AT412400B - Minicircle-herstellung - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Plasmid, welches die folgenden funktionellen Einheiten umfasst: - einen prokaryontischen Replikationsursprung - eine Markersequenz 5 - zwei spezifische Rekombinase-Erkennungssequenzen und - eine multiple Klonierungsstelle, als auch ein Kit zur Herstellung eines therapeutisch brauchbaren Proteins, einen Minicircle, eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutisch brauchbaren Proteins. io Die Anwendung von effizienten Abgabesystemen für DNA-Impfstoffe oder somatischen Gentransfer ist im modernen Impfstoffdesign wünschenswert. Daher werden viele Anwendungsweisen und Formulierungen untersucht, um optimale Abgabe von Plasmid-DNA für Gentransfer sicherzustellen. Beispiele sind kationische Liposome, kationische Poly-L-lysine, Polyethytenamin, polymere Vesikel, bloße DNA allein und mikrobielle Träger wie Viren, denen es an Replikation mangelt. 15 Jedoch hat für Gentransfer und DNA-Impfungen verwendete Plasmid-DNA den Nachteil, dass sie einen Antibiotika-Resistenzmarker und einen bakteriellen Replikationsursprung trägt, welche als Folge von klinischer Verwendung in die Umgebung ausgeschüttet werden können. Aufgrund dieser Streuung von rekombinierter bakterieller DNA können endogene Enterobacteriacae sich die DNA aneignen, was zu Replikation und weiterer unkontrollierter Verbreitung der Antibiotika-20 Resistenzgene zwischen unterschiedlichen Arten und Gattungen führt (horizontaler Gentransfer). Daher sind Anstrengungen unternommen worden, dieses biologische Sicherheitsproblem zu überwinden.

Minicircle-DNA für nicht-viralen Gentransfer ist beschrieben worden, welche nur die therapeutische Expressionskassette enthält. Ferner ist gezeigt worden, dass jene Minicirdes neben ihren 25 Vorteilen für biologische Sicherheit aufgrund der geringen Größe verbesserte Eigenschaften hinsichtlich Gentransfer und biologischer Verfügbarkeit zeigen (Darquet, A.M. et al., 1997, A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle; Gene Ther. 4:1341-9; Darquet, A.M. et al., 1999, Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer; Gene Ther. 6:209-18). Solche Minicirdes können aus in vivo Herangehensweisen hergeleitet werden, wo eine 30 Rekombinase wie die Bakteriophagen λ Int-Integrase, die Cre-Rekombinase von Bakteriophagen P1 oder die ParA-Resolvase entsprechende kurze Sequenzen erkennt und zwischen ihnen kodierte DNA-Sequenzen ausschneidet. Falls sich der Replikationsursprung und das Antibiotika-Resistenzgen zwischen den Rekombinase-Erkennungssequenzen befindet, teilt die Rekombinase das ursprüngliche Plasmid in zwei Teile: ein replikatives Miniplasmid und einen Minicircle, welcher 35 nur die Sequenzen trägt, die von Interesse sind. In vitro Verfahren sind für die Herstellung von Minicircle-DNA ebenfalls verfügbar, wie Restriktionsdigestion, gefolgt von Ligation. Jedoch wären diese Verfahren extrem teuer und sehr schwer auf einen Maßstab zur industriellen Verwendung zu bringen. Im Gegensatz zu der Herangehensweise in vitro ist die Rekombination in vivo einfach, preiswert und erfordert nur, dass eine Rekombinase in ausreichenden Mengen induziert wird. 40 In Bigger et al. (2001, An araC-controlIed Bacterial cre Expression System to Produce DNA Minicircle Vectors for Nuclear and Mitochondrial Gene Therapy, J. Biol. Chem. 276:23018-27) werden Minicirdes hergestellt, welche nur Genexpressionselemente umfassen, wobei ein ursprüngliches Plasmid, welches einen Replikationsursprung, eine eukaryontische Expressionskassette, eine Markersequenz und zwei loxP sites als Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, 45 in eine Bakterie transfiziert wird, welche rekombinant ist für die Cre-Rekombinase, eine Bakteriophagen P1 abgeleitete Integrase, welche site-spezifische Rekombination zwischen direkten Wiederholungen von 34 Basenpaaren (loxP sites) katalysiert. Nach Expression der Cre-Rekombinase wird das Ursprungsplasmid in ein Minipiasmid und einen Minicircle geteilt, wobei besagter Minicircle nur die eukaryontische Expressionskassette umfasst. Die sich ergebenden so Plasmidprodukte werden spezifischen Restriktionsenzymen unterworfen, welche das Miniplasmid schneiden, aber nicht den Minidrcle. Nicht-digerierter supercoiled Minicirde kann dann von dem linearen Ursprungsplasmid und ausgeschnittenen Miniplasmid an einem Cäsiumchlorid-Gradienten unter Verwendung des interkalierenden Wirkstoffs Ethidiumbromid Dichte-getrennt werden. Um die Expressionskassette des Minicirdes innerhalb von Säugetierzellen zu testen, wurde der Minicircle 55 zusammen mit LipofedAMINE in die Zellen transfiziert. Es wird erwähnt, dass besagtes eingesetz- 2

AT 41 2 400 B tes Cre-vermitteltes Rekombinationssystem eine minimale Konstruktgröße ergab, welche mit Phage λ Integrase-vermittelter Rekombination vergleichbar ist, was zu Minicircles mit höherer Transfektionseffizienz führt.

In Darquet et al. (1997, A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. 5 Gene Ther. 4:1341-9) wird die Herstellung von Minicircles beschrieben, welche nur die Expressionskassette umfassen. Hier wird das Ursprungsplasmid in ein Bakterium transfiziert, welches für die Phage λ Integrase rekombinant ist, welche die Rekombination des Plasmids in Miniplasmid in Minicircle vermittelt. Die Plasmidprodukte wurden mit Restriktionsenzymen digeriert, welche lineares Miniplasmid und Ursprungsplasmid herstellen und den Minicircle supercoiled lassen, welcher io an Dichtegradienten gereinigt wurde. Jedoch wird erwähnt, dass die Ausbeute an nicht-rekombiniertem Plasmid etwa 40% des Ausgangsmaterials war. Es wird vorgeschlagen, die Rekombinationsausbeute zu verbessern, welche nahe 100% sein müsste, zum Beispiel durch Optimieren der Kulturbedingungen der rekombinanten Bakterien und durch Überexprimieren der Integrase. 15 Kreiss et al. (1998, Production of a new DNA vehicle for gene transfer using site-specific re-combination. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:560-7) betrifft die Herstellung von Minicircles, welche durch Rekombination eines Ursprungsplasmids hergestellt werden, angetrieben durch eine Bakteriophagen λ Integrase, welche in den Bakterien vorhanden ist, in welche das Ursprungsplasmid transfiziert wird. Jedoch wurden Minicircle-Multimere ebenfalls hergestellt und umfassten bis zu 20 30% aller synthetisierten Minicircles. Um die Minicircle-Produktionseffizienz zu erhöhen, wurde parABCDE'-Locus von Plasmid RK2 in das Minicircle-Fragment eingeführt und ein paraA-Gen, welches für eine Resolvase kodiert, die die Rekombination an einer Multimer resolution site im parABCDE'-Locus katalysiert, wurde ebenfalls in die Bakterien eingeführt. Die parA-Resolvase führte zusammen mit dem parABCDE'-Locus zur Herstellung von Minicircle-Dimeren von weniger 25 als 2% aller Minicircles. Jedoch wird hier ebenfalls erwähnt, dass die Effizienz der Minidrcle-Herstellung weiter gesteigert werden muss und es wird vorgeschlagen, die Reinigung des Minicircle von nicht gelöstem Plasmid und Miniplasmid zu verbessern.

Darquet et al. (1999, Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6:209-18) betrifft die Herstellung von Minicircle, wobei ein Verfahren beschrieben 30 wird, welches die Minicircle-Produktionseffizienz verbessern sollte: Das Ursprungsplasmid wird in eine Bakterie transfiziert, welche ein Gen für die Phagen λ Integrase umfasst, welches die Rekombination an den attP/attB sites katalysiert, welche an dem Ursprungsplasmid vorhanden sind, um Minicircle und Miniplasmid herzustellen. Die Minicircles umfassen eine Genexpressionskassette unter Verwendung eines starken humanen Cytomegalovirus sehr frühen (immediate-early) Ver-35 stärkers/Promotors. Die Plasmidproduktionen wurden mit Restriktionsenzymen digeriert, welche nur das Miniplasmid und das nicht-rekombinierte Plasmid schneiden, aber nicht den entsprechenden Minicircle. Supercoiled Minicircles wurden dann durch CsCI-Ethidiumbromid- Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Es wurde gefunden, dass die Minicircles, welche die spezifischen Promotoren umfassen, bessere Ergebnisse mit starker Genexpression im Vergleich mit nicht-40 rekombiniertem Plasmid oder größeren Plasmiden produzierten.

Jedoch ist der Nachteil der Verfahren gemäß den oben erwähnten Dokumenten die niedrige Effizienz der Minicircle-Produktion im Vergleich zu Ursprungsplasmiden. Dieses Problem ist in den obigen Dokumenten diskutiert worden, jedoch wurde eine Produktion von Minicircles nahe 100% nicht erreicht. Daher gibt es einen Bedarf für ein Plasmid, aus welchem nahe 100% Minicircle 45 hergestellt werden kann, als auch für ein Verfahren für solch eine hochgradig effiziente Minidrde-Herstellung.

Die WO 02/083889 A2 betrifft ein Plasmid, mit dem nach Einwirken einer spezifischen Rekom-binase ein Minicircle und ein Miniplasmid hergestellt werden, wobei der Minidrde lediglich eine gewünschte DNA-Sequenz umfasst, nicht jedoch die restlichen Regulator-Sequenzen; diese sind so auf dem Miniplasmid vorhanden. Dabei wird die Rekombinase „von außen“ zur Verfügung gestellt, d.h., dass das Plasmid in der die Rekombinase exprimiert wird.

Die WO 96/00282 A1 betrifft die Expression von Genen in Streptomyces-Stämmen, wobei eine Expressions-Kassette offenbart wird, die zwar unter anderem ein Minicircle aufweist, dieser Minicircle ist jedoch definiert als Integrationselement, das aus Streptomyces coelicolor stammt und 55 dazu dient, die Insertion des Vektors in das Streptmyces-Genom zu leiten. 3

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Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Konstruktion eines Plasmids, welches in dem Verfahren für die Herstellung eines Minicircles verwendet wird, wobei ein hohe Effizienz in der Minicircle-Herstellung erhalten wird.

Dieses Ziel wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch ein Plasmid der eingangs angeführ-5 ten Art gelöst, wobei es weiters ein Gen, welches für eine sequenzspezifische Rekombinase kodiert, umfasst, wobei die Einheiten derart auf dem Plasmid angeordnet sind, dass das Plasmid bei Expression der sequenzspezifischen Rekombinase in ein Miniplasmid und einen Minicircle geteilt wird, wobei besagtes Miniplasmid den prokaryontischen Replikationsursprung, die Markersequenz und das Gen für die sequenzspezifische Rekombinase umfasst und besagter Minicircle die multiple io Klonierungsstelle umfasst. Mit diesem Plasmid wird eine hohe Effizienz bei der Herstellung von Minicircle aufgrund der Tatsache erreicht, dass das Gen, welches für eine sequenzspezifische Rekombinase kodiert, an dem (Ursprungs-)plasmid vorhanden ist. Dies ergibt eine hohe Plasmid-Rekombination und Minicircle-Herstellung, welche unter optimalen Bedingungen bis zu 100% erreichen kann. Dies ist teilweise eine Folge der Kontrolle der Expression von Rekombinase, 15 welche sicherstellt, dass die Rekombination nicht zu früh durchgeführt wird, so dass eine Begrenzung der Herstellung von Minicircle nicht stattfindet. Ein weiterer Grund für die Effizienzsteigerung der Minicircle-Herstellung im Vergleich mit dem Stand der Technik ist die Tatsache, dass das bekannte Plasmid, welches die Rekombinase enthält, welches in den Bakterien vorhanden ist, und das zweite separate Plasmid, von welchem das Miniplasmid und der Minicircle abgleitet werden, 20 häufig in unterschiedlichen Mengen in den Bakterien vorhanden sind. Daher wird in den bekannten Verfahren gemäß dem Stand der Technik die Herstellung von Minicircle häufig durch die Anzahl an Rekombinaseplasmid begrenzt. Das Plasmid der Erfindung, welches die Einheiten eines Miniplasmids und die Einheiten des Minicircles, als auch das Gen umfasst, welches für die Rekombinase kodiert, ist nach Stand der Technik noch nicht beschrieben oder geoffenbart worden. Ferner wurde 25 nach Stand der Technik auf eine Steigerung der Effizienz abgezielt, indem die bakteriellen Kulturbedingungen optimiert wurden und durch Entwickeln alternativer Verfahren für Promotor mit hoher Kopie, welche in der eukaryontischen Expressionskassette verwendet werden, welche an dem Minicircle vorhanden ist, und Verfahren für die Reinigung des Minicircle. Jedoch ein Plasmid vorzusehen, welches nicht nur die verschiedenen funktionellen Einheiten vom Minipiasmid und Mini-30 circle umfasst, sondern auch das Gen, welches für eine sequenzspezifische Rekombinase kodiert, ist nach Stand der Technik nicht erwähnt oder offensichtlich gemacht worden.

Natürlich kann das Plasmid der Erfindung weitere regulatorische und funktionelle Einheiten umfassen, jedoch sind die oben definierten Einheiten das Minimum für eine effiziente Herstellung von Minicircle. 35 Der prokaryontische Replikationsursprung und eine Markersequenz sind für die Herstellung des Plasmids in zum Beispiel Bakterien nötig. Es sind dem Fachmann verschiedene prokaryontische Replikationsursprünge bekannt, welche in der Lage sein werden, entsprechend der Bakteri-enkuitur, der Kulturbedingungen und der Art des Plasmids den optimalen prokaryontischen Replikationsursprung auszuwählen. Die Markersequenz kann jede der gut bekannten Sequenzen sein, 40 welche verwendet werden, weil sie in der Lage sind, Bakterien nachzuweisen, welche das Plasmid umfassen, oder das Wachstum von Bakterien zu kontrollieren, welche das Plasmid umfassen, im Vergleich zu Bakterien, welche nicht mit dem fraglichen Plasmid transfiziert worden sind. Zum Beispiel können Antibiotika-Resistenzgene, Schwermetailresistenzen, auxotrophe Selektionsmarker, Gene, welche eine für das bakterielle Wachstum notwendige Substanz produzieren usw. 45 verwendet werden.

Der Begriff „Gen, welches für eine sequenzspezifische Rekombinase kodiert“ betrifft alle Sequenzen, welche für die Expression der Rekombinase nötig sind, z.B. einen Promotor, Terminationssequenz usw. Die Rekombinase selbst kann jede Rekombinase sein, welche in der Lage ist, die Rekombination des Ursprungsplasmids in Miniplasmid und getrennten Minicircle an definierten 50 Erkennungssequenzen zu katalysieren.

Der Begriff „zwei spezifische Rekombinase-Erkennungssequenzen“ betrifft Sequenzen, welche durch die Rekombinase erkannt werden. Die Tatsache, dass zwei Erkennungssequenzen vorhanden sind bedeutet, dass die Erkennungssequenzen derart auf einem Plasmid angeordnet sein müssen, dass die Rekombinase die Herstellung eines Miniplasmids und eines Minicircles kataly-55 siert. Natürlich ist es möglich, dass die Erkennungssequenzen von einer Erkennungssequenz 4

AT 412 400 B abgeleitet werden, in welche zum Beispiel eine Klonierungsstelle insertiert wird, was bedeutet, dass tatsächlich die Sequenzen, welche durch die Rekombinase erkannt werden, die multiple Klonierungsstelle flankieren sollten, was dann den Minicircle vorsehen wird. Natürlich ist es möglich, dass der hergestellte Minicircle mindestens einen Teil der einen und/oder der anderen Erken-s nungssequenz umfasst.

Der Begriff „multiple Klonierungsstelle“ betrifft eine site, welche mindestens 2 sites für Restriktionsenzyme umfasst, jedoch umfasst sie vorzugsweise eine Anzahl an sites für verschiedene Restriktionsenzyme.

Wie nach Stand der Technik bekannt, umfasst der hergestellte Minicircle nur die multiple Klo-io nierungsstelle ohne irgendwelche der prokaryontischen Regulationseinheiten, z.B. den prokaryon-tischen Replikationsursprung, die Markersequenz und ohne das Gen, welches für die spezifische Rekombinase kodiert. Dadurch wird die Herstellung eines kleinen Minicircles erreicht, wobei je kleiner der Minicircle, desto effizienter ist die Aufnahme zum Beispiel in die Säugetierzellen.

Vorzugsweise wird ein Gen, welches für ein spezifisches Protein kodiert, vorzugsweise ein the-15 rapeutisch brauchbares Protein, in die multiple Klonierungsstelle insertiert. Da der Minicircle hauptsächlich für therapeutische Zwecke verwendet werden wird, wird die multiple Klonierungsstelle vorzugsweise ein Gen umfassen, welches für ein therapeutisch brauchbares Protein kodiert. Jedoch ist es selbstverständlich möglich, jedes Gen zu insertieren, welches für irgendein Protein kodiert, in welchem Fall der Minicircle für Nachweisverfahren, biochemische Pathway-Studien usw. 20 verwendet werden kann.

Noch bevorzugter umfasst das Plasmid ferner eine Minicircle- und/oder eine Miniplasmid-Identifikationssequenz zur Identifikation und Isolation des Minicircles. Die Identifikationssequenz sieht einen effizienten Weg vor, den Minicircle von dem Miniplasmid zu trennen, was die Effizienz der Minicircle-Herstellung weiter erhöht. Die Minicircle- oder Miniplasmid-Identifikationssequenz ist 25 jede Sequenz, welche an dem Minicircle und nicht an dem Miniplasmid (oder umgekehrt) vorhanden sein wird und welche die Identifikation und Isolation des Minicircles (oder die Entfernung des Miniplasmids) erlauben wird. Die Beschreibung unten wird sich auf Minicircle-Identifikationssequenzen konzentrieren, aber wird ebenfalls auf Miniplasmid-Identifikationssequenzen oder die Gegenwart von beiden, Minicircle- und Miniplasmid-30 Identifikationssequenzen, anwendbar sein. Dies kann eine spezifische Sequenz sein, welche sich an einen gegebenen Liganden bindet, so dass ein Minicircle mit dem Liganden komplexiert werden wird, wonach der Komplex von dem Miniplasmid, zellulären Bestandteilen usw. z.B. durch Immobilisierung des Liganden getrennt werden wird.

Falls das in vivo hergestellte Gemisch aus Minicircle und Miniplasmid durch Interaktionschro-35 matographie getrennt werden sollte, sollte eines der zwei DNA-Moleküle die spezifische Erkennungssequenz haben. Um Trennung zu erreichen, kann die Erkennungssequenz prinzipiell in dem Minicircle oder Miniplasmid integriert sein. Falls die Erkennungssequenz in dem Miniplasmid integriert ist, können nur die Zielsequenz und die Res-site (das Produkt der Rekombination zwischen res1 und res2 site) an dem Minicircle gefunden werden. In diesem Verfahren befindet sich die 40 Minicircle-DNA in dem Eluat der Affinitätschromatographie, während die Miniplasmid-DNA an die Matrix gebunden wird (die Miniplasmid-DNA kann dann zum Beispiel durch Erhöhen der Temperatur von <30°C auf £42°C aus der Säule eluiert werden; dadurch wird die Säule regeneriert und ein neuer Reinigungsprozess beginnt). Zur Reinigung der Minicircle-DNA sollte das Eluat auf eine folgende Säule aufgetragen werden. Diese Säule kann zum Beispiel eine Säule mit einer lonen-45 austauschmatrix oder einer Matrix für hydrophobe Interaktionschromatographie, bzw. für Größenexklusionschromatographie usw. sein. Im Prinzip kann jedes Chromatographieverfahren eingesetzt werden, welches zum Isolieren von DNA-Molekülen verwendet wird.

In Kombination mit der Immobilisierung der Minidrcle-DNA und der nachfolgenden Protein E vermittelten Lysis bietet dieses Reinigungsverfahren den Vorteil, dass möglicherweise auftretende 50 Kapazitätsprobleme der Affinitätschromatographiematrix gelöst werden können. Da der größte Teil der cytoplasmatischen Moleküle (einschließlich Miniplasmid-DNA) während der Lysis in das Kulturmedium ausgestoßen wird, muss nur eine vergleichsweise kleine Anzahl an DNA-Miniplasmiden (etwa 10%) an die Matrix gebunden werden.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist die Identifikationssequenz eine Se-55 quenz, welche in der Lage ist, sich spezifisch an ein Protein zu binden, um einen stabilen 5

AT 41 2 400 B DNA-Proteinkomplex zu bilden. Der Begriff „spezifisch binden“ definiert, dass diese Identifikationssequenz nicht jede Sequenz sein darf, welche sich zufällig und unspezifisch an jedes Protein bindet, mit welchem es in Kontakt gebracht wird. Die Identifikationssequenz stellt eine spezifische Bindung an ein gewähltes Protein sicher, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden. Diese 5 Identifikationssequenz ist in der Lage, sich spezifisch an ein Protein zu binden, was die Herstellung des Minicircle aus dem Miniplasmid sicherstellt, indem der Minicircle mit dem spezifischen Protein in Kontakt gebracht wird, an welches sich die Identifikationssequenz binden wird. Für die Protein-DNA-Interaktionschromatographie werden spezifische DNA-Bindungsproteine an einer Matrix für Affinitätschromatographie immobilisiert (z.B. der Repressor von Lactose-Operon, der Repressor io des Bakteriophagen lambda oder von Bakteriophage 434 usw.). Die entsprechende Erkennungssequenz wie passend (z.B. die Operatorsequenz des Promotors des Lactose-Operons, des Pl oder PR Promotors des Bakteriophagen lambda oder entsprechende Sequenzen von Bakteriophage 434) befindet sich an dem DNA-Molekül, das sich spezifisch an diese Matrix binden sollte. Um spezifisch gebundene DNA-Moleküle von der Affinitätschromatographiematrix durch Temperatur-15 Verschiebung (Elutionspuffer mit entsprechender Temperatur) wieder abzutrennen, können thermisch instabile Mutanten der erwähnten Repressormoleküle verwendet werden. Die 'Erkennungssequenzen können durch einen spacer voneinander getrennt werden. Die spacer-Sequenz kann willkürlich (Sequenz ohne Bezug) gewählt werden und dient zum Optimieren der Interaktion zwischen dem temperaturempfindlichen Repressor und dem entsprechenden Operator. Die Trennung 20 kann durch Immobilisierung des gebildeten Komplexes, durch Trennung nach Partikelgröße, z.B. Filtration oder andere Verfahren stattfinden, welche den Fachleuten gut bekannt sind, wobei das Trennverfahren von dem gewählten Protein abhängen wird.

Noch bevorzugter ist besagte Identifikationssequenz eine lac Operator site, welche sich spezifisch an ein Lacl-Repressorprotein bindet. Die lac Operator site ist eine Sequenz, welche sich an 25 ein Lacl-Repressorprotein bindet, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden, welcher dann von dem Miniplasmid getrennt werden kann. Daher wird ein effizientes System für die Herstellung und auch für die Abtrennung von Minicircles vorgesehen.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird die sequenzspezifische Rekombinase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakteriophagen lambda Int-Integrase, Cre-Rekombinase vom 30 Bakteriophagen P1 und der ParA-Resolvase. Diese Rekombinasen haben gezeigt, dass sie gute Ergebnisse bei der Herstellung von Minicircles vorsehen, wobei jede Rekombinase spezifische Merkmale zeigt. Zum Beispiel braucht das lambda-lntegrasesystem den Integrations-Wirtsfaktor zur Rekombination, die ParA-Resolvase braucht Topoisomerasen, welche in allen Bakterien vorhanden sind. Um die Rekombinationskomplexe aufzulösen, hat das Cre-vermittelte Rekombinati-35 onssystem andererseits den Vorteil, dass es eine sehr kleine Erkennungstelle, zum Beispiel nur 34 Basenpaare ergibt, und so eine minimale Konstruktstelle produziert. Der Fachmann wird die optimale Rekombinase gemäß diesen Unterschieden und ihren spezifischen Merkmalen wählen.

Vorteilhafterweise werden die spezifischen Rekombinase-Erkennungssequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lambda attachment sites (att sites) und resolution sites {res sites) 40 aus Multimer-Resolution-Systemen. Diese Erkennungssequenzen werden von der gewählten Rekombinase abhängen, so dass gemäß der für das Rekombinationssystem benötigten Merkmale der Fachmann die optimalen Erkennungssequenzen und Rekombinase auswählen wird.

Ein bevorzugtes Plasmid umfasst ferner ein regulatorisches Element für die Expression der Rekombinase. Durch Vorsehen eines regulatorischen Elements für die Expression der Rekombi-45 nase kann die Expression der Rekombinase entweder gehemmt oder herbieigeführt werden. Dies ermöglicht es, dass die Expression der Rekombinase auftritt, wenn sie notwendig ist. Mit diesem System kann das Plasmid in großen Mengen hergestellt werden, bevor die Expression der Rekombinase herbeigeführt wird, so dass eine maximale Effizienz der Minidrcle-Herstellung erreicht wird. Verschiedene regulatorische Elemente sind dem Fachmann gut bekannt und deren Wahl wird so von dem Wirt abhängen, in welchem das Plasmid in anderen Vektoren produziert wird.

Vorzugsweise umfasst das regulatorische Element für die Rekombinase einen starken Promotor. Dies erlaubt ausreichende Expression von Rekombinase, um die Rekombination der gesamten Menge des in der Probe vorhandenen Plasmids zu katalysieren, um eine maximale Ausbeute an Minicircle zu erreichen. 55 Noch bevorzugter ist das regulatorische Element ein transkriptionales Kontrollsystem eines 6

AT 41 2 400 B araB-Promotors von einem araBAD-Operon. Dieses Kontrollsystem wird Expression der Rekombi-nase solange hemmen, wie keine Arabinose in dem Kulturmedium vorhanden ist. Nach Zugabe von Arabinose, zum Beispiel L-Arabinose zu dem Kulturmedium, wird die Rekombinaseexpression herbeigeführt. Dies ist ein sehr einfaches und effizientes Verfahren zum Regulieren der Expression 5 von Rekombinase.

Vorzugsweise ist das Markergen ein Antibiotika-Resistenzgen. Dies ist ein gut bekanntes Verfahren, um die mit dem Plasmid transfizierten Bakterien, welche ein Markergen umfassen zu selektieren, um das Plasmid in hoher Kopiezahl effizient herzustellen.

Vorteilhafterweise ist der prokaryontische Replikationsursprung ein Replikationsursprung mit 10 hoher Kopiezahl, vorzugsweise von Plasmid pUC19. Wie bei dem oben erwähnten starken Promotor wird dies ein optimales Plasmid vorsehen, welches reichlich in einer Bakterie herstellt werden wird. Die Ausbeute der Minicircle-Herstellung wird durch Herstellen einer hohen Kopiezahl von Plasmid in der Bakterienzelle optimiert.

Vorzugsweise umfasst das Plasmid gemäß der Erfindung einen Replikationsursprung im Mini-15 circle. Die Erkennungssequenz für die Protein-DNA-Interaktionschromatographie kann aus Wiederholungen von Operatorsequenzen (z.B. lacOs) bestehen, welche durch einen spacer getrennt werden. Dieser spacer kann aus jeder Sequenz bestehen. Vorzugsweise ist dieser spacer ein Replikationsursprung (ori) für Bakteriophagen, spezifisch für E. coli (zum Beispiel faserförmige Bakteriophagen, wie z.B. f 1, M13, fd, icosaedrische Bakteriophagen wie z.B. ΦΧ174). Solch ein 20 Replikationsursprung dient der Herstellung von einsträngiger DNA, welche für die systematische Einführung von Mutationen in die Zielsequenz (therapeutische Sequenz oder Sequenz für Impfung) verwendet werden kann (Kunkel et al., Meth. Enzymol. 204 (1991), 125-139; Meth. Enzymol. 154 (1987), 367-382). Eine weitere Anwendung eines Bakteriophagen-Replikationsursprungs ist die Herstellung einer einsträngigen DNA (ssDNA) für Gentransfer. Mit Hilfe eines ssDNA-25 Replikationsursprungs (z.B, dem oben erwähnten faserförmigen Bakteriophagen oder dem ΦΧ174 Ursprung) kann ssDNA der Minicircle-Sequenz hergestellt werden, vorausgesetzt, dass sich der Replikationsursprung an der Minicircle-DNA befindet. Je nach verwendetem Replikationsursprung können entsprechende Hilfsfaktoren notwendig sein, um ssDNA herzustellen (z.B. Protein A in Kombination mit ΦΧ174 ori). Für die Isolation der einsträngigen DNA durch Affinitätschroma-30 tographie können ssDNA Bindungsproteine (z.B. Protein J von Bakteriophage ΦΧ174) verwendet werden, oder ssDNA-Primer komplementär zu einer Sequenz der ss-Minicircle-DNA, z.B. Res1-site. Die Anwendung von ssDNA kann zu einer weiteren Verbesserung der Gentransferkapazität von Minicircle-DNA führen (Molas et al., Biochim. Biophys. Acta 1572 (2002) 37-44).

Falls ein Bakteriophagen-Replikationsursprung in das Ausgangsplasmid integriert wird, wird er 35 sich nach Rekombination an der Minicircle-DNA befinden. Daher hat die Minicircle-DNA keinen bakteriellen Replikationsursprung sondern einen Replikationsursprung, welcher von einem nichtlysogenen Bakteriophagen stammt. Dieser Bakteriophage ist hinsichtlich biologischer Sicherheit harmlos, da dieser ohne entsprechende Hilfsfaktoren (Proteinfaktoren oder Helfer-Phagen) nicht zu Proliferation der Minicircle-DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen führt. 40 Ein weiterer Aspekt betrifft ein Kit für die Herstellung eines therapeutisch brauchbaren DNA-Moleküls, welches umfasst: - ein Plasmid gemäß der vorliegenden Erfindung und - ein Protein, welches in der Lage ist, an die Identifikationssequenz des Plasmids zu binden, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden, wobei das Protein gegebenenfalls an einen festen 45 Support immobilisiert wird. Ähnlich dem obigen Kit umfasst dieses Kit ein System zum Trennen des Minicircles von dem Miniplasmid, wobei ein Protein vorgesehen wird, an weiches sich die Identifikationssequenz des Minicircles spezifisch bindet, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden, welcher dann von dem Miniplasmid getrennt werden kann.

In beiden Fällen können der Einstrang bzw. das Protein an einem festen Support immobilisiert 50 werden, welcher zum Beispiel eine Säule, Membran, ein Objektträger, ein Filter usw. sein kann. In diesem Fall wird die Probe mit dem festen Support nach Expression der Rekombinase in Kontakt gebracht, wonach der feste Support vorzugsweise gewaschen wird, so dass nur Minicircle am festen Support verbleibt. Um isolierte Minicircles herzustellen, kann ein weiterer Elutionsschritt durchgeführt werden. 55 Vorzugsweise ist das Protein ein Lacl-Repressorprotein, vorzugsweise ein mutiertes 7

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Lacl-Repressorprotein. Dieses Protein bindet sich an das lac-Operon, welches an dem Minicircle als Identifikationssequenz vorgesehen werden kann. Dieses System sieht daher einen hochgradig effizienten Weg zum Trennen von Minicircle und Miniplasmid vor. Das Lacl-Repressorprotein kann ein Mutant sein, wobei das Protein vorzugsweise derart mutiert ist, dass die Bindung des Repres-5 sorproteins an das lac-Operon reguliert werden kann. Eine Möglichkeit ist, ein mutiertes Repressorprotein vorzusehen, welches nur bei einer bestimmten Temperatur stabil ist. Über oder unterhalb dieser Temperatur ist der Repressor-Iac-Operonkomplex nicht stabil, so dass der Minicircle vom Protein gelöst wird. Dies ist ein sehr eleganter Weg, Regulation von Immobilisierungselution von Minicircles vorzusehen. io Vorteilhaftenweise wird das Protein zur Immobilisierung an einen festen Support an ein tag fusioniert. Dies erlaubt die Verwendung von jedem gewählten Protein, da die Immobilisierung durch das tag bestimmt werden wird, so dass jeder gewählte DNA-Proteinkomplex entworfen werden kann.

Noch bevorzugter wird das Protein an ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid fusioniert. In 15 diesem Fall wird das Protein an der Membran der Bakterie immobilisiert, was die Immobilisierung des Minicircles an der Membran erlaubt. Die Bakterienmembran kann dann aufgebrochen werden, um das cytoplasmatische Material zu erhalten, welches das Miniplasmid und das aus der Bakterie ausgewogene Ursprungsplasmid umfasst. Die verbleibenden bakteriellen Phantome behalten alle strukturellen Merkmale der Zelle und die Minicircles. Dieses bakterielle Phantom ist ein hervorra-20 gender Hilfsstoff, welcher T-Zellen-Aktivierung und mukosale Immunität verstärkt.

Vorteilhafterweise umfasst das Plasmid ein Gen, welches für das Protein kodiert, welches den DNA-Proteinkomplex bildet, vorzugsweise ein Gen, welches für das Lacl-Repressorprotein kodiert. Durch Vorsehen des Gens, welches für dieses Protein kodiert, an dem selben Plasmid, vorzugsweise unter der Kontrolle des Promotors, welcher-ebenfalls die Rekombinase kontrolliert, wird die 25 effiziente Expression des Proteins sichergestellt und es ist nicht notwendig, einen zusätzlichen Weg zum Vorsehen des Proteins, zum Beispiel in der Bakterie, vorzusehen.

Vorzugsweise umfasst das Plasmid eine Sequenz, welche für ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid kodiert. Dieses Membran-Anker-Peptid kann des Protein des DNA-Proteinkomplexes sein oder ein Teil des Proteins oder es kann auch ein separates Protein sein, welches an das 30 Protein des DNA-Proteinkomplexes fusioniert wird. Das hydrophobe Membran-Anker-Protein erlaubt die Immobilisierung des DNA-Proteinkomplexes in der bakteriellen inneren Membran. Daher werden die Minicircles, sobald sie hergestellt sind, an die innere Membran der Bakterie gebunden, in welcher die Rekombinase exprimiert und das Plasmid hergestellt wurde. Der Vorteil hiervon liegt in der Tatsache, dass nicht nur die Herstellung des Minicircles in vivo stattfindet, 35 sondern auch die Trennung des Minicircles von dem Miniplasmid, zum Beispiel durch Aufbrechen der bakteriellen Membran, so dass das cytoplasmatische Material aus der Bakterienzelle ausgeworfen wird. Ein weiterer Vorteil liegt in der Tatsache, dass das sich ergebende bakterielle Phantom, welches aus der Zellwand und dem an die innere Membran gebundenen Minicircle besteht, einen effizienten Hilfsstoff darstellt, so dass der Minicircle, welcher zum Beispiel ein therapeutisch 40 brauchbares Protein umfasst, in der Form dieses bakteriellen Phantoms ohne eine weitere DNA-Extraktion oder Packungsverfahren verabreicht werden kann.

Zum Aufbrechen der bakteriellen Zelle umfasst das Kit vorzugsweise ferner ein Plasmid mit einem induzierbaren Lysis-Gen bzw. eine Kultur aus rekombinierten Bakterien, welche mit besagtem Plasmid transfiziert sind. Das induzierbare Lysis-Gen führt Lysis der Bakterien herbei, um eine 45 Zellwand aufzubrechen, wie oben erwähnt. Das Plasmid mit dem induzierbaren Lysis-Gen kann das Ursprungsplasmid sein, welches so zusätzlich die Einheiten für das Miniplasmid und den Minicircle umfasst, jedoch ist es möglich, auch ein separates Plasmid vorzusehen, entweder isoliert oder transfiziert in eine Bakterienkultur. Da das Lysis-Gen induzierbar ist, kann die Bakterie zusammen mit dem Ursprungsplasmid kultiviert werden, bis die ausreichende Anzahl an Plasmid so hergestellt ist, wonach die Expression von Rekombinase herbeigeführt werden kann. Sobald die Rekombinase den Minicircle und das Miniplasmid produziert hat, kann das Lysis-Gen aktiviert werden, um den Minicircle wie oben erwähnt abzutrennen. Dieses Kit sieht ein alles in vivo-System für eine hochgradig effiziente Herstellung von Minicircles vor.

Vorteilhafterweise ist das Lysis-Gen das Lysis-Gen E von Bakteriophage PhiX174. Von diesem 55 wird gezeigt, dass es ein optimaler Weg für die obige in vivo Minicircle-Herstellung ist. 8

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Ein vorteilhaftes Kit umfasst eine für die Expression und Funktion der Rekombinase spezifische Bakterienkultur. Da eine spezifische Rekombinase im Allgemeinen spezifische Faktoren für die Expression und Funktion der Rekombinase benötigt, ist es effizienter, die Bakterien vorzusehen, die diese Faktoren bereits umfassen, statt diese Faktoren in andere gewählten Bakterien zu-5 zugeben.

Noch bevorzugter umfasst das Kit ferner Arabinose. Dies wird in dem Fall optimal sein, wenn das Plasmid ein regulatorisches Element umfasst, welches bei Zugeben von Arabinose herbeigeführt wird, wobei die Arabinose vorzugsweise L-Arabinose ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Minicirde, welcher von einem er-io findungsgemäßen Plasmid, wie oben beschrieben, ableitbar ist, - eine multiple Klonierungsstelle und - ein Gen umfasst, welches für ein therapeutisch brauchbares Protein kodiert, insertiert in die multiple Klonierungsstelle, wobei der Minicirde an ein bakterielles Phantom über ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid gebunden ist. Auch für diesen Aspekt lassen sich die gleichen Definitionen 15 und bevorzugten Ausführungsformen wie oben erwähnt anwenden. Durch Vorsehen dieses erfinderischen Minidrdes wird ein hochgradig effizientes Werkzeug für DNA-Therapie vorgesehen, da das bakterielle Phantom ein effizienter Hilfsstoff ist.

In Anbetracht dieser Vorteile betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche den oben definierten erfinderischen Minicirde und einen 20 pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Aufgrund des bakteriellen Phantoms ist es nicht notwendig, weitere Hilfsstoffe zuzugeben, jedoch je nach Konzentration von Minidrde und der zu verabreichenden DNA ist es natürlich möglich, einen weiteren Hilfsstoff zuzugeben, als auch alle anderen zusätzlichen Substanzen, welche üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen vorhanden sind, wie Salze, Puffer, Stabilisatoren, Farbstoffe, Geschmacksstoffe usw. 25 Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines therapeutisch brauchbaren DNA-Moleküls, welches die folgenden Schritte umfasst: • Transfizieren des Plasmids gemäß der vorliegenden Erfindung in Bakterien, welche in der Lage sind, das Plasmid zu replizieren, - Kultivieren der Bakterien währenddessen die Rekombinase exprimiert wird, so dass Miniplas-30 mide und Minicircles hergestellt werden und

Isolieren der Minicircles. Auch für diesen Aspekt finden die obigen Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen Anwendung. Wie bereits oben erwähnt, erlaubt dieses Verfahren eine hochgradig effiziente Herstellung von Minicirde, was eine hohe Ausbeute, vorzugsweise bis zu 100%, ergibt. Es war mit den Verfahren gemäß dem Stand der Technik nicht möglich, dies zu 35 erreichen, wobei die hohe Ausbeute hauptsächlich Folge der Tatsache ist, dass die Rekombinase an dem Plasmid vorhanden ist, welches die Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst.

Vorzugsweise werden die Minicircles durch Verwenden der Minidrcle-Identifikationssequenz isoliert. Dies erlaubt eine Optimierung des Verfahrens und steigert die Ausbeute der Minicirde-Herstellung. Hier finden wiederum die obigen Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen 40 Anwendung.

Vorteilhafterweise werden die Minidrdes durch Immobilisierung an einen festen Support isoliert, vorzugsweise eine Chromatographiesäule. Dabei wird nicht nur eine hohe Ausbeute der Minicircle-Herstellung erreicht, sondern das Verfahren kann auch ohne zusätzliche High-tech Mittel durchgeführt werden und zwar in jedem Labor. Die Probe mit dem Rekombinase-45 Umsetzungsprodukt wird einfach zu dem festen Support, z.B. der Chromatographiesäule zugegeben, vorzugsweise gewaschen, wonach der Minicirde wie bereits oben beschrieben eluiert werden kann.

Alternativ kann das Protein, welches die Minidrde-Identifikationssequenz erkennt, auch in den Bakterien exprimiert und in der bakteriellen Membran verankert werden, um so in der Lage zu sein, so an die Minidrdes zu binden.

Noch bevorzugter wird die Rekombinase nach Induktion des regulatorischen Elements exprimiert, vorzugsweise durch Zugeben von Arabinose zu dem Kulturmedium. Wie bereits vorher erwähnt, erlaubt dies die Herstellung des Ursprungsplasmids in einem ersten Schritt und erst, sobald eine ausreichende Menge an Ursprungsplasmid produziert worden ist, wird die Expression 55 der Rekombinase durch Aktivieren des regulatorischen Elements, zum Beispiel durch Zugeben von 9

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Arabinose zu dem Kulturmedium, herbeigeführt, so dass erst in diesem Moment das Ursprungsplasmid in Miniplasmid und Minicircle geteilt wird.

Die Erfindung wird detaillierter mit den folgenden Beispielen und Figuren beschrieben, auf welche die Erfindung jedoch nicht begrenzt wird, wobei Fig. 1 einen Vorläufer der in der vorliegenden 5 Erfindung verwendeten Plasmide zeigt; Fig. 2 eine schematische Darstellung eines entworfenen Plasmids zeigt; Fig. 3 die Wachstumskurve von zwei Klonen von E. coli zeigt; Fig. 4 ein Gel mit den Bändern von supercoiled Formen von Minicircle und Miniplasmid zeigt; Fig. 5 und 6 schematische Darstellungen von Plasmidkonstruktionen zeigen; Fig. 7 eine Gel-Elektrophorese von ParA-Resolvase zeigt; Fig. 8 und 9 Gel-Elektrophorese von Minicircles und Miniplasmiden zeigen. 10

Beispiel 1

Plasmide, Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Plasmide pBADparA (Jechlinger, W. Ph.D. Thesis, Universität Wien (2002), pKLys36.1 (Haidinger, W. 2001, Ph.D. Universität Wien), pKLysparAS (siehe Fig. 1), pSIPIres (Jechlinger, W„ Ph. 15 D. Thesis Universität Wien (2002)), pUC19 (Yanisch-Perron, C. et al., 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors; Gene. 33:103-19), pJMS11 (Panke, S. et al., Engineering of quasi-natural Pseudomonas putida strains for toluene metabolism through an ortho-chleavage degradation pathway. Appl. Environ. Microbiol., 1998; 64 (2):748-51), pBAD24 (Guzman, L.M. et al., Tight regulation, modulation, and high-level 20 expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacterial, 1995; 177 (14): 4121-30), pSIP (Mayrhofer, P. Ph.D. Thesis University of Vienna (2002)) und E. coli Stamm MC4100 (Silhavy, T.J., Berman et al., 1984; Experiments with Gene Fusions; Gold Spring Harbor Laboratory Press, New York) wurden verwendet.

Bakterien wurden in Luria-Brühe (LB) wachsen gelassen und mit Ampicillin (200 pg/ml) und 25 Kanamydn (50 pg/ml) falls angemessen ergänzt. Für durch den PBAD-Promotor getriebene Genexpression wurde das Medium mit 0,5% L-Arabinose ergänzt. Expression des Lysis-Gens E von Vektor pKLys36.1 wurde durch eine Temperaturverschiebung von 36°C auf 42eC herbeigeführt. Wachstum und Lysis von Bakterien wurden durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600nm) überwacht. 30 Die PCR-Bedingungen zur Erzeugung von PCR-Fragmenten waren wie folgt: Fünfunddreißig Amplifikationszyklen (45 s bei 94°C, 60 s bei 60°C und 1 Min. - 7 Min. bei 72°G) wurden nach 3 Min. eines Vordenaturierungsschritts bei 94°C in einem 100 pl Umsetzungsgemisch (1 x Pfu Polymerasepuffer, enthaltend 2 mM Mg 2+, 2U von Pfu Polymerase, 200 pM dNTP jeweils, 25 pM von jedem Primer und 0,2 pg Plasmid-DNA als Matrize) durchgeführt. Die Extensionszeit (72°C) 35 differiert für jedes Konstrukt und wird separat im Folgenden beschrieben:

Konstruktion von Plasmid pSIPI

Um die resolution sites an den gewünschten Positionen im SIP-Vektor zu platzieren, war es notwendig, geeignete Restriktionsstellen in Plasmid pSIP einzuführen, um gerichtetes Klonieren der resolution sites zu ermöglichen. Plasmid pSIP wurde mit Hin-dlll linearisiert und nachfolgend 40 mit Nael digeriert. Das sich ergebende 2995 bp Hindlll/Nael-Fragment wurde aus einem Agarose-gel eluiert. Dieses Fragment enthält die regulativen Elemente des araBAD-Operons und die wesentlichen Elemente zur Selbstimmobilisierung. Ein 3131 bp-DNA-Fragment, welches das ß-Lactamasegen und Replikationsursprünge von M13 und von pBR322 enthält, wurde durch PCR-Amplifikation (Extensionszeit: 7 Min) unter Verwendung der Primer pSIPI5 (5-45 CAGCAG AAGCTT GTTTTG-GCGG-ATG AG AG AAG-3’) und pSIPI3 (5‘- AGATCTCTGCTGGCGGCCGCGGTTGCT-GGC-GCCTATATC-3') und des Vektors pSIP als Matrize erzeugt. Primer pSIPI5 enthält eine einzelne Hindlll-Stelle, pSIPI3 enthält eine Bglll- und eine Notl-Restriktionsstelle. Nach Digerierung des PCR-Fragments mit Hindlll wurde es mit dem oben beschriebenen 2995bp-Fragment ligiert durch ihre stumpfe Stelle, erhalten durch die Pfu-50 Polymerase bzw. die entsprechende Hindlll-Stelle, was den Vektor pSIPI ergibt. Aufgrund der Klonierungsstrategie wurden folgende Restriktionsstellen eingeführt: Sacll, Notl, Bglll, Ball.

Konstruktion von Plasmid pSIPIres

Die resolution sites wurden durch PCR-Amplifikation (Extensionszeit: 1 Min.) unter Verwendung des Vektors pJMS11 als Matrize und den folgenden Primer-Sets erzeugt: resolution ~site 1: 55 5res1: S'-CAGCAGCTGCAGCCTTGGTCAAA-TTGGGTATACC-S'; 3res1: 5’-CT- 10

AT 412 400 B GCTGAAGCTTGCACATATGTGGGCGTGAG-3'; resolution site 2: 5res2: 5'- CAGCAGGCGGCCGCCCTTGGTCAAATTGGGTATACC-3' 3res2: 5’-CT GCTGAG ATCT G- CACATATGTGG GCGTGAG-3’. Das PCR-Fragment, welches für die resolution site 2 kodierte, enthielt eine einzigartige Notl-Stelle am 5'-Ende und eine Bglll-Stelle am 3'-Ende und wurde in die 5 entsprechende einzelne Stelle von pSIPI kloniert, was den Vektor pSIPIres2 ergab. Das resolution site 1-Fragment, welches eine einzelne Pstl-Stelle am 5-Ende bzw. Hindlll-Stelle am 3'-Ende enthielt, wurde dann in die entsprechenden einzelnen Stellen von pSIPIres2 kloniert, war den Vektor pSIPIres ergab.

Konstruktion von Plasmid pSIPIresHCN 10 Der pBR322 Replikationsursprung im Vektor pSIPIres wurde durch den Replikationsursprung mit hoher Kopiezahl von Plasmid pUC19 ersetzt. Dafür wurde die pUC19 Ursprungssequenz durch PCR (Extensionszeit: 2 Min.) von pUC19 unter Verwendung der Primer 5ori (5-CAGCAGGCCGGCTGAGCAAAAGGCCAGCA-3') und 3ori (5-TGCTGCG- CGGCCGCTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAG-3') amplifiziert. Der 5ori-Primer enthält eine 15 einzelne Nael-Stelle und der 3ori-Primer eine einzelne Notl-Stelle. Nach Digestion des PCR-Fragments mit Nael und Eagl wurde es in die entsprechenden Stellen eines 4828bp Nael/Eagl-Fragments kloniert, abgeleitet vom Vektor pSIPIres durch partielle Digestion mit Nael und Eagl, was den Vektor pSIPIresHCN (HCN: HighCopyNumber) ergab.

Konstruktion von Plasmid pKLysBADparaA 20 Ein 1920 bp DNA-Fragment, welches für das parA-Gen unter Expressionskontrolle des Arabi-nose-Operons kodiert, wurde unter Verwendung von Plasmid pBADparA als Matrize und den Primern BAD-KLysfw (5'-ATTCCGACTAGTCAAGCCGTCAATTGTCTG 3') und BADKlysrev (5-AGCCCTAGATCTTTA11111GCTGCTGCGC 3') amplifiziert, welche terminale Spei- bzw. Bglll-Stellen enthalten (Extensionszeit: 4 Min.). Das DNA-Fragment wurde in die zwei entsprechenden 25 Stellen der breiten Wirt-Bandbreite kloniert und Plasmid pKLysparAS mit niedriger Kopie, abgeleitet von pKLys36. In diesem Konstrukt (pKLysBADparA) wird die E-spezifische Lysis-Kassette von Plasmid pKLys36 durch das parA-Resolvasegen flankiert, welches sich unter transkriptioneller Kontrolle des Arabinose induzierbaren PBAD-Promotors (Fig. 2) befindet. 30 Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)

Herstellung von Minicircles und Miniplasmiden mit einer Resolvase an einem separaten Plasmid

Plasmide pSIPresHCN und pKLysBADparA wurden in E. coli MC4100 (siehe Fig. 2) co-transformiert. Das Plasmid mit niedriger Kopiezahl pKLys-BADparA trägt eine Temperatur-35 induzierbare Gen E-spezifische Lysiskassette und das parA Resolvase-Gen unter Expressionskontrolle des Arabinose-Operons. Nach Induktion der Resolvase (Schritt „A“) bindet es an die entsprechenden resolution sites von Plasmid pSIPresHCN, ein Plasmid mit hoher Kopiezahl, wo die resolution sites das Antibiotika-Resistenzgen und den Replikationsursprung (OR) flankieren. Das Rekombinations-Event (Schritt „B“) führt zu einer Aufteilung des Ursprungsplasmids in ein kleines 40 replikatives Miniplasmid (mp) und das Minicircle (mc) Molekül.

Das Plasmid mit hoher Kopiezahl pSIPresHCN trägt das laclL'-Fusionsgen unter der transkrip-tionalen Kontrolle des Arabinose-Operons und die resolution sites, welche das Antibiotika-Resistenzgen und den Replikationsursprung flankieren. Bakterien wurden bei 36°C wachsen gelassen und parA-Expression, angetrieben von Plasmid pKLysBADparA, bzw. die Expression des 45 laclL'-Fusionsproteins, angetrieben von Plasmid pSIPresHCN, wurde durch Zugabe von 0,5% L-Arabinose (Fig. 3) herbeigeführt. 25 Min. nach Zugabe von Expression des parA-Resolvasegens wurden Bakterienkulturen von 36°C auf 42°C verschoben, um Gen E-Expression herbeizuführen und somit Lysis der Zellen (Fig. 3). Ein und zwei Stunden nach Resolvase-Induktion (35 bzw. 95 Minuten nach Lysis-Induktion) wurden Proben aus den lysierten Kulturen entnommen und so Plasmide wurden isoliert.

Um die Rekombinationseffizienz zu analysieren, wurden Aliquoten der DNA-Niederschläge an einem 1% Agarosegel (Fig. 4): λ, λ BestEII-Marker; Bahn A, Kultur über Nacht ohne Arabinose, abgetrennt. Da das Plasmid pKLysBADparA ein Plasmid mit niedriger Kopiezahl ist, ist die super-coiled Form im Vergleich zu pSI-PresHCN kaum sichtbar; Bahn B, vor Zugabe von Arabinose; 55 Bahn C und D, 60 bzw. 120 Minuten nach Expression der ParA-Resolvase. Die Bänder der super- 11

AT 41 2 400 B coiled Formen von Minicircle und Miniplasmid, als auch des ursprünglichen pSIPresHCN-Plasmids werden mit Pfeilen angezeigt. Es ist aus Fig. 4 ersichtlich, dass das supercoiled („sc“) rekombinier-te Miniplasmid („mp“) und Minicircle („mc“) als auch die nicht rekombinierten Formen des Ursprungsplasmids pSIPresHCN eine und zwei Stunden nach Resolvase-Induktion nachgewiesen 5 werden können. Es wurde geschätzt, dass etwa 50% der ursprünglichen selbstimmobilisierenden pSIPresHCN-Plasmide mit hoher Kopiezahl Rekombination mit dem parA-Resolvasegen, expri-miert von dem Plasmid pKLys-BADparA mit niedriger Kopiezahl, unterworfen wurden.

Da die Rekombinase von einem Plasmid mit niedriger Kopiezahl mit etwa 10 Kopien pro Zelle produziert wurde, schien die Menge an Resolvase nicht ausreichend zu sein, um eine effiziente io Rekombination des Plasmids pSIPresHCN mit hoher Kopiezahl (etwa 500 Kopien pro Zelle) zu erreichen, welches die entsprechenden resolution sites trug. Die Ergebnisse waren ähnlich jenen von Darquet et al., 1997 und Darquet et al., 1999, wo «ine Rekombinase (die Phagen lambda-Integrase) in das Chromosom von E. coli als Einzelkopie-Gen integriert wurde. Darquet und seine Mitarbeiter konnten etwa 60% der Ursprungsplasmide rekombinieren, welche die entsprechenden 15 lambda attachment sites trugen, welche ein therapeutisches Gen flankierten, nach Induktion des Einzelkopie-Integrasegens aus dem Chromosom. Somit war das weitere Ziel, das parA-Resolvasegen auf das Plasmid mit der gleichen hohen Kopiezahl zu platzieren, welches ebenfalls für die resolution sites kodiert (pSIPresHCN), um die Resolvase zu überexprimieren und Rekombinationseffizienz nahe 100% zu erreichen. 20

Beispiel 3

Minicircle DNA, immobilisiert in Escherichia coli-Phantomen Konstruktion von Plasmid pHCNparA und pBADparA A 672-bp PCR-Fragment, welches das parA-Resolvasegen enthält, wurde durch PCR-25 Amplifikation (Extensionszeit: 2 Min.) erzeugt. Plasmid pJMSB8 wurde als Matrize benutzt und Primer BADparAfw (5-ATAGAACCATGGCGACGCGAGAGCAACAAC 3’) und BADparArev (5'-AGCCCTCTGCAGTTATT ΓΤΤGCTGCTGCGC 3'), um Ncol- bzw. Pstl-Restriktionstellen einzuführen. Das PCR-Fragment wurde in die entsprechenden Stellen von Plasmid pSIPresHCN kloniert, was Plasmid pHCNparA (Fig. 5) ergab, bzw. in pBAD24, was pBADparA ergab.

30 Konstruktion von Plasmid pSIPHCNparA

Unter Verwendung von Plasmid pBAD24parA als Matrize wurde ein 672-bp PCR-Fragment, welches für die parA-Resolvase und die ribosomale Bindungsstelle, abgeleitet von pBAD24 kodiert, durch PCR-Amplifikation (Extensionszeit: 2 Min.) erhalten. Oligonucleotide HCNparAfw (5-ACCG AACT GCAGCTACACCATACCCGTTTTTTT -GGGC 3') und HCNparArev (5'- 35 AGCCCTCTGCAGAAGCTTTTATII Π GCTGCTG-CGC 3’), welche Pstl und Pstl/Hindlll als terminale Restriktionsstellen enthalten, wurden als Primer verwendet. Das Fragment wurde mit Pstl digeriert und in die entsprechenden Stellen von Plasmid pSIPresHCN kloniert, was Plasmid pSIPHCNparA (Fig. 6) ergab. DNA-Niederschlag aus Kultur-Flüssigkeitsüberstand 40 DNA aus dem Kultur-Flüssigkeitsüberstand wurde mit CTAB (Cetyltrimethyl-ammoniumbromid), modifiziert nach Del Sal, ausgefällt. 30 ml Flüssigkeitsüberstand einer lysierten Kultur wurden gesammelt und 15 Min. zentrifugiert (15000 U/Min., 4eC). Nach Zentrifugation wurde der Flüssigkeitsüberstand durch einen 0,2 pm sterilen Filter passiert und mit 2,5 ml 5% CTAB Lösung in Wasser ausgefällt. Nach Zugabe von CTAB wurde die DNA durch Zentrifugation für 45 15 Min. (10000 U/Min. 4°C) ausgefällt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 400 pl 1,2 M NaCI-Lösung gelöst. Die DNA wurde wieder mit 2,5 Volumina von 96% EtOH ausgefällt (10 Min., 13000 U/Min., Raumtemperatur, Minizentrifuge) und das Pellet wurde mit 1 ml 70% EtOH gewaschen. Nach Lufttrocknen wurde das DNA-Pellet mit dem Gel-Extraktionskit von QIAGEN (gemäß der Anleitung des Herstellers) weiterer Reinigung unterworfen, um die Masse an so chromosomaler DNA zu entfernen. SDS-PAGE und Western-Blotting

Proben (Pellets aus 1 ml Kulturen, resuspendiert in Probenpuffer [100 x ODöOOnm in μΙ]) wurden für 5 Min. auf 95°C in Probenpuffer erhitzt und an einem 12% SDS-Polyacrylamid (PAA)<3el abgetrennt (10 μΙ von jeder Probe). Proteine wurden durch Semi-dry-electro-blotting auf Nitrocellu-55 losemembranen übertragen. Proteine wurden mit einem polyklonalen Antiserum von Kaninchen 12

AT 41 2 400 B zum ParA-Resolvaseprotein nachgewiesen. Die Membranen wurden mit primären Antikörpern (Anti-ParA-Serum, verdünnt 1:100 in TBS, enthaltend 0,5% BSA [Rinderserum-Albumen], 0,05% NaN3) und sekundären Antikörpern (Ziege-Anti-Kaninchen-Alkali-Phosphatase-konjugierte Antikörper von Sigma, verdünnt 1:5000) für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Um den Antigen-5 Antikörper-Komplex einzufärben, wurden BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphatase) und NTB (Nitroblue-tetrazolium) von Roche (Roche Diagnostics GmbH, Wien, Österreich) in alkalischem Phosphatasepuffer wie durch den Hersteller empfohlen verwendet. Um unspezifische Bindung der Antikörper zu minimieren, wurde polyklonales Antiserum zur ParA-Resolvase mit Acetonpulver inkubiert, hergeleitet von E. coli-Stamm MC4100. 10 Expression der ParA-Resolvase

Um zu bestimmen, ob das Arabinose-Operon von Plasmid pBAD24 für die Expression von hohen Graden an Resolvase und umgekehrt für enge Repression vor Induktion verwendet werden kann, wurde das parA-Resolvasegen unter transkriptionale Kontrolle des araB-Promotors des araBAD-Operons in Plasmid pBADparA gestellt. Expression des parA-Resolvasegens wurde 15 während des logarithmischen Wachstums von E. coli MC4100 (pBADparA) mit L-Arabinose herbeigeführt. Western-Blot-Analyse unter Verwendung von ParA-spezifischen polyklonalen Antikörpern zeigte starke immunreaktive Bänder an der erwarteten Größe von 24 kD nach 60, 120 und 180 Min. Induktion von parA-Genexpression (Fig. 7). Hierfür wurden Proben unter Verwendung eines 12% SDS-Polyacrylamidgels und Immunblotting mit einem ParA-spezifischen Antiserum 20 analysiert. Bahn BHR, broad host ränge Proteinmarker; Bahnen A-D, E. coli NM522 (pBADparA) Wachstum mit bzw. ohne Arabinose; Bahnen E-G, E. coli NM522 (pJMSB8) Wachstum mit bzw. ohne IPTG. Vor Induktion konnte kein spezifisches immunreaktives Proteinband nachgewiesen werden. Für eine positive Kontrolle wurden E. coli MC4100 (pJMSB8) logarithmisch wachsen gelassen und durch Zugabe von IPTG wurde Expression der parA-Resolvaseexpression herbeige-25 führt. Für die ParA-Resolvase spezifische Proteinbänder konnten 60 und 120 Min. nach Induktion („it“ = Induktionszeit) bestimmt werden, aber auch vor der Induktion konnte eine Hintergrundexpression der Rekombinase beobachtet werden.

Minicircle-Herstellung in vivo in E. coli MC4100 (pHCNparA)

Da das Arabinose-Expressionssystem für hochgradige Expression und enge Repression des 30 parA-Resolvasegens in Plasmid pBADparA geeignet schien, wurde die Rekombinationseffizienz mit Plasmid pHCNparA bewertet. In Plasmid pHCNparA wurde die Resolvase unter die Expressionskontrolle des araB-Promotors gestellt. Ferner werden der Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen durch die resolution sites an dem gleichen Plasmid flankiert {Fig. 5). Plasmide pHCNparA, pSIPHCNparA und die Produkte der Rekombination, getrieben durch die parA-35 Resolvase (Schritt „A“)· HCNmc, Minicircle abgeleitet von Ursprungsplasmid pHCNparA; SIPHCNmc, Minicircle abgeleitet von Ursprungsplasmid pSIPHCNparA; bla, Ampidliin-Resistenzgen; ori, Replikationsursprung abgeleitet von pUC19; parA, parA-Resolvasegen; lacl-L', Fusionsgen von lacl-Repressorgen mit Bakteriophagen MS2 L' Anker-Sequenz; PBAD, Arabinose-induzierbarer Promotor; araC, Repressor/Induzierer des PBAD-Promotors; lacOs, veränderte lac-40 Operatorsequenzen mit hoher Affinität zu dem Lacl-Repressorprotein; res1, res2, resolution sites, durch die ParA-Resolvase erkannte Sequenzen; rmB, transkriptionale Terminatoren des 5S ribo-somalen Gens. Nach Induktion des parA-Resolvasegens konnte eine vollständige Abtrennung, basierend auf Rekombination des Ursprungsplasmids in einen Minicircle („mc“) und ein Miniplasmid („mp“) durch Plasmidanalyse 30 Minuten nach Induktion der Resolvase beobachtet werden 45 (Fig. 8A): λ, λ BstEII-Marker; Bahn A vor Zugabe von Arabinose; Bahn B 30 Min. nach Induktion von parA-Resolvase. Die doppelten Bänder der entspannten und supercoiled Formen von Minicircle und Miniplasmid werden mit Pfeilen angezeigt; Bahn C 30 Minuten nach Expression der ParA-Resolvase, digeriert mit Ncol. Der Minicircle wurde linearisiert („L“) und das Miniplasmid blieb undigeriert; Bahn D 30 Minuten nach Expression der ParA-Resolvase, digeriert mit Hindlll. Das so Miniplasmid wurde linearisiert und der Minicircle blieb undigeriert. Fig. 8B: DNA-Herstellungen von E. coli MC4100 (pSIPHCNparA), wobei λ, λ BstEII Marker; Bahn A vor Zugabe von Arabinose; Bahn B 30 Minuten nach Expression der ParA-Resolvase. Die doppelten Bänder der entspannten und supercoiled Formen von Minicircle und Miniplasmid werden mit Pfeilen angezeigt; Bahn C 30 Minuten nach Expression der ParA-Resolvase, digeriert mit Hindlll. Der Minicircle und das 55 Miniplasmid wurden linearisiert. 13

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Vor Induktion konnten keine Rekombinations-Events nachgewiesen werden (Fig. 8A). In Fig. 8A werden die entspannten und supercoiled Formen des zirkulären Miniplasmids und Minicirc-les 30 Minuten nach Induktion des parA-Resolvasegens gezeigt, während kein Ursprungsplasmid nachgewiesen wurde. Restriktionsanalyse des Miniplasmids und Minicircle ergab die erwarteten 5 Größen der linearisierten Formen (Fig. 8A). SIP-Minicircle-Herstellung in vivo in E. coli MC4100 (pSIPHCNparA)

Nach Bewerten der Rekombinationseffizienz mit Plasmid pHCN-parA wurde die parA-Resolvase zusammen mit dem lacl-L’-Hybridgen unter Expressionskontrolle des araB-Promotors als Polycistron in Plasmid pSIPHCNparA gebracht, welches auch den Replikationsursprung und io das Ampicillin-Resistenzgen, flankiert durch die resolution sites enthält (Fig. 5). Durch Herbeiführen der Genexpression sollten das lacl-L’-Hybridgen, als auch das Rekombinasegen gleichzeitig exprimiert werden. Nach Induktion der Herstellung des Membran-verankerten Lacl und der Resol-vase mit L-Arabinose in wachsenden Kulturen von E. coli NM522 (pSIPHCNparA) konnte eine vollständige Rekombination des Ursprungsplasmids in ein Miniplasmid und einen Minicircle 15 30 Minuten nach Induktion der Resolvase nachgewiesen werden (Fig. 8B). Die doppelten Bänder der entspannten und supercoiled Formen von Minicircle und Miniplasmid werden in Fig. 8B mit Pfeilen angezeigt. Wie in pSIPHCNparA wird die res1-Sequenz durch Hind-Ill-Stellen flankiert (Fig. 5), der Minicircle, als auch das Miniplasmid wurden bei Digestion mit Hindill linearisiert. Das linearisierte Miniplasmid und Minicircle zeigten die erwarteten Größen {Fig. 8B). 20 Selbstimmobilisierung von Minicircle-DNA in bakteriellen Phantomen.

Ein System mit zwei kompatiblen Vektoren wird für die in vivo-lmmobilisierung der Minicircle-DNA verwendet. Ein Vektor, das Ausgangsplasmid, kodiert für für Elemente der Herstellung der Minicircle-DNA, als auch für die notwendigen Bestandteile für die Verankerung der Elemente in der bakteriellen cytoplasmatischen Membran. Die gewünschten Sequenzen für die Gentherapie oder 25 für die Impfung können in diesen Vektor kloniert sein. Der zweite Vektor kodiert für die Sequenz, welche für bakterielle Lysis notwendig ist (Protein E, als auch entsprechende regulatorische Bestandteile). Um den Prozess der Plasmid-Immobilisierung und der Protein E vermittelnden Lysis zu trennen, müssen beide Vektoren unabhängig induzierbar sein.

Das Ausaanasplasmid für dieses Verfahren (pSIPHCNparA), veranschaulicht in Fig. 5, umfasst 30 einen zusätzlichen Bestandteil (Lacl-L') für die Immobilisierung der Minicircle DNA (vergleiche Fig. 6A). Zusätzlich kodiert das Plasmid für den Repressor des Lactose-Operons (Lacl), an welchen an der 3'-site die letzten 56 C-terminalen Aminosäuren des Lysis-Proteins L (L') des Bakteriophagen MS2 kloniert wurden. Dieses Fusionsprotein (Lacl-L’) wird ebenfalls unter der Kontrolle des Promotors des Arabinose-Operons (Pbad) gehalten. Durch Induktion des PeAD-Promotors mit 35 L-Arabinose wird eine bicistrionische mRNA hergestellt, welche für ParA-Resolvase, als auch für Lacl-Fusionsprotein kodiert. Wie oben beschrieben, teilt die exprimierte ParA-Resolvase das Ausgangsplasmid in Miniplasmid und Minicircle. Das Lacl-L'-Fusionsprotein bindet sich an die Minicircle-DNA. Die Tandemwiederholung der LacO-Sequenz dient als Bindungsstelle für Lacl-L'. Aufgrund der Fusion mit dem hydrophoben Peptid L' wird der Repressor und somit das gebundene Plasmid 40 direkt in der bakteriellen Membran verankert (vergleiche Fig. 6A).

Das Lvsis-Plasmid kodiert für Gen E des Bakteriophagen ΦΧ174 (vergleiche Fig. 6A -pKLys36). Das Genprodukt, Protein E, ist ein hydrophobes Polypeptid mit 91 Aminosäuren und einem molekularen Gewicht von etwa 10 kD (Barrell et al.; Nature 264 (1976), 34-41). Durch Expression eines Plasmid-kodierten Proteins E wird eine Kanalstruktur mit 40 bis 200 nm Durchmes-45 ser in der Membran der Plasmid herstellenden Bakterie (E. coli) gebildet. Der E-Lysis-Kanal ist gekennzeichnet durch eine enge Öffnung in dem Membrankomplex von E. coli. Die Bildung des Kanals wird mit einer Fusion der inneren und äußeren Membran in Verbindung gebracht (Witte et al., J. Bacteriol. 172 (1990)m, 4109-4117). Getrieben durch den osmotischen Druck im Inneren der Zelle werden cytoplasmatische Bestandteile in das Kulturmedium mit der Protein E vermittelnden so Lysis ausgestoßen. Witte und Lubitz (Eur. J. Biochem. 180 (1989), 383-398) waren in der Lage zu zeigen, dass 20 Minuten nach Induktion der Protein E Expression etwa 90% der cytoplasmatischen Protein ß-Galactosidase in dem Kultur-Flüssigkeitsüberstand vorhanden waren. Zusätzlich konnten chromosomale DNA, fraktioniert aufgrund der Seher-Beanspruchung während der Lysis in Fragmente von 30 bis 40 kbp, supercoiled Plasmid DNA, als auch tRNA und rRNA in dem Kultur-55 Flüssigkeitsüberstand nachgewiesen werden. Leere Bakterium-envelopes, hergesteilt durch Prote- 14

AT 41 2 400 B in E vermittelnde Lysis, werden Phantome genannt. Plasmide, welche vor der Herbeiführung der Lysis in der cytoplasmatischen Membran der Wirtsbakterie immobilisiert worden sind, werden während des Lysis-Verfahrens nicht in das Kulturmedium ausgestoßen, weil sie an der cytoplasmatischen Membran des Bakterienphantoms verankert sind (vergleiche Fig. 5 (Mayrhofer (2002) 5 und Jechlinger (2002) Ph.D. Theses, siehe oben). Das beschriebene Prinzip der Trennung in ein Miniplasmid und einen Minicircle besteht in diesem Verfahren ebenfalls. Der grundlegende Unterschied liegt darin, dass der Minicircle mit dieser weiteren Entwicklung des Verfahrens in vivo in der bakteriellen cytoplasmatischen Membran immobilisiert wird. Der Nutzen dieser Immobilisierung liegt in der Tatsache, dass die Bakterienzellen, welche Plasmid produzieren, durch Bildung einer 10 transmembranalen Kanalstruktur lysiert werden können. Während dieses Lysisprozesses wird der größte Teil der cytoplasmatischen Bestandteile in das Kulturmedium ausgestoßen, während der DNA-Minicircle an die Wirtszelle verankert bleibt. Dabei wird eine vorbereitende Reinigung, also eine Abtrennung der Miniplasmid-DNA, als auch unerwünschter Nucleinsäuren der Wirtszelle erreicht. Die an die Bakterienphantome verankerten DNA-Minicircles können durch Standardver-15 fahren zerschnitten und nachfolgend isoliert werden.

Um bakterielle Phantome in Kombination mit der Selbstimmobilisierung des Minicircles herzustellen, wurden gemäß des vorliegenden Beispiels Bakterien mit pSIPHCNparA und pKLys36 co-transformiert, einem Lysisplasmid, welches eine E-spezifische Lysiskassette trägt, wo sich Gen E unter Expressionskontrolle des ApRmutwj-Promotors und des temperaturempfindlichem cl857-Re-20 pressors befindet (Fig. 6A): Die E. coli NM522-Zellen werden mit dem selbstimmobilisierten Plasmid (pSIPHCNparA) und einem kompatiblen Lysisplasmid (pKLys36.1) co-transformiert. Fig. 6B: Die ParA-Resolvase und der Lacl-L'-Membran-Anker werden exprimiert und die Resolvase schneidet den Replikationsursprung und das Antibiotika-Resistenzgen des Ursprungsplasmids, was ein replikatives Miniplasmid und den Minicircle ergibt. Das Lacl-L'-Fusionsprotein integriert sich in die 25 innere Membran und die Minicircles binden durch die lac-Operator sites an das Lacl-Protein. C: Lysis wird durch Gen E-Expression herbeigeführt und das cytoplasmatische Material wird zusammen mit den nicht immobilisierten Plasmiden durch die Transmembran-Tunnelstruktur freigesetzt, was bakterielle Phantome ergibt, welche DNA-Minicircles in der inneren Membran tragen.

Zehn Min. nach Induktion der Expression des lacl-L'-Hybridgens und des parA-Resolvasegens 30 (Fig. 6B) (Schritt „A“), wurde die E-Lysis durch Verschieben der Temperatur von 36°C auf 42°C herbeigeführt (Fig. 6C) (Schritt „B“). Eine Kontrolle wurde bei 36°C ohne Herbeiführen von Lysis durch Temperaturverschiebung nach oben wachsen gelassen. DNA wurde aus den Flüssigkeits-überständen und den Pellets ausgefällt, um zu untersuchen, ob das Miniplasmid die Zelle durch die Lysis verlässt, während der Minicircle in dem bakteriellen Phantom aufgrund der Interaktion zwi-35 sehen den lac-Operatorsequenzen und dem an der inneren Membran verankerten Lad-Protein zurückgehalten wird. In Fig. 9 wird gezeigt, dass 10 und 30 Min. nach Induktion der Lysis sowohl DNA-Moleküle, als auch das Miniplasmid und der Minicircle im Flüssigkeitsüberstand und den Pellets in unterschiedlichen Mengen nachgewiesen werden konnten:

Fig. 9A: Herstellung von DNA aus Pellets und Flüssigkeitsüberständen von E. coli MC4100 40 (pSIPHCNparA, pKLys36.1): 10 Min. (Bahnen A und B) und 30 Min. (Bahnen D und E) nach Induktion von E-vermittelter Lysis (20 bzw. 40 Min. nach Zugabe von L-Arabinose). Als Kontrolle wurde E. coli MC4100 (pSIPHCNparA, pKLys36.1) bei 36°C wachsen gelassen und 20 (Bahn C) und 40 Minuten (Bahn F) nach Zugabe von L-Arabinose wurden die DNA-Präparate analysiert, λ, λ Bst Eil Marker. Hauptsächlich das kleinere Miniplasmid konnte in den Flüssigkeitsüberständen 45 nachgewiesen werden; hauptsächlich die Minicircles konnten in den Pellets nachgewiesen werden. Während 20 Min. nach Induktion der Resolvase beide DNA-Moleküle in gleichen Mengen nachgewiesen werden konnten, stieg die Menge des replikativen Miniplasmids 40 Min. nach Resolvasein-duktion. Fig. 9B: Umgekehrt proportionale Menge an Miniplasmid und Minicircle in dem Flüssigkeitsüberstand und den Pellets von Lysaten von E. coli MC4100 (pSIPHCNparA, pKLys36.1) 30 so Min. nach Induktion von E-vermittelter Lysis, digeriert mit Seal und BamHI. λ, λ BstEII-Maricer; Bahn A, Aliquote von DNA-Präparat des Flüssigkeitsüberstands, digeriert mit Seal und BamHI, beide DNA-Moleküle sind linearisiert, hauptsächlich das kleinere Miniplasmid konnte in dem Flüssigkeitsüberstand nachgewiesen werden; Bahn B, Aliquote von DNA-Minipräparat von Pellets, digeriert mit Seal und BamHI, hauptsächlich der Minicircle konnte in den Pellets nachgewiesen 55 werden. 15

Claims (31)

1. AT 412 400 B Im Präparat des Flüssigkeitsüberstands wurde das replikative Miniplasmid in großen Mengen gefunden, während in den Pellets den bakteriellen Phantomen, hauptsächlich der immobilisierte Minicircle nachgewiesen wurde. Das in jedem Fall andere DNA-Molekül konnte nur als schwaches Band nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen an, dass das meiste des Minicircle während 5 des Lysisverfahrens in den bakteriellen Phantomen zurückgehalten wurde und in den Pellets des Lysats gefunden werden konnte, während die Mehrheit der Miniplasmide durch die Lysisporen ausgebracht wurde und in dem Flüssigkeitsüberstand nachgewiesen werden konnte. Diese umgekehrt proportionale Menge an Miniplasmid und Minicircle in dem Flüssigkeitsüberstand und den Pellets wurde bestätigt, wenn beide Präparate mit Restriktionsenzymen Seal und BamHI geschnit-10 ten wurden, um die DNA-Moleküle zu linearisieren (Fig. 9B). Wie erwartet, zeigte das Pellet DNA-Präparat der Kontrolle, welche bei 36°C weiter wachsen gelassen worden war, dass die Menge an Miniplasmid in den Zellen im Vergleich zu den Minicircles stieg, da das Miniplasmid im Gegensatz zu den Minicircles in der Lage war, sich zu replizieren (Fig. 9A). Da die Kontrollkultur nicht auf 42°C verschoben worden war und da daher keine E-spezifischen Poren in den Bakterien erzeugt worden 15 waren, konnten die Miniplasmide die wachsenden Zellen nicht verlassen. PATENTANSPRÜCHE: 20 25 30 35 40 45 50 1. Plasmid, welches die folgenden funktionellen Einheiten umfasst: - einen prokaryontischen Replikationsursprung - eine Markersequenz - zwei spezifische Rekombinase-Erkennungssequenzen und - eine multiple Klonierungsstelle, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters - ein Gen, welches für eine sequenzspezifische Rekombinase kodiert, umfasst, wobei die Einheiten derart auf dem Plasmid angeordnet sind, dass das Plasmid bei Expression der sequenzspezifischen Rekombinase in ein Miniplasmid und einen Minicircle geteilt wird, besagtes Miniplasmid den prokaryontischen Replikationsursprung, die Markersequenz und das Gen für die sequenzspezifische Rekombinase umfasst und besagter Minicircle die multiple Klonierungsstelle umfasst.
2. 2. Plasmid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen, welches für ein spezifisches Protein, vorzugsweise ein therapeutisch brauchbares Protein kodiert, in die multiple Klonierungsstelle insertiert wird.
3. 3. Plasmid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Mini-circle-ldentifikationssequenz zur Identifizierung und Isolierung des Minicircles umfasst.
4. 4. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner eine Miniplasmid-Identifikationssequenz zur Identifizierung, Isolierung und €ntfemung des Miniplasmids umfasst.
5. 5. Plasmid gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifikationssequenz eine Sequenz ist, welche in der Lage ist, sich spezifisch an ein Protein zu binden, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden.
6. 6. Plasmid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierungssequenz eine lac-Operator site ist, welche sich spezifisch an ein Lacl-Repressorprotein bindet.
7. 7. Plasmid gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner ein Gen umfasst, welches für das Protein kodiert, welches den DNA-Proteinkomplex bildet, vorzugsweise ein Gen, welches für das Lacl-Repressorprotein kodiert.
8. 8. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid eine Sequenz umfasst, welche für ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid kodiert.
9. 9. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifische Rekombinase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Bakteriophage lambda Int-Integrase, Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1 und der ParA-Resolvase.
10. 10. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Rekombinase-Erkennungssequenzen ausgewählt werden aus der Gruppe beste- 16 55 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 AT 412 400 B hend aus lambda attachment sites (att sites) und resolution sites (res sites) aus Multimer-Resolutions-Systemen.
11. 11. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner ein regulatorisches Element für die Expression der Rekombinase umfasst.
12. 12. Plasmid gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das regulatorische Element für die Rekombinase einen starken Promotor umfasst.
13. 13. Plasmid gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das regulatorische Element ein transkriptionales Kontrollsystem eines araB-Promotors eines araBAD-Operons ist.
14. 14. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Markergen ein Antibiotika-Resistenzgen ist.
15. 15. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der pro-karyontische Replikationsursprung ein Replikationsursprung mit hoher Kopiezahl ist, vorzugsweise von Plasmid pUC19.
16. 16. Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Replikationsursprung am Minicircle umfasst.
17. 17. Kit für die Herstellung eines therapeutisch brauchbaren DNA-Moleküls, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: - das Plasmid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 15 und - ein Protein, welches in der Lage ist, sich an die Identifikationssequenz des Plasmids zu binden, um einen stabilen DNA-Proteinkomplex zu bilden, wobei das Protein gegebenenfalls an einen festen Support immobilisiert wird.
18. 18. Kit gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Lacl-Repressorprotein ist, vorzugsweise ein Mutant-Lacl-Repressorprotein.
19. 19. Kit gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein zur Immobilisierung an einen festen Support an ein tag fusioniert wird.
20. 20. Kit gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein an ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid fusioniert wird.
21. 21. Kit gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Plasmid mit einem induzierbarem Lysis-Gen bzw. eine Kultur aus rekombinierten Bakterien, transfiziert mit besagtem Plasmid, umfasst.
22. 22. Kit gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysis-Gen das Lysis-Gen E von Bakteriophage PhiX174 ist.
23. 23. Kit gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es eine für die Expression und Funktion der Rekombinase spezifische Bakterienkultur umfasst.
24. 24. Kit gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner Ara-binose umfasst.
25. 25. Minicircle, dadurch gekennzeichnet, dass er von einem Plasmid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 16 ableitbar ist und - eine multiple Klonierungsstelle und - ein Gen umfasst, welches für ein therapeutisch brauchbares Protein, insertiert in die multiple Klonierungsstelle kodiert, wobei der Minicircle über ein hydrophobes Membran-Anker-Peptid an ein bakterielles Phantom gebunden wird.
26. 26. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche den Minicircle gemäß Anspruch 25 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
27. 27. Verfahren für die Herstellung eines therapeutisch brauchbaren DNA-Moleküls, dadurch gekennzeichnet dass es die folgenden Schritte umfasst: - Transfizieren des Plasmids gemäß einem der Ansprüche 2 bis 15 in Bakterien, welche in der Lage sind, das Plasmid zu replizieren, • Kultivieren der Bakterien, währenddessen die Rekombinase exprimiert wird, so dass Miniplasmide und Minicircles hergestellt werden und • Isolieren der Minicircles.
28. 28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Minicircles durch Verwenden der Minicircle-Identifikationssequenz isoliert werden.
29. 29. Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Minicircles 17 55 AT 412 400 B durch Immobilisierung an einen festen Support, vorzugsweise eine Chromatographiesäule isoliert werden.
30. 30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase bei Induktion des regulatorischen Elements, vorzugsweise durch Zugeben 5 von Arabinose zu dem Kulturmedium exprimiert wird.
31. 31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein, welches die Minicircle-Identifikationssequenz erkennt, ebenfalls in den Bakterien exprimiert und in der bakteriellen Membran verankert wird, um so in der Lage zu sein, an die Minicircles zu binden. 10 HIEZU 10 BLATT ZEICHNUNGEN 15 20 25 30 35 40 45 50 18 55