD4。在一些实施例中，异源基因编码表观遗传调节剂的全部或部分。在一些实施例中，表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶，例如SETDB1、PRMT5等。在一些实施例中，表观遗传调节剂是组蛋白去甲基化酶，例如组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDM)等。在一些实施例中，表观遗传调节剂是组蛋白乙酰化酶(HDAC)。在一些实施例中，表观遗传调节剂是DNA甲基转移酶(DNMT)。在一些实施例中，表观遗传调节剂是DNA去甲基化酶(例如，TET1-3)。
在一些实施例中，异源基因包括报告序列，其可用于验证例如在特定细胞和组织中异源基因表达。可以在转基因中提供的报告序列包括但不限于编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶和本领域中众所周知的其他。当与驱动其表达的调节元件相关联时，报告序列提供可通过常规手段检测的信号，所述常规手段包括酶促、射线照相、比色、荧光或其他光谱测定、荧光激活细胞分选测定和免疫测定、包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，在标志物序列是LacZ基因的情况下，则通过检测β-半乳糖苷酶活性来检测携带信号的载体的存在。在转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶的情况下，可以通过在发光计中通过颜色或发光来目测测量携带信号的载体。
在一些实施例中，异源基因不包括编码序列。非编码序列，例如shRNA、启动子、增强子、标志物DNA的序列(例如，用于抗体识别)、PCR扩增位点、定义限制性酶位点的序列、位点特异性重组酶识别位点、被结合和/或修饰核酸的蛋白质识别的序列和接头可以包括在载体中。在异源基因是反式剪接分子的情况下，非编码序列包括结合靶内含子的结合结构域。在一些实施例中，异源基因包括结合结构域(例如，结合结构域，例如，反式剪接分子的前mRNA结合部分)。
在一些实施例中，异源基因的长度是0.1Kb至100Kb(例如异源基因的长度是从0.2Kb至90Kb、从0.5Kb至80Kb、从1.0Kb至70Kb、从1.5Kb至60Kb、从2.0Kb至50Kb、从2.5Kb至45Kb、从3.0Kb至40Kb、从3.5Kb至35Kb、从4.0Kb至30Kb、从4.5Kb至25Kb、从4.6Kb至24Kb、从4.7Kb至23Kb、从4.8Kb至22Kb、从4.9Kb至21Kb、从5.0Kb至20Kb、从5.5Kb至18Kb、从6.0Kb至17Kb、从6.5Kb至16Kb、从7.0Kb至15Kb、从7.5Kb至14Kb、从8.0Kb至13Kb、从8.5Kb至12.5Kb、从9.0Kb至12.0Kb、从9.5Kb至11.5Kb，或从10.0Kb至11.0Kb，例如长度从0.1Kb至0.5Kb、从0.5Kb至1.0Kb、从1.0Kb至2.5Kb、从2.5Kb至4.5Kb、从4.5Kb至8Kb、从8Kb至10Kb、从10Kb至15Kb、从15Kb至20Kb或更大，例如长度从0.1Kb至0.25Kb、从0.25Kb至0.5Kb、从0.5Kb至1.0Kb、从1.0Kb至1.5Kb、从1.5Kb至2.0Kb、从2.0Kb至2.5Kb、从2.5Kb至3.0Kb、从3.0Kb至3.5Kb、从3.5Kb至4.0Kb、从4.0Kb至4.5Kb、从4.5Kb至5.0Kb、从5.0Kb至5.5Kb、从5.5Kb至6.0Kb、从6.0Kb至6.5Kb、从6.5Kb至7.0Kb、从7.0Kb至7.5Kb、从7.5Kb至8.0Kb、从8.0Kb至8.5Kb、从8.5Kb至9.0Kb、从9.0Kb至9.5Kb、从9.5Kb至10Kb、从10Kb至10.5Kb、从10.5Kb至11Kb、从11Kb至11.5Kb、从11.5Kb至12Kb、从12Kb至12.5Kb、从12.5Kb至13Kb、从13Kb至13.5Kb、从13.5Kb至14Kb、从14Kb至14.5Kb、从14.5Kb至15Kb、从15Kb至15.5Kb、从15.5Kb至16Kb、从16Kb至16.5Kb、从16.5Kb至17Kb、从17Kb至17.5Kb、从17.5Kb至18Kb、从18Kb至18.5Kb、从18.5Kb至19Kb、从19Kb至19.5Kb、从19.5Kb至20Kb、从20Kb至21Kb、从21Kb至22Kb、从22Kb至23Kb、从23Kb至24Kb、从24Kb至25Kb或更大，例如长度约4.5Kb、约5.0Kb、约5.5Kb、约6.0Kb、约6.5Kb、约7.0Kb、约7.5Kb、约8.0Kb、约8.5Kb、约9.0Kb、约9.5Kb、约10Kb、约11Kb、约12Kb、约13Kb、约14Kb、约15Kb、约16Kb、约17Kb、约18Kb、约19Kb、约20Kb或更大)。
在一些实施例中，异源基因的长度为至少1,100bp(例如，长度为1,100bp至10,000bp、1,100bp至8,000bp或1,100bp至5,000bp)。
在一些实施例中，异源基因的长度为至少2,500bp(例如，长度为2,500bp至10,000bp、2,500bp至8,000bp或2,500bp至5,000bp)。例如，在特定实施例中，异源基因足够大以编码蛋白质并且不是寡核苷酸疗法(例如，不是反义、siRNA、shRNA疗法等)。
控制元件
除了末端重复序列(例如，DD元件)和异源基因之外，本发明的DNA载体(例如，如本文所述的环状DNA载体)可以包括必要的常规控制元件，这些控制元件以允许在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到异源基因。
表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，科扎克共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和增强编码的产物分泌的序列。各种表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以用作本发明的一部分。如果启动子区域能够影响该基因的转录，则启动子区域与异源基因可操作地连接，使得所得的转录物可能被翻译成所需的蛋白质或多肽。可用作本文所述的DNA载体的一部分的启动子包括组成型和诱导型启动子。组成型启动子的示例包括巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1 a启动子。
诱导型启动子允许对基因表达的调节并且可以受到外源提供的化合物、环境因素(如温度)、或存在特异性生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时)的调节。可从多种商业来源获得诱导型启动子和诱导型系统。许多其他系统已被描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的示例包括锌诱导型绵羊巯基金属结合蛋白(MT)启动子、地塞米松诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、T7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素抑制型系统、四环素诱导型系统、RU486-诱导型系统和雷帕霉素诱导型系统。在本文中可能有用的再其他类型的诱导型启动子是受具体生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时)调节的那些。
在另一个实施例中，使用异源基因的天然启动子。当希望异源基因的表达应该模拟天然表达时，天然启动子可能是优选的。当必须时序性或发育性地、或以组织特异性方式、或响应于特异性转录刺激调节异源基因的表达时，可以使用天然启动子。在进一步实施例中，还可以使用其他天然表达控制元件(如增强子元件、聚腺苷酸化位点或科扎克共有序列)来模仿天然表达。
对于编码蛋白质的异源基因，可以在异源基因之后和末端重复序列之前插入聚腺苷酸化(pA)序列。可用于本披露的异源基因还可以包含内含子，理想地位于启动子/增强子序列和异源基因之间的内含子。内含子和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的。
宿主细胞中基因表达所需的调节序列的确切性质可能因物种、组织或细胞类型而异，但根据需要，一般应包括分别与转录和翻译起始有关的5′非转录和5′非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、增强子元件等。特别是，这种5′非转录调节序列将包括启动子区域，该区域包括启动子序列，用于对可操作连接的基因进行转录控制。根据需要，调节序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。本披露的载体可以任选地包括5′前导或信号序列。
III.产生的方法
本文提供了产生合成的DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体和/或具有DD元件的DNA载体)的方法。特别地，本文提供的方法涉及体外合成(例如，在不存在细胞的情况下(即，无细胞))而不是通过细菌细胞合成，这提供了相对于细菌衍生的载体而言更纯的所得DNA载体组合物并且能够更快、更有效的合成。
DNA载体(例如本文所述的环状DNA载体和/或含有DD元件的DNA载体)的无细胞合成依赖于使用聚合酶如噬菌体聚合酶(例如Phi29聚合酶)的有效复制。在一些实施例中，Phi29聚合酶对于处理末端重复序列例如DD元件的复制特别有用。本文使用的聚合酶可以是具有通过富含GC的残基的高持续合成能力的嗜热聚合酶。在一些实施例中，用于复制(例如，扩增)DD元件的聚合酶是Phi29聚合酶。产生本发明的DNA载体的具体方法在下面的实例中详细描述。
一般而言，本发明的DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体)的产生可以开始于提供具有环状DNA分子的样品，所述环状DNA分子包括具有异源基因和末端重复序列(例如，DD元件)的AAV基因组(例如，rAAV基因组)。例如，样品可以是来自被AAV载体(例如rAAV载体)感染的细胞(例如哺乳动物细胞)的裂解物或其他制备物。可以使用标准DNA提取/分离技术从细胞中获得双链环状DNA。在一些实施例中，线性DNA被特异性降解，例如使用plasmid-safe DNA酶，以纯化环状DNA。
接下来，具有AAV基因组的双链环状DNA可以在无细胞制剂中通过以下进行体外扩增：将DNA与聚合酶(例如，噬菌体聚合酶，例如，Phi29 DNA聚合酶；TempliPhi试剂盒，GE健康医疗集团(GE Healthcare))、引物(例如，随机引物，例如，随机六聚体引物)和核苷酸混合物(例如，dNTP，例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)孵育。在一些实施例中，核苷酸混合物是天然核苷酸混合物(即，基本上没有核苷酸类似物)。聚合酶(例如，噬菌体聚合酶，例如，Phi29聚合酶)通过滚环扩增(例如，等温滚环扩增)扩增AAV基因组(例如，包括完整末端重复序列例如DD元件的AAV基因组)，生成具有多个AAV基因组拷贝的线性多联体。合适的聚合酶包括嗜热聚合酶和具有通过富含GC的残基的高持续合成能力的聚合酶。
可以使用限制酶消化所得的多联体，在基因组内切割一次，以生成单位长度的线性AAV基因组，其包括异源基因和末端重复序列(例如，DD元件)。这种线性DNA分子的自连接(例如，通过添加DNA连接酶)产生本发明的环状的合成的DNA载体，其具有异源基因和任选的完整末端重复序列(例如，DD元件)。可替代地，在自连接之前，可以根据已知技术将线性DNA分子克隆到质粒载体中并进行表征，如下面的实例所示，以形成最终的DNA载体(例如，如本文所述的环状载体和/或含有DD的DNA载体)。
因为在无细胞条件下使用聚合酶复制和扩增基因组是可行的，所以合成的DNA载体可以从克隆它的质粒的细菌组分中分离出来，并且分离的载体中不存在细菌特征，例如细菌CpG基序和/或dam或dcm甲基化。
IV.药物组合物
本文提供了药物组合物，其包括在药学上可接受的载剂中的本文所述的任何DNA载体(例如合成的DNA载体)(例如，上述的含有DD元件的DNA载体和/或环状DNA载体)。本文所述的药物组合物基本上没有污染物，例如病毒颗粒、病毒衣壳蛋白或其肽片段。在一些实施例中，本文提供的药物组合物是非免疫原性的。例如，非免疫原性药物组合物可能基本上没有先天免疫系统细胞可识别的病原体相关分子模式。此类病原体相关分子模式包括CpG基序(例如，未甲基化的CpG基序或低甲基化的CpG基序)、内毒素(例如，脂多糖(LPS)，例如细菌LPS)、鞭毛蛋白、脂磷壁酸、肽聚糖和病毒核酸分子，例如作为双链RNA。
可通过常规方法评估本文所述的药物组合物的污染，并将药物组合物配制成旨在用于合适施用途径的药物组合物。其他含有DNA载体的组合物也可以类似地与合适的载剂一起配制。此类配制涉及使用药学上和/或生理学上可接受的媒剂或载剂，特别是针对向靶细胞施用。在一个实施例中，适用于向靶细胞施用的载剂包括缓冲盐水、等渗氯化钠溶液或其他缓冲剂(例如HEPES，以将pH维持在适当的生理水平)以及任选地，其他药用剂、药物剂、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂或稀释剂。
在一些实施例中，载剂是注射用液体。示例性的生理上可接受的载剂包括无菌无热原水和无菌无热原磷酸盐缓冲盐水。美国专利号7,629,322中提供了多种此类已知载剂，该专利通过引用并入本文。在一个实施例中，载剂是等渗氯化钠溶液。在另一个实施例中，载剂是平衡盐溶液。在一个实施例中，载剂包括吐温。如果载体要长期保存，可以在甘油或Tween 20存在的情况下冷冻。
在其他实施例中，本文所述的含有载体的组合物包括表面活性剂。可以包括有用的表面活性剂，例如普朗尼克(Pluronic)F68(泊洛沙姆(Poloxamer)188，也称为
Figure BDA0003648562500000571
F68)，因为它们可以防止AAV粘附在惰性表面上，从而确保递送所需的剂量。载剂是等渗氯化钠溶液并且包括表面活性剂普朗尼克F68。
递送媒剂(例如脂质体、纳米颗粒、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可用于将本披露的组合物引入合适的宿主细胞。特别地，DNA载体可以被配制用于通过封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡或纳米颗粒中来递送。在一些实施例中，DNA载体与递送媒剂例如泊洛沙姆和/或聚阳离子材料复合。
具有本发明的任何DNA载体(例如本文所述的环状DNA载体和/或包括DD元件的DNA载体)的药物组合物可以包含单位剂量，所述单位剂量包含以下DNA量：从10μg至10mg(例如从25μg至5.0mg、从50μg至2.0mg，或从100μg至1.0mg的DNA，例如从10μg至20μg、从20μg至30μg、从30μg至40μg、从40μg至50μg、从50μg至75μg、从75μg至100μg、从100μg至200μg、从200μg至300μg、从300μg至400μg、从400μg至500μg、从500μg至1.0mg、从1.0mg至5.0mg，或从5.0mg至10mg的DNA，例如约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约600μg、约700μg、约750μg、约1.0mg、约2.0mg、约2.5mg、约5.0mg、约7.5mg或约10mg的DNA)。
在一些实施例中，药物组合物含有按重量计至少约0.01％DNA载体。例如，药物组合物可以包含按重量计0.01％至80％的DNA载体(例如从按重量计0.05％至50％、按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、或按重量计1％至2.5％的DNA载体，例如按重量计0.01％至0.05％、按重量计0.05％至0.1％、按重量计0.1％至0.5％、按重量计0.5％至1.0％、按重量计1.0％至2％、按重量计2％至3％、按重量计3％至5％、按重量计5％至10％、按重量计10％至20％、或按重量计20％至50％的DNA载体)。
本发明的药物组合物可以含有本文所述的任何单体形式的合成的环状DNA载体(例如大于50％单体、大于60％单体、大于70％单体、大于80％单体、大于90％单体、大于95％单体、大于97％单体、大于98％单体、或大于99％单体)。在一些实施例中，药物组合物中70％至99.99％的合成的环状DNA载体分子是单体的(例如药物组合物中从70％至99.9％、从70％至99.5％、从70％至99％、从75％至99.9％、从75％至99.5％、从75％至99％、从80％至99.9％、从80％至99.5％、从80％至99％、从85％至99.9％、从85％至99.5％、从85％至99％、从90％至99.9％、从90％至99.5％、从90％至99％、从95％至99.9％、从95％至99.5％，或从95％至99％的合成的环状DNA载体分子是单体的，例如药物组合物中约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的合成的环状DNA载体分子是单体的)。
V.使用方法
本文提供了通过向有需要的受试者施用本文所述的任何DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体和/或包括DD元件的DNA载体)或其药物组合物在所述受试者中诱导异源基因表达(例如，附加型表达)的方法(例如，作为基因疗法方案的一部分)。可以通过检查宿主细胞的核酸序列(例如，RNA序列，例如，mRNA序列)来表征受试者的包含异源基因的细胞，例如通过蛋白质印迹或PCR分析，以测定载体中所含的异源基因的存在。可替代地，可以通过监测与对应于异源基因的靶基因中的缺陷或突变相关的疾病的进展来表征受试者中异源基因的表达(例如，定量或定性)。在一些实施例中，通过观察与疾病相关的一种或多种症状的下降来确认异源基因的表达(例如，附加型表达)。
因此，本发明提供了通过向有需要的受试者施用本文所述的任何DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体和/或包括DD元件的DNA载体)或其药物组合物治疗所述受试者的与靶基因(例如，对应于异源基因的基因)中的缺陷相关的疾病的方法。在一些实施例中，所述疾病是眼部疾病。在一些实施例中，使用具有异源CEP290基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的莱伯氏先天性黑蒙(LCA，例如LCA 10)。在一些实施例中，正在使用具有异源ABCA4基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的斯塔加特病。在一些实施例中，使用具有异源ABCC6基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的弹性假黄瘤。在一些实施例中，使用具有异源RIMS1基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的视杆视锥营养不良(例如视杆视锥营养不良7)。在一些实施例中，使用具有异源LRP5基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的渗出性玻璃体视网膜病变。在一些实施例中，使用具有异源CC2D2A基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的朱伯特综合征。在一些实施例中，使用具有异源TRPM1基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的CSNB-1C。在一些实施例中，使用具有异源C3基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的年龄相关性黄斑变性。在一些实施例中，使用具有异源IFT172基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的色素性视网膜炎71。在一些实施例中，使用具有异源COL11A1基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的史蒂克勒氏综合征(例如，史蒂克勒氏综合征2)。在一些实施例中，使用具有异源TUBGCP6基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的小头畸形和脉络膜视网膜病变。在一些实施例中，使用具有异源KIAA1549基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的色素性视网膜炎(例如，RP隐性)。在一些实施例中，使用具有异源CACNA1F基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的CSNB 2。在一些实施例中，使用具有异源MYO7A基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的厄舍综合征(例如，厄舍综合征1B型)。在一些实施例中，使用具有异源VCAN基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的瓦格纳综合征。在一些实施例中，使用具有异源USH2A基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的厄舍综合征2A型。在一些实施例中，使用具有异源HMCN1基因或其部分(例如，作为反式剪接分子的一部分)的DNA载体治疗受试者的AMD 1。
本发明还提供治疗选自由以下组成的组的疾病或障碍的方法：眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的异源基因。障碍可以是眼部障碍，其是视网膜营养不良。
障碍可以是孟德尔遗传性视网膜营养不良。视网膜营养不良可以选自由以下组成的组：LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
障碍可以是神经障碍，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。神经退行性疾病可以选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化。神经退行性疾病可以是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病。CNS的自身免疫性疾病可以是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。神经障碍可以是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。神经障碍可以是选自癫痫或偏头痛的离子通道病。神经障碍可以是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍(childhooddisorder)、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。神经障碍可以是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
溶酶体贮积障碍可以选自由以下组成的组：泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-皮克病和粘多糖贮积症(MPS)。
心血管障碍可以是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。心血管障碍可以是选自由缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷组成的组的退行性心脏病。
障碍可以是免疫障碍，其是自身免疫性障碍。自身免疫性障碍可以是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
疾病可以是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。肝病可以是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
疾病可以是癌症，其是血癌或实体组织癌。血癌可以是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。实体组织癌可以是肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌。
本发明的任何载体(例如本文所述的环状DNA载体和/或含有DD元件的DNA载体)可以10μg至10mg DNA的剂量施用于受试者(例如从25μg至5.0mg、从50μg至2.0mg，或从100μg至1.0mg的DNA，例如从10μg至20μg、从20μg至30μg、从30μg至40μg、从40μg至50μg、从50μg至75μg、从75μg至100μg、从100μg至200μg、从200μg至300μg、从300μg至400μg、从400μg至500μg、从500μg至1.0mg、从1.0mg至5.0mg，或从5.0mg至10mg的DNA，例如约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约600μg、约700μg、约750μg、约1.0mg、约2.0mg、约2.5mg、约5.0mg、约7.5mg或约10mg的DNA)。
在一些实施例中，本发明的DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体和/或含有DD元件的DNA载体)或其组合物的施用与施用其他基因疗法载体(例如，质粒DNA载体和病毒载体)相比，是非免疫原性的或不太可能在受试者中诱导免疫应答。上文描述了评估载体免疫原性的方法。
本文提供的合成的DNA载体(例如本文所述的环状DNA载体和/或含有DD元件的DNA载体)可以重复给药，因为它们相对于AAV载体能够感染靶细胞而不触发免疫应答或不诱导免疫应答降低，如上所述。因此，本发明提供了重复施用本文所述的载体和药物组合物的方法。可以以合适的频率和持续时间重复任何上述给药量。在一些实施例中，受试者接受的剂量为每天约两次、每天约一次、每周约五次、每周约四次、每周约三次、每周约两次、每周约一次、每月约两次、每月约一次、每六周约一次、每两个月约一次、每三个月约一次、每四个月约一次、每年两次、每年一次、或更少。在一些实施例中，剂量的数量和频率对应于靶细胞的周转率。应当理解，在使用本文所述的载体转染的长寿命的有丝分裂后靶细胞中，单剂量的载体可能足以将异源基因在靶细胞内的表达维持相当长的一段时间。因此，在其他实施例中，本文提供的DNA载体可以单剂量施用于受试者。向受试者递送异源核酸的次数可以是维持临床(例如治疗)益处所需的次数。
本发明的方法包括通过任何合适的途径施用DNA载体(例如，本文所述的环状DNA载体和/或含有DD元件的DNA载体)或其药物组合物。DNA载体或其药物组合物可以全身或局部施用，例如，静脉内、经眼部(例如，玻璃体内、视网膜下、通过眼药水、眼内、眶内)、肌内、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、皮内、肝内、脑内、肌内、经皮、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、瘤内、皮下、结膜下、囊内、经黏膜、心包内、脐内、口服、局部地、透皮、通过吸入、通过雾化、通过注射(例如，通过喷射注射)、通过电穿孔、通过植入、通过输注(例如，通过连续输注)、通过直接局部灌注液中靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中、或在脂质组合物中。
另外地或可替代地，载体可以离体施用至宿主细胞，例如通过从个体患者外植细胞，然后例如在选择已掺入载体的细胞之后将宿主细胞重新植入患者体内。因此，在一些方面，本披露提供了转染的宿主细胞及其用于治疗疾病的施用方法。
本发明提供了在有需要的受试者中诱导异源基因附加型表达的方法。例如，可以通过向受试者施用本发明的分离的DNA载体(或其组合物)(例如，缺乏复制起点和/或抗药性基因、重组位点和与细菌合成相关的任何其他元件(例如，dam和dcm甲基化模式)的分离的环状DNA载体)，在受试者(其具有有待被替换的蛋白质的缺陷或缺失(例如，从而导致凝血障碍、溶酶体贮积障碍或任何其他可通过蛋白质替代疗法治疗的障碍))中诱导编码治疗性替代蛋白(例如，单基因治疗性替代蛋白)的异源基因的附加型表达。在特定情况下，通过向受试者施用编码因子VII的本发明的DNA载体，在患有因子VII缺乏症的受试者中诱导编码因子VII的异源基因的游离表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子VIII的本发明的DNA载体，在具有血友病A的受试者中诱导编码因子VIII的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码因子IX的本发明的DNA载体，在具有血友病B的受试者中诱导编码因子IX的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子X的本发明的DNA载体，在患有因子X缺乏症的受试者中诱导编码因子X的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码因子XI的本发明的DNA载体，在患有因子XI缺乏症的受试者中诱导编码因子XI的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子XIII的本发明的DNA载体，在患有因子XIII缺乏症的受试者中诱导编码因子XIII的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码冯·维勒布兰德因子的本发明的DNA载体，在患有冯·维勒布兰德病的受试者中诱导编码冯·维勒布兰德因子的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码蛋白质C的本发明的DNA载体，在患有蛋白质C缺乏症的受试者中诱导编码蛋白质C的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码抗凝血酶III的本发明的DNA载体，在患有抗凝血酶III缺乏症的受试者中诱导编码抗凝血酶III的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码纤维蛋白原的本发明的DNA载体，在患有纤维蛋白原缺乏症的受试者中诱导编码纤维蛋白原的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码C1-酯酶抑制剂的本发明的DNA载体，在聚有遗传性血管性水肿的受试者中诱导编码C1-酯酶抑制剂的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码α1蛋白酶抑制剂的本发明的DNA载体，在患有a1-P1缺乏症的受试者中诱导编码α1蛋白酶抑制剂的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码葡糖脑苷脂酶的本发明的DNA载体，在患有戈谢病的受试者中诱导编码葡糖脑苷脂酶的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过给受试者施用编码α-L-艾杜糖醛酸酶的本发明的DNA载体，在患有粘多糖贮积症I的受试者中诱导编码α-L-艾杜糖醛酸酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过给受试者施用编码艾杜糖醛酸硫酸酯酶的本发明的DNA载体，在患有粘多糖贮积症II的受试者中诱导编码艾杜糖醛酸硫酸酯酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的本发明的DNA载体，在患有粘多糖贮积症VI的受试者中诱导编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的本发明的DNA载体，在患有粘多糖贮积症IVA的受试者中诱导编码N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码硫酸乙酰肝素硫酸酯酶的本发明的DNA载体，在患有粘多糖贮积症IIIA的受试者中诱导编码硫酸乙酰肝素硫酸酯酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码α-半乳糖苷酶A的本发明的DNA载体，在患有法布里病的受试者中诱导编码α-半乳糖苷酶A的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码α-葡糖苷酶的本发明的DNA载体，在患有庞贝病的受试者中诱导编码α-葡糖苷酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码酸性鞘磷脂酶的本发明的DNA载体，在患有尼曼皮克B型疾病的受试者中诱导编码酸性鞘磷脂酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码芳基硫酸酯酶A的本发明的DNA载体，在患有异染性脑白质营养不良的受试者中诱导编码芳基硫酸酯酶A的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码溶酶体酸性脂肪酶的本发明的DNA载体，在患有LAL缺乏症的受试者中诱导编码溶酶体酸性脂肪酶(LAL)的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码蔗糖酶-异麦芽糖酶的本发明的DNA载体，在患有蔗糖酶-异麦芽糖酶缺乏症的受试者中诱导编码蔗糖酶-异麦芽糖酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码腺苷脱氨酶的本发明的DNA载体，在患有ADA缺乏症的受试者中诱导编码腺苷脱氨酶(ADA)的异源基因的附加型表达。在其他情况下，通过向受试者施用编码胰岛素样生长因子1(IGF-1)的本发明的DNA载体，在患有IGF-1缺乏症(例如，原发性IGF-1缺乏症)的受试者中诱导编码IGF-1的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码碱性磷酸酶的本发明的DNA载体，在患有低磷酸酯酶症的受试者中诱导编码碱性磷酸酶的异源基因的附加型表达。在一些情况下，通过向受试者施用编码胆色素原脱氨酶的本发明的DNA载体，在患有急性间歇性卟啉症的受试者中诱导编码胆色素原脱氨酶的异源基因的附加型表达。
另外地或可替代地，本发明包括通过向患有疾病或障碍的受试者施用本发明的分离的DNA载体(例如，缺乏复制起点和/或抗药性基因、重组位点和任何其他与细菌合成相关的元件(例如，dam和dcm甲基化模式)的分离的环状DNA载体)(或其组合物)来治疗所述受试者的方法。在特定情况下，通过向受试者施用编码因子VII的本发明的DNA载体来治疗患有因子VII缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子VIII的本发明的DNA载体来治疗患有血友病A的个体。在其他情况下，通过向受试者施用编码因子IX的本发明的DNA载体来治疗患有血友病B的个体。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子X的本发明的DNA载体来治疗患有因子X缺乏症的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码因子XI的本发明的DNA载体来治疗患有因子XI缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码因子XIII的本发明的DNA载体来治疗患有因子XIII缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码冯·维勒布兰德因子的本发明的DNA载体来治疗患有冯·维勒布兰德病的个体。在其他情况下，通过向受试者施用编码蛋白质C的本发明的DNA载体来治疗患有蛋白质C缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码抗凝血酶III的本发明的DNA载体来治疗患有抗凝血酶III缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码纤维蛋白原的本发明的DNA载体来治疗患有纤维蛋白原缺乏症的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码C1-酯酶抑制剂的本发明的DNA载体来治疗患有遗传性血管性水肿的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码α-1蛋白酶抑制剂的本发明的DNA载体来治疗患有a1-P1缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码葡糖脑苷脂酶的本发明的DNA载体来治疗患有戈谢病的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码α-L-艾杜糖醛酸酶的本发明的DNA载体来治疗患有粘多糖贮积症I的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码艾杜糖醛酸硫酸酯酶的本发明的DNA载体来治疗患有粘多糖贮积症II的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的本发明的DNA载体来治疗患有粘多糖贮积症VI的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的本发明的DNA载体来治疗患有粘多糖贮积症IVA的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码硫酸乙酰肝素硫酸酯酶的本发明的DNA载体来治疗患有粘多糖贮积症IIIA的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码α-半乳糖苷酶A的本发明的DNA载体来治疗患有法布里病的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码α-葡糖苷酶的本发明的DNA载体来治疗患有庞贝病的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码酸性鞘磷脂酶的本发明的DNA载体来治疗患有尼曼皮克B型疾病的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码芳基硫酸酯酶A的本发明的DNA载体来治疗患有异染性脑白质营养不良的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码溶酶体酸性脂肪酶的本发明的DNA载体来治疗患有LAL缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码蔗糖酶-异麦芽糖酶的本发明的DNA载体来治疗患有蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码腺苷脱氨酶的本发明的DNA载体来治疗患有ADA缺乏症的受试者。在其他情况下，通过向受试者施用编码IGF-1的本发明的DNA载体来治疗患有IGF-1缺乏症(例如，原发性IGF-1缺乏症)的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码碱性磷酸酶的本发明的DNA载体来治疗患有低磷酸酯酶症的受试者。在一些情况下，通过向受试者施用编码胆色素原脱氨酶的本发明的DNA载体来治疗患有急性间歇性卟啉症的受试者。
评估和监测
可以使用本领域已知的或本文描述的任何方法来评估本文描述的任何载体的转染效率。也可以根据标准技术分离转染的细胞。例如，包含异源基因的细胞可以表达由异源基因的序列编码的可见标志物，例如荧光蛋白(例如，GFP)或其他报告蛋白，其有助于鉴定和分离包含异源基因的一个或多个细胞。含有异源基因的细胞也可以表达来自该基因的选择性标志物。细胞在某些条件(例如暴露于细胞毒性物质或缺乏通常存活所需的营养物或底物)下的存活可能取决于选择性标志物的表达或缺乏表达。因此，在这种条件下细胞的存活或不存活允许鉴定和分离含有异源基因的细胞或细胞集落。还可以通过检查宿主细胞的核酸序列(例如，RNA序列，例如，mRNA序列)来表征含有异源基因的细胞，例如通过蛋白质印迹或PCR分析，以测定载体中所含的异源基因的存在。
因此，本发明的方法包括在将本文所述的任何载体施用于受试者之后，随后检测受试者中异源基因的表达。可以在施用后一周至四周、施用后一个月至四个月、施用后四个月至一年、施用后一年至五年、或施用后五年至二十年(例如，施用后至少一周、至少两周、至少一个月、至少四个月、至少一年、至少两年、至少五年、至少十年)检测到表达。在任何这些检测时间点，都可以观察到DNA载体的持久性(例如，附加型持久性)。在一些实施例中，环状DNA载体的持久性比参考载体(例如，在细菌中产生或具有不存在于本发明的载体中的一个或多个细菌特征的环状载体)大5％至50％、大50％至100％、1倍至5倍或5倍至10倍(例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更大)。
之后的实例不限制本文描述的实施例的范围。本领域技术人员将理解，可以对旨在包含在本发明的精神和范围内的以下实例进行修改。
实例
重组AAV(rAAV)载体在各种模型系统中具有高效基因转移的既定记录，现在正在作为多种人类疾病的治疗形式进行测试。动物和人类研究表明，rAAV载体基因组在体内主要以环状附加体形式持续存在。本发明基于这样的发现，即可以使用合成技术复制这种持久性以产生环状DNA载体。从动物和人类分离的rAAV附加型基因组的分子分析表明，这些环状基因组包含末端重复序列。在以下一些实例中，在rAAV附加型基因组中鉴定的末端重复序列包括双D(DD)元件，其这是位于线性AAV基因组两端的反向末端重复(ITR)重组的结果，如图1所示。与细菌中产生的载体相比，这种合成的DNA载体可以降低宿主的免疫原性和炎症，因为细菌中产生的DNA含有固有的细菌特征(CpG基序)以及来自细菌本身的杂质(内毒素、细菌基因组DNA和RNA)可导致体内质粒和基因表达的丢失。
实例1.具有DD元件的DNA载体的合成产生
步骤1-产生rAAV2-eGFP病毒，然后进行细胞转导。
获得了质粒pAAV-BASIC-EGFP(载体生物实验室公司(Vector Biolabs)，马尔文(Malvern)，宾夕法尼亚州)，其含有位于表达盒的侧翼的AAV2 ITR，所述表达盒由驱动具有BGHpA信号的eGFP蛋白的CMV增强子/启动子组成。所述质粒用于HEK293T细胞中的三重转染策略以产生rAAV2-eGFP病毒载体。三重转染中使用的另外两种质粒是AAV辅助质粒pRep-Cap2(部件号0912；应用病毒公司(Applied Viromics)，弗里蒙特，加利福尼亚州)和pHELP(部件号0913；应用病毒公司，弗里蒙特，加利福尼亚州)。使用磷酸钙试剂盒(完美哺乳动物转染系统(Profection Mammalian Transfection System)，部件号TM012；普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)。在转染后48小时，通过冷冻/解冻裂解细胞并用benzonase处理以产生粗病毒裂解物。通过qPCR测定粗裂解物中的病毒滴度为5.3×1012个DNA酶抗性颗粒(DRP)/mL。为了生成环状rAAV基因组，用rAAV2-eGFP病毒感染HEK293T细胞，感染复数(MOI)为1×105。图4总结了这个过程。
步骤2-具有DD元件的rAAV基因组的克隆和表征。
具有DD元件的rAAV基因组的克隆和表征的总结如图5所示。感染后七天收获受感染的细胞，并使用DNeasy血液和组织试剂盒(凯杰公司(Qiagen)；日耳曼敦(Germantown)，马里兰州)从细胞中提取总细胞DNA。为了消除残留的线性rAAV基因组，用plasmid-safeDNA酶(卢西基因公司(Lucigen)，米德尔顿(Middleton)，威斯康星州)处理DNA，所述酶特异性降解线性DNA，使双链环状rAAV基因组保持完整。使用TEMPLIPHITM试剂盒(部件号25640010，GE健康医疗集团；匹兹堡，宾夕法尼亚州)扩增残留的环状rAAV基因组。TEMPLIPHITM试剂盒包含使用等温滚环扩增(RCA)的Phi29聚合酶，用于使用噬菌体Phi29DNA聚合酶对环状DNA进行指数扩增。Phi29扩增的结果是DNA的长线性多联体。然后用酶(EcoRI)消化该DNA，该酶在rAAV基因组内切割一次以产生单位长度的基因组，单位长度的基因组被克隆到pBlueScript II KS+质粒(部件号212207，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)；芝加哥，伊利诺伊州)中。
对所得克隆中的DD元件进行测序，克隆“TG-18”被鉴定为具有长度为165bp的完整DD元件(无缺失或重排)。克隆TG-18的序列如图6A所示。
步骤3-用于产生DD载体的模板的生成
鉴定了包含DD元件(克隆TG-18)的rAAV基因组后，下一步是产生用于下游产生DD载体的环状模板。用限制酶EcoRI消化质粒TG-18，这从质粒骨架中释放线性单位长度的rAAV基因组。然后将线性片段自连接(而不是与异源DNA片段连接)以重新创建环状rAAV基因组。任何未连接形成环状产物的线性片段均通过plasmid-safe DNA酶处理消除。该过程的图示在图7中示出。
步骤4-在试管中产生DD载体
步骤3中产生的环状rAAV基因组起源于细菌，并包含有可能降低在宿主中的持久性和/或具有免疫原性的细菌特征。步骤4在试管中扩增该环状模板，以生成更多没有细菌特征和污染物的rAAV基因组。与细菌中产生的传统基因转移载体相比，这是一个优势。对于试管产生，使用TEMPLIPHITM试剂盒(部件号25640010，GE健康医疗集团，匹兹堡(Pittsburgh)，宾夕法尼亚州)扩增环状模板。TEMPLIPHITM试剂盒包含使用等温滚环扩增(RCA)的Phi29聚合酶，用于使用噬菌体Phi29 DNA聚合酶对环状DNA进行指数扩增。Phi29扩增的结果是DNA的长线性多联体。我们检查了扩增的DNA以查看DD元件是否被Phi29 DNA聚合酶忠实复制。结果示于图8中。
首先用SwaI消化经扩增的DNA，SwaI在DD元件的任一侧切割(图9)以释放244bp长度的片段。来自经扩增DNA的SwaI片段与来自原始TG-18pBlueScript质粒的SwaI片段大小相同(图10，箭头)，表明Phi29可以扩增DD元件。通过用在DD元件内进行切割的AhdI消化进一步分析经扩增的DD元件的完整性。AhdI在DD载体内切割一次，并将多联体DNA消化成2.1kb单位长度的基因组，如图11所示(箭头)。
证明了DD载体中的DD元件可以被忠实地扩增，下一步是生成最终的环状DD载体产物。产生策略的概要示于图12-14中。使用Phi29聚合酶扩增步骤3中产生的环状rAAV基因组，该聚合酶使用等温RCA以使用噬菌体Phi29 DNA聚合酶对环状DNA进行指数扩增。Phi29扩增的结果是DNA的长线性多联体(图13A)。然后用酶(EcoRI)消化该DNA，该酶在rAAV基因组内切割一次以产生AAV基因组(即，单位长度的AAV基因组；图13A)。然后该AAV基因组自连接以重新产生环状rAAV基因组(图14A)。任何未连接形成环状产物的线性片段均通过plasmid-safe DNA酶处理消除。
步骤5-DD载体的基因表达的确认
体外产生过程的最后一步是确认DD载体具有生物活性(即在培养细胞中表达转基因)。使用Lipofectamine 2000(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)将含有eGFP表达盒作为异源基因的含DD的DNA载体转染到HEK293T细胞中。48小时后通过免疫荧光(图15A和15B)或蛋白质印迹(图16)分析细胞的GFP表达。
实例2.环状DNA载体的合成产生
产生单体DNA载体，其中载体不含细菌质粒DNA序列，并且完全在试管中合成(不需要在细菌中复制)。因此，合成的DNA载体可以赋予给定的靶细胞以转基因DNA，其行为类似于AAV病毒DNA，而不需要病毒本身。与病毒载体相比，这种策略提供了几个优势。首先，它允许递送太大而无法包装到普通病毒载体中的基因。此外，它可以重复给药，因为没有病毒蛋白会触发免疫应答阻止另一种病毒载体的重复给药。此外，相对于其他病毒载体，体外合成过程具有更大的制造效率的潜力。
用于产生合成的环状DNA载体的示例性过程显示在图17中。使用phi29聚合酶对超螺旋单体DNA模板进行扩增，以产生具有限制性位点的线性多联体DNA，所述限制性位点限定重复的DNA片段之间的边界。使用将DNA切割成单位长度片段的限制酶消化多联体。接下来，添加DNA连接酶以诱导DNA片段的自连接，产生DNA结构的混合物，包括开放松弛环和超螺旋DNA单体。使用亲硫芳族吸附色谱树脂(Plasmid select Xtra，GE健康医疗集团28-4024-01)对该混合物进行柱纯化，该树脂具有允许将质粒DNA的超螺旋共价闭环形式与开环形式分离的选择性。从该纯化中获得的超螺旋DNA单体被回收，并可用于本文所述的方法中，可替代地，可用作另外扩增的模板。
实例3.体内持久性的表征-GFP表达
为了表征本发明的合成的环状DNA载体的持久性程度，给小鼠施用三种组合物，每种组合物包括不同的DNA载体：(1)质粒CAG-GFP(SEQ ID NO:42)，作为持久性的阴性对照；(2)ΔDD CAG-GFP(合成的环状DNA载体，缺乏DD元件)；以及(3)DD CAG-GFP(具有DD元件的合成的环状DNA载体)。每组总共包含32只小鼠(每个时间点8只小鼠)，并且通过流体动力学注射以每只小鼠10μg DNA施用每种组合物。在以下每个时间点处死每组八只小鼠：两周、四周、八周和十六周，在每个时间点收获和处理肝组织。根据已知方法量化肝细胞中GFP的表达，并在每个时间点进行组间比较。如果与来自施用质粒CAG-GFP的小鼠的肝细胞相比，来自施用合成的环状CAG-GFP的小鼠的肝细胞表达更高水平的GFP，则确定合成的环状CAG-GFP具有高度持久性。
实例4.体内持久性的表征-mSEAP表达
表征本发明的合成的环状DNA载体的持久性程度的另一项研究涉及小鼠分泌的碱性磷酸酶(mSEAP)的异源表达，所述碱性磷酸酶不在小鼠中内源性表达。在这个实验中，给小鼠施用了四种组合物，每种组合物包括不同的DNA载体：(1)质粒CAG-mSEAP，作为持久性的阴性对照；(2)质粒CAG-mSEAP-ΔCpG，其缺乏CpG基序；(3)ΔDD CAG-mSEAP-ΔCpG，其缺乏DD元件和CpG基序；以及(4)DD CAG-mSEAPΔCpG，其包括DD元件并且缺乏CpG基序。每组包含12只小鼠，通过流体动力学注射以每只小鼠20μg DNA施用每种组合物。在以下每个时间点处死每组两只小鼠：两周、四周、八周、十二周、十六周和二十四周，采血200μL。根据已知方法在每个样品中量化mSEAP的血清浓度，并在每个时间点进行组间比较。
CpG基序和/或DD元件对持久性的影响通过比较实验组间的mSEAP浓度来量化。例如，在早期时间点，实验组间的血清mSEAP水平大致相等；然而，施用具有更高持久性载体的小鼠在随后的时间点表现出更高浓度的mSEAP。
列举的实施例
本文描述的技术的一些实施例可以根据以下编号的段落中的任何一个来定义：
1.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
2.如段落1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
3.如段落2所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
4.如段落1-3中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
5.如段落1-4中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏免疫原性细菌特征。
6.如段落1-5中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点。
7.如段落1-6中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体基本上没有CpG岛。
8.如段落1-7中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白被分泌到血液中。
9.如段落1-8中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
10.如段落1-9中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
11.如段落1-10中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
12.如段落1-11中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
13.如段落1-12中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
14.如段落1-13中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
15.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗眼部障碍。
16.如段落15所述的DNA载体，其中所述眼部障碍是视网膜营养不良。
17.如段落16所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
18.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗凝血障碍。
19.如段落18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
20.如段落19所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
21.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
22.如段落21所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。
23.如段落21或22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK-9、磷脂酰丝氨酸或骨硬化蛋白。
24.如段落22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、双特异性抗体或抗原结合片段。
25.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
26.如段落25所述的DNA载体，其中所述生长因子是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、M-CSF、GM-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。
27.如段落25所述的DNA载体，其中所述白介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。
28.如段落25所述的DNA载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-γ。
29.如段落25所述的DNA载体，其中所述凝血因子是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。
30.如段落25所述的DNA载体，其中所述神经保护因子选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。
31.如段落30所述的DNA载体，其中所述神经营养因子选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
32.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
33.如段落32所述的DNA载体，其中所述障碍是眼部障碍，所述眼部障碍是视网膜营养不良。
34.如段落33所述的DNA载体，其中所述障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
35.如段落33所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
36.如段落32所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
37.如段落32所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
38.如段落32或37所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
39.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
40.如段落39所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。
41.如段落39所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病。
42.如段落41所述的DNA载体，其中CNS的所述自身免疫性疾病是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。
43.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。
44.如段落43所述的DNA载体，其中所述离子通道病是癫痫或偏头痛。
45.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。
46.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
47.如段落32所述的DNA载体，其中所述溶酶体贮积障碍选自由以下组成的组：泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-皮克病和粘多糖贮积症(MPS)。
48.如段落32所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。
49.如段落32所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是选自由以下组成的组的退行性心脏病：缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷。
50.如段落32所述的DNA载体，其中所述免疫障碍是自身免疫性障碍。
51.如段落50所述的DNA载体，其中所述自身免疫性障碍是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
52.如段落32所述的DNA载体，其中所述疾病是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。
53.如段落52所述的DNA载体，其中所述肝病是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
54.如段落33所述的DNA载体，其中所述癌症是血癌或实体组织癌。
55.如段落54所述的DNA载体，其中所述血癌是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
56.如段落54所述的DNA载体，其中所述实体组织癌是肝癌、肾癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌。
57.如段落1-56中任一项所述的DNA载体，其中所述障碍是隐性遗传障碍。
58.如段落1-57中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在选自由以下组成的组的靶细胞中可表达：肝细胞、视网膜细胞、干细胞、神经细胞、肌肉细胞或血细胞。
59.如段落1-58中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在有丝分裂后靶细胞中可表达。
60.如段落58或59所述的DNA载体，其中所述靶细胞是选自由以下组成的组的神经细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞。
61.如段落1-60中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性蛋白质被分泌到血液中。
62.如段落1-61中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包含启动子序列。
63.如段落1-62中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包在所述一个或多个异源基因下游含聚腺苷酸化位点。
64.如段落1-63中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
65.如段落1-64中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
66.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA载体：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
67.如段落66所述的DNA载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或CRISPRi分子。
68.如段落65-67中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
69.如段落65-68中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
70.如段落1-69中任一项所述的DNA载体，其中所述载体包含自杀基因。
71.如段落1-70中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏细菌质粒DNA。
72.如段落1-66中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
73.如段落1-72中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体：
(a)缺乏免疫原性细菌特征；
(b)缺乏RNA聚合酶停滞位点；和/或
(c)基本上没有CpG岛。
74.如段落1-73中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
75.如段落1-74中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
76.如段落1-75中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
77.如段落1-76中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
78.一种组合物，所述组合物包含多个如段落1-77中任一项所述的DNA载体。
79.如段落78所述的组合物，其中所述多个所述DNA载体中的至少50％包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
80.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码治疗性蛋白质的异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
81.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
82.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
83.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
84.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA分子：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
85.如段落80-84中任一项所述的分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含限制酶位点。
86.如段落85所述的分离的线性DNA分子，其中所述限制酶位点位于所述异源基因和末端重复序列之间。
87.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因的分离的DNA载体。
88.如段落87所述的方法，其中所述AAV基因组包含末端重复序列。
89.如段落87或88所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
90.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和末端重复序列；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含末端重复序列的质粒克隆；
(vi)消化包含所述末端重复序列的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。
91.如段落87-90中任一项所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
92.如段落87-91中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
93.一种产生如段落1-58中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因的所述分离的DNA载体。
94.如段落93所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
95.如段落93或94所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
96.如段落93-95中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
97.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
98.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含DD元件的质粒克隆；
(vi)消化包含所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
99.如段落97或98所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
100.如段落97-99中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
101.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的治疗性DNA载体。
102.如段落101所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
103.如段落101或102所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
104.一种在有需要的受试者中诱导异源基因的附加型表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体或如段落78或79所述的组合物。
105.一种治疗受试者的障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体或如段落78或79所述的组合物。
106.如段落104或105所述的方法，其中重复施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
107.如段落104-106中任一项所述的方法，其中局部施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
108.如段落107所述的方法，其中玻璃体内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
109.如段落104-108中任一项所述的方法，其中所述障碍是眼部障碍。
110.如段落109所述的方法，其中所述眼部障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
111.如段落110所述的方法，其中所述眼部障碍是LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
112.如段落104-106中任一项所述的方法，其中全身施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
113.如段落112所述的方法，其中所述障碍是凝血障碍。
114.如段落113所述的方法，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
本文描述的技术的其他实施例可以根据以下编号的段落中的任何一个来定义：
1.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
2.如段落1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
3.如段落2所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
4.如段落1-3中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
5.如段落1-4中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏免疫原性细菌特征。
6.如段落1-5中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点。
7.如段落1-6中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体基本上没有CpG岛。
8.如段落1-7中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白被分泌到血液中。
9.如段落1-8中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
10.如段落1-9中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
11.如段落1-10中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
12.如段落1-11中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
13.如段落1-12中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
14.如段落1-13中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
15.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗眼部障碍。
16.如段落15所述的DNA载体，其中所述眼部障碍是视网膜营养不良。
17.如段落16所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
18.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗凝血障碍。
19.如段落18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
20.如段落18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
21.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
22.如段落21所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。
23.如段落21或22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK-9、磷脂酰丝氨酸或骨硬化蛋白。
24.如段落22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、双特异性抗体或抗原结合片段。
25.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
26.如段落25所述的DNA载体，其中所述生长因子是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、M-CSF、GM-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。
27.如段落25所述的DNA载体，其中所述白介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。
28.如段落25所述的DNA载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-γ。
29.如段落25所述的DNA载体，其中所述凝血因子是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。
30.如段落25所述的DNA载体，其中所述神经保护因子选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。
31.如段落30所述的DNA载体，其中所述神经营养因子选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
32.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
33.如段落32所述的DNA载体，其中所述障碍是眼部障碍，所述眼部障碍是视网膜营养不良。
34.如段落33所述的DNA载体，其中所述障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
35.如段落33所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
36.如段落32所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
37.如段落32所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
38.如段落32或37所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
39.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
40.如段落39所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。
41.如段落39所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病。
42.如段落41所述的DNA载体，其中CNS的所述自身免疫性疾病是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。
43.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。
44.如段落43所述的DNA载体，其中所述离子通道病是癫痫或偏头痛。
45.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。
46.如段落32所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
47.如段落32所述的DNA载体，其中所述溶酶体贮积障碍选自由以下组成的组：泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-皮克病和粘多糖贮积症(MPS)。
48.如段落32所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。
49.如段落32所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是选自由以下组成的组的退行性心脏病：缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷。
50.如段落32所述的DNA载体，其中所述免疫障碍是自身免疫性障碍。
51.如段落50所述的DNA载体，其中所述自身免疫性障碍是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
52.如段落32所述的DNA载体，其中所述疾病是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。
53.如段落52所述的DNA载体，其中所述肝病是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
54.如段落33所述的DNA载体，其中所述癌症是血癌或实体组织癌。
55.如段落54所述的DNA载体，其中所述血癌是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
56.如段落54所述的DNA载体，其中所述实体组织癌是肝癌、肾癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌。
57.如段落1-56中任一项所述的DNA载体，其中所述障碍是隐性遗传障碍。
58.如段落1-57中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在选自由以下组成的组的靶细胞中可表达：肝细胞、视网膜细胞、干细胞、神经细胞、肌肉细胞或血细胞。
59.如段落1-58中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在有丝分裂后靶细胞中可表达。
60.如段落58或59所述的DNA载体，其中所述靶细胞是选自由以下组成的组的神经细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞。
61.如段落1-60中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性蛋白质被分泌到血液中。
62.如段落1-61中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包含启动子序列。
63.如段落1-62中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包在所述一个或多个异源基因下游含聚腺苷酸化位点。
64.如段落1-63中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
65.如段落1-64中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
66.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA载体：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
67.如段落66所述的DNA载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或CRISPRi分子。
68.如段落65-67中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
69.如段落65-68中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
70.如段落1-69中任一项所述的DNA载体，其中所述载体包含自杀基因。
71.如段落1-70中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏细菌质粒DNA。
72.如段落1-66中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
73.如段落1-72中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体：
(a)缺乏免疫原性细菌特征；
(b)缺乏RNA聚合酶停滞位点；和/或
(c)基本上没有CpG岛。
74.如段落1-73中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
75.如段落1-74中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
76.如段落1-75中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
77.如段落1-76中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
78.一种组合物，所述组合物包含多个如段落1-77中任一项所述的DNA载体。
79.如段落78所述的组合物，其中所述多个所述DNA载体中的至少50％包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
80.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码治疗性蛋白质的异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
81.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
82.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
83.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
84.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA分子：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
85.如段落80-84中任一项所述的分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含限制酶位点。
86.如段落85所述的分离的线性DNA分子，其中所述限制酶位点位于所述异源基因和末端重复序列之间。
87.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因的分离的DNA载体。
88.如段落87所述的方法，其中所述AAV基因组包含末端重复序列。
89.如段落87或88所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
90.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和末端重复序列；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含末端重复序列的质粒克隆；
(vi)消化包含所述末端重复序列的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。
91.如段落87-90中任一项所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
92.如段落87-91中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
93.一种产生如段落1-58中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因的所述分离的DNA载体。
94.如段落93所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
95.如段落93或94所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
96.如段落93-95中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
97.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
98.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含DD元件的质粒克隆；
(vi)消化包含所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
99.如段落97或98所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
100.如段落97-99中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
101.一种产生如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的治疗性DNA载体。
102.如段落101所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
103.如段落101或102所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
104.一种在有需要的受试者中诱导异源基因的附加型表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体或如段落78或79所述的组合物。
105.一种治疗受试者的障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如段落1-77中任一项所述的分离的DNA载体或如段落78或79所述的组合物。
106.如段落104或105所述的方法，其中重复施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
107.如段落104-106中任一项所述的方法，其中局部施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
108.如段落107所述的方法，其中玻璃体内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
109.如段落104-108中任一项所述的方法，其中所述障碍是眼部障碍。
110.如段落109所述的方法，其中所述眼部障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
111.如段落110所述的方法，其中所述眼部障碍是LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
本文描述的技术的其他实施例可以根据以下编号的段落中的任何一个来定义：1.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
2.如段落1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
3.如段落2所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
4.如段落1-3中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
5.如段落1-4中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏免疫原性细菌特征。
6.如段落1-5中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点。
7.如段落1-6中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含基本上没有CpG岛的启动子。
8.如段落1-7中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白被分泌到血液中。
9.如段落1-8中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
10.如段落1-9中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
11.如段落1-10中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
12.如段落1-11中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合的。
13.如段落1-12中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
14.如段落1-13中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合且超螺旋的。
15.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗眼部障碍。
16.如段落15所述的DNA载体，其中所述眼部障碍是视网膜营养不良。
17.如段落16所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
18.如段落1-14中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白用于治疗凝血障碍。
19.如段落18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
20.如段落18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
21.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
22.如段落21所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。
23.如段落21或22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK-9、磷脂酰丝氨酸或骨硬化蛋白。
24.如段落22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、双特异性抗体或抗原结合片段。
25.如段落1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
26.如段落1所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
27.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
28.如段落27所述的DNA载体，其中所述酶是表观遗传调节剂。
29.如段落28所述的DNA载体，其中所述表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶。
30.如段落27所述的DNA载体，其中所述生长因子是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、M-CSF、GM-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。
31.如段落27所述的DNA载体，其中所述白介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。
32.如段落27所述的DNA载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-γ。
33.如段落27所述的DNA载体，其中所述凝血因子是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。
34.如段落27所述的DNA载体，其中所述神经保护因子选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。
35.如段落34所述的DNA载体，其中所述神经营养因子选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
36.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
37.如段落36所述的DNA载体，其中所述障碍是眼部障碍，所述眼部障碍是视网膜营养不良。
38.如段落37所述的DNA载体，其中所述障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
39.如段落38所述的DNA载体，其中所述孟德尔遗传性视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙(LCA)、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
40.如段落36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是CD40、CD40L、CD46、XCL1、MDA-7、IL-12、IL-24或OPCML(阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子)。
41.如段落36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是肿瘤抑制基因。
42.如段落41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码细胞内蛋白质的基因。
43.如段落41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码分泌的激素或发育信号的受体或信号转导器的基因，所述分泌的激素或发育信号抑制细胞增殖。
44.如段落41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码检查点控制蛋白的基因。
45.如段落41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码促凋亡蛋白的基因。
46.如段落41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码DNA修复蛋白的基因。
47.如段落36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
48.如段落36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
49.如段落36或48所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
50.如段落36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
51.如段落50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。
52.如段落50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病是中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病。
53.如段落52所述的DNA载体，其中CNS的所述自身免疫性疾病是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。
54.如段落36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。
55.如段落54所述的DNA载体，其中所述离子通道病是癫痫或偏头痛。
56.如段落36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。
57.如段落36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
58.如段落36所述的DNA载体，其中所述溶酶体贮积障碍选自由以下组成的组：泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-皮克病和粘多糖贮积症(MPS)。
59.如段落36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。
60.如段落36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是选自由以下组成的组的退行性心脏病：缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷。
61.如段落36所述的DNA载体，其中所述免疫障碍是自身免疫性障碍。
62.如段落61所述的DNA载体，其中所述自身免疫性障碍是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
63.如段落36所述的DNA载体，其中所述疾病是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。
64.如段落63所述的DNA载体，其中所述肝病是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
65.如段落36所述的DNA载体，其中所述癌症是血癌或实体组织癌。
66.如段落65所述的DNA载体，其中所述血癌是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
67.如段落65所述的DNA载体，其中所述实体组织癌是肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌。
68.如段落36所述的DNA载体，其中所述异源基因编码转录因子。
69.如段落36所述的DNA载体，其中所述转录因子是TSHZ2、HOXA2、MEIS2、HOXA3、HAND2、HOXA5、TBX18、PEG3、GLI2、CLOCK、HNF4A、VHL/HIF、WT-1、GSK-3、SPINT2、SMAD2、SMAD3或SMAD4。
70.如段落1-69中任一项所述的DNA载体，其中所述障碍是隐性遗传障碍。
71.如段落1-70中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在选自由以下组成的组的靶细胞中可表达：肝细胞、视网膜细胞、干细胞、神经细胞、肌肉细胞或血细胞。
72.如段落1-71中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在有丝分裂后靶细胞中可表达。
73.如段落71或72所述的DNA载体，其中所述靶细胞是选自由以下组成的组的神经细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞。
74.如段落1-73中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性蛋白质被分泌到血液中。
75.如段落1-74中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包含启动子序列。
76.如段落1-75中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包在所述一个或多个异源基因下游含聚腺苷酸化位点。
77.如段落1-76中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
78.如段落1-77中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
79.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA载体：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
80.如79 66所述的DNA载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或CRISPRi分子。
81.如段落79或80所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
82.如段落79-81中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
83.如段落1-82中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含自杀基因。
84.如段落1-83中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏细菌质粒DNA。
85.如段落1-79中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
86.如段落1-85中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体：
(a)缺乏免疫原性细菌特征；
(b)缺乏RNA聚合酶停滞位点；和/或
(c)基本上没有CpG岛。
87.如段落1-86中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
88.如段落1-87中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
89.如段落1-88中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
90.如段落1-89中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
91.一种组合物，所述组合物包含多个如段落1-90中任一项所述的DNA载体。
92.如段落91所述的组合物，其中所述多个所述DNA载体中的至少50％包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
93.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码治疗性蛋白质的异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
94.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
95.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
96.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
97.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA分子：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
98.如段落93-97中任一项所述的分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含限制酶位点。
99.如段落98所述的分离的线性DNA分子，其中所述限制酶位点位于所述异源基因和末端重复序列之间。
100.一种产生如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因的分离的DNA载体。
101.如段落100所述的方法，其中所述AAV基因组包含末端重复序列。
102.如段落100或101所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
103.一种产生如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和末端重复序列；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含末端重复序列的质粒克隆；
(vi)消化包含所述末端重复序列的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。
104.如段落100-103中任一项所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
105.如段落100-104中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
106.一种产生如段落1-71中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因的所述分离的DNA载体。
107.如段落106所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
108.如段落106或107所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
109.如段落106-108中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
110.一种产生如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
111.一种产生如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含DD元件的质粒克隆；
(vi)消化包含所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
112.如段落110或111所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
113.如段落110-112中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
114.一种产生如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的治疗性DNA载体。
115.如段落114所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
116.如段落114或115所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
117.一种在有需要的受试者中诱导异源基因的附加型表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体或如段落91或92所述的组合物。
118.一种治疗受试者的障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如段落1-90中任一项所述的分离的DNA载体或如段落91或92所述的组合物。
119.如段落117或118所述的方法，其中重复施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
120.如段落117或118所述的方法，其中全身施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
121.如段落117-120中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
122.如段落117-120中任一项所述的方法，其中局部施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
123.如段落122所述的方法，其中玻璃体内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
124.如段落117-123中任一项所述的方法，其中所述障碍是眼部障碍。
125.如段落124所述的方法，其中所述眼部障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
126.如段落124所述的方法，其中所述眼部障碍是LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
127.如段落117-126中任一项所述的方法，其中全身施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
128.如段落127所述的方法，其中所述障碍是凝血障碍。
129.如段落128所述的方法，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
其他实施例
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合在此，如同每一独立的出版物、或专利申请具体且单独地指明通过引用结合在此。
尽管本发明已结合其特定实施例进行了描述，但应当理解，它能够进行进一步修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变化、使用或改编，一般而言，遵循本发明的原理包括本披露的偏离，这些偏离属于本发明所属领域内的已知或惯常实践，并且可以应用于上文阐述的基本特征，并且在权利要求的范围内。
其他实施例在权利要求范围内。
序列表
<110> 星际治疗有限公司（Intergalactic Therapeutics, Inc. ）
<120> 合成的DNA载体和使用方法
<130> 51503-026WO2
<150> US 62/902,084
<151> 2019-09-18
<160> 42
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
aggaacccct agtgatggag 20
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
ttggccactc cctctctgcg cgctdgctcg ctcactgagg c 41
<210> 3
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<212> DNA
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<223> 合成的构建体
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cgcccgggc 9
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<223> 合成的构建体
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gcccgggcg 9
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<212> DNA
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<223> 合成的构建体
<400> 7
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca a 41
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ctccatcact aggggttcct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165
<210> 10
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165
<210> 11
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 120
caactccatc actaggggtt cct 143
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<212> DNA
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<223> 合成的构建体
<400> 12
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 120
caactccatc actaggggtt cct 143
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
cgcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120
ct 122
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
aggaacccct agtgatggag ctccatcact aggggttcct 40
<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 115
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120
ggggttcct 129
<210> 17
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<212> DNA
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<223> 合成的构建体
<400> 17
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctcgcagag agggagtggc caactccatc 60
actaggggtt cct 73
<210> 18
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg ggttcct 107
<210> 19
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<400> 19
ttacccctag tgatggag 18
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ctccatcact aggggtaa 18
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gccatacctc tagtgatgga g 21
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ctccatcact agaggtatgg c 21
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gggcaaacct agatgatgga g 21
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ctccatcatc taggtttgcc c 21
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tacaaaacct ccttgcttga gagtgtggca 30
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tgccacactc tcaagcaagg aggttttgta 30
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aggaacccct agtgatggag 20
<210> 28
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<212> DNA
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<223> 合成的构建体
<400> 28
ctccatcact aggggttcct 20
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
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<223> 合成的构建体
<400> 29
cgcggtaccc ctagtgatgg ac 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
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<400> 30
ctccatcact aggggtaccg cg 22
<210> 31
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
ggcaactcca tcactagggg taa 143
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 33
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60
agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcactagagg tatggc 146
<210> 34
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60
agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcatctaggt ttgccc 146
<210> 35
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 35
ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60
agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120
cgcgacaggg gggagagtgc cacactctca agcaaggagg ttttgta 167
<210> 36
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 36
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 37
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg taccgcg 147
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 38
cgcgctaccc ctagtgatgg ag 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 39
ctccatcact aggggtagcg cg 22
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 40
cgcgattacc cctagtgatg gag 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 41
ctccatcact aggggtaatc gcg 23
<210> 42
<211> 6100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 42
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcggtaccgg 720
atccagatct caattgacgc gtcccggggc taccttaaga gagcgcgtat ttaaatcgct 780
accttaggac cgttatagtt atcgactgaa ttgccgcagg aacccctagt gatggagttg 840
gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt 900
cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 960
aactccatca ctaggggttc ctgcggcccg cgccattacc ctgttatccc taatttaaat 1020
ctcgatgcta ccttaagaga ggatatcccc ggtcagaagc catagagccc accgcatccc 1080
cagcatgcct gctattgtct tcccaatcct cccccttgct gtcctgcccc accccacccc 1140
ccagaataga atgacaccta ctcagacaat gcgatgcaat ttcctcattt tattaggaaa 1200
ggacagtggg agtggcacct tccagggtca aggaaggcac gggggagggg caaacaacag 1260
atggctggca actagaaggc acagtcgagg ctgatcagcg ggtttaaact tacttgtaca 1320
gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa ctccagcagg accatgtgat 1380
cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg 1440
gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca 1500
cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct 1560
tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga 1620
tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc 1680
cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc 1740
gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt 1800
cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt ggtcacgagg gtgggccagg 1860
gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg taggtggcat 1920
cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga 1980
ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt gctcaccatg gtggcgagct 2040
agactatgcg gccgctagtg tacaccaacc tgtcaggaga ggaaagagaa gaaggttagt 2100
acaattgtct agagccgccg gtcacacgcc agaagccgaa ccccgccctg ccccgtcccc 2160
cccgaaggca gccgtccccc cgcggacagc cccgaggctg gagagggaga aggggacggc 2220
ggcgcggcga cgcacgaagg ccctccccgc ccatttcctt cctgccggcg ccgcaccgct 2280
tcgccccgcg cccgctagag ggggtgcggc ggcgcctccc agatttcggc tccgcacaga 2340
tttgggacaa aggaagtccc tgcgccctct cgcacgatta ccataaaagg caatggctgc 2400
ggctcgccgc gcctcgacag ccgccggcgc tccgggggcc gccgcgcccc tcccccgagc 2460
cctccccggc ccgaggcggc cccgccccgc ccggcacccc cacctgccgc caccccccgc 2520
ccggcacggc gagccccgcg ccacgccccg tacggagccc cgcacccgaa gccgggccgt 2580
gctcagcaac tcggggaggg gggtgcaggg ggggttgcag cccgaccgac gcgcccacac 2640
cccctgctca cccccccacg cacacacccc gcacgcagcc tttgttcccc tcgcagcccc 2700
ccccgcaccg cggggcaccg cccccggccg cgctcccctc gcgcacactg cggagcgcac 2760
aaagccccgc gccgcgcccg cagcgctcac agccgccggg cagcgcggag ccgcacgcgg 2820
cgctccccac gcacacacac acgcacgcac cccccgagcc gctccccccg cacaaagggc 2880
cctcccggag cccctcaagg ctttcacgca gccacagaaa agaaacaagc cgtcattaaa 2940
ccaagcgcta attacagccc ggaggagaag ggccgtcccg cccgctcacc tgtgggagta 3000
acgcggtcag tcagagccgg ggcgggcggc gcgaggcggc ggcggagcgg ggcacggggc 3060
gaaggcagcg tcgcagcgac tccccgcccg ccgcgcgctt cgctttttat agggccgccg 3120
ccgccgccgc ctcgccataa aaggaaactt tcggagcgcg ccgctctgat tggctgccgc 3180
cgcacctctc cgcctcgccc cgccccgccc ctcgccccgc cccgccccgc ctggcgcgcg 3240
cccccccccc ccccccgccc ccatcgctgc acaaaataat taaaaaataa ataaatacaa 3300
aattgggggt ggggaggggg gggagatggg gagagtgaag cagaacgtgg ggctcacctc 3360
gaccatgtta atagcgatga ctaatacgta gatgtactgc caagtaggaa agtcccataa 3420
ggtcatgtac tgggcataat gccaggcggg ccatttaccg tcattgacgt caataggggg 3480
cgtacttggc atatgataca cttgatgtac tgccaagtgg gcagtttacc gtaaatactc 3540
cacccattga cgtcaatgga aagtccctat tggcgttact atgggaacat acgtcattat 3600
tgacgtcaat gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta ccgtaagtta 3660
tgtaacgcgg aactccatat atgggctatg aactaatgac cccgtaattg attactatta 3720
ataactagtc aataatcaat gtcaacgcgt atatctggcc cgtacatcgc gaagcagcgc 3780
aaaacgccta accctaagca gattcttcat gcaacccggg tctagaagct tctcgaggcg 3840
gccgcgaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc 3900
agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 3960
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 4020
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 4080
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 4140
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 4200
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 4260
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 4320
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 4380
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 4440
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 4500
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 4560
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 4620
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 4680
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4740
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 4800
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4860
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4920
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 4980
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5040
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5100
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 5160
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5220
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5280
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5340
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5400
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5460
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 5520
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 5580
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5640
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5700
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5760
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5820
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5880
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 5940
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6000
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6060
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 6100

Claims (129)

1.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码治疗性替代蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
2.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
3.如权利要求2所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
4.如权利要求3所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
5.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏免疫原性细菌特征。
6.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏RNA聚合酶停滞位点。
7.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含基本上没有CpG岛的启动子。
8.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白分泌到血液中。
9.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
10.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
11.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
12.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合的。
13.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
14.如权利要求13所述的DNA载体，其中所述DNA载体是共价闭合且超螺旋的。
15.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白适用于治疗眼部障碍。
16.如权利要求15所述的DNA载体，其中所述眼部障碍是视网膜营养不良。
17.如权利要求16所述的DNA载体，其中所述视网膜营养不良选自由以下组成的组：斯塔加特病、莱伯氏先天性黑蒙LCA、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
18.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述治疗性替代蛋白适用于治疗凝血障碍。
19.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
20.如权利要求18所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
21.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
22.如权利要求21所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段。
23.如权利要求21或22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白结合TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素、胰岛素样生长因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、β淀粉样蛋白、碱性磷酸酶、淀粉样蛋白A、CCR4、叶酸受体、粘蛋白5AC、PCSK-9、磷脂酰丝氨酸或骨硬化蛋白。
24.如权利要求22所述的DNA载体，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、双特异性抗体或抗原结合片段。
25.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
26.如权利要求1所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
27.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
28.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述酶是表观遗传调节剂。
29.如权利要求28所述的DNA载体，其中所述表观遗传调节剂是组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、DNA甲基转移酶或DNA去甲基化酶。
30.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述生长因子是BDNF、CNTF、CSF、EGF、FGF、G-SCF、M-CSF、GM-CSF、NGF、PDGF、PEDF、TGF、VEGF、促性腺激素或胰岛素样生长因子。
31.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述白介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或IL-21。
32.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述干扰素是IFN-α或IFN-γ。
33.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述凝血因子是因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯·维勒布兰德因子。
34.如权利要求27所述的DNA载体，其中所述神经保护因子选自由以下组成的组：神经营养因子、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.β.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-肌动蛋白、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9和NPG10。
35.如权利要求34所述的DNA载体，其中所述神经营养因子选自由以下组成的组：NGF、BDNF、NT-3、NT-4和CNTF。
36.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包括与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA载体缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
37.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是眼部障碍，所述眼部障碍是视网膜营养不良。
38.如权利要求37所述的DNA载体，其中所述障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
39.如权利要求38所述的DNA载体，其中所述孟德尔遗传性视网膜营养不良选自由以下组成的组：莱伯氏先天性黑蒙LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、和瓦格纳综合征。
40.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是CD40、CD40L、CD46、XCL1、MDA-7、IL-12、IL-24或OPCML(阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子)。
41.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述障碍是癌症并且所述异源基因是肿瘤抑制基因。
42.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码细胞内蛋白质的基因。
43.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码分泌的激素或发育信号的受体或信号转导器的基因，所述分泌的激素或发育信号抑制细胞增殖。
44.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码检查点控制蛋白的基因。
45.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码促凋亡蛋白的基因。
46.如权利要求41所述的DNA载体，其中所述肿瘤抑制基因是编码DNA修复蛋白的基因。
47.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
48.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于编码纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子X、因子XI、因子XIII或参与其翻译后修饰的酶或参与维生素K代谢的酶的基因中的突变。
49.如权利要求36或48所述的DNA载体，其中所述凝血障碍的特征在于FGA、FGB、FGG、F2、F5、F7、F10、F11、F13A、F13B、LMAN1、MCFD2、GGCX或VKORC1中的突变。
50.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
51.如权利要求50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。
52.如权利要求50所述的DNA载体，其中所述神经退行性疾病是中枢神经系统CNS的自身免疫性疾病。
53.如权利要求52所述的DNA载体，其中CNS的所述自身免疫性疾病是多发性硬化、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳病或视性眼阵挛肌阵挛综合征。
54.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、脊髓损伤、中枢神经系统障碍、神经精神障碍或离子通道病。
55.如权利要求54所述的DNA载体，其中所述离子通道病是癫痫或偏头痛。
56.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是焦虑障碍、情绪障碍、儿童心理障碍、认知障碍、精神分裂症、物质相关障碍或进食障碍。
57.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述神经障碍是脑梗塞、中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤的症状。
58.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述溶酶体贮积障碍选自由以下组成的组：泰-萨克斯病、戈谢病、法布里病、庞贝病、尼曼-皮克病和粘多糖贮积症MPS。
59.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是退行性心脏病、冠状动脉疾病、局部缺血、心绞痛、急性冠状动脉综合征、外周血管疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病或动脉粥样硬化。
60.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述心血管障碍是选自由以下组成的组的退行性心脏病：缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷。
61.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述免疫障碍是自身免疫性障碍。
62.如权利要求61所述的DNA载体，其中所述自身免疫性障碍是1型糖尿病、多发性硬化、类风湿关节炎、狼疮、脑脊髓炎、副肿瘤综合征、自身免疫性内耳疾病、或视性眼阵挛肌阵挛综合征、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病变、视神经脊髓炎、银屑病关节炎、银屑病、重症肌无力、慢性莱姆病、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、外周神经病变、纤维肌痛、桥本甲状腺炎、溃疡性结肠炎、或川崎病。
63.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述疾病是选自由以下组成的组的肝病：肝炎、阿拉吉尔综合征、胆道闭锁、肝癌、肝硬化、囊肿病、卡罗利综合征、先天性肝纤维化、脂肪肝、半乳糖血症、原发性硬化性胆管炎、酪氨酸血症、糖原贮积病、威尔逊病、和内分泌缺乏症。
64.如权利要求63所述的DNA载体，其中所述肝病是选自由以下组成的组的肝癌：肝细胞增生、肝细胞腺瘤、局灶性结节性增生或肝细胞癌。
65.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述癌症是血癌或实体组织癌。
66.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述血癌是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。
67.如权利要求65所述的DNA载体，其中所述实体组织癌是肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌或脑癌。
68.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述异源基因编码转录因子。
69.如权利要求36所述的DNA载体，其中所述转录因子是TSHZ2、HOXA2、MEIS2、HOXA3、HAND2、HOXA5、TBX18、PEG3、GLI2、CLOCK、HNF4A、VHL/HIF、WT-1、GSK-3、SPINT2、SMAD2、SMAD3或SMAD4。
70.如权利要求1-69中任一项所述的DNA载体，其中所述障碍是隐性遗传障碍。
71.如权利要求1-70中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在选自由以下组成的组的靶细胞中可表达：肝细胞、视网膜细胞、干细胞、神经细胞、肌肉细胞或血细胞。
72.如权利要求1-71中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因在有丝分裂后靶细胞中可表达。
73.如权利要求71或72所述的DNA载体，其中所述靶细胞是选自由以下组成的组的神经细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞。
74.如权利要求1-73中任一项所述的DNA载体，其中所述治疗性蛋白质被分泌到血液中。
75.如权利要求1-74中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体在所述一个或多个异源基因上游包含启动子序列。
76.如权利要求1-75中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体在所述一个或多个异源基因下游包含聚腺苷酸化位点。
77.如权利要求1-76中任一项所述的DNA载体，其中所述一个或多个异源基因包含反式剪接分子或其一部分(例如，结合结构域)。
78.如权利要求1-77中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含末端重复序列。
79.一种分离的环状DNA载体，所述分离的环状DNA载体包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA载体：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
80.如权利要求79或66所述的DNA载体，其中所述治疗性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或CRISPRi分子。
81.如权利要求79或80所述的DNA载体，其中所述末端重复序列的长度为至少10bp。
82.如权利要求79-81中任一项所述的DNA载体，其中所述末端重复序列是DD元件。
83.如权利要求1-82中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含自杀基因。
84.如权利要求1-83中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体缺乏细菌质粒DNA。
85.如权利要求1-79中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
86.如权利要求1-85中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体：
(a)缺乏免疫原性细菌特征；
(b)缺乏RNA聚合酶停滞位点；和/或
(c)基本上没有CpG岛。
87.如权利要求1-86中任一项所述的DNA载体，其中所述异源基因的长度大于4.5Kb。
88.如权利要求1-87中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是双链的。
89.如权利要求1-88中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是单体的。
90.如权利要求1-89中任一项所述的DNA载体，其中所述DNA载体是超螺旋的。
91.一种组合物，所述组合物包含多个如权利要求1-90中任一项所述的DNA载体。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述多个所述DNA载体中的至少50％包含一个或多个未甲基化的GATC序列、一个或多个未甲基化的CCAGG序列和/或一个或多个CCTGG序列。
93.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码治疗性蛋白质的异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
94.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码抗原结合蛋白的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
95.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含编码酶、生长因子、激素、白介素、干扰素、细胞因子、抗凋亡因子、抗糖尿病因子、凝血因子、抗肿瘤因子、肝脏分泌蛋白或神经保护因子的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
96.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含与选自由眼部障碍、肝障碍、神经障碍、免疫障碍、癌症、心血管障碍、凝血障碍、溶酶体贮积障碍或2型糖尿病组成的组的障碍相关的一个或多个异源基因，其中所述DNA分子缺乏：
(a)复制起点和/或抗药性基因；以及
(b)重组位点。
97.一种分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含多个相同的扩增子，其中所述多个相同的扩增子中的每一个包含一个或多个治疗性核酸，其中所述DNA分子：
(a)缺乏复制起点和/或抗药性基因；
(b)缺乏重组位点；以及
(c)包含末端重复序列。
98.如权利要求93-97中任一项所述的分离的线性DNA分子，所述分离的线性DNA分子包含限制酶位点。
99.如权利要求98所述的分离的线性DNA分子，其中所述限制酶位点位于所述异源基因和末端重复序列之间。
100.一种产生如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因的分离的DNA载体。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述AAV基因组包含末端重复序列。
102.如权利要求100或101所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
103.一种产生如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和末端重复序列；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含末端重复序列的质粒克隆；
(vi)消化包含所述末端重复序列的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述末端重复序列的分离的DNA载体。
104.如权利要求100-103中任一项所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
105.如权利要求100-104中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
106.一种产生如权利要求1-71中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因的所述分离的DNA载体。
107.如权利要求106所述的方法，所述方法进一步包括对包含所述异源基因的所述分离的DNA载体进行柱纯化以从所述分离的DNA载体中纯化超螺旋DNA。
108.如权利要求106或107所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
109.如权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
110.一种产生如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生多个AAV基因组；以及
(iv)允许所述多个AAV基因组中的每一个自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
111.一种产生如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体的方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用第一聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生第一线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述第一线性多联体以产生第一AAV基因组；
(iv)将所述第一AAV基因组克隆到质粒载体中；
(v)鉴定包含DD元件的质粒克隆；
(vi)消化包含所述DD元件的质粒克隆以产生第二AAV基因组；
(vii)允许所述第二AAV基因组自连接以产生环状DNA模板；
(viii)使用第二聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述环状DNA模板以产生第二线性多联体；
(ix)使用限制酶消化所述第二线性多联体以产生第三AAV基因组；以及
(x)允许所述第三AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的分离的DNA载体。
112.如权利要求110或111所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
113.如权利要求110-112中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
114.一种产生如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体的无细胞方法，所述方法包括：
(i)提供包含环状DNA载体的样品，所述环状DNA载体包含AAV基因组，其中所述AAV基因组包含所述异源基因和DD元件；
(ii)使用聚合酶介导的滚环扩增来扩增所述AAV基因组以产生线性多联体；
(iii)使用限制酶消化所述多联体以产生AAV基因组；以及
(iv)允许所述AAV基因组自连接以产生包含所述异源基因和所述DD元件的治疗性DNA载体。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述聚合酶介导的滚环扩增是等温滚环扩增。
116.如权利要求114或115所述的方法，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
117.一种在有需要的受试者中诱导异源基因的附加型表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体或如权利要求91或92所述的组合物。
118.一种治疗受试者的障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-90中任一项所述的分离的DNA载体或如权利要求91或92所述的组合物。
119.如权利要求117或118所述的方法，其中重复施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
120.如权利要求117或118所述的方法，其中全身施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
121.如权利要求117-120中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
122.如权利要求117-120中任一项所述的方法，其中局部施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
123.如权利要求122所述的方法，其中玻璃体内施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
124.如权利要求117-123中任一项所述的方法，其中所述障碍是眼部障碍。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述眼部障碍是孟德尔遗传性视网膜营养不良。
126.如权利要求124所述的方法，其中所述眼部障碍是LCA、斯塔加特病、弹性假黄瘤、视杆视锥营养不良、渗出性玻璃体视网膜病变、朱伯特综合征、CSNB-1C、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、史蒂克勒氏综合征、小头畸形和脉络膜视网膜病变、色素性视网膜炎、CSNB 2、厄舍综合征、或瓦格纳综合征。
127.如权利要求117-126中任一项所述的方法，其中全身施用所述分离的DNA载体或所述组合物。
128.如权利要求127所述的方法，其中该障碍是凝血障碍。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述凝血障碍是血友病、冯·维勒布兰德疾病、因子XI缺乏症、纤维蛋白原障碍或维生素K缺乏症。
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