CN105612254B

CN105612254B - 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组及其试剂盒和方法

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Publication number: CN105612254B
Application number: CN201480055468.9A
Authority: CN
Inventors: 天野仰; 酒井智美; 矢内久阳; 多叶田誉; 南洋; 北岛勋; 仁井见英树
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2013-10-07
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2034-10-07
Also published as: EP3056567A4; MY182940A; CN111534623A; EP3056567A1; EP3543362A3; EP3543362B1; CN105612254A; JP6920362B2; EP3543362A2; SG10201806000YA; JP2019107019A; US20210002708A1; JP6491100B2; JPWO2015053293A1; SG11201602686YA; AU2017279773A1; MY195854A; US20160244812A1; EP3056567B1; AU2014332956A1

Abstract

本发明的目的在于，提供对于进一步提高利用PCR法检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的灵敏度有用的引物组，使用了其的用于PCR的试剂盒及检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法，以及通过使细菌来源的核酸的混入量为最小限度、并进行使用了上述的引物组的PCR法，从而达成检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法的灵敏度的进一步的提高。为了达成上述目的，本发明涉及的用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组包含：从包含特定的引物对的第S1组～第S7组的各组中分别选择1对引物对而得到的7对引物对中的至少1对引物对。此外，本发明涉及的用于检出细菌菌种的试剂盒包含：从包含特定的引物对的第K1组～第K7组的各组中分别选择1对引物对而得到的7对引物对中的至少1对引物对。

Description

用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组及其试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及对于利用使用了PCR尤其是实时PCR(real-time PCR)的检测方法进行的细菌菌种的检出及/或鉴定有用的引物组、用于检出或鉴定细菌菌种的包含该引物组的试剂盒、以及使用它们的检出及/或鉴定细菌菌种的方法。

背景技术

微生物检测被认为是在研究现场、医疗现场、食品制造现场等中必要的技术。在医疗现场、食品制造现场，以往，作为常规的检测方法，实施涂抹·镜检·培养等。另外，在医疗现场，由于还存在微生物中具有抗生素耐性基因的情况，所以还并行地进行药敏试验的情况也很多。然而，培养等上述的一般的检测方法需要相当长的时间(以天为单位)，所以近年来为了满足检测所要求的迅速化·高灵敏度化而进行着非常活跃地研究。尤其是，由于基于基因分析的公开数据库的积累，利用致病基因的分析、毒素基因的分析、抗生素耐性基因的分析、基于系统发生学视角的编码rRNA的DNA序列(rDNA)的分析等，检测方法也在实现着多种多样的发展。

目前，作为基因检测方法，主要分为DNA探针法和基因扩增法 (PCR法)。尤其是，PCR法可在短时间内将试样中存在的微量的 DNA扩增，并且与DNA探针法相比，检出灵敏度高，相应地适用范围广泛。

在这样的背景下，对使用PCR来检测出未鉴定的细菌进行了研究，进行了以下尝试：利用PCR对痕量的败血症病原微生物DNA进行扩增，使扩增出的病原微生物DNA与以凭经验设定的微生物为靶标的菌种固有的核苷酸探针进行杂交(hybrid)，从而检测出病原微生物，以及对细菌菌种进行鉴定(日本特开平6-90799号公报)。

此外，为了满足检出及细菌菌种鉴定迅速性的要求，对于以使用了杂交探针(hybridization probe)的实时PCR为基本原理的败血症检测技术进行了研究开发(生物试样分析(生物試料分析)，Vol.28，No5. (2005)，400-40)。另外，研究了病原菌的迅速检出及鉴定细菌菌种的方法(国际公开2007/097323号)，所述方法按照以下方式进行：以微生物DNA为模板，使用多种特定的引物组，利用PCR进行基因扩增，接下来，针对对应于得到的多种DNA片段的熔融温度(Tm值) 的组合、或各Tm值间的差进行分析。

然而，对于即使是在短时间内得到的结果，也必须确保精度，因此可以说，对于PCR而言，同时实现高度的灵敏度和特异度是重要的。上述已有技术虽然应用了基于PCR的基因扩增技术，但均为已经限定了假定的目标微生物的方法。

另一方面，为了提供PCR中使用的DNA聚合酶，研究了基于基因重组技术的DNA聚合酶制备物的制造方法(日本特开2006- 180886号公报)。已提出了在使用以真核生物为宿主而制造的耐热性 DNA制备物利用PCR法进行极微量的被检样品细菌DNA的扩增时抑制非特异核酸扩增的方法(国际公开第2010/082640号)。通过将该以真核生物为宿主而生产的耐热性DNA聚合酶制备物用于PCR，可提供适于极微量的被检样品细菌的新型检测的分析方法，该技术作为极微量的被检样品细菌的分析方法是极其划时代的技术。

另外，提出了使用最新的实时PCR装置，针对由细菌扩增的3 种DNA片段，利用高分辨率熔融曲线分析(High Resolution Melting： HRM)得到曲线，利用其形状组合判定细菌菌种的方法(Journal of Clinical Microbiology 2009，p.2252-2255：Journal ofClinical Microbiology 2010，p.3410-3413)。然而，上述文献中并未公开判定波形一致、不一致的明确的标准。另外，虽然上述文献中实施了60 种细菌的判定，但推测利用基于来自3种DNA片段的HRM的3种曲线来鉴定超过100种这样的大范围的菌种是困难的。同时，该方法中，使用经血液培养后的被检样品作为用于提取DNA的样品，是仅为了培养就必须要耗费相当时间的方法。

此外，还公开了同样使用实时PCR装置，测定扩增的16S rDNA 片段和多个探针的Tm值，基于所述Tm值来确定细菌菌种的方法 (Journal of Clinical Microbiology 2010，p.258-267)。该方法中，也使用了血液培养后的被检样品作为用于提取DNA的样品，成为耗费时间的方法，所耗费的时间是为了培养而必要的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平6-90799号公报

专利文献2：国际公开2007/097323号

专利文献3：日本特开2006-180886号公报

专利文献4：国际公开第2010/082640号

非专利文献

非专利文献1：生物试样分析(生物試料分析)，Vol.28，No5. (2005)，400-40

非专利文献2：Journal of Clinical Microbiology 2009，p.2252- 2255

非专利文献3：Journal of Clinical Microbiology 2010，p.3410- 3413

非专利文献4：Journal of Clinical Microbiology 2010，p.258-267

发明内容

发明所要解决的课题

若基于专利文献4中公开的技术，则可简便地扩增来自极微量的被检样品细菌的DNA，在短时间内进行分析、尤其是进行定量或鉴定分析，如果可以做到这一点，则不仅能对目前为止无法分析的极微量水平的基因进行分析，而且将会在医疗领域、兽医领域、生活用水、食品等各种被检样品的分析领域中进行迅速且正确的判断。然而，基于临床现场、食品制造现场等，要求更进一步的检出灵敏度的提高及迅速性。

如上文所述，使用PCR法的检出方法，相对于DNA探针法具有迅速性，而且还适于高灵敏度检出，作为临床现场、食品制造现场等的迅速且高灵敏度检出方法是有用的。然而，对于以往的使用了PCR 法的检出方法而言，存在以下情况：无法应对被检样品中含有的菌种不明时的情况；为了确保检出所需要的量的核酸而使被检样品中的细菌增殖需要时间，等等，无法充分达成更进一步的检出灵敏度的提高及迅速性。

例如，非专利文献4中，经过培养等之后的大量的菌体量对于分析是必要的，这从使用2-10ng供于PCR的细菌DNA也可得知。以大肠杆菌作为细菌的例子时，大肠杆菌MG1655株的基因组大小 (genome size)为4639675bp，由此，考虑到1碱基对的平均分子量、以及每1个细菌细胞的基因组为1拷贝(1分子)并进行计算，可知每1个细胞大肠杆菌的基因组DNA约为5fg，与供于PCR的DNA量相当的细菌量是相当多的量，由此认为，本方法的检出灵敏度不充分。

使用PCR法进行细菌的检出、鉴定的情况下，为了提高检测的检出·鉴定灵敏度，PCR法中使用的引物组的选择成为重要的要素之一。例如，通过引物组的选择，从而在PCR中的扩增率、到完成为止的循环数、并非目标的扩增产物的生产率等方面不同，为了提高检测的检出·鉴定灵敏度，使上述各要件最优化的引物组是必要的。根据被检样品的种类，如来源于血液等的被检样品之类，除了作为检测对象的细菌来源的DNA之外，例如血液被检样品的情况下，有时来源于白血球、剥离的上皮细胞等人细胞的DNA大量存在。根据本申请的发明人的研究，在这样的被检样品中作为检测对象的细菌的DNA 含量少的情况下，用于PCR的引物组相对于作为检测对象的细菌 DNA的选择性、或其扩增产物的生产率低时，有时无法获取对于鉴定检测对象的菌种是必要的量的扩增产物；或者，不作为目标的DNA 的扩增产物的量增多，导致鉴定的本底上升。专利文献4中，在使用 PCR法进行的作为检测对象的细菌的鉴定中，通过使用用真核生物作为宿主而生产的、抑制了细菌来源的DNA的量的耐热DNA聚合酶制备物，对于专利文献4作为对象的基于现有技术的鉴定方法实现了鉴定灵敏度的显著提高，但对于如上所述作为检测对象的细菌的DNA 的量比大量地存在的作为检测对象的细菌以外的DNA更少的被检样品，也有必要使更高灵敏度的鉴定成为可能。从这样的观点考虑，对于PCR法中使用的引物组，设计出不存在并非目标的扩增产物、选择性更高的引物也是重要的。然而现状是，着眼于上述那样的以血液等被检样品为检测对象时的技术课题而设计的引物组在现有技术中并不存在。

此外，在使用扩增产物的Tm值进行对检出对象菌的分析、对未鉴定菌的鉴定时，从提高检测的迅速性、检出灵敏度方面考虑，优选选择可得到具有合适的Tm值的扩增产物的引物组。

另一方面，利用PCR法进行的扩增中使用的耐热性DNA聚合酶制备物的特性、其使用条件也成为对于提升使用了PCR法的检测的检出灵敏度而言的重要要素之一。

虽然在PCR反应中通常使用的市售的耐热性DNA聚合酶制备物中，高纯度纯化制备物也有市售，但即使使用这些高纯度纯化制备物进行PCR反应，也会在为了进行高灵敏度检出而需要进行超过通常的30个循环左右的循环数的基因扩增反应等情况下，检测到原因不明、来源不明的扩增产物，其使用存在限度。

专利文献4中，虽然提到了DNA聚合酶的宿主来源的细菌DNA 的混入，但并未提及其他的来源于试剂、器具的作为污染源的细菌来源的DNA的混入。然而，来源于试剂、器具的作为污染源的细菌来源DNA的混入，在极微量的被检样品中的细菌DNA的检出及细菌菌种的鉴定中，带来极其重大的影响，这点已通过本发明人的研究而明确。

在将极微量的被检样品中的细菌来源的DNA扩增的情况的PCR 分析中，尚未提供用于更进一步地将灵敏度和特异度均控制为高水平的手段，关于以被检样品中的细菌来源的DNA为对象的情况下的细菌菌种的高灵敏度的鉴定，也不能说已充分实现。

通过专利文献2中公开的使用以真核生物为宿主而生产的耐热性 DNA聚合酶制备物的检出方法，可将细菌来源的DNA的检出极限降低至10fg/μL，与以往的使用PCR的检出方法相比，能以更高灵敏度分析来源于被检样品的DNA。

通过专利文献2中公开的方法，使用序列号51和序列号52进行 PCR法时，可检出10fg/μL以上的微生物DNA，但无法检出不足10fg/ μL的浓度的DNA。由此，若以某种溶液为模板，利用专利文献2 中公开的方法，使用序列号51和序列号52进行PCR，未能确认到目标产物的扩增的话，则可确认在该溶液中混入的细菌来源的DNA的浓度不足10fg/μL。

为了不仅以高灵敏度高精度地进行被检样品中的细菌菌种的检出，而且以高灵敏度高精度地进行被检样品中的细菌菌种的鉴定，除了降低细菌来源的DNA量的检出极限之外，获得足以进行细菌菌种鉴定的量的被检样品来源的DNA扩增产物是必要的。例如，通过测定被检样品来源的DNA的扩增产物的Tm值而进行被检样品中的细菌菌种的鉴定时，为了得到可靠性高的Tm值的测定结果，为此，利用PCR得到充分的量的扩增产物是重要的。换言之，未进行充分的 DNA的扩增时，无法进行正确的Tm值的测定，高精度的鉴定变难。

例如，每1个细胞的大肠杆菌的基因组DNA约为5fg，检出极限为10fg/μL的检出方法的情况下，理论上，每1μL供于PCR的试样的DNA量相当于2个大肠杆菌细胞，以高灵敏度检出被检样品中的大肠杆菌成为可能。与此相对，相当于为了测定DNA扩增产物的有可靠性的Tm值所需要的最低限度的来源于被检样品中的大肠杆菌的 DNA量，即当假设鉴定极限为20pg/μL时供于PCR的DNA量可被认为是相当高的量。

通过本申请的发明人的研究，得到了下述新的见解：在能以高灵敏度检出细菌菌种的测定系统中，为了进一步降低鉴定极限而高精度地进行高灵敏度的细菌菌种的鉴定，使用进一步提高了扩增产物的扩增率、选择性的引物组是有效的。例如，由专利文献2及专利文献4 中使用的全部细菌的16SrRNA基因中共有的序列部位制作的引物具有相同序列，若能提供与上述专利文献中公开的引物组相比进一步提高了扩增产物的扩增率、选择性的引物组，则不仅可进一步提高细菌菌种的检出灵敏度，而且可进一步提高细菌菌种的鉴定灵敏度。

因此，本发明的目的在于，提供对于进一步提高利用PCR法检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的灵敏度有用的引物组、使用了其的用于PCR的试剂盒及检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法。

本发明的另一目的在于，通过使细菌来源的核酸的混入量为最小限度、并进行使用了上述的引物组的PCR法，从而达成检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法的灵敏度的进一步的提高。

用于解决课题的手段

本发明人鉴于上述课题而进行深入研究，结果发现，通过使用特定的引物组、进而使使用的试剂及器具的作为污染源的细菌来源的 DNA的混入为最小限度，从而可得到可高灵敏度、高精度地实施极微量的被检样品中的细菌DNA的检出及该细菌菌种的鉴定的细菌菌种鉴定试剂盒。

本发明涉及的用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组的特征在于，包含从后述的第S1组～第S7组的各组中分别选择1对引物对而得到的7对引物对中的至少1对引物对。

本发明涉及的用于检出细菌菌种的试剂盒的特征在于，包含从后述的第K1组～第K7组的各组中分别选择1对引物对而得到的7对引物对中的至少1对引物对。

该试剂盒除了具有引物组之外，可进一步具有从用于PCR的酶、 pH缓冲液、荧光色素、dNTP、MgCl₂及测定用容器等中选择的至少 1种试剂及部件，可使得以它们的分别或整体计细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

本发明涉及的检出及/或鉴定被检样品中的检出对象细菌菌种的方法的特征在于，具有以下工序：

使用由前述被检样品制备的细菌的基因组DNA、引物、和耐热性DNA聚合酶进行PCR的工序，所述引物用于得到包含在检出对象细菌菌种中为特异性的目标基因的扩增产物，和

通过检出前述PCR的扩增产物中的前述目标基因、或分析该扩增产物，从而进行前述被检样品中的检出对象细菌菌种的检出或鉴定的工序，

使用上述的引物组作为前述引物。

发明的效果

通过本发明，可提供对于高灵敏度检出及/或鉴定细菌菌种有用的用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组及用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒。此外，通过使该试剂盒中使用的试剂及器具的作为污染源的细菌来源的DNA的混入为最小限度，可进一步提高细菌菌种的检出及/或鉴定的灵敏度。因此，通过本发明，可与以往的检测试剂盒相比更高灵敏度、更高精度地实施医疗领域、食品领域等中的极微量的被检样品中的细菌来源的DNA的检出及细菌菌种的检出及/或鉴定。

附图说明

[图1A]为表示实施例2和比较例2中的电泳的结果的一部分的图。

[图1B]为表示实施例3和比较例3中的实时PCR的结果的一部分(扩增曲线)的图。

[图1C]为表示实施例3和比较例3中的实时PCR的结果的一部分(熔融曲线)的图。

[图2]为表示实施例12中的结果的图。

[图3]为表示实施例13中的结果的图。

[图4]为表示实施例14中的结果的图。各线为以下的引物对的扩增结果。(1)序列号15与16的组合(2)序列号43与50的组合(3)序列号51与52的组合(4)序列号53与57的组合(5) 序列号62与70的组合(6)序列号81与103的组合(7)序列号 115与5的组合

[图5]为表示实施例16中的结果的图。

具体实施方式

<引物>

本发明中的第一点在于能享有检出灵敏度提高及基于此的鉴定精度提高这样的效果的特定的引物组。

专利文献4中记载的引物组中的各引物具有与编码细菌16S rRNA的DNA(16SrDNA)中的细菌共有的保守区杂交的DNA序列 (序列号1，序列号16，序列号28，序列号44，序列号51，序列号 52，序列号53，序列号57，序列号62，序列号70，序列号76，序列号91，序列号104，序列号2)。然而，如图1A的第2道所示，对于专利文献4中记载的引物组而言，在电泳分析中出现分析对象物以外的条带，或者，未能检测到目标扩增产物，或者，在实时PCR中散见扩增效率低的物质(参照图1B的虚线)，在实时PCR的熔融曲线分析中，出现主峰以外的峰(或肩)(参照图1C的虚线)。它们有时成为进一步提高极微量的被检样品来源的DNA的检出及细菌菌种的鉴定的检出灵敏度的障碍。

16S rDNA上存在有多个细菌共有的保守区，但对专利文献2中记载的引物组所识别的7个区域进行了研究。具体而言，以专利文献 2中记载的引物组为基准，在距共有保守区的3’末端侧及5’末端侧偏离数碱基～数十个碱基程度的范围，并且分别针对正向引物、反向引物进行了关于十～数十个碱基左右的引物的各种设计。对于设计的与7个保守区相当的多对引物对，进行了效果确认，明确发现，被分类为以下的第S1组～第S7组的引物对以及被分类为第K1组～第K7 组的引物对是合适的。

因此，从第S1组～第S7组的各组中分别选择1对引物对，利用这样得到的7对第1～第7的选择的引物对的组中的至少1对、优选至少4对，作为可用于检出及/或鉴定细菌菌种的用于扩增细菌DNA 的PCR中使用的引物组。需要说明的是，通过使用第1～第7的选择的引物对中的至少4对引物对，可作为用于鉴定细菌菌种的引物组。

(引物组用引物对)

第S1组：

1-1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号1的序列，所述反向引物包含序列号22及27中的任一序列，

1-2A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号10的序列，所述反向引物包含序列号20及21 中的任一序列，

1-3A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号11的序列，所述反向引物包含序列号16、18及 26中的任一序列，

1-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号12的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号13的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号15的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-8A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号6的序列，所述反向引物包含序列号16、19～21、 23、24、26及27中的任一序列，

1-9A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号7的序列，所述反向引物包含序列号16～21、23、 24、26及27中的任一序列，或

1-10A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号8的序列，所述反向引物包含序列号16～21、23、 24、26及27中的任一序列，

第S2组：

2-1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号28的序列，所述反向引物包含序列号45及47～ 50中的任一序列，

2-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号29的序列，所述反向引物包含序列号44、45、47、48及50中的任一序列，

2-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号30的序列，所述反向引物包含序列号45及47～50 中的任一序列，

2-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号31的序列，所述反向引物包含序列号46及47中的任一序列，

2-5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号32的序列，所述反向引物包含序列号45及47～49 中的任一序列，

2-6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号33的序列，所述反向引物包含序列号44、45及 47～50中的任一序列，

2-7A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号34的序列，所述反向引物包含序列号45、47及 48中的任一序列，

2-8A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号35的序列，所述反向引物包含序列号44、45、 48及49中的任一序列，

2-9A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号36的序列，所述反向引物包含序列号44、45、 48及49中的任一序列，

2-10A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号37的序列，所述反向引物包含序列号45及47～ 50中的任一序列，

2-11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号38的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，

2-12A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号39的序列，所述反向引物为序列号44～48及50 中的任一，

2-13：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号40的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，

2-14A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号41的序列，所述反向引物包含序列号45及46 中的任一序列，

2-15A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号42的序列，所述反向引物包含序列号48及49 中的任一序列，或

2-16A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号43的序列，所述反向引物包含序列号44、46～ 48及50中的任一序列，

第S3组：

引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号51的序列，所述反向引物包含序列号52的序列，

第S4组：

4-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号53的序列，所述反向引物包含序列号57～61中的任一序列，

4-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号54的序列，所述反向引物包含序列号59及61中的任一序列，

4-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号55的序列，所述反向引物包含序列号57～59及号 61中的任一序列，或

4-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号56的序列，所述反向引物包含序列号57～59及61 中的任一序列，

第S5组

5-1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号62的序列，所述反向引物包含序列号70、73～ 75中的任一序列，

5-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号63的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

5-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号64的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

5-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号65的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

5-5A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号66的序列，所述反向引物包含序列号70、72、 73及75中的任一序列，

5-6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号67的序列，所述反向引物包含序列号70、71及73～75中的任一序列，

5-7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号68的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，或

5-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号69的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

第S6组

6-1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号76的序列，所述反向引物包含序列号93、96及 101～103中的任一序列，

6-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号77的序列，所述反向引物包含序列号91、96及 101～103中的任一序列，

6-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号78的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，

6-4A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号79的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，

6-5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号80的序列，所述反向引物包含序列号91、93及 100～103中的任一序列，

6-6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号81的序列，所述反向引物包含序列号91、93及 101～103中的任一序列，

6-7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号82的序列，所述反向引物包含序列号91、96、97 及101～103中的任一序列，

6-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号83的序列，所述反向引物包含序列号91、101～103 中的任一序列，

6-9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号84的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，

6-10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号85的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，

6-11A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号86的序列，所述反向引物包含序列号91、93及 101～103中的任一序列，

6-12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号87的序列，所述反向引物包含序列号91、96及 101～103中的任一序列，

6-13：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号88的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，

6-14：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号89的序列，所述反向引物包含序列号91及101～ 103中的任一序列，或

6-15：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的分别的组合，所述正向引物包含序列号90的序列，所述反向引物包含序列号91、 92、96及101～103中的任一序列

第S7组

7-1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号104的序列，所述反向引物包含序列号5及118～ 125、127、128、130及131中的任一序列，

7-2A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号105的序列，所述反向引物包含序列号5及118～ 125中的任一序列，

7-3A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号106的序列，所述反向引物包含序列号2、5及 116及118～131中的任一序列，

7-4A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号107的序列，所述反向引物包含序列号120及121 中的任一序列，

7-5A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号108的序列，所述反向引物包含序列号120及123 中的任一序列，

7-6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号109的序列，所述反向引物包含序列号2、118～ 122、124及126中的任一序列，

7-7A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号110的序列，所述反向引物包含序列号118、120、 121、124及126～130中的任一序列，

7-8A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号111的序列，所述反向引物包含序列号2、5及 118～131中的任一序列，

7-9A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号112的序列，所述反向引物包含序列号2、5及 116、及118～125中的任一序列，

7-10A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号113的序列，所述反向引物包含序列号2、5、 118～126、130及131中的任一序列，

7-11A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号114的序列，所述反向引物包含序列号5的序列，或

7-12A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号115的序列，所述反向引物包含序列号2及5中的任一序列

此外明确，作为构成用于检出细菌菌种的试剂盒的引物对，被分类为以下的第K1组～第K7组的引物对是合适的。

因此，从第K1组～第K7组的各组中分别选择1对引物对，利用这样得到的7对第1～第7的选择的引物对的组中的至少1对、优选至少4对，可构成用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒。需要说明的是，通过使用第1～第7的选择的引物对的组中的至少4对引物对，可制成用于鉴定细菌菌种的试剂盒。

(试剂盒用引物对)

第K1组：

1-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号1的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号10的序列，所述反向引物包含序列号16、18、20 及21中的任一序列，

1-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号11的序列，所述反向引物包含序列号16～21和 23～26中的任一序列，

1-6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号14的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号6的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号7的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，

1-10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号8的序列，所述反向引物包含序列号16～27中的任一序列，或

1-11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号9的序列，所述反向引物包含序列号16、17、19 及26中的任一序列，

第K2组：

2-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号28的序列，所述反向引物包含序列号44、45及序列号47～50中的任一序列，

2-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号29的序列，所述反向引物包含序列号44、45、47、 48及50中的任一序列，

2-6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号33的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，

2-7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号34的序列，所述反向引物包含序列号45～50中的任一序列，

2-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号35的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，

2-9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号36的序列，所述反向引物包含序列号44～46及 48～50中的任一序列，

2-10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号37的序列，所述反向引物包含序列号45～50中的任一序列，

2-12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号39的序列，所述反向引物为序列号44～50中的任一，

2-14：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号41的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，

2-15：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号42的序列，所述反向引物包含序列号44～50中的任一序列，或

2-16：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号43的序列，所述反向引物包含序列号44～48及 50中的任一序列，

第K3组：

第K4组：

第K5组

5-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号62的序列，所述反向引物包含序列号70、71及73～ 75中的任一序列，

5-5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号66的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

5-6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号67的序列，所述反向引物包含序列号70～75中的任一序列，

第K6组

6-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号76的序列，所述反向引物包含序列号91、93、96 及101～103中的任一序列，

6-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号79的序列，所述反向引物包含序列号91、97及 101～103中的任一序列，

6-11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号86的序列，所述反向引物包含序列号91、93、 97及101～103中的任一序列，

第K7组

7-1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号104的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号105的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号106的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号107的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号108的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号109的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号110的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号111的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116 131中的任一序列，

7-9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号112的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116 131中的任一序列，

7-10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号113的序列，所述反向引物包含序列号2、5及 116～131中的任一序列，

7-11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号114的序列，所述反向引物包含序列号2、5及 125中的任一序列，或

7-12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号115的序列，所述反向引物包含序列号2、5、116、 118、123及125～128中的任一序列。

包含从上述的第S1组～第S7组中选择的引物对的引物组优选包含以下的S-1)～S-7)的7对引物对中的至少1对引物对。

S-1)作为第S1组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号15的序列，所述反向引物包含序列号16的序列，

S-2)作为第S2组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号43的序列，所述反向引物包含序列号50的序列，

S-3)作为第S3组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号51的序列，所述反向引物包含序列号52的序列，

S-4)作为第S4组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号53的序列，所述反向引物包含序列号57的序列，

S-5)作为第S5组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号62的序列，所述反向引物包含序列号70的序列，

S-8)作为第S6组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号81的序列，所述反向引物包含序列号103的序列，及

S-7)作为第S7组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号115的序列，所述反向引物包含序列号5的序列。

此外，对于上述的引物组而言，用于检出细菌菌种时，包含前述 S-1)～S-7)的引物对中的任1对作为必需成分是优选的，用于检出及/或鉴定细菌菌种时，包含以下的A～G中的任一组合是优选的。

(A)在必须包含前述S-1)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-2)～S-7)中选择的至少3对引物对。

(B)在必须包含前述S-2)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-1)及S-3)～S-7)中选择的至少3对引物对。

(C)在必须包含前述S-3)的引物组的情况下，进一步包含从 S-1)、S-2)及S-4)～S-7)中选择的至少3对引物对。

(D)在必须包含前述S-4)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-1)～S-3)及S-5)～S-7)中选择的至少3对引物对。

(E)在必须包含前述S-5)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-1)～S-4)及S-6)～S-7)中选择的至少3对引物对。

(F)在必须包含前述S-6)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-1)～S-5)及S-7)中选择的至少3对引物对。

(G)在必须包含前述S-7)的引物组的情况下，进一步包含从前述S-1)～S-6)中选择的至少3对引物对。

包含从上述的第K1组～第K7组中选择的引物对的试剂盒用的引物组优选包含以下的K-1)～K-7)的7对引物对中的至少1对引物对。

K-1)作为第K1组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号15的序列，所述反向引物包含序列号16的序列，

K-2)作为第K2组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号43的序列，所述反向引物包含序列号50的序列，

K-3)作为第K3组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号51的序列，所述反向引物包含序列号52的序列，

K-4)作为第K4组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号53的序列，所述反向引物包含序列号57的序列，

K-5)作为第K5组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号62的序列，所述反向引物包含序列号70的序列，

K-6)作为第K6组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号81的序列，所述反向引物包含序列号103的序列，及

K-7)作为第K7组的引物组，为下述引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号115的序列，所述反向引物包含序列号5的序列。

此外，对于上述的试剂盒用的引物组而言，用于检出细菌菌种时，包含前述K-1)K-～7)的引物对中的任1对作为必需成分是优选的，用于检出及/或鉴定细菌菌种时，包含以下的A～G中的任一组合是优选的。

(A)在必须包含前述K-1)的引物组的情况下，进一步包含从前述K-2)～K-7)中选择的至少3对引物对。

(B)在必须包含前述K-2)的引物组的情况下，进一步包含从前述K-1)及K-3)～K-7)中选择的至少3对引物对。

(C)在必须包含前述K-3)的引物组的情况下，进一步包含从 K-1)、K-2)及K-4)K-7)中选择的至少3对引物对。

(D)在必须包含前述4)的引物对的情况下，进一步包含从前述K-1)～K-3)及K-5)K-7)中选择的至少3对引物对。

(E)在必须包含前述5)的引物对的情况下，进一步包含从前述K-1)～K-4)及K-6)～K-7)中选择的至少3对引物对。

(F)在必须包含前述K-6)的引物组的情况下，进一步包含从前述K-1)～K-5)及K-7)中选择的至少3对引物对。

(G)在必须包含前述K-7)的引物组的情况下，进一步包含从前述K-1)～K-6)中选择的至少3对引物对。

在上述的引物组中，通过组合使用S-1～S-7的引物对中的4 对，可进行细菌菌种的鉴定，优选将从上述7对引物对中选择的组数增加至5以上，更优选组合7对S-1～S-7的引物对中的全部。像这样，通过增加选择的引物的组数，可进一步提高鉴定精度。

同样地，通过在上述的试剂盒用的引物组中组合使用K-1～K -7的引物对中的4对，可进行细菌菌种的鉴定，优选将从上述7对引物对中选择的组数增加至5以上，更优选组合7对K-1～K-7的引物对中的全部。像这样，通过增加选择的引物的组数，可进一步提高鉴定精度。

另外，只要在可享有本发明的效果的范围内，也可应用序列中一部分碱基有所变化的序列。原则上，只要是可与本申请的权利要求记载的序列号的各DNA片段的互补链杂交的序列，就视同为本发明的引物，只要是在碱基序列中添加、缺失或取代1～2个的碱基而成的碱基序列，就与本发明的引物同等看待。

应予说明，本发明的引物组是基于大量的组合确认有无效果后才发现的引物组，而非仅仅是对效果进行事后确认的水平所能实现的。另外，进行了序列检索，结果确认，是新型的作为用于检出及/或鉴定细菌菌种的引物组的组合。

本发明中，除了本发明的引物组以外，不妨碍并用多种关于真菌、特定微生物或病毒而已知的引物。

本发明的引物组可合适地用于以下目的：利用PCR，由从被检样品提取的细菌DNA，扩增目标DNA片段，测定扩增的DNA片段的 Tm，或测定分子量，对序列进行解读。具体而言，可合适地用于通过利用本发明的引物组扩增的包含Bacteria的16S rDNA序列的一部分的DNA片段的Tm值，鉴定细菌菌种。

利用PCR进行的DNA扩增、Tm测定中，在使用用于引物组或用于试剂盒的前述第1～第7的引物对中的1对以上的引物对之前，利用包含与16S rDNA上的细菌共有的保守区杂交的DNA序列的、碱基数为15～30b的正向及反向引物对，预先扩增包含目标序列的 DNA，对于该扩增的试样，可利用前述引物组进一步进行PCR扩增 (所谓的巢式PCR(Nested PCR)法及半巢式PCR(Semi-nested PCR) 法)。

在第1次利用PCR进行的DNA扩增中使用的碱基数为15～30b 的正向及反向引物只要包含与16S rDNA序列上的细菌共有的保守区杂交的DNA序列，就没有特别限制，但优选使用该引物对的PCR产物的DNA链长为500bp～1500bp。特别地，与第2次扩增中使用的引物组(具体为第K1组至K7组中记载的引物对)杂交并由此可得到至少4个以上的DNA片段这样的DNA产物得以产生的引物是优选的。

本发明中可使用的引物组可合适地用于极微量的被检样品细菌 DNA的检出及/或细菌菌种的鉴定。因此，有必要将各引物对中作为污染源的细菌来源的DNA的混入抑制为最小限度。关于作为污染源的细菌来源的DNA的混入量，相对于引物对制备液，不足10fg、优选不足5fg、进一步优选不足1fg。

PCR中的引物浓度没有特别限制，通常在0.05μM～1.0μM的范围内根据研究适当设定。

<试剂>

对于本发明中为了进行PCR分析而使用的引物组以外的试剂而言，可通过已知的组合使用已知的试剂。对于测定中所需要的试剂而言，可举出用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、Mg²⁺源、通过过滤处理等而进行了纯化的无菌水。另外，在实时PCR分析中，除了上述之外，还需要荧光色素。

<用于PCR的酶>

作为本发明中可使用的用于PCR的酶，优选使用将细菌来源的 DNA混入量止于最小限度的耐热性DNA聚合酶。具体而言，可举出利用真核生物生产的酶、经高度纯化处理的酶、或利用作为选择的膜透过性色素的EMA(叠氮溴化乙锭，ethidium monoazide)、PMA(叠氮溴化丙锭，propidium monoazide)处理过的酶，但不受限制。

作为本发明中的宿主或作为污染源的细菌来源的DNA的混入量，相对于酶制备液，不足10fg、优选不足5fg、进一步优选不足1fg。需要说明的是，利用细菌来源的耐热性DNA聚合酶基因，用真核生物进行生产，使用混有来自细菌来源的耐热性DNA聚合酶基因的DNA 的状态的耐热性DNA聚合酶制备物(制备液)时，使编码耐热性DNA 聚合酶的基因以外的细菌来源的DNA的混入量为上述的上限以下。用于PCR的酶优选为细菌来源的DNA含量不足10fg/μL的Taq DNA 聚合酶。

编码本发明中可使用的用于PCR的酶的基因可以是编码耐热性 DNA聚合酶的cDNA、基因组DNA、合成DNA等任何基因，另外，可以是单链，也可以是具有其互补链的双链，可包含天然或人工的核苷酸衍生物。此外，耐热性DNA聚合酶为生物来源时，对该耐热性DNA聚合酶的来源也没有特别限制。

作为本发明中可使用的耐热性DNA聚合酶的具体例，可举出栖热水生菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)、Thermococcus gorgonarius(Thermococcus gorgonarius)、Thermococcus kodakaraensis KOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1)、伍氏热球菌(Pyrococcus woesei)Pyrococcus furiosus(Pyrococcus furiosus)、Aeropyrum pernix(Aeropyrum pernix)、Aquifex aeolicus(Aquifex aeolicus)、东工大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)、或甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)来源的耐热性DNA聚合酶。

另外，耐热性DNA聚合酶也可以是利用基因工程学人工合成的耐热性DNA聚合酶。

本发明中使用的用于PCR的酶优选为具有耐热性的生物来源的耐热性DNA聚合酶，更优选为甲烷菌、嗜热嗜酸菌、嗜热菌、超嗜热菌等原核生物来源的酶。

(真核生物生产)

作为本发明中可使用的用于PCR的酶，优选为以真核生物为宿主而生产的酶。

作为真核细胞，可举出菌类、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，作为宿主细胞，只要是真核生物来源的细胞即可，没有特别限制。

作为菌类，可举出酵母、霉菌等子囊菌、丝状菌、担子菌、接合菌等，其中，优选酵母或丝状菌，作为具体例，可举出酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属 (Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Rhodosporidi (Rhodosporidi)、曲霉菌属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)等。

具体而言，可举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidini)、Pichia metanolica(Pichia metanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、圆红冬孢酵母 (Rhodosporidium toruloides)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Aspergillus oryzae(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、及里氏木霉(Trichodermareesei)等。

作为动物细胞，可举出人来源培养细胞、小鼠来源培养细胞等，作为具体例，可举出CHO细胞、Hela细胞等。作为植物细胞，只要是由植物衍生的细胞即可，优选为已建立细胞系的培养细胞，可举出烟草(Nicotiana)属细胞、拟南芥(Arabidopsis)属细胞、番薯(Ipomoea) 属细胞、胡萝卜(Daucus)属细胞、稻(Oryza)属细胞等，具体而言，可举出烟草(Nicotiana tabacum)BY-2培养细胞、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)培养细胞、番薯(Ipomoea batatas)培养细胞、胡萝卜(Daucus carota)培养细胞、稻(Oryza sativa)培养细胞等。作为昆虫细胞，只要是由昆虫衍生的细胞即可，优选为已建立细胞系的培养细胞，可举出蛾近似种草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞来源培养细胞sf9株、sf21株、蚕(Bombix mori)培养细胞 Bm-N株等。作为宿主细胞，优选为酵母等增殖快的微生物或真核生物，例如，可举出以酿酒酵母等酵母菌属为代表的酵母、以烟草 (Nicotianatabacum)等烟草(Nicotiana)属植物的培养细胞为代表的植物细胞、以米曲霉等曲霉(Aspergillus)属为代表的丝状菌。

制造方法没有特别限制，例如，可按照专利文献4中记载的方法适当制造。

(高度纯化处理)

另外，可以是以大肠杆菌等细菌为宿主生产的一般的酶，也可以是使用DNA分解酶、离子交换树脂等物理地除去宿主细菌来源的DNA的实施了高度纯化处理的酶，只要是使作为污染源的细菌来源的DNA的混入量相对于酶制备液不足10fg，就可在本发明中使用。

(基于选择性膜透过性色素的处理)

对于用于PCR的酶，通过与作为选择性膜透过性色素的EMA (ethidiummonoazide)、PMA(propidium monoazide)混合并进行光照射，可使作为污染源的细菌来源的DNA、尤其是死菌细菌来源的 DNA失活。已失活的DNA不发生基于PCR的扩增，因此，可仅对被检样品中存在的作为检出的对象的细菌来源的DNA进行检出及细菌菌种的鉴定。处理条件按照该试剂及该试剂处理剂的制造销售厂商的推荐条件。

<其他试剂、器具等>

pH缓冲液是为了将提供给PCR分析的试样调整为pH＝7.0～10.0 (更优选为、pH8.0～9.0)而使用的。具体而言，可举出Tris盐酸缓冲液等。例如，在Tris盐酸缓冲液的情况下，以5mM～100mM使用。

dNTP是为了进行基于PCR的DNA扩增的核苷源，dATP、dGTP、 dCTP、dTTP这4种是必要的。另外，关于dNTP，可使用为了用于热启动(Hot-start)法而进行了化学修饰的物质，例如可使用TriLink BioTechnologies，Inc.制CleanAmp^TM dNTP。对于使用量而言，以分别为0.2mM左右的浓度使用dATP、dGTP、dCTP、dTTP。

在基于PCR的DNA扩增中，Mg²⁺是必要的。作为Mg²⁺源，可举出MgCl₂、MgSO₄等。优选的是MgCl₂，对于其使用量而言，在0.5mM 至5.0mM的范围内根据研究适当使用。

荧光色素是出于基于实时PCR的DNA扩增产物的检出、以及已扩增的DNA片段的Tm测定的目的而使用的，可使用多种已知的荧光色素。例如，可举出使用具有标识功能的嵌入剂(intercalator)的方法、使用在相对扩增的DNA序列特异性地杂交的核苷酸上结合荧光物质的探针的方法等。作为嵌入剂，可举出作为不饱和型荧光色素的溴化乙锭、SYBR GreenI、作为饱和型荧光色素的Resolight(Roche 公司制)、EvaGreen(Biotim公司制)等。优选的嵌入剂为作为不饱和型荧光色素的SYBR Green I、作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight，更优选为作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight。对于使用量而言，按照使用的荧光色素的制造销售厂商的推荐。

此外，试剂盒中可包含作为PCR的阳性对照而使用的细菌的基因组DNA、作为阴性对照而使用的无菌水，

作为本发明中可使用的PCR分析测定用容器(例如分析测定用管(tube))，可选择具有对应于测定仪器的形状、结构的PCR分析测定用容器而使用。如果使用由测定仪器的获得处推荐的PCR分析测定用容器，则可没有特别问题地用于测定。

实施本发明时，作为另外的必要的器具，可举出移液器、移液器用枪头、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物学的实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出PCR、净化台(clean bench)、管用离心机等在分子生物学的实验中广泛使用的仪器。

<污染程度>

本发明中的第二点在于，使得以试样液整体计的作为污染源的细菌来源的DNA的混入程度降低至不妨碍极微量的被检样品细菌的检出及细菌菌种的鉴定的程度，所述试样液是包含用于检出及/或鉴定的引物、为了进行PCR测定而制备的试样液。

专利文献4中记载了作为耐热性聚合酶制备液中的细菌来源的 DNA的混入量，优选10fg以下。然而，经本申请的发明人研究发现，关于试剂·器具中的细菌污染，在极微量的被检样品细菌的检出及细菌菌种的鉴定中也是极其重要的因素。直接使用市售的试剂·器具而供于分析时，根据情况，散见可观察到基于PCR的扩增的情况(比较例11)。

本发明中，对于使用的各试剂，需要抑制作为污染源的细菌来源的DNA的混入是当然的，对于为了制作测定用制备液而使用的器具、过滤水也同样，需要抑制作为污染源的细菌来源的DNA的混入。关于器具，在阻断来自环境的DNA的混入的例如洁净室(clean room)等作业空间中，用无DNA混入的溶解DNA的洗涤水洗涤器具，对洗涤后的洗涤水实施基于PCR法的分析，由此可检测DNA的混入。根据需要，可使用该方法检测有无DNA的混入。

作为本发明中的作为污染源的细菌来源的DNA的混入量，相对于鉴定试剂盒整体为10fg以下、优选为5fg以下、进一步优选为1fg 以下。对于各试剂·器具，虽然也取决于后述的试剂盒的方式，但相对于每种单独的制备液不足10fg、优选不足5fg、进一步优选不足1fg。通过将作为污染源的细菌来源的DNA的混入量抑制为该水平，即使实行极微量的被检样品细菌的检出及细菌菌种的鉴定所需要的PCR 分析的30循环以上的扩增，也不出现不需要的峰，不存在Tm值的偏离等，可高灵敏度、高精度地进行细菌菌种的检出及细菌菌种的鉴定。

<污染除去方法>

对于本发明中使用的试剂·器具，作为抑制作为污染源的细菌来源的DNA的混入的方法，可举出UV照射处理、γ射线灭菌处理、超滤处理、EMA处理等。通过检验等而明确作为污染源的细菌来源的DNA的混入量为10fg以下时，不一定需要进行以下的处理。

(γ射线灭菌处理)

对于本发明中使用的试剂·器具，通过直接照射γ射线，可破坏作为污染源的细菌来源的DNA。对于γ射线照射条件，根据被照射物的种类的不同而不同。通常可应用5kGy～30kGy、优选10kGy～ 25kGy的处理。

但是，对于Resolight、EvaGreen、SYBR Green I等特定的荧光色素、引物、聚丙烯等特定的材质的器具，通过γ射线照射而发生劣化，因此，根据条件，无法应用γ射线灭菌处理。后述的实施例15示出了γ射线灭菌处理的效果。

(超滤处理)

对于本发明中使用的试剂，通过进行超滤处理，可将作为污染源的细菌来源的DNA分离除去。具体而言，作为污染源的细菌来源的 DNA为细菌本身、或为基因组DNA时，其分子量大，因此，以使使用的试剂等通过超滤膜、使基因组DNA不通过超滤膜的方式选择膜后，实施超滤即可。作为超滤膜，优选使用分级分子量为1kDa～ 1000kDa、优选为10kDa～100kDa、更优选为30kDa～50kDa的膜。其中，在对引物进行超滤处理时，使用超滤膜的分级分子量为10kDa～ 1000kDa、优选为30kDa～100kDa、更优选为30kDa～50kDa的膜。作为超滤膜的材质，没有特别限制，可举出再生纤维素、纤维素乙酸酯、聚醚砜等。作为用于超滤的压力源，可使用气体加压、离心等任意的方法，可根据处理量而选择优选的方法。

处理量少时，优选离心膜过滤处理。离心膜过滤处理的情况下，处理液量、离心操作时的离心力(G)按照使用的过滤装置的制造销售厂商的推荐。

后述的实施例13、实施例14及比较例10、比较例11示出了离心式膜过滤处理的效果。

(选择性膜透过性色素处理)

对于试剂·器具，通过用作为选择性膜透过性色素的EMA (ethidiummonoazide)、PMA(propidium monoazide)进行处理并进行光照射，可使作为污染源的细菌来源的DNA、尤其是死菌细菌来源的DNA失活。失活的DNA不发生基于PCR的扩增，因此，可仅对被检样品中存在的作为检出对象的细菌来源的DNA进行检出及细菌菌种的鉴定。

处理条件按照该试剂及该试剂处理剂的制造销售厂商的推荐条件。例如，TakaraBio公司的”Viable Bacteria Selection Kit for PCR”公开了以下条件：相对于作为处理对象的溶液40μl，添加附带的 Solution A-gn液10μl、Solution B-gn液5μl，在遮光下静置5～15分钟而进行反应，然后进行约5分钟光照射。后述的实施例16 示出了EMA处理的效果。

<试剂盒的方式>

本发明的细菌菌种鉴定试剂盒是用于通过对利用本发明的引物组而扩增的包含细菌的16S rDNA序列的一部分的DNA片段进行分析从而鉴定细菌菌种的试剂盒。对于DNA片段的分析而言，可举出 DNA片段的分子量分析、Tm值测定等。优选为Tm值测定，为了该目的，可优选使用实时PCR。分子量的分析可利用电泳、质谱仪等进行分析。

明确了作为构成用于检出细菌菌种的试剂盒的引物对，被分类为以下的第K1组～第K7组的引物对是合适的。因此，从第K1组～第 K7组的各组中分别选择1对引物对，使用这样得到的7对引物对中的至少1对、优选至少4对，形成用于检出细菌菌种的试剂盒。

(试剂盒用引物对)

第K1组：

第K2组：

第K3组：

第K4组：

第K5组

第K6组

6-15：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的分别的组合，所述正向引物包含序列号90的序列，所述反向引物包含序列号91、 92、96及101～103中的任一序列，

第K7组

7-8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号111的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

7-9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号112的序列，所述反向引物包含序列号2、5及116～ 131中的任一序列，

上述的引物组及试剂盒优选包含下述的1)～7)的7对引物对中的至少1对引物对。

1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号15的序列，所述反向引物包含序列号16的序列，

2)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号43的序列，所述反向引物包含序列号50的序列，

3)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号51的序列，所述反向引物包含序列号52的序列，

4)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号53的序列，所述反向引物包含序列号57的序列，

5)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号62的序列，所述反向引物包含序列号70的序列，

6)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号81的序列，所述反向引物包含序列号103的序列，及

7)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号115的序列，所述反向引物包含序列号5的序列。

此外，上述的试剂盒优选包含前述1)～7)的引物对中的任1 对作为必需成分，用于鉴定细菌菌种时，包含以下的A～G中的任一组合是优选的。

(A)在必须包含前述1)的引物组的情况下，进一步包含从前述2)～7)中选择的至少3对引物对。

(B)在必须包含前述2)的引物组的情况下，进一步包含从前述1)及3)～7)中选择的至少3对引物对。

(C)在必须包含前述3)的引物对的情况下，进一步包含从1)、 2)及4)～7)中选择的至少3对引物对。

(D)在必须包含前述4)的引物对的情况下，进一步包含从前述1)～3)及5)～7)中选择的至少3对引物对。

(E)在必须包含前述5)的引物对的情况下，进一步包含从前述1)～4)及6)～7)中选择的至少3对引物对。

(F)在必须包含前述6)的引物对的情况下，进一步包含从前述1)～5)及7)中选择的至少3对引物对。

(G)在必须包含前述7)的引物对的情况下，进一步包含从前述1)～6)中选择的至少3对引物对。

本发明涉及的细菌菌种的检出及/或鉴定试剂盒的构成为，包含1 对以上上述的引物对。除了该引物之外，根据需要，可包含从用于 PCR的酶、pH缓冲液、MgCl₂、dNTP(或CleanAmp-dNTP)及无菌水等试剂、PCR分析测定用容器(例如分析测定用管)、其他必要的器具等部件中选择的至少1种试剂及/或部件。此外，在利用实时 PCR进行的分析中，可添加荧光色素作为成分。另外，根据PCR法的各种方式的不同，可向试剂盒中添加除了上述成分之外的使用的 PCR法所需要的成分。上述各试剂或各部件可以以每种单独、或其一部分分别、或全部一体等任何形态包装。具体而言，例如为以下这样的方式。

1)使用的试剂逐一分开。

2)细分成预先混合pH缓冲液、MgCl₂、dNTP(或CleanAmp- dNTP)、利用实时PCR进行的分析中的荧光色素而成的物质、引物对及酶这3份。

3)细分成预先混合pH缓冲液、MgCl₂、dNTP(或CleanAmp- dNTP)、利用实时PCR进行的分析中的荧光色素、引物对而成的物质、及酶这2份。

4)将预先混合pH缓冲液、MgCl₂、dNTP(或CleanAmp-dNTP)、利用实时PCR进行的分析中的荧光色素、引物和酶全部预先混合。

对于上述试剂盒而言，作为整体，作为污染源的细菌来源的DNA 的混入量为10fg以下，使用的酶是实施了真核生物生产、高度纯化处理或EMA等选择性膜透过性色素处理的酶，使用的试剂·器具(包括PCR分析用管)是根据需要作为每种单独或整体而实施了γ射线灭菌处理、离心式膜过滤处理或选择性膜透过性色素处理的试剂·器具。进行各种处理，以使得在进行各试剂及部件的包装时，包装密封后的包装内的细菌来源的DNA的混入量成为10fg以下。

<用途领域·被检样品>

本发明的细菌菌种检出及/或鉴定试剂盒可用于医疗领域、食品领域、环境分析等各种领域中的细菌的检出及细菌菌种的鉴定。尤其是在医疗领域中，可针对感染症中的感染菌进行检出及/或细菌菌种的鉴定，因而是有用的。

作为可供于细菌检测的被检样品，没有特别限制，可适用于广泛的被检样品。具体而言，医疗领域中，可举出血液、髓液、泪液、羊水、其他体液、导管等医疗器具附着物等。关于血液、羊水、髓液，在严重的感染症的病原菌检出中特别有用。食品领域中，可举出食品自身、生产中途的液体、或固体试样、制造工序内的仪器附着物等。

<DNA提取处理>

使用本发明的鉴定试剂盒实施被检样品中的细菌的检出及/或细菌菌种的鉴定时，需要预先从在被检样品中可能存在的细菌提取DNA。作为DNA提取方法，目前，已知碱溶解法、煮沸(boiling)法、苯酚提取法等，另外，由各厂商公司也销售专用的DNA提取试剂盒。

本发明中的DNA的提取方法没有特别限制，根据被检样品不同，最合适的方法不同，因此，优选选择与对象被检样品相应的方法。需要说明的是，在本申请实施例中使用的QIAGEN公司制QIAamp DNA Mini Kit、Roche公司制高纯度PCR模板制备试剂盒(High purePCR template preparation kit)是可合适地使用的DNA提取方法的一例。另外，如QIAGEN公司制QIAamp DNA Mini Kit的手册中所记载那样，溶出量根据需要可在50ml至200ml间变动。

<PCR分析>

本发明的引物组或试剂盒可在PCR法中使用。作为PCR法，只要是为了检出被检样品细菌的、用于进行目标基因的扩增的PCR法即可，可利用各种PCR法。作为优选的分析法，优选为实时PCR，更优选为实时PCR与用于Tm测定的解曲线分析的组合。该情况下，作为使用的实时PCR仪器的规格，优选温度控制能力为±0.1℃。以下，记载了PCR及实时PCR和使用了其的Tm测定的具体例。

PCR及实时PCR中，装置、方法等使用通常已知的装置、方法即可。

PCR中的温度循环的条件(温度、时间、升降温速度、循环数) 没有特别限制，根据使用的引物、酶、模板等的性质、PCR后的DNA 检出方法的灵敏度适当设定即可。关于这样的条件的设定，已知有大量文献。

PCR中，通常反复进行模板双链DNA的热变性步骤、引物的退火步骤、利用酶进行的DNA延伸步骤。对于热变性的步骤而言，只要为模板双链DNA解离成单链的温度和时间即可，例如在90℃～98 ℃下设定为数秒～数分钟。另外，在PCR开始时，也常常仅对其第1 次的循环，追加数分钟～10分钟的热变性的过程。引物的退火步骤根据引物的碱基序列、碱基数而设定，常在40℃～72℃下设定数秒～数十秒。DNA延伸步骤中，关于温度，根据酶的最适温度等性质，例如，通常为58℃～76℃，关于DNA延伸步骤的时间，由想要扩增的 DNA的链长和酶的DNA合成速度估算必要时间而设定。通过反复进行热变性、退火、延伸的步骤，从而将目标DNA扩增，该反复次数根据模板DNA的量、酶的量、PCR后的DNA检出方法的灵敏度进行适当变更即可，作为一般的例子，可例举10～50次。另外，退火的温度与DNA延伸的温度为同等程度时，也可同时进行两步骤。

实时PCR中，针对DNA扩增所需要的热变性、退火、DNA延伸的条件设定、以及这些步骤的反复次数也与上述的关于PCR的记载同样。实时PCR中，在DNA延伸的步骤前后等，通过测定来源于嵌入剂、探针的荧光强度，可定量或估计扩增的DNA量。测定荧光强度的温度可根据使用的探针的种类等进行适当变更。对于测定荧光强度的温度而言，例如使用嵌入剂实施的情况下，可以直接是DNA 延伸时的温度，另外，在扩增的目标DNA的链长较长、其Tm值较高的情况下，可利用引物二聚物等链长较短的非特异地扩增的目标外 DNA(也称为非特异扩增DNA)的Tm值较低这点，设定成以目标 DNA的Tm值与非特异扩增DNA的Tm值的中间值为代表的目标 DNA的Tm值与非特异扩增DNA的Tm值之间的温度。通过这样做，尤其是使用嵌入剂实施时，仅引物二聚物等非特异扩增DNA从双链解离成单链，由荧光强度定量或估算的DNA量是关于目标DNA的量。

此外，在实时PCR中，在DNA扩增工序结束后，通过熔融曲线分析，可测定扩增的DNA的Tm。熔融曲线分析中，观察与温度变化对应的DNA的从双链向单链的解离，其温度及检出条件没有特别限制。通常，经过热变性(Denaturation)(90℃至98℃)、双链形成(Annealing)(40℃至80℃)、熔融(Melting)(从双链形成的温度缓缓升温至98℃左右)的阶段，监测熔融步骤中的荧光强度的变化，由此得到熔融曲线，由此，可得到Tm值。这样的测定可利用实时PCR 装置的多种机型进行，可按照仪器的使用方法实施。

<检出及/或鉴定方法>

作为本发明涉及的检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法，可使用具有以下的工序的方法。

(1)使用由前述被检样品制备的细菌的基因组DNA、引物、和耐热性DNA聚合酶进行PCR的工序，所述引物用于得到包含在检出对象细菌菌种中为特异性的目标基因的扩增产物。

(2)通过检出前述PCR的扩增产物中的前述目标基因、或分析该扩增产物，从而进行前述被检样品中的检出对象细菌菌种的检出或鉴定的工序。

通过使用本发明涉及的引物组作为引物，可进行高灵敏度的细菌菌种的鉴定。此外，通过使用上文中说明的控制污染程度的试剂、器具，可达成进一步的高灵敏度化及迅速化。

该检出及/或鉴定方法中，优选在抑制目标基因以外的基因(目标外基因)的扩增的情况下进行扩增工序。为了进行该目标外基因的扩增抑制，可利用热启动法PCR。作为一例，可举出使用抗DNA聚合酶抗体的热启动法。此时，优选使用相对于耐热性DNA聚合酶1U为过量的抗DNA聚合酶抗体。另外，如日本特开2000-4847、日本特开平10-276776中公开那样，基于针对DNA聚合酶实施可逆的化学修饰的热启动法也可合适地利用。此外，使用经化学修饰的dNTP、或使用如美国专利申请第20070281308号那样进行了化学修饰的引物的热启动法也可合适地利用。另外，基于使用通过加热而熔融的蜡等，将DNA聚合酶、与对于利用DNA聚合酶进行的DNA扩增必不可少的构成成分(例如引物、dNTP、Mg²⁺盐)物理隔离的热启动法也可合适地利用。

扩增产物的检出及/或鉴定工序可通过利用使用了具有检出用的荧光标识的嵌入剂、探针的实时PCR测定Tm而实施。优选为使用了嵌入剂的实时PCR，优选的嵌入剂为作为不饱和型荧光色素的SYBR Green I、作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight，更优选为作为饱和型荧光色素的EvaGreen、Resolight。

基于使用了实时PCR的Tm测定的检出及/或鉴定工序中，可进行操作以使得可检出前述目标基因的扩增产物，而不检出除此之外的目标外基因的扩增产物。作为为了该目的方法，优选通过进行以下操作而设定使得目标基因的扩增产物可检出、而不检出除此之外的目标外基因的扩增产物的条件，从而仅检出目标基因的扩增产物的方法：

(1)以目标基因扩增产物的熔融温度(Tm^A)高于目标外基因的扩增产物的熔融温度(Tm^B)的方式设计前述引物，

(2)在Tm^A与Tm^B之间的温度下进行扩增产物的检出。

此外，可使用以下方法：利用使用显示扩增产物的量的显示装置的实时PCR，进行扩增工序和检出及/或鉴定工序，目标外基因的扩增产物不在前述显示装置中显示。

检出及/或鉴定工序也可通过利用在凝胶上等进行的电泳将扩增产物展开、进行可视化的扩增产物的分析进行。另外，检出及/或鉴定工序也可通过基于解读扩增产物的碱基序列而进行的扩增产物的分析进行。此外，该工序也可通过利用质谱仪测定扩增产物的分子量而进行分析的方法进行。

<鉴定方法>

为了鉴定检出细菌，可利用使用本发明涉及的引物组从检出细菌得到的DNA片段的Tm值。作为用于进行鉴定的算法(algorithm)，可添加以下工序：不仅利用上述的Tm值本身的组合，而且还利用各 Tm值间的差的组合而进行鉴定，由此，例如可使每次启动仪器而导致的测定误差这样的测定误差的影响成为最低限度。

作为修正上述的每次启动仪器而导致的测定误差的方法，可利用“算出Tm值的组合的平均值，由该平均值得到的各Tm值的相对值的组合”。即，将Tm值的组合的配置作为“形”而进行鉴定的方法。以2维示出Tm值的组合的配置的“形”不受测定误差影响。例如，将在检出细菌中特异的Tm值的组合(n个(n为4以上、7以下的整数))记为T1db～Tndb(db为database)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1db～dndb。同样，将从被检样品得到的未知的检出对象生物的Tm值的组合(n个(n为4以上、7以下的整数))记为 T1ref～Tnref(ref为reference)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1ref～dnref。这样，与database进行比较，将“相对值的组合近似的＝Tm值的组合的配置的“形”接近的”作为鉴定算法进行利用。

作为具体的计算方法，例如，可举出算出欧几里得空间上的2点间距离的方法(式1)，但不限于此。

[式1]

Dist.＝√[(d1db-d1ref)²+(D2_db-D2_ref)²+....(dndb-dnref) ²]

在基于式1的计算方法的情况下，鉴定为将通过该计算式得到的D值最接近0时求出的检出细菌菌种。但是，考虑到使用的PCR仪器的测定误差，虽然也取决于仪器的温度控制规格、引物的数目，但作为D值的容许范围，为0～0.37、优选为0～0.30。

以上的算法可在计算机上以数据库型鉴定软件的形式利用。

<可鉴定的细菌菌种>

对于可鉴定的微生物而言，只要是在分类上属于细菌的微生物，在原理上就可以进行检出及细菌菌种的鉴定。作为具体的细菌菌种，可举出脱硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、Aerococcus christensenii、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、伴放线菌聚集菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、Alistipes onderdonkii、Anaerococcus vaginalis、 Anaeroglobus geminatus、溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)、卡氏节杆菌(Arthrobacter cumminsii)、阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Bacteroides dorei、Bacteroides finegoldii、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Bacteroides nordii、Bacteroides salyersiae、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌 (Bacteroides uniformis)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、汉塞巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、曲形弯曲杆菌 (Campylobacter curvus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌 (Capnocytophaga gingivalis)、颗粒二氧化碳噬纤维菌 (Capnocytophagagranulosa)、溶血二氧化碳噬纤维菌 (Capnocytophaga haemolytica)、生痰二氧化碳嗜纤维菌 (Capnocytophaga sputigena)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)、非丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridium butyricum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)、溶组织棱状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)、Clostridiumhylemonae、副腐化梭状芽胞杆菌(Clostridium paraputrificum)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、败血梭状芽胞杆菌 (Clostridium septicum)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、偏端梭状芽胞杆菌(Clostridium subterminale)、第三梭状芽胞杆菌(Clostridium tertium)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、混乱棒状杆菌(Corynebacteriumconfusum)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、解葡萄糖苷棒杆菌(Corynebacterium glucuronolyticum)、 (Corynebacterium jeikeium)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)、麦氏棒杆菌(Corynebacterium macginleyi)、微小棒状杆菌(Corynebacterium minutissimum)、假白喉棒状杆菌 (Corynebacteriumpseudodiphtheriticum)、假结核棒状杆菌 (Corynebacterium pseudotuberculosis)、Corynebacterium riegelii、结核硬脂酸棒状杆菌(Corynebacteriumtuberculostearicum)、溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)、结膜干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingia meningoseptica)、短稳杆菌 (Empedobacter brevis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、牛肠球菌(Enterococcus bovis)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、殊异肠球菌 (Enterococcusdispar)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、黄色肠球菌(Enterococcus flavescens)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、Enterococcus gilvus、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcusitalicus)、病臭肠球菌(Enterococcus malodoratus)、蒙氏肠球菌(Enterococcusmundtii)、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、假鸟肠球菌 (Enterococcuspseudoavium)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、 Enterococcussanguinicola、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、艾伯特埃希菌(Escherichia albertii)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、坏死梭杆菌 (Fusobacteriumnecrophorum)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、牙周梭杆菌(Fusobacteriumperiodonticum)、变形梭杆菌(Fusobacterium varium)、阴道加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜热脂肪土芽孢杆菌 (Geobacillusstearothermophilus)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、中度嗜盐菌(Halomonasvenusta)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)、金氏金菌(Kingella kingae)、肉芽肿杆菌 (Klebsiella granulomatis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、人支原体(Mycoplasma hominis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Nocardia cyriacigeorgica、内脏臭气杆菌(Odoribactersplanchnicus)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、吉氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)、Parvimonas micra、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、有害片球菌 (Pediococcus damnosus)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)、Peptoniphilus gorbachii、厌氧消化链球菌 (Peptostreptococcus anaerobius)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、人体普氏菌(Prevotellacorporis)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、产黑色素类杆菌(Prevotellamelaninogenica)、变黑普雷沃氏菌 (Prevotella nigrescens)、Prevotella timonensis、真口普氏菌(Prevotella veroralis)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、黏液罗氏菌(Rothiamucilaginosa)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、鼠咬热螺旋体(Spirillum minus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、头葡萄球菌 (Staphylococcuscapitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、Staphylococcus pettenkoferi、普氏葡萄球菌(Staphylococcus pulvereri)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcusschleiferi)、模仿葡萄球菌 (Staphylococcus simulans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、狗链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马链球菌(Streptococcus equi)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、巴黎链球菌(Streptococcus lutetiensis)、缓症链球菌 (Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、猪链球菌(Streptococcus porcinus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、(Veillonella parvula)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、河流孤菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌 (Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis) 等，但不限于这些。

实施例

以下，利用实施例及试验例进一步具体地说明本发明，但本发明不受它们的限制。

(制造例1)DNAP制备方法

按照专利文献4的0195至0201段，利用以下的方法，制备e- DNAP，在以下的实施例中使用。

(1)DNA的合成

对于T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶而言，由GenScript公司合成全DNA序列。此时，将密码子序列针对酵母宿主S.cerevisiae 进行优化。合成的DNA被掺入进质粒pUC57中，由GenScript公司提供，得到载体pUC-TA01。编码耐热性DNA聚合酶的基因按照以下方式设计：在5’末端序列引入HindIII，在3’末端序列引入EcoRI 限制酶位点。

(2)T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶表达用载体的构建

将合成的编码T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶的基因插入至质粒pYES2(invitrogen公司)，构建载体pYES-TA01。对于编码耐热性DNA聚合酶的基因，用限制酶HindIII、EcoRI(TaKaRa Bio) 消化pUC-TA01，用1％琼脂糖凝胶(Wako)进行电泳，用QIAquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收编码耐热性DNA聚合酶的基因。对于质粒pYES2，用EcoRI、NotI(TaKaRa Bio)消化，用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa Bio)将编码耐热性DNA聚合酶的基因与pYES2 连接。

(3)S.cerevisiae的转化

以酿酒酵母X2180的基因组为模板，以序列号134为正向引物，以序列号135为反向引物，进行PCR，得到约550bp的片段A。同样地，以酿酒酵母X2180的基因组为模板，以序列号136为正向引物，以序列号137为反向引物，进行PCR，得到约550bp的片段B。接下来，以片段A和片段B为模板，以序列号134为正向引物，以序列号137为反向引物，进行PCR，得到片段AB。接下来，对酿酒酵母 X2180进行培养后，制成感受态细胞，使用FastTrackTM-YeastTransformation Kit(Geno Technology公司)转化片段AB。将转化体涂布于以终浓度为1mg/ml的量含有5-FOA的最小琼脂培养基。于 28℃培养该琼脂培养基3天，然后，取得可在含有5-FOA的最小琼脂培养基中生长的株，作为酿酒酵母X2180-S株。需要说明的是，酵母酿酒酵母X2180株可从作为细胞·微生物·基因库的美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得。

将所述得到的载体pYES-TA01导入到酵母(酿酒酵母X2180 -S株)中。宿主只要是需尿嘧啶株即可，也可使用其他酵母。使用了FastTrackTM-Yeast Transformation Kit(Geno Technology公司) 进行转化。

(4)基于S.cerevisiae的T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶的生产

在以下的实验中，关于超纯水·器具，使用无DNA的超纯水·器具进行。对于得到的转化体，在SD培养基(0.67％Bacto酵母氮源基础(yeast nitrogen base)，2％半乳糖)100ml中，于28℃，进行72小时振荡培养。以5000rpm对它们进行10分钟离心分离，收集细菌，悬浮于破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，50mM KCl)，使用0.5mm玻璃珠破碎菌体，然后以12000rpm进行30分钟离心分离，得到酵母破碎液上清液及沉淀物，作为细胞提取物。接下来，于 70℃对上述细胞提取物进行60分钟热处理，热处理后，以5000rpm、于4℃进行30分钟离心分离，回收上清液。以终浓度为0.1％的量，向该上清液中添加聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich)，剧烈搅拌1分钟，然后于室温放置5分钟。然后，以8000rpm、于4℃进行30分钟离心分离，回收上清液，使该上清液通过0.45mm的滤器。

(5)T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶的纯化

在以下的实验中，超纯水·器具使用无DNA的超纯水·器具，在低温箱内进行。将回收的粗提取液供于用缓冲液A(50mM Tris- HCl pH7.5)平衡化过的HiTrap Q FF(GE)，然后使5％的缓冲液B (50mM Tris-HCl pH7.5、1M NaCl)流过柱，将夹杂物洗脱。接下来，使15％的缓冲液B流过柱，将耐热性DNA聚合酶洗脱。将洗脱的酶溶液供于用15％的缓冲液B平衡化过的HiTrap Heparin，阶段性地提高缓冲液B，直到50％，回收洗脱出的含酶的级分。将该酶级分的缓冲液置换为保存用缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.0、1M NaCl、 2mM DTT、0.2mMEDTA)，进而等量添加保存用溶液(98％甘油、 1％Tween20、1％NP-40)，搅拌后制成酶溶液，于-20℃进行保存。

(6)T.aquaticus来源耐热性DNA聚合酶的活性测定

首先，制备表1所示的溶液，于70℃保温5分钟。使用该溶液，如表2所示，制备反应用液，于74℃进行5分钟反应，为了终止反应，添加50mL的10mM EDTA。反应终止后，添加SYBER Green I 10mL 和无菌水15mL，于室温放置5分钟，然后进行荧光的测定(Em：497nm，Ex：528nm)。通过以Thunder Taq(NIPPON GENE)的单元数为标准，定义耐热性DNA聚合酶的活性。

[表1]

表1活性测定用反应液组成1

[表2]

表2活性测定用反应溶液组成2

(实施例1)基于巢式PCR的细菌鉴定

本实施例中，由大肠杆菌MGl655的培养液，使用QIAamp DNA 提纯试剂盒(purification kit)(QIAGEN)，提取大肠杆菌DNA，在提取后，利用吸光度计测定DNA量，在用超纯水稀释的溶液中，将表3所示的EC1和EC3用作反应的模板。实时PCR装置使用Rotor -Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)。超纯水·器具使用了无DNA 的超纯水·器具。需要说明的是，大肠杆菌Escherichia coli MGl655 株可由作为细胞·微生物·基因库的美国典型培养物保藏中心获得。

[表3]

表3实验中使用的大肠杆菌基因组溶液

进行巢式PCR时，以表4所示的组成，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行40次。

[表4]

表4反应液组成1

关于引物，使用正向引物序列号1和反向引物序列号2。PCR结束后，回收反应液，用无DNA的超纯水稀释至500倍。将该稀释的溶液作为模板，以表5所示的组成进行反应。

[表5]

表5反应液组成2

关于PCR的方法，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10 秒、72℃10秒的循环重复进行35次。关于引物，用(1)正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、(2)正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、(6)正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、(7)正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合这7组进行，DNA扩增后，进行 DNA解离曲线的制成，测定Tm值。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，在各阶段中保温2秒，取得数据。对于得到的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，得到 D值。将D值为0.3以下的情况判定为同种。将该结果与比较例1的结果合并示于表6。

(比较例1)实施例1(巢式PCR)的比较(直接PCR)

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。由大肠杆菌 MGl655的培养液，使用QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)，提取大肠杆菌DNA，提取后，用吸光度计测定DNA量，在用无DNA 的超纯水稀释的溶液中，如表3中记载那样，将EC1和EC3用作反应的模板。反应利用表5所示的组成进行。超纯水·器具使用了无 DNA的超纯水·器具。关于PCR的方法，于95℃加热5分钟后，将 94℃10秒、60℃10秒、72℃20秒的循环重复进行35次。关于引物，用(1)正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、(2) 正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、(6)正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、 (7)正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合这7组进行， DNA扩增后，进行DNA解离曲线的制成，测定Tm值。对于得到的 Tm值，与按照专利文献4的实施例7预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，得到D值。将该结果与实施例1的结果合并示于表6。将D值为0.3以下的情况判定为同种。

[表6]

表6直接PCR(direct-PCR)与巢式PCR的比较

○：鉴定成功

×：鉴定失败

(实施例2)引物验证(纯化coli基因组的电泳)

本实施例中，将表3所示的EC3用作反应的模板。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。对于引物的组合，以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2-5的反向引物的各种组合、(2) 包含序列号1及6-15的正向引物和包含序列号16-27的反向引物的各种组合、(3)包含序列号28-43的正向引物和包含序列号44 -50的反向引物的各种组合、(4)包含序列号53-56的正向引物和包含序列号57-61的反向引物的各种组合、(5)包含序列号62-69 的正向引物和包含序列号70-75的反向引物的各种组合、(6)包含序列号76-90的正向引物和包含序列号91-103的反向引物的各种组合、(7)包含序列号104-113的正向引物和包含序列号2及116 -131的反向引物的各种组合、和包含序列号114的正向引物和包含序列号2及5及125的反向引物的各种组合、和包含序列号115的正向引物和包含序列号2及5及125的反向引物的各种组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1)的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

上述的引物的组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94 ℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。上述引物组合中，对于(2)至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、 60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次。对于反应后的溶液，用2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，对目标产物的扩增量及非特异的产物的扩增进行验证。需要说明的是，关于包含序列号 1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、包含序列号28的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、包含序列号104的正向引物和包含序列号2 的反向引物的组合，为专利文献4的附加测试实验。将其结果与比较例2的结果合并示于表7-1～表7-7。

需要说明的是，表7中的评价按照以下的标准进行。

目标产物量：

◎：扩增特别良好

○：扩增良好

△：扩增差

×：扩增特别差

非特异扩增产物

○：无非特异产物

△：有非特异产物

×：非特异产物多

(比较例2)实施例2的比较例

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，将表 3所示的EC3用作反应的模板。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、(2)包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、(3)包含序列号28的正向引物和包含序列号44 的反向引物的组合、(4)包含序列号53的正向引物和包含序列号57 的反向引物的组合、(5)包含序列号62的正向引物和包含序列号70 的反向引物的组合、(6)包含序列号76的正向引物和包含序列号91 的反向引物的组合、(7)包含序列号104的正向引物和包含序列号2 的反向引物的组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1) 的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5 所示的组成，进行反应。

上述的引物的组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94 ℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。上述引物组合中，对于(2)至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、 60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次。对于反应后的溶液，用2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，对目标产物的扩增量及非特异的产物的扩增进行验证。将其结果与实施例2的结果合并示于表7-1～表7-7。

[表7-1]

表7-1

[表7-3]

表7-3

[表7-4]

表7-4

(实施例3)引物验证(纯化coli基因组的PCR·熔融)

本实施例中，使用表3的EC3作为模板。超纯水·器具使用了无 DNA的超纯水·器具。以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2-5的反向引物的各种组合、(2)包含序列号1及6-15的正向引物和包含序列号16-27的反向引物的各种组合、(3)包含序列号28-43的正向引物和包含序列号44-50的反向引物的各种组合、 (4)包含序列号53-56的正向引物和包含序列号57-61的反向引物的各种组合、(5)包含序列号62-69的正向引物和包含序列号70 -75的反向引物的各种组合、(6)包含序列号76-90的正向引物和包含序列号91-103的反向引物的各种组合、(7)包含序列号104 -113的正向引物和包含序列号2及116-131的反向引物的各种组合、和包含序列号114的正向引物和包含序列号2及5及125的反向引物的各种组合、和包含序列号115的正向引物和包含序列号2及5及125 的反向引物的各种组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述 (1)的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于程序，上述引物组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将 94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次，对于(2) 至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10 秒的循环重复35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，在各阶段中保温2 秒，取得数据。进行对扩增曲线直到完成为止的循环数及解离曲线的验证。需要说明的是，关于包含序列号1的正向引物和包含序列号2 的反向引物的组合、包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、包含序列号28的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、包含序列号104的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合，为专利文献4的附加测试实验。将其结果与比较例3的结果合并示于表8-1～表8-7。

需要说明的是，表8中的评价按照以下的标准进行。

到完成为止的循环数：

◎：到完成为止的循环数快(减少2个循环以上)

○：到完成为止的循环数稍快(减少0-1个循环)

△：到完成为止的循环数稍慢(增加1-2个循环)

×：到完成为止的循环数慢(增加3个循环以上)

熔融分析

○：峰只有1个

△：有小峰

×：有多个峰

-：无峰

(比较例3)实施例3的比较例

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，将表 3所示的EC3用作反应的模板。超纯水·器具使用无DNA的超纯水·器具，作业在净化台内进行。以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、(2)包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、(3)包含序列号28的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、(4)包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、(5)包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、(6)包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、(7)包含序列号104 的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1)的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于程序，上述引物组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将 94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次，对于(2) 至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10 秒的循环重复进行35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于 72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，在各阶段中保温 2秒，取得数据。进行扩增曲线的到完成为止的循环数及解离曲线的验证。将其结果与实施例3的结果合并示于表8-1～表8-7。

[表8-1]

表8-1

[表8-3]

表8-3

[表8-4]

表8-4

(实施例4)引物验证(模拟DNA被检样品的电泳)

本实施例中，将以终浓度成为10pg/ml的量在100mg/ml人基因组DNA(humangenomic DNA)(clonetech)中添加大肠杆菌基因组DNA而得到的溶液、HE作为模板使用。超纯水·器具使用了无 DNA的超纯水·器具。对于引物的组合，以成为(1)包含序列号1 的正向引物和包含序列号2-5的反向引物的各种组合、(2)包含序列号1及6-15的正向引物和包含序列号16-27的反向引物的各种组合、(3)包含序列号28的正向引物和包含序列号44及45及47 的反向引物的各种组合、和包含序列号30的正向引物和包含序列号 48的反向引物的组合、和包含序列号31的正向引物和包含序列号47 的反向引物的组合、和包含序列号32的正向引物和包含序列号48的反向引物的组合、和包含序列号33-43的正向引物和包含序列号44 -50的反向引物的各种组合、(4)包含序列号53的正向引物和包含序列号57及61的反向引物的各种组合、包含序列号54的正向引物和包含序列号59及61的反向引物的各种组合、包含序列号55的正向引物和包含序列号57-59及61的反向引物的各种组合、包含序列号56的正向引物和包含序列号61的反向引物的组合、(5)包含序列号62的正向引物和包含序列号70及71及73-75的反向引物的各种组合、包含序列号63-69的正向引物和包含序列号70-75的反向引物的各种组合、(6)包含序列号76-90的正向引物和包含序列号 91-103的反向引物的各种组合、(7)包含序列号104-113的正向引物和包含序列号2及116-131的反向引物的各种组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1)的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

上述的引物的组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94 ℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。上述引物组合中，对于(2)至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、 60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次。对于反应后的溶液，用2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，对目标产物的扩增量及非特异的产物的扩增进行验证。需要说明的是，关于包含序列号 1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、包含序列号28的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、包含序列号104的正向引物和包含序列号2 的反向引物的组合，为专利文献4的附加测试实验。将其结果与比较例4的结果合并示于表9-1～表9-7。

需要说明的是，表9中的评价按照以下的标准进行。

目标产物量：

◎：扩增特别良好

○：扩增良好

△：扩增差

×：扩增特别差

非特异产物扩增

○：无非特异产物

△：有非特异产物

×：非特异产物多

(比较例4)实施例4的比较例

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本实施例中，将以终浓度成为10pg/ml的量在100mg/ml人基因组DNA(clonetech) 中添加大肠杆菌基因组DNA而得到的溶液、HE作为模板使用。超纯水·器具使用无DNA的超纯水·器具，作业在净化台内进行。以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、 (2)包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、 (3)包含序列号28的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、 (4)包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、 (5)包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、 (6)包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、 (7)包含序列号104的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1)的组合，以表4 所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

上述的引物的组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94 ℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。上述引物组合中，对于(2)至(7)，于95℃加热5分钟后，94℃10秒、60 ℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次。对于反应后的溶液，用 2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，对目标产物的扩增量及非特异的产物的扩增进行验证。将其结果与实施例4的结果合并示于表9-1～表9-7。

[表9-1]

表9-1

[表9-3]

表9-3

[表9-4]

表9-4

(实施例5)引物验证(模拟DNA被检样品的PCR·熔融)

本实施例中，将以终浓度成为10pg/ml的量在100mg/ml人基因组DNA(clonetech)中添加大肠杆菌基因组DNA而得到的溶液、 HE作为模板使用。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。对于引物的组合，以成为(1)包含序列号1的正向引物和包含序列号2 -5的反向引物的各种组合、(2)包含序列号1及6-15的正向引物和包含序列号16-27的反向引物的各种组合、(3)包含序列号28 的正向引物和包含序列号44及45及47的反向引物的各种组合、包含序列号30的正向引物和包含序列号48的反向引物的组合、包含序列号31的正向引物和包含序列号47的反向引物的组合、包含序列号 32的正向引物和包含序列号48的反向引物的组合、包含序列号33- 43的正向引物和包含序列号44-50的反向引物的各种组合、(4)包含序列号53的正向引物和包含序列号57及61的反向引物的各种组合、包含序列号54的正向引物和包含序列号59及61的反向引物的各种组合、包含序列号55的正向引物和包含序列号57-59及61的反向引物的各种组合、包含序列号56的正向引物和包含序列号61的反向引物的组合、(5)包含序列号62的正向引物和包含序列号70 及71及73-75的反向引物的各种组合、包含序列号63-69的正向引物和包含序列号70-75的反向引物的各种组合、(6)包含序列号 76-90的正向引物和包含序列号91-103的反向引物的各种组合、(7) 包含序列号104-113的正向引物和包含序列号2及116-131的反向引物的各种组合、包含序列号114的正向引物和包含序列号5的反向引物的组合、包含序列号115的正向引物和包含序列号2及5的反向引物的各种组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1) 的组合，以表4所示的组成，对于上述(2)至(7)的组合，以表5 所示的组成，进行反应。

实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，上述引物组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次，对于 (2)至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、 72℃10秒的循环重复进行35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，在各阶段中保温2秒，取得数据。进行扩增曲线的到完成为止的循环数及解离曲线的验证。需要说明的是，关于包含序列号1的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、包含序列号1的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、包含序列号28的正向引物和包含序列号44 的反向引物的组合、包含序列号53的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、包含序列号62的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、包含序列号76的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、包含序列号104的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合，为专利文献4的附加测试实验。将其结果与比较例5的结果合并示于表10-1～表10-7。

需要说明的是，表10中的评价按照以下的标准进行。

到完成为止的循环数：

◎：到完成为止的循环数快(减少2个循环以上)

○：到完成为止的循环数稍快。(减少0-1个循环)

△：到完成为止的循环数稍慢(增加1-2个循环)

×：到完成为止的循环数慢(增加3个循环以上)

熔融分析：

○：峰只有1个

△：有小峰

×：有多个峰

-：无峰

(比较例5)实施例5的比较例

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本实施例中，将以终浓度成为10pg/ml的量在100mg/ml人基因组DNA(clonetech) 中添加大肠杆菌基因组DNA而得到的溶液、HE作为模板使用。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。以成为(1)包含序列号1 的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合、(2)包含序列号1 的正向引物和包含序列号16的反向引物的组合、(3)包含序列号28 的正向引物和包含序列号44的反向引物的组合、(4)包含序列号53 的正向引物和包含序列号57的反向引物的组合、(5)包含序列号62 的正向引物和包含序列号70的反向引物的组合、(6)包含序列号76 的正向引物和包含序列号91的反向引物的组合、(7)包含序列号104 的正向引物和包含序列号2的反向引物的组合的方式添加到反应液中，进行PCR。对于上述(1)的组合，以表4所示的组成，对于上述(2) 至(7)的组合，以表5所示的组成，进行反应。

实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，上述引物组合中，对于(1)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次，对于 (2)至(7)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、 72℃10秒的循环重复进行35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，在各阶段中保温2秒，取得数据。进行扩增曲线的到完成为止的循环数及解离曲线的验证。将其结果与实施例5的结果合并示于表10-1～表 10-7。

[表10-1]

表10-1

[表10-3]

表10-3

[表10-4]

表10-4

(实施例6)直接PCR的与专利文献4的比较

本实施例中，由大肠杆菌MG1655的培养液，使用QIAamp DNA 提纯试剂盒(QIAGEN)，提取大肠杆菌DNA，在提取后，利用吸光度计测定DNA量，将用超纯水稀释过的表3所示的EC1和EC2溶液用作反应的模板。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。对于反应，以表5所示的组成，进行反应。实时PCR装置使用Rotor -Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于程序，于95℃加热5 分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35 次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔 0.5℃逐步升温至95℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，进行扩增产物的Tm值的测定。关于引物，使用下述7组中的全部，进行 PCR，

(1)正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号81与反向引物序列号103的组合、及

(7)正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对于得到的各片段的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，得到D值。将D值为0.3以下的情况判定为同种。将该结果与比较例6的结果合并示于表11。

(比较例6)实施例6的专利文献4中的引物部分

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，由大肠杆菌MG1655的培养液，使用QIAamp DNA提纯试剂盒 (QIAGEN)，提取大肠杆菌DNA，在提取后，利用吸光度计测定 DNA量，将用超纯水稀释过的表3所示的EC1和EC2溶液用作反应的模板。对于反应，以表5所示的组成，进行反应。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于程序，于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，使用下述7组中的全部，进行PCR，

(1)正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、及

(7)正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合

对于得到的各片段的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，得到D值。将该结果与实施例6的结果合并示于表11。将D值为0.3以下的情况判定为同种。

[表11]

表11直接PCR中的引物的比较

○：鉴定成功

×：鉴定失败

(实施例7)模拟被检样品的检出灵敏度及与专利文献4中的引物的巢式PCR的比较

本实施例中，准备下述液体：在健康人的全血2ml中添加大肠杆菌悬浮液，以成为表12所示的浓度。实验全部在日本富山大学(邮编930-0194日本富山县富山市杉谷2630)的附属医院检测部检测室内进行。

[表12]

表12模拟血液被检样品浓度

以100g对在全血中添加大肠杆菌悬浮液而成的溶液进行5分钟离心分离，回收血浆级分，然后进一步以13000g对该上清液进行5 分钟离心分离，回收沉淀。以使用QIAampDNA提纯试剂盒 (QIAGEN)从该沉淀中提取的DNA溶液、B1和B2为模板，进行 PCR。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30 秒的循环重复进行40次。关于引物，对于正向引物序列号1与反向引物序列号5的组合进行，以表4所示的组成进行反应。接下来，用无DNA的超纯水将该反应产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10 秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA 解离曲线的制成。关于引物，使用下述7组中的全部。

(1)正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号81与序列号103的组合、及

(7)正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对于得到的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，进行验证。对于DNA解离曲线的制成而言，于 95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95 ℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，进行扩增产物的Tm值的测定。将其结果与比较例7的结果合并示于表13。将D值为0.3以下的情况判定为同种。

(比较例7)实施例7的专利文献4中的引物部分

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，准备下述液体：在健康人的全血2ml中添加大肠杆菌悬浮液，以成为表 12所示的浓度。实验全部在日本富山大学附属医院检测部检测室内进行。以100g对在全血中添加大肠杆菌悬浮液而成的溶液进行5分钟离心分离，回收血浆级分，然后进一步以13000g对该上清液进行5 分钟离心分离，回收沉淀。以使用QIAamp DNA提纯试剂盒 (QIAGEN)从该沉淀中提取的DNA溶液为模板，进行PCR。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor Gene Q5-plex(QIAGEN)，对于PCR程序而言，首先，于95℃加热5 分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行40 次。关于引物，对于正向引物序列号1与反向引物序列号2的组合进行，以表1所示的组成进行反应。接下来，用无DNA的超纯水将该反应产物稀释至500倍，将其作为模板，以表2所示的组成，于95 ℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，使用下述7组中的全部进行。

(1)正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、及

(7)正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合

对于得到的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的大肠杆菌的Tm值比较，进行验证。将其结果与实施例7的结果合并示于表13。将D值为0.3以下的情况判定为同种。

[表13]

表13使用了模拟血液被检样品的鉴定灵敏度的研究

○：鉴定成功

×：鉴定失败

(实施例8)利用多菌种的引物的验证。(电泳)

本实施例中，使用QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)，从在日本富山大学(附属医院检测部检测室)保存的脆弱拟杆菌 (Bacteroides flagilis)、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringes)、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、结膜干燥棒状杆菌、阴沟肠杆菌的培养菌体提取基因组，将所得物用作反应的模板。对于反应，以表5所示的组成，进行反应。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。对于PCR程序，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、 60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次。关于引物，对于下述组合，进行PCR，

(1)序列号13与序列号17的组合、

(2)序列号34与序列号50的组合、

(3)序列号43与序列号50的组合、

(4)序列号54与序列号61的组合、

(5)序列号55与序列号58的组合、

(6)序列号55与序列号61的组合、

(7)序列号68与序列号72的组合、

(8)序列号77与序列号103的组合、

(9)序列号81与序列号103的组合、

(10)序列号114与序列号125的组合、

(11)序列号115与序列号5的组合

对是否观察到目标片段的扩增进行验证。将其结果与比较例8合并示于表14-1～14-5。

需要说明的是，对于脆弱拟杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、结膜干燥棒状杆菌、阴沟肠杆菌的菌株，可从日本理化研究所生物资源中心(RIKEN BioResourceCenter)、日本微生物培养保藏机构(Japan Culture Collection of Microorganisms) 获得。

需要说明的是，表14中的评价按照以下的标准进行。

目标产物量：

◎：扩增特别良好

○：扩增良好

△：扩增差

×：扩增特别差

非特异产物扩增

○：无非特异产物

△：有非特异产物

×：非特异产物多

到完成为止的循环数：

◎：到完成为止的循环数快(减少2个循环以上)

○：到完成为止的循环数稍快。(减少0-1个循环)

△：到完成为止的循环数稍慢(增加1-2个循环)

×：到完成为止的循环数慢(增加3个循环以上)

熔融分析：

○：峰只有1个

△：有小峰

×：有多个峰

-：无峰

(比较例8)利用多菌种的引物的验证。(电泳)

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，使用 QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)，从在日本富山大学(附属医院检测部检测室)保存的脆弱拟杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、结膜干燥棒状杆菌，阴沟肠杆菌的培养菌体提取基因组，将所得物用作反应的模板。对于反应，以表5所示的组成，进行反应。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。对于PCR程序，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10 秒、72℃10秒的循环重复进行35次。

关于引物，对于下述组合进行PCR，

(1)序列号1与序列号16的组合、

(2)序列号28与序列号44的组合、

(3)序列号51与序列号52的组合、

(4)序列号53与序列号57的组合、

(5)序列号62与序列号70的组合、

(6序列号76与序列号91的组合、

(7)序列号104与序列号2的组合

对是否观察到目标片段的扩增进行验证。将其结果与实施例8合并示于表14。

(实施例9)利用多菌种的引物的验证。(PCR)

本实施例中，使用QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)，从在日本富山大学(附属医院检测部检测室)保存的脆弱拟杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、结膜干燥棒状杆菌、阴沟肠杆菌的培养菌体提取基因组，将所得物用作反应的模板。对于反应，以表5所示的组成，进行反应。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor-GeneQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于程序，于95℃加热5分钟后，将94℃ 10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行35次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于 95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95 ℃。关于引物，对于下述组合进行PCR，

(1)序列号13与序列号17的组合、

(2)序列号34与序列号50的组合、

(3)序列号43与序列号50的组合、

(4)序列号54与序列号61的组合、

(5)序列号55与序列号58的组合、

(6)序列号55与序列号61的组合、

(7)序列号68与序列号72的组合、

(8)序列号77与序列号103的组合、

(9)序列号81与序列号103的组合、

(10)序列号114与序列号125的组合、

(11)序列号115与序列号5的组合

然后进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5 ℃逐步升温至95℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，测定扩增产物的Tm值。基于该结果，进行扩增曲线的到完成为止的循环数及解离曲线的验证。将其结果与比较例5合并示于表14。

(比较例9)利用多菌种的引物的验证。(PCR)

以下的比较例为专利文献4的附加测试实验。本比较例中，使用 QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)，从在日本富山大学(附属医院检测部检测室)保存的脆弱拟杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、乙酸钙不动杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、结膜干燥棒状杆菌、阴沟肠杆菌的培养菌体提取基因组，将所得物用作反应的模板。对于反应，以表 5所示的组成，进行反应。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，对于程序于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10 秒的循环重复进行35次。

关于引物，对于序列号1与序列号16的组合、序列号28与序列号44的组合、序列号51与序列号52的组合、序列号53与序列号57 的组合、序列号62与序列号70的组合、序列号76与序列号91的组合、序列号104与序列号2的组合，进行PCR，然后进行扩增产物的 DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热 10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，测定扩增产物的Tm值。基于该结果，进行扩增曲线的到完成为止的循环数及解离曲线的验证。将其结果与实施例9合并示于表14。

[表14-1]

表14-1

[表14-2]

表14-2

[表14-3]

表14-3

[表14-4]

表14-4

[表14-5]

表14-5

(实施例10)大肠杆菌以外的菌种的模拟血液被检样品的验证

本实施例中，在日本富山大学的协助下，准备下述液体：在健康人的全血2ml中，添加在日本富山大学(附属医院检测部检测室)保存的蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌、产气肠杆菌、无乳链球菌 (Streptococcus agalctiae)的培养菌体，以成为表15所示的浓度。实验全部在日本富山大学附属医院检测部检测室内进行。以100g对在全血中添加菌悬浮液而得到的溶液进行5分钟离心分离，回收血浆级分，然后进一步以13000g对该上清液进行5分钟离心分离，回收沉淀。以使用QIAamp DNA提纯试剂盒(QIAGEN)从该沉淀提取的 DNA溶液为模板，在日本富山大学附属医院检测部检测室内进行PCR。超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。实时PCR装置使用 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行40次。关于引物，对于正向引物序列号1与反向引物序列号5的组合进行。对于反应，以表4所示的组成进行反应。用无 DNA的超纯水将该反应产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10 秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA 解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10 秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，进行扩增产物的Tm值的测定。关于引物，使用下述的7组。

正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

正向引物序列号81与序列号103的组合、及

正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对于得到的Tm值，与如专利文献4中记载那样预先取得的各菌种的Tm值比较，进行验证。

其结果示于表15。

[表15]

表15用大肠杆菌以外的细菌制成的模拟血液被检样品的浓度和结果

(实施例11)日本富山大学附属医院临床被检样品的验证

本实施例中，在日本富山大学附属医院，使用从疑似败血症的患者的血液被检样品提取出的DNA溶液作为模板，实验全部在日本富山大学附属医院检测部检测室内进行。超纯水·器具使用了无DNA 的超纯水·器具。实时PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plexHRM，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10 秒、72℃30秒的循环重复进行40次。关于引物，对于正向引物序列号1与反向引物序列号5的组合进行。对于反应，以表4所示的组成进行反应。用无DNA的超纯水将该反应产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成，于95℃加热5分钟后，将94℃10 秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。对于DNA解离曲线的制成而言，于95℃加热10秒加热后，于72℃保温90秒，间隔0.5℃逐步升温至95 ℃。另外，各阶段中保温2秒，取得数据，进行扩增产物的Tm值的测定。关于引物，使用下述的7组。

正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

正向引物序列号81与序列号103的组合、及

正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对于得到的Tm值，与输入了如专利文献4中记载那样预先取得的各菌的Tm值的数据库内的数据比较，进行验证。

其结果示于表16。

[表16]

表16日本富山大学临床被检样品的鉴定结果

(实施例12)关于热启动PCR

本实施例中，使用DNA溶液(HE)作为模板，使用作为用于热启动的dNTP的CleanAmpdNTPs(Sigma-Aldrich)和通常使用的 dNTP，进行扩增反应，对其结果进行比较。对于组成，以表4及表 17所示的组成进行反应。

[表17]

表17反应液组成3

超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。模板使用表3所示的EC3。关于引物，以正向引物序列号1与反向引物序列号2的组合进行，对于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10 秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。对于反应后的溶液，用2％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙锭染色后，对目标产物的扩增量及非特异的产物的扩增进行验证。

其结果示于图2。

(实施例13)除DNA处理(超滤，大肠杆菌基因组添加实验)

超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。向Amicon UFC50508(Millipore)提供无菌水500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，提供1当量的盐酸500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。最后，进行2次下述操作：提供无菌水500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，混合从表4所示的反应液组成中除去模板及EvaGreen而得到的物质，制成溶液100mL，进一步添加4pg的大肠杆菌DNA。将该溶液供于完成了上述操作的Amicon UFC50508，以5000g进行5分钟离心分离，回收滤液。向该滤液中添加EvaGreen和无菌水，进行PCR。PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30 秒的循环重复进行35次。关于引物，以序列号1和2的组合进行。将该反应液的产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成进行PCR。于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、 72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，以下述的 7组进行PCR，

正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、及

正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、及

正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、及

正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合

对是否观察到各DNA片段的扩增进行验证。将其结果与比较例 10的结果合并示于图3。

(比较例10)除DNA处理(超滤，大肠杆菌基因组添加实验的阴性对照)

向Amicon UFC50508(Millipore)提供无菌水500mL，以5000g 进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，提供1当量的盐酸500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。最后，进行2次下述操作：提供无菌水500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，混合从表4所示的反应液组成中除去模板及EvaGreen而得到的物质，制成溶液100mL，将该溶液供于完成了上述操作的Amicon UFC50508，以5000g进行5分钟离心分离，回收滤液。向该滤液中添加EvaGreen和无菌水，进行PCR。PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5 分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。关于引物，以序列号1和2的组合进行。将该反应液的产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成进行PCR。于 95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，以下述7组进行PCR，

正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、及

正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、及

正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、及

正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合

对是否观察到各DNA片段的扩增进行验证。将其结果与实施例 13的结果合并示于图3。

(实施例14)除DNA处理(污染试剂的纯化，直接PCR)

超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。向Amicon UFC50508(Millipore)提供无菌水500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，提供1当量的盐酸500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。最后，进行2次下述操作：提供无菌水500mL，以5000g进行5分钟离心分离，除去在滤液及滤器内残留的溶液。接下来，混合从表4所示的反应液组成中除去模板及EvaGreen而得到的物质，制成溶液100mL。向该滤液中添加EvaGreen和无菌水，进行PCR。PCR 装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃ 30秒的循环重复进行35次。关于引物，以序列号1和2的组合进行。将该反应液的产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成进行PCR。PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、 72℃10秒的循环重复进行26次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，对于下述 7组进行PCR，

(1)正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号81与反向引物序列号103的组合、及

(7)正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对是否观察到目标片段的扩增进行验证。将其结果与比较例11 的结果合并示于图4。

(比较例11)除DNA处理(污染试剂的纯化，直接PCR)

超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。制成表4所示的反应组成的溶液，进行PCR。PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行35次。关于引物，以序列号1和2的组合进行。将该反应液的产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，以表5所示的组成进行PCR。PCR装置使用 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)，于95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行26次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，进行各扩增产物的Tm值的测定。关于引物，对下述7组进行进行PCR，

(1)正向引物序列号15与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号43与反向引物序列号50的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号81与反向引物序列号103的组合、及

(7)正向引物序列号115与反向引物序列号5的组合

对是否观察到目标片段的扩增进行验证。将其结果与实施例14 的结果合并示于图4。

(实施例15)除DNA处理(γ射线灭菌，对大肠杆菌DNA进行γ射线处理)

超纯水·器具使用了无DNA的超纯水·器具。准备在无菌水 100mL中添加500fg的大肠杆菌DNA而得到的溶液，向其照射10kGy 及25kGy的γ射线。以该溶液为模板，在以下的条件下进行PCR。对于反应，以表1所示的组成进行反应。PCR装置使用Rotor-Gene Q MDx5plex HRM(QIAGEN)，关于PCR程序，首先，于95℃加热5 分钟后，将94℃10秒、65℃10秒、72℃30秒的循环重复进行40 次后，进行DNA解离曲线的制成。关于引物，以序列号1和2的组合进行。将该反应液的产物稀释至500倍，进而，将其作为模板，于 95℃加热5分钟后，将94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒的循环重复进行30次，然后，进行扩增产物的DNA解离曲线的制成。关于引物，以下述7组进行PCR，

(1)正向引物序列号1与反向引物序列号16的组合、及

(2)正向引物序列号28与反向引物序列号44的组合、及

(3)正向引物序列号51与反向引物序列号52的组合、及

(4)正向引物序列号53与反向引物序列号57的组合、及

(5)正向引物序列号62与反向引物序列号70的组合、及

(6)正向引物序列号76与反向引物序列号91的组合、及

(7)正向引物序列号104与反向引物序列号2的组合

对是否观察到各DNA片段的扩增进行验证。其结果示于表18。

[表18]

表18γ射线灭菌

○：观察到扩增。

△：稍微观察到扩增。

×：未观察到扩增。

(实施例16)除DNA处理(EMA)

超纯水·器具使用无DNA的超纯水·器具，作业在净化台内进行。由表5所示的反应液组成制备除了模板、引物、evagreen之外的溶液，向其中添加25ng的大肠杆菌基因组DNA。接下来，准备以终浓度成为20μM的量添加Ethidium Monoazide Bromid(MolecularProbe)而成的上述溶液、和作为阴性对照而未添加EMA的上述溶液。将这些溶液设置于570流明的LED电灯泡下，照射光15分钟。然后，添加引物、EvaGreen，于95℃加热10分钟，然后将95℃10秒、60 ℃30秒、72℃的循环重复进行60次，然后进行扩增产物的DNA解离曲线的制成，验证有无目标产物的扩增。引物使用正向引物序列号 51与反向引物序列号52。其结果示于图5。

(实施例17)基于4个Tm值的菌种的鉴定

针对大肠埃希氏杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、阴沟肠杆菌的4菌种的培养液，不标记名称，进行盲试。将大肠埃希氏杆菌记为细菌1，将艰难梭状芽胞杆菌记为细菌2，将肺炎克雷白氏杆菌记为细菌3、将阴沟肠杆菌记为细菌4，进行DNA提取，尝试鉴定。对于PCR反应，与实施例11的方法同样地进行。鉴定仅利用其中4个Tm值的组合进行。考虑到RotorGene Q的测定误差，将Dist <0.2以下的细菌作为同一菌种。

[表19]

表19利用4个Tm值的菌种的识别

Claims

1.用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组，其特征在于，其包含：

从下述第S1组选择的1对引物对，

第S1组：

1－7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号15的序列组成，所述反向引物由序列号16～27中的任一序列组成。

2.如权利要求1所述的引物组，除了所述从第S1组选择的1对引物对之外，还包含从下述第S2组～第S7组的各组中分别选择1对引物对而得到的6对引物对中的至少1对引物对；

第S2组：

2－1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号28的序列组成，所述反向引物由序列号45及47～50中的任一序列组成，

2－2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号29的序列组成，所述反向引物由序列号44、45、47、48及50中的任一序列组成，

2－3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号30的序列组成，所述反向引物由序列号45及47～50中的任一序列组成，

2－4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号31的序列组成，所述反向引物由序列号46及47中的任一序列组成，

2－5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号32的序列组成，所述反向引物由序列号45及47～49中的任一序列组成，

2－6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号33的序列组成，所述反向引物由序列号44、45及47～50中的任一序列组成，

2－7A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号34的序列组成，所述反向引物由序列号45、47及48中的任一序列组成，

2－8A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号35的序列组成，所述反向引物由序列号44、45、48及49中的任一序列组成，

2－9A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号36的序列组成，所述反向引物由序列号44、45、48及49中的任一序列组成，

2－10A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号37的序列组成，所述反向引物由序列号45及47～50中的任一序列组成，

2－11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号38的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，

2－12A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号39的序列组成，所述反向引物由序列号44～48及50中的任一序列组成，

2－13：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号40的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，

2－14A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号41的序列组成，所述反向引物由序列号45及46中的任一序列组成，

2－15A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号42的序列组成，所述反向引物由序列号48及49中的任一序列组成，或

2－16A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号43的序列组成，所述反向引物由序列号44、46～48及50中的任一序列组成，

第S3组：

引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号51的序列组成，所述反向引物由序列号52的序列组成，

第S4组：

4－1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号53的序列组成，所述反向引物由序列号57～61中的任一序列组成，

4－2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号54的序列组成，所述反向引物由序列号59及61中的任一序列组成，

4－3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号55的序列组成，所述反向引物由序列号57～59及61中的任一序列组成，或

4－4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号56的序列组成，所述反向引物由序列号57～59及61中的任一序列组成，

第S5组

5－1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号62的序列组成，所述反向引物由序列号70、73～75中的任一序列组成，

5－2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号63的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

5－3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号64的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

5－4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号65的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

5－5A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号66的序列组成，所述反向引物由序列号70、72、73及75中的任一序列组成，

5－6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号67的序列组成，所述反向引物由序列号70、71及73～75中的任一序列组成，

5－7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号68的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，或

5－8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号69的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

第S6组

6－1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号76的序列组成，所述反向引物由序列号93、96及101～103中的任一序列组成，

6－2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号77的序列组成，所述反向引物由序列号91、96及101～103中的任一序列组成，

6－3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号78的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，

6－4A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号79的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，

6－5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号80的序列组成，所述反向引物由序列号91、93及100～103中的任一序列组成，

6－6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号81的序列组成，所述反向引物由序列号91、93及101～103中的任一序列组成，

6－7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号82的序列组成，所述反向引物由序列号91、96、97及101～103中的任一序列组成，

6－8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号83的序列组成，所述反向引物由序列号91、101～103中的任一序列组成，

6－9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号84的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，

6－10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号85的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，

6－11A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号86的序列组成，所述反向引物由序列号91、93及101～103中的任一序列组成，

6－12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号87的序列组成，所述反向引物由序列号91、96及101～103中的任一序列组成，

6－13：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号88的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，

6－14：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号89的序列组成，所述反向引物由序列号91及101～103中的任一序列组成，或

6－15：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的分别的组合，所述正向引物由序列号90的序列组成，所述反向引物由序列号91、92、96及101～103中的任一序列组成，

第S7组

7－1A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号104的序列组成，所述反向引物由序列号5及118～125、127、128、130及131中的任一序列组成，

7－2A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号105的序列组成，所述反向引物由序列号5及118～125中的任一序列组成，

7－3A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号106的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116及118～131中的任一序列组成，

7－4A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号107的序列组成，所述反向引物由序列号120及121中的任一序列组成，

7－5A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号108的序列组成，所述反向引物由序列号120及123中的任一序列组成，

7－6A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号109的序列组成，所述反向引物由序列号2、118～122、124及126中的任一序列组成，

7－7A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号110的序列组成，所述反向引物由序列号118、120、121、124及126～130中的任一序列组成，

7－8A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号111的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及118～131中的任一序列组成，

7－9A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号112的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116、及118～125中的任一序列组成，

7－10A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号113的序列组成，所述反向引物由序列号2、5、118～126、130及131中的任一序列组成，

7－11A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号114的序列组成，所述反向引物由序列号5的序列组成，或

7－12A：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号115的序列组成，所述反向引物由序列号2及5中的任一序列组成。

3.如权利要求2所述的引物组，其包含下述的1)的1对引物对、和下述的2)～7)的6对引物对中的至少1对引物对；

1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号15的序列组成，所述反向引物由序列号16的序列组成，

2)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号43的序列组成，所述反向引物由序列号50的序列组成，

3)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号51的序列组成，所述反向引物由序列号52的序列组成，

4)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号53的序列组成，所述反向引物由序列号57的序列组成，

5)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号62的序列组成，所述反向引物由序列号70的序列组成，

6)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号81的序列组成，所述反向引物由序列号103的序列组成，及

7)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号115的序列组成，所述反向引物由序列号5的序列组成。

4.如权利要求3所述的引物组，其包含以下的A的组合，

(A)在包含前述1)的引物组的情况下，进一步包含从前述2)～7)中选择的至少3对引物对。

5.如权利要求1～4中任一项所述的引物组，其用于检出细菌菌种。

6.如权利要求4所述的引物组，其用于检出及/或鉴定细菌菌种。

7.用于检出细菌菌种的试剂盒，其特征在于，包含从下述第K1组选择的1对引物对，

第K1组：

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，除了从所述第K1组选择的1对引物对之外，还包含从下述第K2组～第K7组的各组中分别选择1对引物对而得到的6对引物对中的至少1对引物对；

第K2组：

2－1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号28的序列组成，所述反向引物由序列号44、45及序列号47～50中的任一序列组成，

2－6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号33的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，

2－7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号34的序列组成，所述反向引物由序列号45～50中的任一序列组成，

2－8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号35的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，

2－9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号36的序列组成，所述反向引物由序列号44～46及48～50中的任一序列组成，

2－10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号37的序列组成，所述反向引物由序列号45～50中的任一序列组成，

2－12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号39的序列组成，所述反向引物为序列号44～50中的任一，

2－14：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号41的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，

2－15：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号42的序列组成，所述反向引物由序列号44～50中的任一序列组成，或

2－16：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号43的序列组成，所述反向引物由序列号44～48及50中的任一序列组成，

第K3组：

第K4组：

第K5组

5－1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号62的序列组成，所述反向引物由序列号70、71及73～75中的任一序列组成，

5－5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号66的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

5－6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号67的序列组成，所述反向引物由序列号70～75中的任一序列组成，

第K6组

6－1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号76的序列组成，所述反向引物由序列号91、93、96及101～103中的任一序列组成，

6－4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号79的序列组成，所述反向引物由序列号91、97及101～103中的任一序列组成，

6－11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号86的序列组成，所述反向引物由序列号91、93、97及101～103中的任一序列组成，

第K7组

7－1：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号104的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－2：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号105的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－3：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号106的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－4：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号107的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－5：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号108的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－6：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号109的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－7：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号110的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－8：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号111的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－9：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号112的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－10：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号113的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及116～131中的任一序列组成，

7－11：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号114的序列组成，所述反向引物由序列号2、5及125中的任一序列组成，或

7－12：引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物由序列号115的序列组成，所述反向引物由序列号2、5、116、118、123及125～128中的任一序列组成。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，包含下述的1)的1对引物对和下述的2)～7)的6对引物对中的至少1对引物对，

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中，包含以下的A的组合，(A)在包含前述1)的引物对的情况下，进一步包含从前述2)～7)中选择的至少3对引物对。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其用于检出及/或鉴定细菌菌种。

12.如权利要求7所述的试剂盒，其中，进一步包含追加的引物对，所述追加的引物对包含：由序列号1的序列组成的正向引物、与选自由序列号2～5中的任一序列组成的反向引物中的至少1种。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中，所述追加的引物对为由序列号1的序列组成的正向引物与由序列号5的序列组成的反向引物的引物对。

14.如权利要求7所述的试剂盒，其中，进一步包含用于PCR的酶。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中，引物及用于PCR的酶，分别或以整体计，其中细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

16.如权利要求14所述的试剂盒，其中，进一步包含pH缓冲液、dNTP、MgCl₂及测定用容器中的至少1种。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，以引物、用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、MgCl₂及测定用容器的分别或整体计，细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中，引物、用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、MgCl₂及测定用容器被每种单独地包装，各包装内的细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

19.如权利要求14或16所述的试剂盒，其中，进一步包含荧光色素。

20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，以引物、用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、荧光色素、MgCl₂及测定用容器的分别或整体计，细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，引物、用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、荧光色素、MgCl₂及测定用容器被每种单独地包装，各包装内的细菌来源的核酸混入量为10fg以下。

22.如权利要求17、18、20或21所述的试剂盒，其中，通过实施γ射线处理、超滤处理及EMA处理中的任何处理，细菌来源的核酸混入量成为10fg以下。

23.如权利要求16所述的试剂盒，其中，dNTP是为了用于热启动PCR而进行了化学修饰的dNTP。

24.如权利要求14～18、20～21、23中任一项所述的试剂盒，其中，用于PCR的酶为细菌来源的DNA含量不足10fg/μL的Taq DNA聚合酶。

25.权利要求1～6中任一项所述的引物组或权利要求7～24中任一项所述的试剂盒在制造用于检出及/或鉴定被检样品中的检出对象细菌菌种的制剂中的用途，其中，所述检出及/或鉴定具有以下工序：

使用由前述被检样品制备的细菌的基因组DNA、引物、和耐热性DNA聚合酶进行PCR的工序，所述引物用于得到包含对于检出对象细菌菌种为特异性的目标基因的扩增产物，

通过检出前述PCR的扩增产物中的前述目标基因、或分析该扩增产物，从而进行检出或鉴定前述被检样品中的检出对象细菌菌种的工序，

并且，其中，使用权利要求1～6中任一项所述的引物组作为前述引物，或者使用权利要求7～24中任一项所述的试剂盒。

26.如权利要求25所述的用途，其中，使用权利要求7～24中任一项所述的试剂盒。