DE69533317T2

DE69533317T2 - Isolierung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69533317T2
Application number: DE69533317T
Authority: DE
Inventors: Arne Helge Deggerdal; Frank Larsen
Original assignee: Dynal Biotech ASA
Current assignee: Life Technologies AS
Priority date: 1994-12-12
Filing date: 1995-12-12
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2015-12-13
Also published as: US20090149646A1; DE69533317D1; AU706211B2; US20080300396A1; CA2207608A1; US20140291576A1; US20060058519A1; US20110251382A1; US20070190559A1; EP0796327B1; US8691969B2; US7989614B2; EP0796327A2; CA2207608C; WO1996018731A3; JP3787354B2; US7173124B2; AU4182996A; US20090068724A1; JPH11501504A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung von Nukleinsäure und insbesondere die Isolierung von DNA oder RNA aus Zellen.
Die Isolierung von DNA oder RNA ist ein wichtiger Schritt bei vielen biochemischen und diagnostischen Verfahren. Beispielsweise ist die Abtrennung von Nukleinsäuren aus den komplexen Gemischen, in denen sie sich oft befinden, häufig notwendig, ehe andere Untersuchungen und Verfahren, z. B. Nachweis, Klonierung, Sequenzierung, Amplifikation, Hybridisierung, cDNA-Synthese usw. durchgeführt werden können; die Anwesenheit von großen Mengen an zellulärem oder anderem verunreinigenden Material, z. B. Proteine oder Kohlenhydrate, in solchen komplexen Gemischen behindert oft viele der in der Molekularbiologie verwendeten Reaktionen und Verfahren. Außerdem kann DNA RNA-Präparationen verunreinigen und umgekehrt. Folglich werden Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Gemischen wie etwa Zellen, Geweben usw. benötigt, nicht nur im Hinblick auf den präparativen Aspekt sondern auch bei den vielen heutzutage verwendeten Verfahren, welche auf die Identifizierung von DNA oder RNA angewiesen sind, beispielsweise die Diagnose von mikrobiellen Infektionen, die forensische Wissenschaft, Gewebe- und Bluttypisierung, Nachweis von genetischen Variationen usw.
Im Hinblick auf die Identifizierungen von RNA ist es für eine eindeutige Diagnose wichtig, dass sicher ist, dass die nachgewiesene Sequenz von einem RNA-Molekül stammt und nicht von einer Verunreinigung mit genomischer DNA in der Probe. Aus diesem Grund sind Verfahren für die Trennung der RNA von DNA wichtig. Für die RNA-Isolierung sind auch schnelle Verfahren erforderlich, da RNA-Moleküle normalerweise sehr instabil sind und von den in Zellen und Körperflüssigkeiten vorhandenen RNAsen schnell abgebaut werden. Die Qualität der RNA ist wahrscheinlich der wichtigste Faktor bei der Bestimmung der Qualität der Endergebnisse in Protokollen unter Verwendung von mRNA, insbesondere für die cDNA-Synthese. Es ist aus mehreren Gründen wichtig, eine DNA-Kontamination von RNA-Präparationen zu vermeiden. Erstens erhöht DNA die Viskosität, was die Handhabung der Probe erschwert, zu einer schlechten RNA-Ausbeute und auch zu einer qualitativ schlechten RNA führt, mit der Wahrscheinlichkeit einer DNA-Kontamination. Eine DNA-Kontamination kann auch RNAse-Enzyme abfangen und Anwendungen stromabwärts wie etwa eine RT-PCR wertlos machen.
Für die Isolierung von Nukleinsäuren ist eine Reihe von Verfahren bekannt, aber im Allgemeinen beruhen diese auf einer komplexen Reihe von Extraktions- und Waschschritten und sind zeitaufwändig und umständlich durchzuführen. Außerdem ist oft die Verwendung von Materialien wie etwa Alkohole und andere organische Lösungsmittel, chaotropen Substanzen und Proteinasen betroffen, was nachteilig ist, da solche Materialien dazu neigen, viele enzymatische Reaktionen und andere Verarbeitungsapplikationen stromabwärts zu stören.
Folglich betreffen die klassischen Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien wie etwa Blut oder Blutprodukten oder Gewebe die Lyse des biologischen Materials durch ein Detergens oder eine chaotrope Substanz, möglicherweise in Gegenwart von proteinabbauenden Enzymen, gefolgt von mehreren Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Phenol und/oder Chloroform, eine Ethanolpräzipitation, Zentrifugationen und eine Dialyse der Nukleinsäuren. Die Reinigung der RNA von DNA kann eine selektive Präzipitation mit LiCl oder eine selektive Isolierung mit saurem Guanidiniumthiocyanat in Kombination mit Phenolextraktionen und einer Ethanolpräzipitation betreffen. Solche Verfahren sind nicht nur umständlich und zeitaufwändig in der Durchführung, die relativ große Anzahl von erforderlichen Schritten steigert auch das Risiko eines Abbaus, Probenverlusts oder einer Kreuzkontamination von Proben, wenn mehrere Proben gleichzeitig bearbeitet werden. Im Fall einer RNA-Isolierung ist das Risiko einer Kontamination mit DNA relativ hoch.
Bei der Reinigung von RNA ist es häufig erwünscht, speziell mRNA zu isolieren. Die meisten mRNA-Reinigungsstrategien betreffen die Isolierung von Gesamt-RNA und Fraktionierung der isolierten RNA. Die Präparation von mRNA mit hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt bei der Analyse der Genstruktur und Genregulierung.
Die meisten eukaryontischen mRNAs besitzen einen Poly(A)-Schwanz, der normalerweise eine Länge von etwa 50–300 Nukleotiden aufweist. Solche mRNA wird als polyadenylierte oder Poly(A)⁺-mRNA bezeichnet. Durch Abtrennung dieser polyadenylierten RNA von der nicht adenylierten RNA, welche 95% oder mehr der Gesamt-RNA einer Zelle ausmacht, wird dieser Poly(A)-Schwanz ausgenutzt und es wird eine Art einer Aftinitätsabtrennung, welche gegen den Poly(A)-Schwanz gerichtet ist, durchgeführt. Die konventionelle Technologie hat die Reinigung von Gesamt-RNA als einen ersten Schritt und die Auswahl von Poly(A)⁺-RNA durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Oligo(dT)-Zellulose als den zweiten Schritt betroffen. Diese Strategie ist ziemlich zeitaufwändig und arbeitsintensiv. Eine alternative Strategie für die Reinigung von mRNA ist die Verwendung von Trägermaterialien wie etwa Mikroplatten, Latex, Agarose oder Magnetbeads, an welche Oligo(dT) gebunden ist.
Während der letzten vier Jahre ist die Anwendung einer durch Magnetbeads unterstützte Strategie für eine Poly(A)⁺-RNA-Selektion zunehmend beliebt geworden, da sich diese Beads bei mRNA-Bearbeitungen als günstig erwiesen haben. In vielen Ansätzen hängen die Ausbeute und die Qualität der Produkte davon ab, wie schnell die mRNA von Nukleasen und anderen Kontaminationen gereinigt werden kann. Unter Verwendung der Trenntechnologie mit Magnetbeads kann intakte Poly(A)⁺-RNA entweder aus Gesamt-RNA-Präparationen oder, wichtiger, direkt aus rohen Lysaten von festen Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten schnell erhalten werden. Das gesamte Verfahren kann in einem Mikrozentrifugenröhrchen ohne Phenolextraktionen oder Ethanolpräzipitationen durchgeführt werden.
Ein bei der RNA-Reinigung üblicher Ansatz, welcher in Verbindung mit dem Festphasenlansatz verwendet werden kann, ist die Durchführung der Lyse des biologischen Materials und die nachfolgende Hybridisierung an Oligo-dT in LiCl und LiDS/SDS-Puffern, wobei Extraschritte wie etwa eine Phenolextraktion oder ein Proteinase K-Verdau vermieden wird. Die gesamte direkte mRNA-Isolierung dauert ungefähr 15 min und da die mRNA für mehr als 30 min im Lysepuffer stabil ist, stellt das die hohe Qualität der gereinigten mRNA sicher. Aber ein Nachteil dieses Verfahrens ist der, dass die mRNA pro Gewichtseinheit an Gewebe durch die Menge des verwendeten Gewebes beeinflusst wird und oberhalb eines kritischen Schwellenwerts an lysierten Zellen die Ausbeute der mRNA sinkt.
Ein anderer üblicher Ansatz für eine direkte mRNA-Isolierung ist, wie oben erwähnt, die Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat (GTC) und Sarkosyl. Ein GTC-Puffersystem wird aufgrund der Fähigkeit dieses chaotropen Salzes, RNAsen zu hemmen, von den meisten Wissenschaftlern bevorzugt. Dies kann auch in Kombination mit dem Magnetbead-Ansatz verwendet werden. Aber die Viskosität von Zelllysaten in 4 M GTC ist hoch und die Beads werden nicht effizient von dem Magneten angezogen, was sowohl bei Beads als auch bei anderen Festphasen ein gesteigertes Risiko einer DNA-Kontamination und geringere Ausbeuten ergibt.
Kürzlich wurden andere Verfahren vorgeschlagen, welche von der Verwendung einer Festphase abhängen. In US-A-5,234,809 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei dem Nukleinsäuren in Gegenwart eines chaotropischen Mittels wie etwa einem Guanidiniumsalz an eine Festphase in Form von Silicapartikeln gebunden wird und dabei vom Rest der Probe abgetrennt wird. WO 91/12075 beschreibt ein Verfahren, bei dem eine Nukleinsäure an der Oberfläche einer Festphase mittels Präzipitation abgefangen wird. Im Allgemeinen werden Alkohole und Salz als Präzipitationsmittel verwendet.
Obwohl solche Verfahren den Trennungsprozess der Nukleinsäure beschleunigen, gibt es Nachteile, welche mit der Verwendung von Alkoholen, chaotropen Substanzen und anderen ähnlichen Mitteln verbunden sind. Chaotrope Substanzen müssen mit einer hohen Molarität verwendet werden, was viskose Lösungen ergibt, mit welchen eine Bearbeitung schwierig sein kann, insbesondere bei der Arbeit mit RNA. Amplifikationsverfahren wie etwa PCR und andere, auf Enzymen basierende Reaktionen sind sehr sensitiv gegenüber den hemmenden oder anderweitig störenden Wirkungen von Alkoholen und anderen Mitteln. Außerdem ist bekannt, dass das Trocknen des Nukleinsäurepellets, welches nach einer Alkoholpräzipitation notwendig ist, und die Probleme beim Lösen von Nukleinsäuren auch zu Artefakten bei auf Enzymen basierenden Verfahren wie etwa der PCR führen. Da solche Verfahren nun eine Stütze der Molekularbiologie sind, besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren der Nukleinsäureisolierung und insbesondere an Verfahren, welche schnell und einfach durchzuführen sind, und welche die Verwendung von chaotropen Substanzen oder eine Alkoholpräzipitation vermeiden. Es besteht auch ein Bedarf an einem Verfahren, welches die Differenzierung zwischen RNA und DNA ermöglicht und eine gesonderte Isolierung von beiden Arten der Nukleinsäure aus der gleichen Probe ermöglicht. Die vorliegende Erfindung möchte solche Verfahren bereitstellen.
Insbesondere ist nun gefunden worden, dass Nukleinsäure in einer Form aus einer Probe isoliert werden kann, welche für eine Amplifikation oder andere Verfahren stromabwärts geeignet ist, durch ein einfach und leicht durchzuführendes Verfahren, das die Behandlung der Probe mit einem Detergens betrifft und es ermöglicht, dass die Nukleinsäure an ein Trägermaterial gebunden wird, woraufhin die Nukleinsäure beispielsweise durch Entfernen des Trägers leicht von der Probe getrennt werden kann. Die Bindung der Nukleinsäure ist unabhängig von ihrer Sequenz.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren bereit zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem Detergens und einem partikulären Trägermaterial umfasst, wobei lösliche Nukleinsäure in der Probe mittels sequenzunabhängiger Bindung in Gegenwart des Detergens und ohne chaotropes Mittel an die Oberfläche des Trägers gebunden wird, und Abtrennen des Trägers mit der gebundenen Nukleinsäure von der Probe.
Die Nukleinsäure kann DNA, RNA oder eine beliebige natürlich vorkommende oder synthetische Modifikation davon und Kombinationen davon sein. Bevorzugt ist die Nukleinsäure aber DNA, welche genomisch oder cDNA sein kann und einzel- oder doppelsträngig oder in einer anderen beliebigen Form vorliegen kann.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, um DNA zu isolieren, kann es günstigerweise mit einem weiteren Schritt gekoppelt werden, um RNA aus der gleichen Probe zu isolieren. Die Verwendung des Verfahrens in solchen Zweischritt-RNA-Trennungen wird unten ausführlicher beschrieben.
Die Proben können ein beliebiges Material darstellen, das Nukleinsäure enthält, einschließlich beispielsweise Nahrungsmittel und ähnliche Produkte, klinische Proben und Umweltproben. Aber im Allgemeinen ist die Probe eine biologische Probe, welche ein beliebiges virales oder zelluläres Material enthalten kann, umfassend alle prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, Viren, Bakteriophagen, Mycoplasmen, Protoplasmen und Organellen. Solch ein biologisches Material kann folglich alle Arten von tierischen Zellen von Säugetieren und Nicht-Säugetieren, Pflanzenzellen, Algen einschließlich Blaugrünalgen, Pilzen, Bakterien, Protozoen usw. umfassen. Beispielhafte Proben umfassend folglich Gesamtblut und von Blut stammende Produkte wie etwa Plasma, Serum und Buffy Coat, Urin, Stuhl, Rückenmarksflüssigkeit oder beliebige andere Körperflüssigkeiten, Gewebe, Zellkulturen, Zellsuspensionen usw.
Die Probe kann auch relativ reine Ausgangsmaterialien wie etwa ein PCR-Produkt oder halbreine Präparationen enthalten, welche durch andere Gewinnungsverfahren für Nukleinsäure erhalten werden.
Die Nukleinsäure enthaltende Probe kann im Allgemeinen leicht mit dem Detergens und einer Festphase kontaktiert werden, welche vor, gleichzeitig mit oder nach dem Detergens zugegeben werden kann. Falls nötig, können dem ein oder mehrere verschiedene Schritte vorangestellt werden, um Strukturkomponenten wie etwa Zellwände zu zerstören oder eine Lyse zu erreichen. Verfahren, um dieses zu erreichen, sind im Fachgebiet gut bekannt. Obwohl einige Zellen, beispielsweise Blutzellen, durch das Detergens alleine lysiert werden können, können folglich beispielsweise andere Zellen, z. B. Pflanzen- oder Pilzzellen oder feste tierische Gewebe, eine kräftigere Behandlung erfordern wie etwa beispielsweise Mahlen in flüssigem Stickstoff, Erhitzen in Gegenwart des Detergens, eine alkalische Lyse in Gegenwart des Detergens. Für Proben, beispielweise in Form von Paraffinschnitten und dergleichen kann eine Lyse (und Schmelzen des Paraffins) durch Erhitzen bewirkt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Mikrowelle (Banerjee, S. K. et al., 1995, Biotechniques 18: 769–773). Auch be stimmte kompaktere Gewebe können eine Enzymbehandlung erfordern, beispielsweise unter Verwendung von Proteinase K, um eine ausreichende Freisetzung der Nukleinsäure zu erhalten. Die verschiedenen Bestandteile werden gemischt und einfach für eine geeignete Zeitdauer stehen gelassen, damit die Nukleinsäure an den Träger binden kann. Falls andere Agenzien wie etwa Enzyme, z. B. Proteinase K, verwendet werden, können sie günstigerweise in dem Detergens enthalten sein. Der Träger wird dann aus der Lösung durch ein beliebiges günstiges Mittel entfernt, welches natürlich von der Art des Trägers abhängt und alle Formen zum Entfernen des Trägers aus dem Probenüberstand oder umgekehrt enthält, beispielsweise Zentrifugation, Dekantieren, Pipettieren usw.
Die Bedingungen während dieses Verfahrens sind nicht kritisch, und es hat sich beispielsweise als günstig erwiesen, die Probe einfach mit dem Detergens in Gegenwart einer Festphase zu mischen und sie bei Raumtemperatur für 5–20 min vor der Trennung stehen zu lassen. Wie oben erwähnt, ist die Reaktionsdauer nicht kritisch und oftmals sind bereits 5 min ausreichend. Falls es praktischer ist, können aber längere Zeiträume verwendet werden, beispielsweise 0,5–3 h oder sogar über Nacht. Das Mischen kann durch ein beliebiges zweckmäßiges Mittel durchgeführt werden einschließlich beispielsweise einer einfachen Bewegung durch Rühren oder Schütteln. Falls erwünscht, können auch höhere oder niedrigere Temperaturen verwendet werden, dies ist aber nicht notwendig.
Das Detergens kann ein beliebiges Detergens sein und es ist eine riesige Anzahl bekannt und in der Literatur beschrieben. Folglich kann das Detergens ionisch sein, einschließlich anionisch und kationisch, nicht ionisch oder zwiterionisch. Der Begriff "ionisches Detergens" wie hierin verwendet, umfasst ein beliebiges Detergens, welches bei Lösung in Wasser teilweise oder vollständig in ionischer Form vorliegt. Es hat sich gezeigt, dass anionische Detergenzien besonders gut funktionieren und bevorzugt werden. Geeignete anionische Detergenzien umfassen beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) oder andere Alkalimetallalkylsulfatsalze oder ähnliche Detergenzien, Sarkosyl oder Kombinationen davon.
Praktischerweise kann das Detergens in einer Konzentration von 0,2 bis 30% (w/v) verwendet werden, beispielsweise von 0,5 bis 30%, bevorzugt von 0,5 bis 15%, mehr bevorzugt von 1 bis 10%. Bei anionischen Detergenzien hat sich gezeigt, dass Konzentrationen von 1,0 bis 5%, beispielsweise von 0,5 bis 5% gut funktionieren.
Das Detergens kann in einer einfachen wässrigen Lösung bereitgestellt werden, welche alkalisch oder sauer sein kann, oder mehr bevorzugt in einem Puffer. Es kann jeder beliebige geeignete Puffer verwendet werden, einschließlich beispielsweise Tris, Bicine, Tricine und Phosphatpuffer. Praktischerweise kann eine Quelle monovalenter Kationen, z. B. ein Salz, enthalten sein, um das Einfangen der Nukleinsäure zu verbessern, obwohl dies nicht notwendig ist. Geeignete Salze umfassen Chloridsalze, z. B. Natriumchlorid, Lithiumchlorid usw. bei Konzentrationen von 0,1 bis 1 M, beispielsweise von 250 bis 500 mM. Wie oben erwähnt, können andere Bestandteile wie etwa Enzyme auch enthalten sein.
Andere optionale Bestandteile in der Detergenszusammensetzung umfassen Chelatbildner, z. B. EDTA, EGTA, und andere Polyaminocarbonsäuren, günstigerweise bei Konzentrationen von 1 bis 50 mM usw., Reduktionsmittel wie etwa Dithiotreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol bei Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 10 mM.
Bevorzugte Detergenszusammensetzungen können beispielsweise umfassen:
100 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM EDTA
2% SDS
oder:
100 mM TrisCl pH 7,5
10 mM EDTA
5% SDS
10 mM NaCl
oder:
100 mM TrisCl pH 7,5
500 mM LiCl
10 mM EDTA
1% LiDS
Das Detergens fungiert in dem Verfahren so, dass das Nukleinsäure enthaltende Material lysiert wird, beispielsweise dass die Zellen und Nuklei die Nukleinsäure freisetzen. Es wird auch angenommen, dass das Detergens bei der Zerstörung der Bindung von Proteinen, beispielsweise DNA bindenden Proteinen, an die Nukleinsäure hilfreich ist und das Problem von Kontaminationen in der Probe, welche dem Trägermaterial anhaften, verringert.
Das partikuläre Trägermaterial kann ein beliebiges der bekannten Träger oder Matrizen sein, welche für die Immobilisierung, Trennung usw. gegenwärtig weithin verwendet oder vorgeschlagen werden.
Günstigerweise kann der Träger aus Glas, Silica, Latex oder einem Polymermaterial bestehen. Bevorzugt sind Materialien, welche für die Bindung der Nukleinsäure eine große Oberfläche bereitstellen. Obwohl eine Bindung an theoretische Betrachtungen nicht erwünscht ist, wird angenommen, dass der Bindungsprozess der Nukleinsäure dadurch unterstützt werden kann, dass die Nukleinsäure um den Träger "herumgewickelt wird". Solche Träger besitzen im Allgemeinen eine unregelmäßige Oberfläche und können beispielsweise porös sein. Partikuläre Materialien, beispielsweise Beads, sind aufgrund ihrer größeren Bindungskapazität im Allgemeinen bevorzugt, insbesondere polymere Beads.
Günstigerweise umfasst ein partikuläres Trägermaterial, welches erfindungsgemäß verwendet wird, sphärische Beads. Die Größe der Beads ist nicht kritisch, aber sie können beispielsweise im Durchmesserbereich von mindestens 1 und bevorzugt mindestens 2 μm liegen und einen maximalen Durchmesser von bevorzugt nicht mehr als 10 und mehr bevorzugt nicht mehr als 6 μm aufweisen. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass Beads mit einem Durchmesser von 2,8 μm und 4,5 μm besonders gut funktionieren.
Monodisperse Partikel, das bedeutet, solche Partikel, die im Wesentlichen eine einheitliche Größe aufweisen (beispielsweise eine Größe mit einer Standardabweichung des Durchmessers von weniger als 5%), besitzen den Vorteil, dass sie eine sehr einheitliche Reproduzierbarkeit der Reaktion bereitstellen. Monodisperse Polymerpartikel, welche durch das in US-A-4,336,173 beschriebene Verfahren hergestellt werden, sind besonders geeignet.
Nicht magnetische Polymerbeads, die zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind von Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norwegen) ebenso wie von Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich.
Um die Manipulation und Trennung zu unterstützen, sind jedoch magnetische Beads bevorzugt. Der Begriff "magnetisch", wie hierin verwendet, bedeutet, dass der Träger einen magnetischen Moment aufweisen kann, der ihm verliehen wird, wenn er in einem Magnetfeld platziert wird, und folglich unter der Wirkung dieses Felds verschoben werden kann. Mit anderen Worten, ein Träger, der magnetische Partikel umfasst, kann leicht durch magnetische Aggregation entfernt werden, wodurch ein schneller, einfacher und effizienter Weg der Trennung der Partikel nach dem Nukleinsäurebindungsschritt bereitgestellt wird, und das ist ein weit weniger rigoroses Verfahren als traditionelle Verfahren wie etwa eine Zentrifugation, wobei Scherkräfte erzeugt werden, welche Nukleinsäuren degradieren können.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können folglich die magnetischen Partikel mit daran haftender Nukleinsäure auf einer geeigneten Oberfläche durch Anwendung eines Magnetfelds entfernt werden, beispielsweise unter Verwendung eines Dauermagneten. Es ist normalerweise ausreichend, einen Magneten an die Seite des Gefäßes anzulegen, welches das Probengemisch enthält, um die Partikel an der Wand des Gefäßes zu aggregieren und den Rest der Probe wegzuschütten.
Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, beispielsweise die von Sintef in EP-A-106 873 beschriebenen Partikel, da die magnetische Aggregation und das Klumpen der Partikel während der Reaktion vermieden werden kann, wodurch eine einheitliche Nukleinsäureextraktion sichergestellt wird. Die gut bekannten magnetischen Partikel, welche von Dynal AS (Oslo, Norwegen) als DYNABEADS verkauft werden, sind für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet.
Funktionalisierte, beschichtete Partikel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch Modifikation der Beads hergestellt werden gemäß den US-Patenten 4,336,173, 4,459,378 und 4,654,264. Folglich können Beads oder andere Träger mit verschiedenen Arten einer funktionalisierten Oberfläche her gestellt werden, beispielsweise positiv geladen oder hydrophob. Schwach und stark positiv geladene Oberflächen, schwach negativ geladene neutrale Oberflächen und hydrophobe Oberflächen, z. B. mit Polyurethan beschichtete Oberflächen, haben sich als gut funktionierend erwiesen.
Es ist auch möglich, Trägermaterialien zu verwenden, welche so modifiziert worden sind, dass sie das selektive Einfangen von gewünschten Zellen, Viren usw. erlauben, welche die Nukleinsäure enthalten. Folglich können beispielsweise Träger verwendet werden, welche Antikörper oder andere Bindungsproteine tragen, die für einen gewünschten Zelltyp spezifisch sind. Dies kann einen Selektivitätsgrad in die Isolierung der Nukleinsäure einbringen, da nur Nukleinsäure von einer gewünschten Zielquelle innerhalb eines komplexen Gemischs abgetrennt werden kann. Folglich kann beispielsweise solch ein Träger verwendet werden, um den gewünschten Zelltyp usw. aus der Probe abzutrennen und zu entfernen, danach wird das Detergens zugegeben, um eine Lyse, eine Freisetzung der Nukleinsäure und eine Bindung an den Träger zu erreichen.
Die Präparation von solchen selektiven Zelleinfangmatrizen ist im Stand der Technik gut bekannt und wird in der Literatur beschrieben.
Ebenso kann der Träger mit Bindungspartnern bereitgestellt werden, um das selektive Einfangen der Nukleinsäuren zu unterstützen. Beispielsweise können komplementäre DNA- oder RNA-Sequenzen oder DNA-Bindungsprotein verwendet werden, oder virale Proteine, welche an virale Nukleinsäure binden. Die Anheftung von solchen Proteinen an das Trägermaterial kann erreicht werden unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Obwohl es nicht notwendig ist, kann es günstig sein, einen oder mehrere Waschschritte in das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren einzubringen, beispielsweise nach der Abtrennung des Trägers aus der Probe. Im Fall von magnetischen Beads kann dies günstigerweise durchgeführt werden, ehe die DNA von den Beads freigesetzt wird. Es können beliebige konventionelle Waschpuffer oder andere Medien verwendet werden. Im Allgemeinen sind Puffer mit einer niedrigen bis moderaten Ionenstärke bevorzugt, z. B. 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0/10 mM NaCl. Falls erwünscht, können auch andere Standardwaschmedien verwendet werden, z. B. Waschmedien, welche Alkohole enthalten.
Nach dem Abtrennungsschritt und beliebigen optionalen Waschschritten, welche erwünscht sein können, kann der Träger, welcher die Nukleinsäure trägt, übertragen werden, z. B. resuspendiert oder eingetaucht in ein beliebiges geeignetes Medium, z. B. Wasser oder Puffer mit einer geringen Ionenstärke. In Abhängigkeit von dem Träger und der Art der gewünschten nachfolgenden Bearbeitung kann es wünschenswert sein oder nicht, die Nukleinsäure von dem Träger abzulösen.
Im Fall eines partikulären Trägermaterials, wie etwa magnetische oder nicht magnetische Beads, kann dieses in vielen Fällen direkt verwendet werden, beispielsweise in einer PCR oder anderen Amplifikationen, ohne die Nukleinsäure vom Träger zu eluieren. Auch für viele Verfahren des Nachweises oder der Identifizierung von DNA ist eine Elution nicht notwendig, da im Allgemeinen ausreichende Längen der DNA vorliegen, welche für die Hybridisierung an Oligonukleotide und für eine Amplifikation ausreichend sind, obwohl die DNA mit der Oberfläche der Beads auf zufällige Art und Weise in Kontakt ist und an einer Vielzahl von Punkten durch Wasserstoffbindung oder ionische oder andere Kräfte gebunden ist.
Aber, falls erwünscht, kann die Elution der Nukleinsäure leicht erreicht werden durch Verwendung bekannter Mittel, beispielsweise durch Erhitzen, z. B. auf 65°C für 5–10 min, und danach kann der Träger aus dem Medium entfernt werden, wobei die Nukleinsäure in Lösung bleibt. Solch ein Erhitzen wird bei einer PCR automatisch durch den DNA-Denaturierungsschritt erhalten, welcher dem Zyklusprogramm vorangeht.
Falls es erwünscht ist, RNA von der DNA zu entfernen, kann dies erreicht werden durch Zerstörung der RNA vor dem DNA-Abtrennschritt, beispielsweise durch Zugabe einer RNAse oder einer Lauge wie etwa NaOH.
Wie oben erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren alternativ verwendet werden, um nacheinander DNA und RNA aus der Probe abzutrennen. Es kann auch verwendet werden, um in einem Verfahren für die RNA-Reinigung DNA aus einer Probe zu entfernen.
Günstigerweise kann die aufeinanderfolgende Abtrennung unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Festphasen stattfinden, beispielsweise Festphasen, welche zwischen DNA und RNA unterscheiden können. Folglich kann solch ein Verfahren die Durchführung eine Abtrennung im ersten Schritt zur Isolierung von DNA wie oben beschrieben umfassen. Dann kann eine weitere Festphase zu der Probe zugegeben werden, um die in der Probe verbleibende RNA einzufangen, entweder unter Verwendung einer Festphase, welche die RNA oder eine beliebige Nukleinsäure binden kann, oder einer Festphase, welche speziell RNA-Moleküle (z. B. durch Tragen einer komplementären Nukleinsäuresonde) oder eine Unterart von RNA-Molekülen, z. B. polyadenylierte RNA einfangen kann. Auf diese Art und Weise ist es möglich, DNA und RNA oder Unterarten von beiden aus der gleichen Probe schnell zu isolieren und zu trennen. Dies kann nützlich sein, beispielsweise durch Messung der isolierten DNA, um die Menge der Zellen abzuschätzen, welche für eine RNA-Extraktion verwendet werden, wodurch eine Referenz zwischen unterschiedlichen Proben erhalten wird.
Aber das Verfahren der DNA-Isolierung der Erfindung kann auch leicht als einleitender Schritt mit anderen konventionellen Verfahren der RNA-Reinigung kombiniert werden, beispielsweise kann eine erfindungsgemäße DNA-Isolierung mit einem Detergens vor einem selektiven RNA-Präzipitationsschritt, beispielsweise unter Verwendung von LiCl oder vor einem RNA-Trennungsschritt unter Verwendung von GTC und Sarkosyl durchgeführt werden.
In einem repräsentativen Verfahren wird die Probe in Gegenwart des Detergens lysiert und die DNA kann an ein Trägermaterial binden, wodurch die DNA durch Entfernen des Trägers leicht aus der Probe abgetrennt werden kann. Falls erwünscht, kann die DNA schnell und leicht weiter gehandhabt werden bei einer Amplifikation oder anderen Verfahren stromabwärts. Dann kann die RNA isoliert werden. Dies kann mit einem auf einer Festphase basierendem System wie oben beschrieben, einschließlich einer Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfah rens, oder durch konventionelle Verfahren wie etwa Extraktionen, Präzipitationen oder Affinitätschromatographie durchgeführt werden.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Isolierungsverfahrens, um vor der Isolierung von RNA DNA aus einer Probe zu entfernen, so dass die Viskosität der lysierten Probe verringert wird und eine spezielle Isolierung von RNA-Molekülen begünstigt wird, was wiederum die Möglichkeit einer DNA-Kontamination der RNA verringert oder vermeidet. Solch ein Verfahren weist auch den Vorteil auf, dass es schnell durchzuführen ist.
Die Erfindung ist vorteilhafterweise einer Automatisierung zugänglich, insbesondere wenn Partikel und im Besonderen magnetische Partikel als Träger verwendet werden.
Die verschiedenen Reaktionspartner und Bestandteile, welche zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich sind, können günstigerweise in Form eines Kits bereitgestellt werden. Solche Kits stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Am einfachsten stellt dieser Aspekt der Erfindung ein Kit zur Isolierung von Nukleinsäure aus einer Probe bereit, umfassend ein Trägermaterial und ein oder mehrere Detergenzien.
Gegebenenfalls kann solch ein Kit Puffer, Salze, Mittel zur Lyse, beispielsweise Proteinasen, Chelatbildner und Reduktionsmittel enthalten.
Zur Isolierung von RNA können die Kits weiterhin Mittel zur Isolierung von RNA umfassen, z. B. ein zweites Trägermaterial zur Isolierung von RNA, beispielsweise einen Träger, bereitgestellt mit Sonden zum Einfangen von RNA, z. B. Oligo-dT oder Sonden mit einer komplementären Sequenz des gewünschten Ziels, oder ein chaotropes oder selektiv präzipitierendes Mittel.
Die Erfindung wird nun ausführlicher in den folgenden, nicht beschränkenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben, worin:
1 ein Scan der optischen Dichte von DNA ist, isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben (die Ordinate zeigt die Extinktion (OD), die Abszisse zeigt die Wellenlänge (nm)). Maximale Extinktion (0,427) bei 257,6 nm; die minimale Extinktion (0,292) bei 236,4 nm; bei einem Schwellenwert von 0,100;
2 eine Gelelektrophorese einer DNA-Probe zeigt, die wie in Beispiel 1 isoliert wurde (Spur 1: Isolierung; Spur 2: λ Hind III (Molekulargewichtsmarker));
3 eine Agarosegelelektrophorese des PCR-Produkts von Beispiel 2 zeigt (Spur 1: PCR-Produkt; Spur 2: λ Hind III; Spur 3: negative PCR-Kontrolle); und
4 eine Agarosegelelektrophorese des PCR-Produkts von Beispiel 5 zeigt (Spur 1: λ Hind III; Spuren 2 und 3: Isolierungen A bzw. B; Spuren 4 und 5: Negativkontrolle; Spur 6: λ Hind III).
5 zeigt den Vergleich zwischen traditionell isolierter DNA und DNA, welche mit Dynabeads DNA DIRECT isoliert wurde. Das Feld 1 zeigt die Menge der genomischen DNA, welche von 10 μl Gesamtblut mit Dynabeads DNA DIRECT einschließlich des optionalen Elutionsschritts (Spuren 1 und 2), mit Dynabeads DNA DIRECT, wobei der Elutionsschritt ausgelassen wurde (Spuren 3 und 4) und mit einer traditionellen DNA-Isolierung (Spuren 5 und 6) isoliert wurde. Der Molekulargewichtsmarker in Spur 7 ist λ Hind III. Das Feld II zeigt die Integrität der DNA, die mit Dynabeads DNA DIRECT isoliert wurde. Die Spuren 1 und 2 zeigen eine AMXY-PCR von 20 ng DNA, die mit Dynabeads DNA DIRECT von einem männlichen bzw. weiblichen Spender isoliert wurde. Die Spuren 4 und 5 zeigen eine AMXY-PCR von 200 ng DNA, die mit traditionellen Verfahren von einem weiblichen bzw. einem männlichen Spender isoliert wurde. Spur 3 ist die Negativkontrolle.
6 zeigt die Reproduzierbarkeit von Dynabeads DNA DIRECT. Die Figur zeigt fünf unabhängige Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT von jedem von zwei Spendern. Die Hälfte der aus 10 μl Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des Produkts von PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, wird im unteren Teil der Figur gezeigt. Die Molekulargewichtsmarker sind λ Hind III (die mit M bezeichnete Spur) oder eine 100 bp Leiter (die mit L bezeichnete Spur).
7 zeigt die Wirkung von verschiedenen Koagulantien. Die Figur zeigt Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT aus Gesamtblut, welches nicht antikoaguliert wurde und aus Blut, welches mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert wurde. Die zwei Isolierungen aus Blut mit dem gleichen Antikoagulans wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern (A oder B) durchgeführt. Ein Viertel der aus 10 μl Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, außer für Heparin, wobei die Hälfte der aus 5 μl erhaltenen DNA gezeigt ist. 20% des Produkts von PCR-Reaktionen, welche mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt, außer für Heparin, wobei 20% der isolierten DNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
8 zeigt die Wirkung der Lagerungsbedingungen der Probe. Feld I zeigt Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT aus EDTA-Blut, welches frisch verwendet worden ist, für 4 Tage im Kühlschrank aufbewahrt wurde oder für 4 Tage eingefroren war. Die zwei Isolierungen aus Blut mit den gleichen Lagerbedingungen wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Die Hälfte der aus 10 μl Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des Produkts von PCR-Reaktionen, welche mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Feld II zeigt Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT aus Citrat-Blut, welches frisch verwendet worden ist oder luftgetrocknet und wieder hydratisiert wurde. Die zwei Isolierungen von Blut mit den gleichen Lagerungsbedingungen wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Die Hälfte der aus 10 μl Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des Produkts von PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt.
9 zeigt Dynabeads DNA DIRECT aus Knochenmark und Kulturzellen. Feld I zeigt Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT von 1, 2 und 5 μl Knochenmark von jedem von zwei Spendern. A oder B über den Spuren bezeichnet die Identität des Spenders. Die Hälfte der erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des Produkts der PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Feld II zeigt zwei Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT von 4 × 10⁵ Daudi-Zellen. Ein Zehntel der erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des Produkts von PCR-Reaktionen, die mit 1 μl von insgesamt 120 μl isolierter DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Der Molekulargewichtsmarker für die genomische DNA ist λ Hind III und eine für die PCR-Produkte 100 bp-Leiter.
10 zeigt Dynabeads DNA DIRECT aus mit Formalin fixiertem, in Paraffin eingebettetem Material. Spur A zeigt 20% des PCR-Produkts aus einer Reaktion, die mit DNA gestartet wurde, die mittels DNA DIRECT aus einem mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitt der Leber isoliert wurde. Spur M ist ein Molekulargewichtsmarker (100 bp-Leiter), Spur B ist eine Positivkontrolle (PCR aus 20 ng humaner DNA) und Spur C ist eine Negativkontrolle (PCR aus Wasser).
11 zeigt Dynabeads DNA DIRECT bei einer mRNA-Reinigung. mRNA wurde mit Dyanbeads Oligo(dT)₂₅ nach der Entfernung von DNA mit Dynabeads DNA DIRECT aus 1 Million Daudi-Zellen pro Probe isoliert. Es wurden steigende Mengen der DNA DIRECT Dyanbeads verwendet, um die genomische DNA zu entfernen; 1 mg in Spur 1 und 2; 2 mg in Spur 3 und 4; 5 mg in Spur 5 und 6 und 10 mg in Spur 7 und B. Spur 9 und 10 sind Kontrollen, bei denen vor der direkten mRNA-Reinigung keine DNA entfernt wurde. Die zusätzlichen Banden im oberen Teil des Bildes zeigen kontaminierende genomische DNA in den Spuren 9 und 10. Die zwei starken Banden in allen Spuren stellen die ribosomale RNA dar.
12 zeigt die Ergebnisse einer DNA-Isolierung und PCR-Amplifikation aus (A) Bakterien, (B) Pilzen, (C) Algen und (D) Pflanzen. Bei allen Proben wurde die DNA mit 200 μl DNA DIRECT (1 Probentest) isoliert und 20% der isolierten DNA und 10% der PCR-Produkte wurden mittels Agaroseelektrophorese analysiert. Bei den Bakterien wurden 2,5% der isolierten DNA pro PCR-Reaktion verwendet, bei den anderen Proben wurden 5% verwendet. 16S rRNA-Regionen wurden aus bakterieller genomischer DNA und aus Chloroplasten-DNA von Algen amplifiziert. Aus der genomischen DNA von Pilzen und Algen wurde 18S rRNA amplifiziert. Eine Amplifikation der Gruppe I-Intron-Chloroplasten-trnL und Teile des genomischen B15C-Gens sind bei Pflanzen gezeigt. Die Negativkontrolle ist eine PCR von Proben, ohne dass DNA auf die gleiche Art und Weise wie in den anderen Reaktionen präpariert wurde.
Beispiel 1
DNA-Isolierung aus Zellkultur
4 × 10⁶ HL60-Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und pelletiert. Das Pellet wurde in 10 μl PBS gelöst und es wurde 1 mg Dynabeads^® M-280* (erhältlich durch Autoklavieren einer Suspension von Dynabeads^® M-280, tosylaktiviert (erhältlich von Dynal A/S, Oslo, Norwegen) in Wasser), resuspendiert in 0,1 ml Lysepuffer [5% SDS/10 mM TrisCl pH 8,0/1 mM EDTA], zugegeben. Danach folgte sofort die Zugabe von 1 ml Lysepuffer, und die Suspension wurde für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Dynabeads^® mit gebundener DNA von einem Magneten angezogen wurden und die flüssige Phase entfernt wurde. Die feste Phase wurde dann zweimal mit 1 ml Waschpuffer [50 mM NaCl/10 mM TrisCl pH 8,0/1 mM EDTA] gewaschen. Schließlich wurden die Beads mit gebundener DNA in 0,1 ml Wasser resuspendiert und für 5 min bei 65°C inkubiert. Die Beads wurden von einem Magneten angezogen und die flüssige Phase wurde entfernt. Die flüssige Phase wurde dann im Hinblick auf den DNA-Gehalt untersucht. Die Ergebnisse von einem Scan der optischen Dichte (1) stimmen mit denen von reiner DNA überein. Das Verhältnis OD₂₆₀/OD₂₈₀ beträgt 1,75; reine DNA in Wasser oder TE besitzt ein Verhältnis von 1,7 – 1,9. Bei reiner DNA kann die Konzentration durch die OD₂₆₀ der Lösung bestimmt werden. Eine Lösung mit 50 μg/ml besitzt eine OD₂₆₀ = 1,0. Aus der Messung der OD₂₆₀ (Tabelle 1) von 0,436 (0,1 ml Gesamtvolumen, 10 mm Lichtweg), kann die Ausbeute als 2,18 μg DNA berechnet werden, 82% der 2,67 μg, was der geschätzte DNA-Gehalt des Ausgangsmaterials war. Eine Gelelektrophorese einer Probe der isolierten DNA (2) zeigt, dass das meiste davon in einer Form mit hohem Molekulargewicht (> 20 kb) vorliegt.
Tabelle 1 Perkin Elmer Lambda Bio UV/Vis-Spektrometer Anwendung Nr. 3: Verhältnis 260/280 nm
Beispiel 2
Isolierung von DNA aus Gesamtblut und enzymatische Anwendung ohne Elution
5 μl Gesamtblut (EDTA-Blut) wurde in 50 μl 5% SDS lysiert und es wurden 50 μg Dynabeads^® M-280* in 5 μl PBS zugegeben. Das Lysat wurde für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert, ehe 0,5 ml TrisCl, pH 7,5 zugegeben wurden. Das Lysat wurde dann weiterhin für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert, ehe die Beads mit gebundener DNA von einem Magneten angezogen wurden und die flüssige Phase entfernt wurde. Die Beads wurden dann einmal mit 0,5 ml 10 mM TrisCl, pH 7,5 gewaschen, ehe die Beads mit gebundener DNA in 40 μl TE (10 mM TrisCl, pH 8,0/1 mM EDTA) resuspendiert wurden. 4 μl der Isolierung wurde als Ausgangsmaterial für eine PCR (GAPDH-PCR wie in Beispiel 7 beschrieben) verwendet. Die PCR-Reaktion ergab große Mengen eines Produkts, wie durch eine Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht wurde (3). 10 μl einer 50 μl-PCR-Reaktion wurde auf das Gel geladen.
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt unter Verwendung der folgenden Kombination von Lysepuffern und Waschpuffern, und es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
(wobei +++ eine sehr gute DNA-Isolierung anzeigt)
1 × TE ist 10 mM TrisCl, pH 8,0/1 mM EDTA, 10 × TE ist 100 mM TrisCl, pH 8,0/10 mM EDTA
Beispiel 4
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 können ähnliche Ergebnisse erreicht werden unter Verwendung von Dynabeads^® M-450, unbeschichtet (Dynal A/S, Oslo, Norwegen).
Beispiel 5
Isolierung von DNA von CD2-positiven Zellen, die aus Blut mit einer immunmagnetischen Trennung erhalten werden
Dieses Experiment bestand aus zwei identischen Isolierungen. 50 μl Blut wurde mit 50 μl PBS [150 mM NaCl/10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 7,4] und 10 μl (4 × 10⁶ Beads) Dynabeads® M-450 Pan-T (CD2) (erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) gemischt. Das Gemisch wurde dann für 30 min bei Raumtemperatur mit sanftem Neigen und Rotation inkubiert. Der Zell/Beads-Komplex wurde von einem Magneten angezogen und die Flüssigkeit wurde entfernt. Der Zell/Beads-Komplex wurde dann 4× in 200 μl PBS gewaschen, ehe 200 μg Dynabeads^® M-280* (wie oben) und 200 μl Lysepuffer [100 mM Tris-HCl, pH 8,0/500 mM LiCl/10 mM EDTA, pH 8,01/1% LiDS] zugegeben wurden. Das Gemisch wurde für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, ehe der DNA/Beads-Komplex von einem Magneten angezogen wurde und der Überstand entfernt wurde. Der DNA/Beads-Komplex wurde 2 × mit 200 μl Waschpuffer [10 mM Tris-HCl, pH 8,0/150 mM LiCl/1 mM EDTA, pH 8,0] gewaschen und in 50 μl Wasser resuspendiert. Nach 5 min bei 65°C wurden die Beads von einem Magneten angezogen und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übertragen. 5 μl des Überstands wurden als Templat für eine Polymerase-Kettenreaktion (GAPDH-PCR wie in Beispiel 7 beschrieben) verwendet, was große Mengen eines Produkts ergab, wie mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht wurde (4).
Beispiel 6
Vergleich von Ausbeute und Integrität zwischen DNA, die mit einem traditionellen Verfahren isoliert wurde und DNA die durch das vorliegende Verfahren isoliert wurde
Bei der Verwendung eines traditionellen Verfahrens, basierend auf einer Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation, wurde genomische DNA aus 5 ml antikoaguliertem EDTA-Blut isoliert. Vier Isolierungen von 10 μl der gleichen Blutprobe wurden unter Verwendung von Dynabeads DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen, enthaltend Beads, die mit den Dynabeads® M-Z80* wie in Beispiel 1 beschrieben äquivalent sind) durchgeführt. Die DNA von zwei der Isolierungen wurde für 5 min bei 65°C eluiert, während die DNA der anderen zwei Isolierungen in Gegenwart der Dynabeads belassen wurde. Die gesamte DNA von den vier Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT wurde auf ein Agarosegel geladen, ebenso 0,2% der traditionell isolierten DNA. Die Fraktion der geladenen, traditionell isolierten DNA entspricht der Ausbeute von 10 μl Blut (0,2% von 5 ml).
Die traditionelle DNA-Isolierung wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von John und Mitarbeitern (John, S. W. M., G. Weitzner, R. Rosen und C. R. Scriver. 1991. "A Rapid Procedure for Extracting Genomic DNA from Leukocytes". Nucl. Acid. Res. 19(2): 408).
Mit Dynabeads DNA DIRECT wurde die Lyse des Bluts erreicht durch Mischen von 200 μl (1 Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 10 μl des Bluts in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (200 μg unbeschichtete Dynabeads in Lyse/Bindepuffer). Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank gelassen, so dass die Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads ermöglicht wurde.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen, und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Der Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (eines der Bestandteile des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes an einen Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 10 μl TE, pH 8,0 (bereitgestellt im Kit) resuspendiert.
Wenn eine Elution durchgeführt wurde, bestand sie aus Erhitzen der Suspension auf 65°C für 5 min und dann Anziehen der Beads an einen Magneten. Die DNA-haltige, wässrige Phase wurde dann entfernt und für die Experimente verwendet.
Die DNA wurde auf 1,5%-igen Agarosegeien, die mit Ethidiumbromid gefärbt wurden, sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Das Ergebnis dieses Experiments ist in Feld I von 5 gezeigt. Die Ausbeute pro μl Blut ist bei den zwei Verfahren ähnlich (Spuren 1–4 gegenüber den Spuren 5–6), und während des Elutionsschritts wird sehr wenig DNA verloren (Spuren 1–2 gegenüber den Spuren 3–4). Das Molekulargewicht der DNA aus beiden Verfahren beträgt mehr als 20 kb und sie läuft langsamer als die 23,13 kb-Bande des λ Hind III-Molekulargewichtsmarkers.
DNA DIRECT wurde verwendet, um DNA aus ACD-Blut von zwei unterschiedlichen Spendern zu isolieren, einem männlichen und einem weiblichen. Von jeder der Isolierungen wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation eines Amplikons in dem X-Y-homologen Amelogenin (AMXY)-Gen (Akane, A., K. Matsubara, H. Nakamura, S. Takahashi und K. Kimura. 1994. "Purification of Highly Degraded DNA by Gel Filtration for PCR". BioTechniques 16 (2): 235–238) verwendet, ebenso wie 200 ng von jeder der zwei traditionellen DNA-Isolierungen.
Die Isolierung mit DNA DIRECT und die traditionelle DNA-Isolierung wurden wie im ersten Teil dieses Beispiels beschrieben durchgeführt.
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × xugegeben, dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben und pro Reaktion wurde 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer) verwendet. Pro Reaktion wurden jeweils 5 pmol der Primer AMXY-1 F (5'-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCT-GTG-3') und AMXY-4R (5'-TTCATTGTAAGAGCAAAGCAAACA-3') zugegeben. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt. Die PCR-Bedingungen für das AMXY-Amplikon betrugen 4 min bei 94°C, 38 × [30 sek bei 94°C, 30 sek bei 55°C, 1 min bei 72°CJ, 10 min bei 72°C.
10 μl der 50 μl-PCR-Reaktionen wurden auf 1,5%-igen Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid gefärbt wurden, sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II der 5 gezeigt. Das X-Y-homologe Amelogeningen ist bekanntermaßen empfindlich gegenüber einem DNA-Abbau (Akane et al. 1994, siehe oben). Mit steigendem Abbau wird das 908 bp lange X-Band zunehmend schwächer im Vergleich zu dem 719 bp langen Y-Band. Aus Feld II der 5 ist ersichtlich, dass die relative Stärke der X- und Y-Banden vergleichbar ist für DNA, die mit Dynabeads DNA DIRECT und dem traditionellen Verfahren isoliert wurde, was darauf hindeutet, dass bei beiden Verfahren das Ausmaß des Abbaus gleich ist. Die PCR-Reaktionen von traditionell isolierter DNA ergaben etwas mehr Produkt als die Reaktionen aus DNA, die mit DNA DIRECT isoliert wurde. Der Grund dafür ist, dass zehnmal mehr Templat in den PCR-Reaktionen aus traditionell isolierter DNA verwendet wurde als in den PCR-Reaktionen aus DNA, die mit DNA DIRECT isoliert wurde.
Lyse/Bindepuffer:
0,5 M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCl, pH 7,5
10 mM EDTA
5 mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer:
0,15 M LiCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
Beispiel 7
Fünf unabhängige DNA-Isolierungen aus Blutproben von jedem von zwei Spendern
Für dieses Experiment verwendeten wir das Dynabeads DNA DIRECT-Kit, welches von Dynal AS, Oslo, Norwegen kommerziell erhältlich ist. Die Pufferzusammensetzungen sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
Es wurden fünf DNA-Isolierungen durchgeführt von jeder von zwei mit Citrat behandelten Blutproben mit relativ geringen Zahlen weißer Blutzellen (Probe A: 3,6 × 10⁶ Zellen/ml, Probe B: 2,6 × 10⁶ Zellen/ml).
Die Lyse des Bluts wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (ein Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit Blut in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann wurden die Lysate bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde mit einem Magneten angezogen (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)), und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Der Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes durch ein Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 40 μl TE, pH 8,0 (im Kit bereitgestellt) resuspendiert. Diese Resuspension wurde für eine PCR und Gelelektrophorese ohne Elution verwendet.
Von jeder Isolierung wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation eines Amplikons im Glyerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × zugegeben, dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben und pro Reaktion wurde 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer) verwendet. 5 pmol von jedem der Primer GAPDH-Forward (5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3') und GAPDH-Reverse (5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3') wurden pro Reaktion zugegeben. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt. Die PCR-Bedingungen für das GAPDH-Amplikon waren 4 min bei 94°C, 34 × [30 sek bei 94°C, 30 sek bei 61°C, 1 min bei 72°C], 10 min bei 72°C.
Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf ein Agarosegel geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse aus diesem Experiment sind in 6 gezeigt. Zwischen den unterschiedlichen Isolierungen kann keine signifikante Abweichung beobachtet werden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen Koagulantien ebenso wie von Spendern mit höheren Zahlen weißer Blutzellen erhalten.
Beispiel 8
DNA-Isolierung aus Blut mit unterschiedlichen Antikoagulantien
Dynabeads DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus unbehandeltem Gesamblut ebenso wie aus Blut zu isolieren, welches mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert wurde. Von jeder Art des Ausgangsmaterials wurden zwei getrennte Isolierungen mit Blut von unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Die Pufferbestandteile im Kit sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
Die Lyse der DNA-haltigen Zellen aus Blut wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (1 Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 5 μl Heparinblut oder 10 μl der anderen Blutproben in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann wurden die Lysate bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank gelassen, um eine Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
Der DNA-Dynabead-Komplex wurde durch einen Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Dann wurde der Komplex zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes durch einen Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 20 bis 40 μl TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Wir verwendeten als Standardvolumen 40 μl, wenn das Ausgangsmaterial Heparinblut war jedoch 20 μl.
Von jeder Isolierung wurden 10% (20% der Heparinproben) als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation eines Amplikons im Glyerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen verwendet. Die PCR wurde direkt mit der Suspension in TE durchgeführt, wobei die Dynabeads vorlagen. Alle PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, 10 × PCR-Puffer (Perkin Elimer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × zugegeben, dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben und es wurde pro Reaktion 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer) verwendet. Von jedem der Primer GAPDH-Forward (5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3') und GAPDH-Reverse (5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3') wurden pro Reaktion 5 pmol zugegeben. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt. Die PCR-Bedingungen für das GAPDH-Amplikon waren 4 min bei 94°C, 34 × [30 sek bei 94°C, 30 sek bei 61 °C, 1 min bei 72°C], 10 min bei 72°C.
10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf ein Agarosegel geladen, ebenso 25% (50% der Heparinproben) der isolierten genomischen DNA. Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 7 gezeigt. Da die Isolierungen von heparinisierten Proben nur aus 5 μl Blut durchgeführt wurden, ist die Verwendung von 20% der DNA aus diesen Isolierungen als Ausgangsmaterial für die PCR vergleichbar mit der Verwendung von 10% der anderen Isolierungen, welche jeweils von 10 μl Blut durchgeführt wurden. Wenn dies in Betracht gezogen wird, ist ersichtlich, dass die Art des verwendeten Antikoagulans das Ergebnis nicht signifikant beeinflusst.
In dem soeben beschriebenen Experiment wurde Lithiumheparin verwendet. In diesem System werden mit Lithium- und Natriumheparin ähnliche Ergebnisse erhalten, obwohl gezeigt wurde, dass Lithiumheparin in anderen Systemen inhibitorische Wirkungen besitzt (Panaccio, M., M. Georgesz und A. M. Lew. 1993. „FoLT PCR: A Simple PCR Protocol for Amplifying DNA Directly from Whole Blood". BioTechniques 14(3): 238–243). DNA DIRECT funktioniert ebenso gut bei Blut, welches mit ACD (Feld II der 5) oder mit CPD (Daten nicht gezeigt) antikoaguliert wird.
Beispiel 9
Isolierung von DNA aus Blutproben die unter verschiedenen Bedingungen gelagert wurden
Dynabeads DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus EDTA-Blut von zwei verschiedenen Spendern zu isolieren. Das restliche Blut der Blutproben wurde dann in zwei Teile geteilt, ein Teil wurde bei +4°C gelagert und ein Teil wurde bei –20°C gelagert. Nach 4 Tagen wurden die eingefrorenen Proben aufgetaut und die DNA wurde sowohl von den gefrorenen Proben als auch den Proben isoliert, die bei +4°C gehalten wurden. Die Pufferkomponenten des Kits sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
Die Lyse des Bluts wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (ein Probentest) von Dynabeads DNA DIRECT mit Blut in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur 5 min auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Der Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes mit einem Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 40 μl TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Sowohl eine PCR als auch eine Agarosegelelektrophorese wurde direkt mit der Suspension in TE durchgeführt, wobei die Dynabeads vorhanden waren.
Von jeder der 6 Isolierungen (frisch, im Kühlschrank gelagert und eingefroren) wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben. Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Gel geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld I von 8 gezeigt. In diesem System wurde kein abträglicher Effekt der viertägigen Lagerung bei +4 oder –20°C beobachtet.
Unter Verwendung von Dynabeads DNA DIRECT wie früher in diesem Beispiel beschrieben, wurde DNA aus zwei mit Citrat behandelten Blutproben isoliert und von den zwei Proben wurden 10 μl auf eine Plastikoberfläche aufgetropft und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die getrockneten Bluttropfen wurden in 1,5 ml-Röhrchen übertragen, 40 μl PBS wurde zugegeben und die Röhrchen wurden mit sanfter Bewegung für 90 min bei Raumtemperatur belassen, ehe DNA mit Dynabeads DNA DIRECT isoliert wurde. Von jeder der 4 Isolierungen (frisch und getrocknet) wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons wie in Beispiel 8 beschrieben verwendet. Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Gel geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophrose wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt, und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II von 8 gezeigt. Die Ausbeute von getrocknetem Blut ist gut und die isolierte DNA ist für eine PCR geeignet.
Beispiel 10
DNA-Isolierung aus Knochenmark und Kulturzellen
DNA-Isolierungen aus Knochenmark
1, 2 und 5 μl heparinisiertes Knochenmark von jedem von zwei gesunden Spendern wurden als Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung mit DNA DIRECT verwendet. Die Pufferbestandteile sind wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Lyse des Knochenmarks wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (ein Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 1–5 μl heparinisiertem Knochenmark in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Der Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes mit einem Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 40 μl TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Sowohl eine PCR als auch eine Agarosegelelektrophorese wurde direkt mit der Suspension in TE durchgeführt, wobei die Dynabeads vorhanden waren.
Von jeder der 6 Isolierungen wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Agarosegel geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld I der 9 gezeigt. Aus Feld I der 9 ist ersichtlich, dass die Ausbeute pro Volumen Ausgangsmaterial aus Knochenmark höher ist als aus Blut (5–8). Dies ist erwartungsgemäß, da die Konzentration an DNA-haltigen Zellen im Knochenmark viel höher ist als in Blut. 5 μl Knochenmark ist nahe der oberen Grenze dessen, was durch einen Probentest DNA DIRECT handhabbar ist. Ein gutes Verhältnis zwischen Probengröße und DNA-Ausbeute wird im Intervall von 1–5 μl Probengröße beobachtet, aber sogar die Ausbeute von 1 μl ist ausreichend für mindestens 10 PCR-Reaktionen.
DNA-Isolierung aus kultivierten Zellen
Zwei Proben von 4 × 10⁵ Daudi-Zellen wurden als Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung mit DNA DIRECT verwendet. Die DNA-Isolierung aus 4 × 10⁵ kultivierten Zellen (Zelllinie Daudi) wurde wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass 1 ml (fünf Probentests) Dynabeads DNA DIRECT verwendet wurde. Entsprechend wurden die Waschschritte in 1 ml Waschpuffer durchgeführt. Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde in 120 μl TE resuspendiert und es wurde wie beim Knochenmark kein Elutionsschritt nach der Resuspension durchgeführt.
Von jeder der Isolierungen wurde 1 μl von insgesamt 120 μl als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Agarosegel geladen, ebenso 10% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II der 9 gezeigt, welche zeigt, dass mindestens 120 PCR-Reaktionen aus einer Isolierung dieses Maßstabs durchgeführt werden können.
Beispiel 11
Isolierung von DNA aus einem mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitt der Leber
Dynabeads DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus einem mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Leberschnitt zu isolieren. Die Pufferbestandteile des Kits und die Beadkonzentration sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
Überschüssiges Paraffin wurde von den Rändern der Probe mit einer Skalpellklinge entfernt. Die Lyse der Probe wurde erreicht durch Zugabe von 200 μl (ein Probentest) Dynabeads DNA DIRECT zu der Probe in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank belassen, um die Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen. Das Lysat, welches DNA und Dynabeads enthielt, wurde in ein frisches Röhrchen übertragen, wobei Zelltrümmer und Paraffin zurückgelassen wurden.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde durch einen Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Der Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Kitbestandteil) durch Anziehen des Komplexes an ein Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands gewaschen. Schließlich wurde der Komplex in 10 μl sterilem Wasser resuspendiert. Diese Suspension mit den Dynabeads darin wurde als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben. Das PCR-Produkt wurde auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegel sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Gel geladen. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert. Das Ergebnis dieses Experiments ist in 10 gezeigt. Aus dem mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Leberschnitt ist klar PCR-amplifizierbares Material erhalten worden.
Beispiel 12
Entfernung von genomischer DNA mit DNA DIRECT vor einer mRNA-Isolierung
mRNA wurde aus 1 Million Daudi-Zellen pro Probe isoliert. Die Zellen wurden in 0,75 ml Lyse/Bindepuffer lysiert, wobei DNA DIRECT Dynabeads in dem Puffer vorlagen. Die Proben wurden für 5 min inkubiert und die DNA/Dynabeads-Komplexe wurden gesammelt durch Anwenden eines Dynal-MPC-E-Magneten für 2 min. Um die genomische DNA zu entfernen, wurden verschiedene Mengen DNA DIRECT-Beads verwendet; 1, 2, 5 und 10 mg pro Probe (11).
Das Lysat von jeder Probe wurde gemäß dem Standardverfahren (Dynal's mRNA DIRECT Kit-Protokoll) in neue Röhrchen mit 1 mg Dynabeads Oligo(dT)₂₅ übertragen. Die Dynabeads wurden mit dem Lysat gemischt, um die polyadenylierte mRNA durch Hybridisierung für 5 min bei Raumtemperatur einzufangen. Die mRNA-Dynabead-Komplexe wurden mit dem MPC-E-Magneten gesammelt durch Platzieren der Röhrchen in dem Magnetgestell für 2 min. Die Lösung wurde entfernt und verworfen. Eine Waschlösung mit LiDS (0,75 ml) wurde zugegeben und die Beads wurden sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren gewaschen. Die mRNA-Dynabead-Komplexe wurden mit dem Magneten gesammelt und die Waschprozedur wurde einmal mit Waschpuffer mit LiDS und zweimal mit Waschpuffer ohne Detergens wiederholt. Schließlich wurde die gereinigte mRNA durch Inkubation bei 65°C für 2 min von den Dynabeads in 20 μl 5 mM Tris-HCl, pH 7,5-Puffer eluiert. Die Eluate wurden durch eine nicht denaturierende Gelelektrophorese in einem 1,0%-igen Agarosegel mit Ethidiumbromid analysiert. 11 die Ergebnisse aus diesem Experiment.
Die EtBr-Färbung zeigt sowohl doppelsträngige DNA als auch rRNA aufgrund der Sekundärstruktur. Die zwei Banden mit ribosomaler DNA sind in allen Spuren klar sichtbar. In Spur 9–10 in 11 ist etwas genomische DNA als Kontamination nach dem mRNA-Reinigungsverfahren vorhanden. In dem empfohlenen mRNA-Verfahren von Dynal ist ein DNA-Scherungsschritt nach der Zelllyse eingefügt, um die Möglichkeit einer DNA-Kontamination zu verringern. Durch Verwendung der DNA-Entfernung mit DNA DIRECT Beads ist dieser Scherungschritt nicht notwendig.
Lyse/Bindepuffer:
0,5 M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCl, pH 7,5
10 mM EDTA
5 mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer mit LiDS:
0,15 M LiCl
0,1% LiDS
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
Waschpuffer:
0,15 M LiCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
Beispiel 13
Allgemeines Verfahren zur DNA-Isolierung: PCR-Ready-DNA von Bakterien, Pilzen Algen Pflanzen und Vertebraten
E. coli und Bacillus cereus wurden über Nacht bei 37°C in LB-Medium angezogen, Agrobacterium tumefaciens wurde über Nacht in YEB-Medium für etwa 40 h bei 28°C angezogen (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory, NY.). Cyanobakterien und Prochlorthrix wurden in NIVA-Medium für 14 Tage bei 18°C angezogen unter Verwendung einer Beleuchtung von 20 Mikro-Einstein (Norwegian Institute of Water Research, 1991, „Culture collection of algae"). 20–200 Millionen Bakterien oder 450 000 Cyanobakterien wurden pro DNA-Isolierung verwendet.
Für das Myzelwachstum wurden Agarplatten mit 2% Malzextrakt verwendet und für 14 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Myzelien wurden durch Abkratzen der Fläche der Agarplatten mit einem Spatel isoliert. Die Fruchtkörper der Pilze wurden von natürlichen Populationen erhalten. Pro DNA-Isolierung wurden im Bereich von 1–3 mg luftgetrocknete und 3–20 mg frische Fruchtkörper der Pilze verwendet.
Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde von einem kommerziellen Anbieter erhalten. Die Algen wurden unter Beleuchtung in IMR-Medium für 7 Tage kultiviert (Eppley, R et al., 1967, Exp. Mar. Biol. Ecol. 1, 191–208). Frische Blätter von Arabidopsis thaliana und Gerste (Hordeum vulgare) wurden von jungen Pflanzen (3 Wochen alt) gepflückt. Epithelien wurden von Flossen von Barschen (Perca fluvatilis) erhalten. Etwa 1 mg Feuchtgewicht Hefe, 30–100 mg junge Pflanzenblätter und 100–400 mg Barsch wurden pro DNA-Isolierung verwendet.
Mehrzellige Gewebe mit festen Zellwänden wurden mechanisch zerbrochen, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen. Die Fruchtkörper von Pilzen wurden mit Zangen für etwa 2 min zerkleinert. Pflanzenblätter wurden für 2 min in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill (Kontes Scientific Instruments, Vineland, New Jersey, USA) homogenisiert. Für alle anderen Proben war für das Brechen der Zellen keine mechanische Arbeit erforderlich.
DNA-Isolierung
Die DNA-Isolierungen wurden unter Verwendung von Dynabeads DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich von Dynal AS, Oslo, Norwegen) durchgeführt. Die Lyse der Zellen und Organismen wurde erreicht durch Mischen von 200 μl Dynabeads DNA DIRECT (200 μg unbeschichtete Dynabeads in Lyse/Bindepuffer) mit der Probe in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann wurden die Lysate für 5–15 min bei Raumtemperatur auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen. Bei einigen Bakterien und bei Pflanzen wurde eine Inkubation bei 65°C für 15 min verwendet, um die Lyse vor dem Adsorptionsschritt zu verbessern.
Der DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle Collector E (MPC-E)) angezogen, und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
Dann wurde der Komplex zweimal in Waschpuffer (ein Kitbestandteil) gewaschen durch Anziehen des Komplexes an einen Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands. Schließlich wurde der Komplex in 40 μl TE, pH 8,0 (im Kit bereitgestellt) durch heftiges Pipettieren resuspendiert. Die Elution wurde durchgeführt durch Erhitzen der Suspension auf 65°C für 5 min und dann Anziehen der Beads mit einem Magneten. Die DNA-haltige wässrige Phase wurde dann entfernt und für die Experimente verwendet.
Die DNA wurde auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Lyse/Bindepuffer:
0,5 M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCL, pH 7,5
10 mM EDTA
5 mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer:
0,15 M LiCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mm EDTA
Für eine Bewertung der Ausbeute mit dem DNA DIRECT-Isolierungsprotokoll wurden Standardverfahren, die auf Phenol/Chloroform basieren, verwendet. Algen-, Vertebraten- und Bakrterien-DNA wurde mit dem vom Sambrook, J. et al., 1989, siehe oben, beschriebenen Protokoll isoliert. Die Cyanobakterien wurden mit Tonerde Typ A-5 (Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA) vor der Isolierung homogenisiert, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Pflanzen- und Pilz-DNA wurde mit dem von Scott, O. R. und Bendich, A. J., 1994, in "Plant Molecular Biology Manual", Seite D1: 1–8, Kluwer Academic Publisher, Belgien, beschriebenen Protokoll isoliert.
PCR-Amplifikationen
Für jeden Probentyp wurde die Reproduzierbarkeit getestet durch Verwendung getrennter DNA-Isolierungen, DNA-Verdünnungsreihen und mehreren PCR-Assays. Die DNA-Isolierungsreagenzien und PCR-Reagenzien wurden in jedem einzelnen Experiment im Hinblick auf die Abwesenheit einer Kontamination kontrolliert. Alle PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, enthaltend: 15 pmol Primer, 20 μmol dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1 Unit thermostabile DynaZyme Polymerase (Finnzymes Oy, Finnland) und 0,1–5 μl isolierte DNA. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt.
Amplikons und Oligonukleotidprimer
Alle PCR-Reaktionen wurden mit einem DNA-Denaturierungsschritt bei 94–97°C für 3–5 min begonnen und endeten mit einem Extensionsschritt bei 72°C für 5 min.
Bakterien und Algen
Das Amplikon war eine 16S rRNA-Region, welche den Basen 334 bis 939 von E. coli entsprach, gemäß der IUD-Nummerierung von Bakterien und Algenchloroplasten (Brosius, J., et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 57, 4801–4805). Primer: CC 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC-3' CG: 5'-CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3' Der Primer CC besitzt am 5'-Ende eine komplementäre Sequenz zum -21 M13-Universalprimer, wodurch er für eine direkte DNA-Sequenzierung geeignet ist. Amplifikation: 30 Zyklen von 96°C für 15 sek und 70°C für 2 min.
Algen: Es wurde mit den Primern A und B, die von Medlin et al., 1990, Gene, 71, 491–499 beschrieben werden, eine 18S rRNA-Region amplifiziert.
Amplifikation: 35 Zyklen von 94°C für 30 sek, 50°C für 1 min und 72°C für 1 min.
Pilze: Es wurde eine 18S rRNA-Region (ca. 600 bp) mit den Primern NS3 und NS4 amplifiziert, wie von White et al., 1990 in "PCR Products, a Guide to Methods and Applications", von Innis, M. A. et al., Seite 315–322, Academic Press, New York, beschrieben.
Amplifikation: 5 Zyklen von 94°C für 30 sek, 53°C für 30 sek und 72°C für 1 min, gefolgt von 25 Zyklen von 94°C für 30 sek, 50°C für 30 sek ansteigend mit 15 sek bei jedem Zyklus, und 72°C für 1 min.
Pflanzen: Es wurde mit den Primern C und D, die von Fangan et al., 1994 in BioTechniques 16, 484–494 beschrieben werden, das tRNL-Gruppe I-Intron in Chloroplasten amplifiziert.
Amplifikation: 30 Zyklen von 94°C für 30 sek, 55°C für 30 sek und 72°C für 1 min.
Es wurde ein Teil des Arabidopsis thaliana-Gens B15C (800 bp) amplifiziert mit den Primern: 5'-CGGGATCCCTAGGAGACACGGTGCCG-3' und 5'-GGAATTCGATCGGCGGTCTTGAAAC-3' Amplifikation: 35 Zyklen von 94°C für 30 sek, 59°C für 30 sek und 72°C für 1 min.
Ein Teil des Gerstengens B15C (800 bp) wurde amplifiziert mit den Primern 5'-CGGATCCCGTCATCCTCTTCTCGCACCCC-3' und 5'-GGAATTCCCTTCTTGGAGGGCAGGTCGGCG-3'.
Amplifikation: 35 Zyklen von 94°C für 30 sek, 60°C für 30 sek und 72°C für 1 min.
Barsch: Es wurde ein Mitochondrien-D-Loop-Fragment (800–900 bp) amplifiziert mit den Primern HV2, beschrieben von Hoelzel et al., 1991, Mol. Biol. Evol., 8, 475–493, und dem Primer 5'-GGTGACTTGCATGTGTAAGTTCA-3'.
Amplifikation: 30 Zyklen von 96°C für 1 min, 52°C für 2 min und 72°C für 2 min.
Die amplifizierten Fragmente wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film dokumentiert.
Die Ergebnisse der Experimente sind in 12 und Tabelle 2 gezeigt.
Bakterien: Das Standardprotokoll ergab für die untersuchten Bakterien DNA-Ausbeuten im Bereich von 100–1000 ng (12A). Für einige Cyanobakterien ergab sich eine wesentliche Steigerung der DNA-Ausbeute (von 500 ng bis mehr als 1 mg) durch Verbesserung der Lyse mit einem zusätzlichen anfänglichen Inkubationsschritt bei 65°C für 15 min. In allen Fällen wurden bei Verwendung von 0,25% der isolierten DNA gute Amplifikationen erhalten.
Pilze: Die höchste DNA-Ausbeute wurde von den getrockneten Fruchtkörpern (300–500 ng) erhalten, verglichen mit frischen Fruchtkörpern (100–200 ng) ( 12B). Die Myzelien ergaben eine geringere DNA-Gewinnung, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Anzahl pro Zellen pro Probe. Aber in den meisten Fällen waren 5% der isolierten DNA ausreichend, um schöne PCR-Produkte zu ergeben (Tabelle 2, 12B). Bei den Fruchtkörpern wurden 0,5–5% der DNA für jede PCR venrwendet.
Algen: Alle untersuchten Algen ergaben bei Verwendung des Standardprotokolls und einem DNA DIRECT-Probentest (Tabelle 2, 12C) eine DNA-Ausbeute im Bereich von 200–400 ng. Schöne PCR-Ergebnisse wurden bei Verwendung von 5% der isolierten DNA pro PCR-Reaktion sowohl bei einer Amplifikation von genomischer DNA als auch von Chloroplasten-DNA erhalten.
Pflanzen: Um eine gute DNA-Ausbeute von Pflanzenblättern zu erhalten, war eine Homogenisierung in flüssigem Stickstoff notwendig. Ein zusätzlicher anfänglicher Inkubationsschritt bei 65°C für 15 min verbesserte ebenso die Ergebnisse ( 12D). Schöne PCR-Ergebnisse wurden sowohl bei der Amplifikation von genomischer DNA als auch von Chloroplasten-DNA erhalten, wenn 5% der isolierten DNA pro PCR-Reaktion verwendet wurden.
Fische: Aus Fischepithel wurde unter Verwendung des Standardprotokolls und einem Probentest routinemäßig eine DNA-Ausbeute von 300–500 ng erhalten (Tabelle 2). Mitochondriale DNA wurde schön amplifiziert bei Verwendung von 5% der isolierten DNA.
Die PCR-Produkte von allen untersuchten Spezies konnten leicht durch eine Festphasensequenzierung (Hultman et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17, 4937–4946) direkt sequenziert werden.
Tabelle 2: DNA-Isolierung und PCR-Amplifikation aus verschiedenen Organismen

Claims

Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: in Kontakt bringen der Probe mit einem Detergens und einem partikulärem Trägermaterial, wobei lösliche Nukleinsäure in der Probe mittels Sequenz-unabhängiger Bindung in Gegenwart des Detergens und ohne chaotropes Mittel an die Oberfläche des Trägers gebunden wird, und Abtrennen des Trägers mit der gebundenen Nukleinsäure von der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, weiter umfassend den zusätzlichen Schritt der Isolierung von RNA aus der Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend einen oder mehrere zusätzliche Schritte, um Strukturbestandteile in der Probe zu zerstören oder die Lyse von Zellen in der Probe zu erreichen.
Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 5, worin das Detergens anionisch ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Detergens Natriumdodecylsulfat oder ein anderes Alkalimetallalkylsulfatsalz oder Sarkosyl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Konzentration des Detergens 0,2 bis 30% (w/v) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Detergens in einer Zusammensetzung enthalten ist, welche zusätzlich ein oder mehrere monovalente Kationen, Chelatbildner oder Reduktionsmittel umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Detergens in alkalischer Lösung verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das partikuläre Trägermaterial magnetische Beads umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die magnetischen Beads Dynabeads^TM sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Trägermaterial ein hydrophobe Oberfläche besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Nukleinsäure nach der Abtrennung aus der Probe von dem Trägermaterial eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Nukleinsäure durch Erhitzen eluiert wird.
Kit zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe, umfassend ein partikuläres Trägermaterial und ein oder mehrere Detergenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Kit nach Anspruch 16, weiter umfassend einen oder mehrere Puffer, Salze, Mittel zur Lyse, Chelatbildner und/oder Reduktionsmittel.
Kit nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, weiter umfassend Mittel zur Isolierung von RNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die Probe Zellen enthält und die Zellen durch immunmagnetische Trennung erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Nukleinsäure DNA ist und das Verfahren weiterhin den zusätzlichen Schritt der Isolierung von RNA aus der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Zellen in einem Zell : Bead-Komplex vorliegen.