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Die
Erfindung betrifft eine lagerstabile Lysepuffermixtur zur Extraktion
von Nukleinsäuren aus biologischen, vorzugsweise diagnostischen
Proben. Sie ist bevorzugt mit einer Extraktionskontrolle verbunden.
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Anwendungsgebiete
sind die molekularbiologische Diagnostik, die Forschung, die medizinische Praxis,
die genbasierte Analytik von Biotechnologie-, Agrar- und Lebensmittelprodukten
sowie die Kriminalistik.
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Stand der Technik
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Eine
Vielzahl der herkömmlichen Lysepuffer zur Extraktion von
Nukleinsäuren enthalten als Salze chaotrope Ionen-Mischungen.
Die zugehörigen Verfahren basieren auf einer von Vogelstein
und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten
und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und
analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen. Die
Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande
enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung
eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel.
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Ein
für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables
Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in
US 5,234,809 (Boom) dargestellt.
Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die
Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Lysepuffer
und einer DNA bindenden festen Phase beschrieben. Diese chaotropen Lysepuffer
realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung
der Nukleinsäuren an die feste Phase.
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Lysepuffer
dieser Art denaturieren aber auch in kurzer Zeit Enzyme, die zur
Lyse einer biologischen Probe notwendig sind. Daher muss in herkömmlichen
Systemen eine getrennte Zugabe der Einzelkomponenten erfolgen. Der
Lysepuffer wird also erst während der Lyseprozedur zusammengesetzt
und in einer bestimmten Abfolge werden die Einzelbestandteile nacheinander
zugegeben.
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Der
Extraktions- und Nachweisablauf kann über zwei verschiedenartige
Kontrollen geprüft werden: Die Extraktionskontrolle zur
Ermittlung der Qualität der Extraktion und eine Reaktionskontrolle
zur Ermittlung der Qualität des Nachweisverfahrens.
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Aus
der Patentanmeldung
DE 19840531 sind
bereits Lösungen für stabilisierte Prozesskontrollen
bekannt, diese beschränken sich aber in nur auf stabilisierte
(RT) qPCR Kontrollen in den entsprechenden Reaktionsgefäßen.
Diese werden wasserfrei auf die entsprechenden Gefäßoberflächen
aufgetragen. Dadurch wird eine Überprüfung der
Reverse-Transkriptase-Reaktion, sowie eine Überprüfung
der qPCR Reaktion ermöglicht. Allerdings bleibt hierbei
die Extraktion unkontrolliert.
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Im
Falle der Extraktion geringster Kopienzahlen von Nukleinsäuren
werden häufig sogenannte Carrier-Nukleinsäuren
eingesetzt, da geringe Mengen an Nukleinsäuren in wässriger
Lösung instabil sind. Diese Carrier-Nukleinsäuren
dürfen keinerlei Homologie zu den extrahierten Nukleinsäuren
haben und müssen in Nukleinsäureextraktionssystemen normalerweise
separat zugegeben werden. Typische Carrier-Nukleinsäuren
sind Lachssperma DNA, Heringssperma DNA, Hefe t RNA und Polyadenyl
RNA.
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In
herkömmlichen Verfahren wird die Carrier-Nukleinsäure üblicherweise
bei der Extraktion mit zur Probe gegeben. Dieses erfordert einen
zusätzlichen Pipettierschritt. Die Extraktionskontrolle
wird ebenfalls bei der Extraktion in bekannter Menge mit zur Probe
gegeben. Dieses erfordert einen weiteren zusätzlichen Pipettierschritt.
Hierbei ergeben sich Schwierigkeiten, die Kontrolle, soweit sie
aus puren Nukleinsäuren besteht, in flüssiger
Form stabil zu lagern. Nukleinsäuren in geringer Konzentration
neigen zum Abbau.
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Anschließend
wird die Extraktionskontrolle nach erfolgter Reaktion über
ein Nachweisverfahren gemessen, anhand des Verlustes an Kontrollnukleinsäure
kann die Rückholrate ermittelt werden.
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Um
dem Effekt der Instabilität entgegenzuwirken, sowie den
Extraktionsvorgang zu simulieren, werden teilweise Phagenpartikel
oder in Phagenpartikel verpackte Nukleinsäuren verwendet.
Die Herstellung solcher Kontrollen ist aber aufwändig und
somit teuer.
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Die
lytischen Enzyme werden der Reaktion als flüssige Komponente
in einem weiteren Pipettierschritt zugegeben. Die Reaktionskontrolle
für die Nachweisverfahren wird separat in die Nachweisreaktion
gegeben, dieses erfordert wiederum einen zusätzlichen Pipettierschritt
oder der Ansatzmix für die Nachweisreaktion enthält
selbst eine sogenannte Amplifikationskontrolle.
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Für
den Anwender ergeben sich hieraus die folgenden Nachteile:
Alle
Komponenten müssen einzeln in verschiedenen Pipettierschritten
zusammen gegeben werden, dies führt zu Arbeitsaufwand und
Kontaminationsgefahr. Die Komponenten eines solchen Systems müssen bei
unterschiedlichen Temperaturen gelagert werden.
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Insgesamt
gestaltet sich die Automatisierung eines solchen Systems kompliziert
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Ein
anderer Ansatz ist in
WO 0034463 gezeigt.
Hier ist ein Lysepuffer beschrieben, der auf nicht chaotropen Salzen
und geeigneten Detergentien basiert.
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Solche
Mischungen sind, wie die
WO 0034463 lehrt,
auch als feste Formulierungen über einige Zeit lagerstabil.
In
WO 03040386 wird
die Möglichkeit der Nutzung eines solchen Systems zur standardisierten
Nukleinsäureextraktion und zum standardisierten Nukleinsäurenachweis
beschrieben.
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Die
Schrift
WO 03040386 beschreibt
Reaktionsräume, die das Potential zu effizienten und schnellen
Verfahren haben. Allerdings ist die Herstellung entsprechender Produkte
sehr aufwändig und an den späteren Reaktionsraum
gebunden. Die Herstellung der Reaktionsräume im Verfahren
WO 03040386 erfolgt über
Gefriertrocknung.
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Die
Reaktionsräume werden mit den verschiedenen Bestandteilen
des Reaktionssystems in wasserfreiem oder weitgehend wasserfreiem
Zustand beschickt. Dies ist mit einem großen zeitlichen Aufwand
für Wägung und Verbringung der Komponenten in
den Reaktionsraum verbunden und verhindert weitgehend eine Automatisierung.
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Die
Carrier-Nukleinsäuren werden über das Lysegefäß in
den Reaktionsraum für den Lysepuffer eingebracht, oftmals
gemeinsam mit der Extraktionskontrolle. Dieses geschieht über
sogenannte Coating Verfahren (Beschichtungsverfahren). Dabei wird
eine Lösung der Nukleinsäuremischung auf die Wand
des Reaktionsgefäßes getrocknet.
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Um
den Reaktionsmix für die Lyseprozedur zu vervollständigen,
ist nun noch ein sogenannter Lysepuffermix vonnöten.
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Die
Lysepuffermixtur enthält nicht chaotrope Salze sowie gegebenenfalls
Detergentien und wird als Flüssiggemisch angesetzt. Dieses
Gemisch wird eingetrocknet. Nach der Trocknung werden lytische Enzyme
in fester Form zugegeben und das entstehende Pulver gründlichst
gemischt. Das Pulver wird dann ausgewogen und auf die beschichteten
Reaktionsräume verteilt. Dadurch befindet sich im Reaktionsraum
eine stabile Mischung für die Lyse nukleinsäurehaltiger
Proben, diese Mischung ist sechs Monate bei Raumtemperatur stabil.
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Die
separate Zugabe der Enzyme als Trockensubstanz ist in diesem Verfahren
unabdingbar, da in der verwendeten Mixtur während der Trocknung die
Enzyme teilweise denaturieren würden.
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Die
Extraktionskontrolle wird auch als Reaktionskontrolle für
das Nachweisverfahren verwendet.
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Dieses
Verfahren bringt die folgenden Vorteile für den Anwender:
Die
Probe kann in flüssiger Form zugegeben werden, keine weiteren
Pipettierschritte sind nötig und eine Vergrößerung
des Volumens flüssiger Proben ist möglich.
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Das
Verfahren hat aber auch Nachteile, diese liegen in der Herstellung
und der Haltbarkeit:
Die Herstellung des oben genannten Systems
ist sehr aufwändig, was das System verteuert. Das System
hat lediglich eine Haltbarkeit von sechs Monaten, und dabei müssen
die beschichteten Gefäße bei –20°C
gelagert werden, die beschichteten mit Lysepuffermixtur befüllten
Gefäße können dann sechs Monate bei Raumtemperatur
gelagert werden.
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Zusammenfassend
lässt sich sagen, dass der Anwender bei dieser Prozedur
viele Vorteile hat, dabei verkompliziert sich aber der Herstellungsprozess,
so dass im Endeffekt das System verteuert wird.
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Durch
die immer größere Bedeutung der Anwendung von
molekularbiologischen Methoden in vielen Bereichen, besteht ein
zunehmender Bedarf an praktischen, kostengünstigen und
einfach und schnell anzuwendenden Nukleinsäureextraktionssystemen.
Darüber hinaus werden mit den modernen qPCR Nachweisverfahren
Extraktionskontrollen in molekulardiagnostischen Anwendungen Standard.
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Entsprechende
Nukleinsäuren in geeigneten Konzentrationen in Lösung
stabil zu halten ist jedoch problematisch.
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Die
der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist daher, ein verbessertes
Nukleinsäureextraktionssystem bereitzustellen, welches
kostengünstig, stabil und einfach anzuwenden ist und dabei
den Ansprüchen an ein modernes Nukleinsäureextraktionssystem
genügt, indem es u. a. Extraktionskontrollen enthält.
Diese Aufgabe wird entsprechend den Ansprüchen 1, 21, 23
und 24 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
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Beschreibung der Erfindung
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist eine inklusive aller Komponenten
flüssig herstellbare Mixtur für einen Lysepuffer
(Lysepuffermixtur) zur Extraktion von Nukleinsäuren aus
biologischen, vorzugsweise diagnostischen Proben. Sie enthält
neben nichtchaotropen Salzen zur Einstellung der Bindebedingungen
für die Festphasenseparation, Detergenzien zur Lyse der
biologischen Probe, eine definierte Menge mindestens einer Nukleinsäure
als Extraktionskontrolle, gegebenenfalls für die Präparation
von geringen Konzentrationen an Nukleinsäure sogenannte
Carrier-Nukleinsäuren, falls notwendig Enzyme zur Lyse
der biologischen Probe und gegebenenfalls weitere Zusätze.
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Die
Lysepuffermixtur wird über Festphasenseparation zur Lyse
der Proben eingesetzt. Sie wird über Gefriertrocknung in
feste Form gebracht, dadurch entsteht eine lagerstabile Formulierung.
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Der
Kernpunkt der Erfindung liegt darin, dass die spezielle Detergenzien-Auswahl
in Kombination mit antichaotropen Salzen, die eingesetzten Enzyme und
Nukleinsäuren stabilisiert. Es ist überraschend, dass
die spezielle Detergenzien-Auswahl in der Lysepuffermixtur ermöglicht,
dass alle Komponenten in flüssiger Form zusammen gegeben
werden können. Dies führt zum einen zu einer gegenseitigen
Stabilisierung der Komponenten und dadurch zu einer erhöhten
Haltbarkeit der gefriergetrockneten Lysepuffermixtur (mindestens
doppelt so hoch wie herkömmliche Systeme) und zum anderen
dazu, dass die Herstellung der entsprechenden Mixtur unabhängig
vom Reaktionsraum ist.
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Die
Lysepuffermixtur kann in Teilschritten (z. B. Gefriertrocknung)
zwar im Reaktionsraum erfolgen, aber auch genauso vollkommen unabhängig
davon (z. B. Tablettenform). Somit kann die spätere Reaktion
in jeglichem denkbaren Reaktionsgefäß durchgeführt
werden.
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Als
nicht chaotrope Salze werden erfindungsgemäß monovalente,
bivalente oder multivalente Kationen oder Mischungen aus diesen
Kationen eingesetzt.
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Vorzugsweise
sind diese Kationen Ammoniumionen, Natriumionen, Kaliumionen, Magnesiumionen,
Calciumionen, Zinkionen oder Manganionen.
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Üblicherweise
wird die Lysepuffermixtur erhalten, indem zwei Stammlösungen
hergestellt werden, welche miteinander vermischt, in Reaktionsgefäße
gefüllt und gefriergetrocknet werden. Die Stammlösung
eins enthält vorzugsweise eine Mischung aus einem oder
mehreren nichtchaotropen Salzen, gegebenenfalls Tris, mindestens
ein Detergenz, mindestens ein lytisches Enzym. Die Stammlösung
zwei enthält vorzugsweise die Nukleinsäure zur Extraktionskontrolle,
gegebenenfalls Carrier-Nukleinsäuren, Zucker und TrisHCl.
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Die
eingesetzte Menge der nicht chaotropen Salze, hängt vom
jeweiligen Salz oder den Mischungen ab. Vorzugsweise werden die
Salze zur Herstellung der Lysepuffermixtur in Konzentrationen von
5 mmol/l–3 mol/l eingesetzt. Wird Ammoniumchlorid als Salz
verwendet, dann wird es in einer Konzentration zwischen 1 und 2
mol/l, vorzugsweise in einer Konzentration von 1,5 mol/l, verwendet.
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Der
pH-Wert der Lysepuffermixtur wird zwischen 5 und 9 eingestellt,
optimal ist ein pH-Wert von 8.
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Als
Detergenzien enthält die erfindungsgemäße
Lysepuffermixtur Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), Tween 20,
Triton X-100 und/oder Natriumdodecylsulfat (SDS), vorzugsweise ist
CTAB enthalten.
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Die
Konzentration der für die Lysepuffermixtur eingesetzten
Detergenzien ist abhängig vom Detergenz und liegt im Bereich
von 0,1–5%. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird CTAB in einer Konzentration von 2% verwendet.
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Erfindungsgemäß enthält
die Lysepuffermixtur Nukleinsäuren zur Extraktionskontrolle,
welche synthetische oder über molekularbiologische Verfahren
hergestellte oder auch native Nukleinsäuren sind. Die Nukleinsäuren
können DNA oder RNA sein.
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Eingesetzt
werden können eine oder mehrere DNA's, eine oder mehrere
RNA's oder Mischungen aus einer oder mehreren DNA's und RNA's. Wichtig ist,
dass die Nukleinsäuren zur Extraktionskontrolle mengenmäßig
bekannt sind.
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Die
Extraktionskontroll-Nukleinsäure wird zur Herstellung der
Lysepuffermixtur abhängig von der späteren Nachweisreaktion
eingesetzt, vorzugsweise in Mengen bis zu 1010 Kopien/ml.
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Die
in der Lysepuffermixtur enthaltenen lytischen Enzyme sind vorzugsweise
Proteinasen, Muraminidasen (z. B. Lysozym) sowie weitere Enzyme zum
Abbau von Biopolymeren. In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird Proteinase K verwendet.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform werden Proteinase
K und Lysozym eingesetzt.
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Erfindungsgemäß werden
als Carrier-Nukleinsäuren synthetische Nukleinsäuren
oder Isolate aus biologischen Materialien verwendet. Diese können
vorzugsweise poly A RNA, tRNA, Lachs Spermien DNA oder Herings Spermien
DNA sein. Weitere sind ebenfalls möglich.
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Die
Carrier-Nukleinsäuren werden für die Herstellung
der Lysepuffermixtur in Konzentrationen von 0,1 μg/ml bis
100 μg/ml, optimal von 10 μg/ml eingesetzt. Als
weitere Zusätze enthält die Lysepuffermixtur gegebenenfalls
Tris, TrisHCl sowie Zucker, wobei der Zucker vorzugsweise Trehalose
ist.
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In
einer besonderen Ausführungsform liegt die erfindungsgemäße
Lysepuffermixtur als feste lagerstabile Formulierung in einsatzfertigen
Reaktionsgefäßen vor, bereit zur Lyse nukleinsäurehaltiger Proben.
Diese Reaktionsgefäße sind im speziellen Fall
der Ausführungsbeispiele 2 ml Mikrozentrifugengefäße,
wobei für andere Anwendungen jegliche Art von Reaktionsgefäß denkbar
ist z. B. 96 well Mikrotiter-Platten, 384 well Mikrotiter-Platten,
genauso wie Gefäße größeren
Volumens.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Lysepuffermixtur.
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In
einer besonderen Ausführungsform wird das Verfahren zur
Isolierung von DNA oder RNA oder DNA in Kombination mit RNA aus
Mikroorganismen eingesetzt.
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Gegenstand
der Erfindung ist ebenfalls ein Reaktionskit für die Extraktion
von Nukleinsäuren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform enthält der
Reaktionskit Gefäße zur Probenlyse enthaltend
die hier beschriebene Lysepuffermixtur, gegebenenfalls einen Bindepuffer
auf alkoholischer Basis, gegebenenfalls einen oder mehrere an sich
bekannte Waschpuffer für die Nukleinsäureaufreinigung,
sowie einen an sich bekannten Elutionspuffer. Die Nukleinsäure
wird über Festphasenadsorption an Silikaoberflächen
oder verwandten Oberflächen gereinigt. Dazu enthält
der Kit Spin Filter, oder 96 Well Filterplatten, oder magnetische
Beads mit den entsprechenden Oberflächen.
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In
einer Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktionskit
für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren aus
diagnostischen Proben geeignet.
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Ebenso
ist der Reaktionskit in einer anderen Ausführungsform für
die Extraktion von bakteriellen Nukleinsäuren aus diagnostischen
Proben geeignet.
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In
einer besonderen Ausführungsvariante der Erfindung enthält
der Kit ein 2 ml Lysegefäß mit der Mixtur, einen
Bindepuffer auf Isopropanol-Basis, zwei verschiedene, an sich bekannte
Waschpuffer, einen an sich bekannten Elutionspuffer, sowie Spin Filter
als Adsorptionsphase. Dieser Kit ist besonders zur Isolierung von
viralen Nukleinsäuren aus diagnostischen Proben geeignet.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass die Herstellung der Lysepufferformulierung
nicht vom Reaktionsraum abhängig ist. Die Mischung kann
also sowohl im Reaktionsraum als auch unabhängig davon hergestellt
werden.
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Die
Extraktionskontrollnukleinsäuren werden in einer Stabilisierungslösung
(Stammlösung zwei) stabilisiert, die dem Lysepuffergemisch
(Stammlösung eins) zugegeben wird. Mit der entstandenen
Lysepuffermixtur werden Gefäße befüllt.
Diese flüssige Zusammengabe aller Komponenten und gegebenenfalls
eine Aliquotierung, ermöglicht einen automatisierten Herstellungsprozess
der Formulierung.
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Die
Gefäßinhalte werden gefriergetrocknet.
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Die
Extraktionskontrolle wird im folgenden auch als Reaktionskontrolle
für das Nachweisverfahren verwendet.
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In
einer besonderen Ausführungsform ist die Lysepuffermixtur
in Tablettenform herstellbar. Diese Tabletten werden dann später
der zu lysierenden Probe zugegeben.
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Nach
der Gefriertrocknung bleiben die Bestandteile stabil und schützen
sich gegenseitig vor eventuell ablaufendem Abbau. Die Salzbestandteile fangen
durch ihre Hygroskopie Flüssigkeit aus der Atmosphäre
bis zu einem gewissen Maße ab, und schützen damit
die Enzyme und die Nukleinsäuren. Natürlich sind
es nicht allein die Einzelbestandteile der Mixtur, welche die Stabilisierung
hervorrufen, sondern auch die abgestimmten Quantitäten
der entsprechenden Zutaten. Bei den Quantitäten muss beachtet
werden, dass die entsprechende Mixtur als Komponente in einer Festphasenseparation
auf Nukleinsäuren geeignet sein muss.
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Überraschenderweise
hat die erfindungsgemäße Lysepuffermixtur eine
Haltbarkeit von mindestens einem Jahr bei Raumtemperatur. Im Gegensatz dazu
beträgt die Haltbarkeit von den bisher im Stand der Technik
beschriebenen Lysepuffermixturen maximal sechs Monate, teilweise
unter Kühlung.
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Die
Vorteile der Erfindung werden im Folgenden anhand eines Vergleichs
des Ablaufs der Lyseprozeduren für die Nukleinsäureextraktion
erklärt.
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Eine
herkömmliche Lyse startet mit einer Probe, der flüssiger
salzhaltiger Lysepuffer mit Detergenzien zugegeben wird, das Volumen
wird mit Wasser eingestellt, dann werden in jeweils einzelnen Schritten
die Enzyme, die Kontrollnukleinsäuren und gegebenenfalls
die Carrier-Nukleinsäuren zugegeben. Erst dann kann die
Lyseprozedur ablaufen.
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Dagegen
läuft eine Lyse unter Verwendung der Erfindung ganz einfach
folgendermaßen ab: Die Probe wird in ein vorgefülltes
Gefäß mit der Fertigmischung gegeben und das Volumen
wird mit Wasser eingestellt, die Lyseprozedur läuft ab.
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Die
Basis der hiesigen Erfindung ist, wie in
WO 03040386 , ein Lysepuffer, der
auf nicht chaotropen Salzen und geeigneten Detergentien basiert.
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Im
Gegensatz zum Verfahren von
WO 03040386 ist
die Herstellung hier aber nicht mehr vom Reaktionsraum abhängig.
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Ein
weiterer Vorteil neben der oben beschriebenen Geschwindigkeit durch
den Wegfall mehrerer Zugabeschritte ist eine reduzierte Kontaminationsgefahr.
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Die
Erfindung ermöglicht sowohl eine automatisierte Herstellung
der Reaktionseinheit für den Lyseschritt beim Hersteller,
sowie eine Vereinfachung der automatisierten Extraktion beim Anwender durch
den Wegfall mehrerer Liquid Handling Schritte mit kleinen Volumina
(Zugabe von Enzymen, Carrier-Nukleinsäuren und Kontrollen).
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Ein
zusätzlicher Vorteil ist die Vergrößerung des
möglichen Probenvolumens, eine flüssige Mixtur enthält
an sich schon Wasser, flüssige diagnostische Proben (Körperflüssigkeiten
und Ausscheidungen) können in einem größeren
Volumen zugegeben werden. Dies erhöht die Menge an isolierten
Nukleinsäuren und damit die Sensitivität entsprechender
Pathogennachweise.
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Damit
genügt diese Lysepuffermixtur auch den modernen Ansprüchen
an einen konzentrierten Lysepuffer.
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Zusammenfassend
lassen sich die Vorteile durch die Erfindung für die Herstellung
entsprechender Systeme folgendermaßen darstellen.
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Die
Herstellung der hier beschriebenen Lysepuffermixtur ist einfach,
da eine stabilisierte Lysepuffermixtur Verwendung findet, in der
alle Komponenten gemeinsam in wässriger Lösung
vorliegen.
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Diese
Lösung wird maschinell in Reaktionsgefäßen
portioniert und anschließend gefriergetrocknet. Dieses
Vorgehen ist kostengünstig.
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Zur
Durchführung des Tests kann die Probe in einem Schritt
zur Lysepuffermixtur gegeben werden. Eine Herstellung der Lysepuffermixtur
in Tablettenform ist ebenfalls möglich. So kann gleichermaßen
die Lysepuffermixtur als Tablette direkt zur Probe gegeben werden.
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Die
Lysepuffermixtur hat eine Haltbarkeit von mindestens 12 Monaten
bei Raumtemperatur. Die Lagerung dieses Gemischs ist also ohne Kühlung möglich.
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Die
Probe kann in flüssiger Form zugegeben werden, keine weiteren
Pipettierschritte sind nötig, dadurch reduziert sich die
Kontaminationsgefahr für die Probe durch Kreuzkontamination
und auch für den Anwender anhand infektiöser Proben.
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Eine
Vergrößerung des verwendbaren Volumens flüssiger
Proben ist möglich, was sich in einer erhöhten
Sensitivität des Nachweisverfahrens auswirkt.
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Nachstehend
wird die Erfindung anhand der Anwendungsbeispiele näher
erläutert.
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Ausführungsbeispiel 1
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Erstellung einer Mixtur entsprechend der
hier beschriebenen Erfindung für die Lyse von diagnostische
Proben, die Bakterien enthalten.
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Es
wird eine Lösung I aus 1,5 M Ammoniumchlorid, 10 mM Tris
pH 8,2% CTAB, 0,5 mg Proteinase K/ml und 0,5 mg Lysozym/ml hergestellt.
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Es
wird eine Lösung II aus 600 μg/ml polyadenyl RNA,
107 Kopien/ml Kontroll DNA Fragment Plasmid
pCONT, 1% Trehalose und 50 mM TrisCl, pH 8, hergestellt.
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Lösung
I und II werden im Verhältnis 40:1 gemischt
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Die
Lösung wird in 400 μl Portionen in verschließbaren
2 ml Reaktionsgefäßen eingefroren. Dann werden
diese Gefäße mit Inhalt gefriergetrocknet, sie
werden im weiteren Text Extraction Tubes Bacteria genannt.
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Ausführungsbeispiel 2
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Erstellung einer Mixtur entsprechend der
hier beschriebenen Erfindung für die Lyse von diagnostische
Proben, die Viren enthalten.
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Es
wird eine Lösung I aus 1,5 M Ammoniumchlorid, 10 mM Tris
pH 8,2% CTAB und 0,5 mg Proteinase K/ml hergestellt.
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Es
wird eine Lösung II aus 600 μg/ml polyadenyl RNA,
107 Kopien/ml Kontroll DNA Fragment Plasmid
pCONT, 108 Kopien/ml Kontroll RNA Fragment,
1% Trehalose und 50 mM TrisCl, pH 8, hergestellt.
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Lösung
I und II werden im Verhältnis 40:1 gemischt
-
Die
Lösung wird in 400 μl Portionen in verschließbaren
2 ml Reaktionsgefäßen eingefroren. Dann werden
diese Gefäße mit Inhalt gefriergetrocknet, sie
werden im weiteren Text Extraction Tube Virus genannt.
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Ausführungsbeispiel 3
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Standardisierte Extraktion von viraler
RNA (Influenza A Virus) und viraler DNA (HBV) mittels der angesetzten
Lysemixtur über Spin Filter
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Serumproben
(200 μl) mit den entsprechenden Viren in bekannter Kopienzahl
(HBV 500 Kopien pro Präparation) oder in abgeschätzter
Titerzahl (Influenza A Virus) werden zur Extraktion eingesetzt.
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In
ein Extraction Tube Virus mit der Mixtur für Virus Lyse
werden 200 μl Serum und 200 μl Wasser gegeben
und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation
für 15 min bei 65°C in einem Eppendorf Thermomixer
unter kontinuierlichem Schütteln dann wird für
10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es
folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels
mehrmaligem auf und ab pipettieren. Das Lysat wird auf einen Spin
Filter der Firma Invitek gegeben und eine Minute bei Raumtemperatur
inkubiert. Danach wird für eine Minute bei 10 000 rpm in
einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Spin Filter wird
zweimal mit einem Waschpuffer bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70%
Ethanol gewaschen. Der Spin Filter wird für fünf Minuten
trocken zentrifugiert. Es erfolgt eine Elution mit 100 μl
RNase/Dnase freiem Wasser wobei drei Minuten vorinkubiert und dann
zentrifugiert wird.
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Die
Viren und die Extraktions-Kontrollen werden über quantitative
PCR Systeme oder über quantitative Reverse Transcriptase
PCR Systeme nachgewiesen.
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Für
Influenza A und HBV werden Nachweissysteme der Firma Congen verwendet
(Avian Influenza A, Hepatitis B Virus). Für den Nachweis
DNA und RNA Extraktions Kontrollen werden Systeme der Firma Invitek
verwendet (DNA Control Detection Assay, RNA Control Detection Assay.
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5 μl
Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden
auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den
vorgegebenen Handbüchern durchgeführt.
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Ausführungsbeispiel 4
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Standardisierte Extraktion von viraler
RNA (Influenza A Virus) und viraler DNA (HBV) mittels der angesetzten
Lysemixtur über Silika Magnetpartikel
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Serumproben
(200 μl) mit den entsprechenden Viren in bekannter Kopienzahl
(HBV 500 Kopien pro Präparation) oder in abgeschätzter
Titerzahl (Influenza A Virus) werden zur Extraktion eingesetzt.
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In
ein Extraction Tube Virus mit der Mixtur für Viruslyse
werden 200 μl Serum und 200 μl Wasser gegeben
und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine Inkubation
für 15 min bei 65°C in einem Eppendorf Thermomixer
unter kontinuierlichem Schütteln dann wird für
10 min bei 95°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es
folgt die Zugabe von 400 μl Isopropanol und Mischen mittels
mehrmaligem auf und ab pipettieren. Zum Lysat werden 20 μl
MAP A Solution der Firma Invitek gegeben, es wird für fünf
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Magnetpartikel werden
durch einen Magnetseparator, KingFisher mL, der Firma Thermo, währenddessen
gemischt. Dann werden die Magnetpartikel in zwei aufeinanderfolgenden
Kavitäten mit dem Waschpuffer, bestehend aus 10 mM Tris
pH 8, 70% Ethanol, gewaschen. Die Magnetpartikel werden danach für
10 Minuten bei Raumtemperatur zur Entfernung des Alkohols getrocknet.
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Es
erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/DNase freiem Wasser
in einer weiteren Kavität, wobei drei Minuten gemischt
und danach die Magnetpartikel absepariert werden.
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Die
Viren und die Extraktions-Kontrollen werden über quantitative
PCR Systeme oder über quantitative Reverse Transkriptase
PCR Systeme nachgewiesen.
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Für
Influenza A und HBV werden Nachweissysteme der Firma Congen verwendet
(Avian Influenza A, Hepatitis B Virus). Für den Nachweis
DNA und RNA Extraktions Kontrollen werden Systeme der Firma Invitek
verwendet (DNA Control Detection Assay, RNA Control Detection Assay).
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5 μl
Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden
auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den
vorgegebenen Handbüchern durchgeführt.
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Ausführungsbeispiel 5
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Standardisierte Extraktion von bakterieller
DNA (Bacillus subtilis) mittels der angesetzten Lysemixtur über
Spin Filter
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Proben
Bakterienpellets aus verschieden Mengen Kultur von Bacillus subtilis
werden zur Extraktion eingesetzt.
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In
ein Extraction Tube mit der Mixtur für Bakterienlyse werden
zusammen mit 400 μl Wasser die Bakterien aus den Pellets
eingebracht und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine
Inkubation für 20 min bei 37°C in einem Eppendorf
Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln, dann wird
für 15 min bei 65°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert,
als letzter Schritt wird dann für 10 min bei 95°C
im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl
Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren.
Das Lysat wird auf einen Spin Filter der Firma Invitek gegeben und
eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird für
eine Minute bei 10 000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert.
Der Spin Filter wird zweimal mit einem Waschpuffer bestehend aus
10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol gewaschen. Der Spin Filter wird für
fünf Minuten trocken zentrifugiert. Es erfolgt eine Elution mit
100 μl RNase/Dnase freiem Wasser wobei drei Minuten vorinkubiert
und dann zentrifugiert wird.
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Die
Bakterien und die Extraktions-Kontrolle werden über quantitative
PCR Systeme nachgewiesen.
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Für
Bacillus subtilis wird eine von Invitek zusammengesetzte Kontrollreaktion über
SYBR Green Färbung verwendet. Für den Nachweis
der DNA Extraktions Kontrolle wird ein System der Firma Invitek verwendet
(DNA Control Detection Assay).
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5 μl
Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden
auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den
vorgegebenen Handbüchern bzw. der Laborvorschrift für
Bacillus subtilis durchgeführt.
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Ausführungsbeispiel 6
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Standardisierte Extraktion von bakterieller
DNA (Bacillus subtilis) mittels der angesetzten Lysemixtur über
Silika Magnetpartikel
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Proben
Bakterienpellets aus verschieden Mengen Kultur von Bacillus subtilis
werden zur Extraktion eingesetzt.
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In
ein Extraction Tube mit der Mixtur für Bakterienlyse werden
zusammen mit 400 μl Wasser die Bakterien aus den Pellets
eingebracht und es wird gründlich gemischt. Es folgt eine
Inkubation für 20 min bei 37°C in einem Eppendorf
Thermomixer unter kontinuierlichem Schütteln, dann wird
für 15 min bei 65°C im Eppendorf Thermomixer inkubiert,
als letzter Schritt wird dann für 10 min bei 95°C
im Eppendorf Thermomixer inkubiert. Es folgt die Zugabe von 400 μl
Isopropanol und Mischen mittels mehrmaligem auf und ab pipettieren.
Zum Lysat werden 20 μl MAP A Solution der Firma Invitek
gegeben, es wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Magnetpartikel werden durch einen Magnetseparator,
KingFisher mL, der Firma Thermo, währenddessen gemischt.
Dann werden die Magnetpartikel in zwei aufeinanderfolgenden Kavitäten
mit dem Waschpuffer, bestehend aus 10 mM Tris pH 8, 70% Ethanol,
gewaschen. Die Magnetpartikel werden danach für 10 Minuten
bei Raumtemperatur zur Entfernung des Alkohols getrocknet.
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Es
erfolgt eine Elution mit 100 μl RNase/Dnase freiem Wasser
in einer weiteren Kavität, wobei drei Minuten gemischt
und danach die Magnetpartikel absepariert werden. Die Bakterien
und die Extraktions-Kontrolle werden über quantitative
PCR Systeme nachgewiesen.
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Für
Bacillus subtilis wird eine von Invitek zusammengesetzte Kontrollreaktion über
SYBR Green Färbung, die hier nicht veröffentlicht
werden soll, verwendet. Für den Nachweis der DNA Extraktions-Kontrolle
wird ein System der Firma Invitek verwendet (DNA Control Detection
Assay).
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5 μl
Eluat werden als Template eingesetzt, und die Prozeduren werden
auf einem Rotorgene 3000 Gerät der Firma Corbett nach den
vorgegebenen Handbüchern bzw. der Laborvorschrift für
Bacillus subtilis durchgeführt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 5234809 [0004]
- - DE 19840531 [0007]
- - WO 0034463 [0015, 0016]
- - WO 03040386 [0016, 0017, 0017, 0066, 0067]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 [0003]