JPH04104790A - 微生物菌体からの遺伝子断片の単離法 - Google Patents
微生物菌体からの遺伝子断片の単離法Info
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- JPH04104790A JPH04104790A JP22119090A JP22119090A JPH04104790A JP H04104790 A JPH04104790 A JP H04104790A JP 22119090 A JP22119090 A JP 22119090A JP 22119090 A JP22119090 A JP 22119090A JP H04104790 A JPH04104790 A JP H04104790A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、微生物菌体内に存在する特定のＤＮＡ断片の
検出、および単離の方法に関する。
検出、および単離の方法に関する。
本発明によれば分子生物学、生化学、遺伝学分野の研究
における組換えＤＮＡ研究をなう際に、迅速、かつ正確
なりＮＡの検出が可能となり、また、プラスミド挿入断
片等の直接的単離が可能となる。
における組換えＤＮＡ研究をなう際に、迅速、かつ正確
なりＮＡの検出が可能となり、また、プラスミド挿入断
片等の直接的単離が可能となる。
（従来技術及び問題点）
分子生物学の発展にともない、ＤＮＡレベルでの研究が
広く行なわれるようになっている。Ｍ近、ＤＮＡの微を
解析法として、ポリメラーゼ連鎖反応接（ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣ
Ｒと略す）が開発され（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３９゜４８７（１９８８））、こ
の実施例が数多く報告されている（太田成馬、細胞工学
８．５４５． （１９８９））。
広く行なわれるようになっている。Ｍ近、ＤＮＡの微を
解析法として、ポリメラーゼ連鎖反応接（ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣ
Ｒと略す）が開発され（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３９゜４８７（１９８８））、こ
の実施例が数多く報告されている（太田成馬、細胞工学
８．５４５． （１９８９））。
ＰＣＲは２つの相向かい合う短いプライマーＤＮＡを用
い、−本鎖ＤＮＡの両端にアニーリングし、この間の配
列をＤＮＡポリメラーゼによって連鎖反応を行い二本鎖
ＤＮＡとし、更に熱変性して一本鎖ＤＮＡとし合成を繰
り返すことにより、特定の領域の配列のみを高度に増幅
する技術である。ＰＣＲはＤＮＡ鎖の熱変性、プライマ
ーとのアニーリング、ポリメラーゼによる伸長反応を繰
り返し行うことによって、特定の断片を増幅することが
できるものである。通常、反応液中の温度変化を繰り返
すためにＤＮＡポリメラーゼは好熱性のものを用いる。
い、−本鎖ＤＮＡの両端にアニーリングし、この間の配
列をＤＮＡポリメラーゼによって連鎖反応を行い二本鎖
ＤＮＡとし、更に熱変性して一本鎖ＤＮＡとし合成を繰
り返すことにより、特定の領域の配列のみを高度に増幅
する技術である。ＰＣＲはＤＮＡ鎖の熱変性、プライマ
ーとのアニーリング、ポリメラーゼによる伸長反応を繰
り返し行うことによって、特定の断片を増幅することが
できるものである。通常、反応液中の温度変化を繰り返
すためにＤＮＡポリメラーゼは好熱性のものを用いる。
通常の反応系では、熱変性は９４℃で行ない、アニーリ
ングは３７℃で、ポリメラーゼ反応は７２℃で行なう。
ングは３７℃で、ポリメラーゼ反応は７２℃で行なう。
これらの一連の反応は繰り返し行なわれ、その結果１つ
のＤＮＡ断片を１００万倍にまで増幅することが可能で
ある。
のＤＮＡ断片を１００万倍にまで増幅することが可能で
ある。
ＰＣＲは非常に感度よく特定の配列を増幅することが可
能であるので、反応液中にごく微量の標的ＤＮＡが存在
するだけで、十分量のＤＮＡ断片を増幅することができ
る。そのため、これまでにＰＣＲを応用した数多くの微
量分析法が提案されている。特に、この方法による動物
細胞や微生物菌体内の特定のＤＮＡ配列を検出する方法
は、遺伝病の検出や、特定の遺伝子の変化を迅速に微量
分析することを可能にすることから非常によく研究され
ている（例、 Ｅｈｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、 ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、 Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ １９９０．ｐｐ３２５−３３６、ｋｉｍ ａｎｄ
Ｓｍ１ｔｈｅｓ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 １６．８８８７（１９８８））。
能であるので、反応液中にごく微量の標的ＤＮＡが存在
するだけで、十分量のＤＮＡ断片を増幅することができ
る。そのため、これまでにＰＣＲを応用した数多くの微
量分析法が提案されている。特に、この方法による動物
細胞や微生物菌体内の特定のＤＮＡ配列を検出する方法
は、遺伝病の検出や、特定の遺伝子の変化を迅速に微量
分析することを可能にすることから非常によく研究され
ている（例、 Ｅｈｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、 ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、 Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ １９９０．ｐｐ３２５−３３６、ｋｉｍ ａｎｄ
Ｓｍ１ｔｈｅｓ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 １６．８８８７（１９８８））。
しかしながら、従来のこれらの分析法はすべて細胞ある
いは菌体からまずＤＮＡ成分を抽出することが必須であ
る。これらの方法によるとＤＮＡの抽出は、界面活性剤
を含む反応液に細胞を懸濁し、物理的あるいは化学的に
細胞を破砕することによって行なわれる。この操作は非
常に多くの時間を要する上、熟練をも要する。多数の資
料を処理するときにはこの方法は多大な労力を要求し、
また操作の途中での試料の損失や、他の物質の汚染の恐
れがあった。そこでこのようなりＮＡ抽出操作を含まな
い方法の開発が待たれていた。
いは菌体からまずＤＮＡ成分を抽出することが必須であ
る。これらの方法によるとＤＮＡの抽出は、界面活性剤
を含む反応液に細胞を懸濁し、物理的あるいは化学的に
細胞を破砕することによって行なわれる。この操作は非
常に多くの時間を要する上、熟練をも要する。多数の資
料を処理するときにはこの方法は多大な労力を要求し、
また操作の途中での試料の損失や、他の物質の汚染の恐
れがあった。そこでこのようなりＮＡ抽出操作を含まな
い方法の開発が待たれていた。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、ＰＣＨにおける微生物菌体からのＤＮＡ
抽出をより簡便なものにするために鋭意研究したところ
、ＰＣＲを行う反応液中に微生物菌体を添加して加熱処
理することによって、微生物菌体中のＤＮＡを直接ＰＣ
Ｒ反応液中に添加することに成功したのである。
抽出をより簡便なものにするために鋭意研究したところ
、ＰＣＲを行う反応液中に微生物菌体を添加して加熱処
理することによって、微生物菌体中のＤＮＡを直接ＰＣ
Ｒ反応液中に添加することに成功したのである。
本発明においては、ＰＣＲはこれまでに知られているＰ
ＣＲを用いないＤＮＡの分析方法に比べて格段に感度が
よい。それゆえに、微生物菌体を加熱処理することによ
って反応液中に浸出したごくわずかなりＮＡでも充分検
出できるものと考えられる。
ＣＲを用いないＤＮＡの分析方法に比べて格段に感度が
よい。それゆえに、微生物菌体を加熱処理することによ
って反応液中に浸出したごくわずかなりＮＡでも充分検
出できるものと考えられる。
本発明では、微生物菌体の様々なりＮＡを特別な抽出処
理を行なうことなく、菌体から直接ＰＣＲ反応液中への
溶出を可能としたために、ＤＮＡ抽出処理のかなりの手
間と時間を省略できる。そのため本発明は実験操作上す
ぐれた方法であり、また、ＤＮＡ分析では、本発明の方
法はより迅速で、より正確な方法ということができる。
理を行なうことなく、菌体から直接ＰＣＲ反応液中への
溶出を可能としたために、ＤＮＡ抽出処理のかなりの手
間と時間を省略できる。そのため本発明は実験操作上す
ぐれた方法であり、また、ＤＮＡ分析では、本発明の方
法はより迅速で、より正確な方法ということができる。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う反応液中に微生
物菌体を添加し、これを加熱処理することによって微生
物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめることを特徴と
するポリメラーゼ連鎖反応液中へＤＮＡ成分を直接的に
得る方法に関するものである。
物菌体を添加し、これを加熱処理することによって微生
物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめることを特徴と
するポリメラーゼ連鎖反応液中へＤＮＡ成分を直接的に
得る方法に関するものである。
また、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う反応液中
に微生物菌体を添加し、これを加熱処理することによっ
て微生物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られ
た反応液中のＤ Ｎ Ａから。
に微生物菌体を添加し、これを加熱処理することによっ
て微生物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られ
た反応液中のＤ Ｎ Ａから。
ＤＮＡポリメラーゼと、特定のＤＮＡ断片の両端部と効
率よく対合することができる２本の相向かい合うプライ
マーＤＮＡ断片を用いて特定のＤＮＡ断片を増幅せしめ
ることを特徴とする微生物菌体からの遺伝子断片の単Ｍ
法に関するものである。
率よく対合することができる２本の相向かい合うプライ
マーＤＮＡ断片を用いて特定のＤＮＡ断片を増幅せしめ
ることを特徴とする微生物菌体からの遺伝子断片の単Ｍ
法に関するものである。
更に、本発明はポリメラーゼ連鎖反応を行う反溶液中に
微生物菌体を添加し、これを加熱処理することによって
微生物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られた
反応液中のＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼと、特定の
ＤＮＡ断片の両端部と効率よく対合することができる２
本の相向かい合うプライマーＤＮＡ断片を用いて特定の
ＤＮＡ断片を増幅せしめることを特徴とする微生物菌体
中の遺伝子の分析方法に関するものである。
微生物菌体を添加し、これを加熱処理することによって
微生物菌体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られた
反応液中のＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼと、特定の
ＤＮＡ断片の両端部と効率よく対合することができる２
本の相向かい合うプライマーＤＮＡ断片を用いて特定の
ＤＮＡ断片を増幅せしめることを特徴とする微生物菌体
中の遺伝子の分析方法に関するものである。
本発明の方法の特色は、微生物菌体を直接、ＰＣＲ反応
液中に投入し、最初の加熱処理の時間を長くすることに
よって、微生物菌体内に存在するＤＮＡを反応液中へ効
率よく浸出せしめることにある。最初の加熱は９０℃以
上であるのが好ましく、加熱時間は１０分程度で充分で
ある。また、反応溶液に加える微生物菌体はつまようじ
の先端部に付着する程度のごくわずかの量でよい。
液中に投入し、最初の加熱処理の時間を長くすることに
よって、微生物菌体内に存在するＤＮＡを反応液中へ効
率よく浸出せしめることにある。最初の加熱は９０℃以
上であるのが好ましく、加熱時間は１０分程度で充分で
ある。また、反応溶液に加える微生物菌体はつまようじ
の先端部に付着する程度のごくわずかの量でよい。
本発明のＰＣＲ反応液中での加熱によって、微生物菌体
に含まれるＤＮＡはよく浸出し、ＰＣＲ反応に供するこ
とができる。
に含まれるＤＮＡはよく浸出し、ＰＣＲ反応に供するこ
とができる。
本発明の方法では通常のＰＣＲの反応液に、つまようじ
などの道具を用いて、ごく微量の微生物菌体を懸濁し、
これをＰＣＨの反応の前に高温（９０℃程度）で１０分
間はど加熱する。この後は通常の方法でＰＣＲを行なう
、これによって確実に目的とするＤＮＡ断片の増幅が行
なわれる。この方法ではどの様な大きさの断片でも検出
が可能である。また、標的とするＤＮＡ以外の断片はこ
の方法によって全く増幅されることが無いので、標的Ｄ
ＮＡだけを純粋な形で得ることができるのである。
などの道具を用いて、ごく微量の微生物菌体を懸濁し、
これをＰＣＨの反応の前に高温（９０℃程度）で１０分
間はど加熱する。この後は通常の方法でＰＣＲを行なう
、これによって確実に目的とするＤＮＡ断片の増幅が行
なわれる。この方法ではどの様な大きさの断片でも検出
が可能である。また、標的とするＤＮＡ以外の断片はこ
の方法によって全く増幅されることが無いので、標的Ｄ
ＮＡだけを純粋な形で得ることができるのである。
本発明に用いるＰＣＲの反応液５通常のＰＣＲに使用さ
れる試薬で、これは反応緩衝液、プライマー、デオキシ
ヌクレオチド、好熱性ＤＮＡポリメラーゼからなるもの
で、これら以外にＤＮＡ抽出用試薬等を添加する必要は
ない。
れる試薬で、これは反応緩衝液、プライマー、デオキシ
ヌクレオチド、好熱性ＤＮＡポリメラーゼからなるもの
で、これら以外にＤＮＡ抽出用試薬等を添加する必要は
ない。
ＰＣＲ反応液中での加熱によって、微生物菌体からの遺
伝子断片は１本鎖ＤＮＡとなっているので、反応液の温
度を５０−６０℃程度に下げ、プライマーとアニーリン
グせしめることができる。
伝子断片は１本鎖ＤＮＡとなっているので、反応液の温
度を５０−６０℃程度に下げ、プライマーとアニーリン
グせしめることができる。
アニーリングが完了した後は、反応液の温度を好熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの適温である７２℃程度に昇温し、ポ
リメラーゼ反応を行う。
ＮＡポリメラーゼの適温である７２℃程度に昇温し、ポ
リメラーゼ反応を行う。
このようにして２本鎖となったＤＮＡは、最初の加熱で
ある９０℃以上の加熱処理を行えば、１本鎖に解離する
ことができる。
ある９０℃以上の加熱処理を行えば、１本鎖に解離する
ことができる。
この反応液をそのままアニーリング処理及びポリメラー
ゼ処理を行う。
ゼ処理を行う。
このような処理をくり返すことによって特定の配列のＤ
ＮＡのみを増幅することができるのである。
ＮＡのみを増幅することができるのである。
また、本発明の方法によって増幅された断片は目的とす
るＤＮＡ断片以外の不必要なＲＮＡやＤＮＡの混入が全
く無いため、これを用いて、直接ＤＮＡ塩基配列の決定
の実験や、ハイブリダイゼーションの実験に用いること
が可能である。
るＤＮＡ断片以外の不必要なＲＮＡやＤＮＡの混入が全
く無いため、これを用いて、直接ＤＮＡ塩基配列の決定
の実験や、ハイブリダイゼーションの実験に用いること
が可能である。
本発明の方法による特定のＤＮＡの調製法は、これまで
に知られている方法に比入、圧倒的に速く、かつ正確で
あり、純度が高い。そのため、これまでのＤＮＡ調製法
でしばしば用いられているＲＮＡ分解酵素などの試薬が
要らない。従って、本発明の方法は従来の方法に比べて
格段に経済的であり効率的であると考えられ、ＤＮＡの
調製法又は遺伝子の分析法としてはきわめてすぐれた方
法といえるのである。
に知られている方法に比入、圧倒的に速く、かつ正確で
あり、純度が高い。そのため、これまでのＤＮＡ調製法
でしばしば用いられているＲＮＡ分解酵素などの試薬が
要らない。従って、本発明の方法は従来の方法に比べて
格段に経済的であり効率的であると考えられ、ＤＮＡの
調製法又は遺伝子の分析法としてはきわめてすぐれた方
法といえるのである。
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例）
実施例１
大腸菌菌体に存在するプラスミドＤＮＡのユニバーサル
プライマーと逆方向プライマーを用いた直接的検出 ｐＵｃプラスミドにクローン化された特定のＤＮＡ断片
の検出を試みた。ｐシ１ＣプラスミドはＭｅｓｓｉｎｇ
らによって開発されたもので、異種のＤＮＡ断片をクロ
ーニングするのに非常に便利のよいマルチクローニング
サイトを有する（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙＩＩｌｏｌ、、
１５３．３ （１９８７））ｓこのマルチクローニング
サイトに存在する制限酵素切断点を用いてＤＮＡをクロ
ーン化した場合、この両側に存在する２つのプライマー
サイトによって容易に塩基配列を決定することができる
ように設計されており、非常に便利なベクターである。
プライマーと逆方向プライマーを用いた直接的検出 ｐＵｃプラスミドにクローン化された特定のＤＮＡ断片
の検出を試みた。ｐシ１ＣプラスミドはＭｅｓｓｉｎｇ
らによって開発されたもので、異種のＤＮＡ断片をクロ
ーニングするのに非常に便利のよいマルチクローニング
サイトを有する（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ
、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙＩＩｌｏｌ、、
１５３．３ （１９８７））ｓこのマルチクローニング
サイトに存在する制限酵素切断点を用いてＤＮＡをクロ
ーン化した場合、この両側に存在する２つのプライマー
サイトによって容易に塩基配列を決定することができる
ように設計されており、非常に便利なベクターである。
しかもこれらのプライマーは市販されており、また有機
合成法によって容易に入手が可能である。
合成法によって容易に入手が可能である。
プラスミドＤＮＡとして表１に示すものを用いた。
表１
実験番号 プラスミド名 ベクター プライマ間の長さ
１ ｐＳＳ３ＣｐＵｃ１９ ３．４ｋｂ
ｐ２ ｐＲＰ４−３ ｐＵｃ１９
２．６ｋｂｐ３ ｐＲＰ４−８ ｐＵ
ｃ１９ １．５ｋｂｐ４ ｐＲＰｌ−４
ｐＵｃ１９ ０．６ｋｂｐ５ ｐＵｃ１
９ ｐＵｃ１９ ０．１ｋｂｐこれらの
プラスミドにはｐＬｌｃベクターに由来するマルチクロ
ーニングサイトが挿入断片の両側に存在する。
１ ｐＳＳ３ＣｐＵｃ１９ ３．４ｋｂ
ｐ２ ｐＲＰ４−３ ｐＵｃ１９
２．６ｋｂｐ３ ｐＲＰ４−８ ｐＵ
ｃ１９ １．５ｋｂｐ４ ｐＲＰｌ−４
ｐＵｃ１９ ０．６ｋｂｐ５ ｐＵｃ１
９ ｐＵｃ１９ ０．１ｋｂｐこれらの
プラスミドにはｐＬｌｃベクターに由来するマルチクロ
ーニングサイトが挿入断片の両側に存在する。
まず、それぞれのプラスミドを有する大腸菌を肉汁寒天
培地上で培養した。これらを分析に用いることとし、生
育してきた大腸菌のコロニーにつまようじを突き刺し、
大腸菌菌体をっまようしの先端部に付着させ、これをも
う１枚の別の新しい寒天培地に突き刺した。さらにこの
つまようじをあらかじめ用意したＰＣＨの反応溶液の中
に挿入し、つまようじに残存する大腸菌菌体を反応溶液
中に懸濁した。
培地上で培養した。これらを分析に用いることとし、生
育してきた大腸菌のコロニーにつまようじを突き刺し、
大腸菌菌体をっまようしの先端部に付着させ、これをも
う１枚の別の新しい寒天培地に突き刺した。さらにこの
つまようじをあらかじめ用意したＰＣＨの反応溶液の中
に挿入し、つまようじに残存する大腸菌菌体を反応溶液
中に懸濁した。
ＰＣＨの反応はＩｎｎ１ｓとＧｅ１ｆａｎｄの方法に従
った（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、 １９９０． ｐｐ３〜１２）。反応液
の組成は５０ｍＭ ＫＣＩ、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ８，３）、 １．５ｍＭ ＭｇＣ１□、 ０
．０１％ゼラチン、 ０．２ｓ＋ＭｄＡＴＰ、 ０．
２ｍＭ ｄＣＴＰ、 ０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＴＴＰ。
った（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、 １９９０． ｐｐ３〜１２）。反応液
の組成は５０ｍＭ ＫＣＩ、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ８，３）、 １．５ｍＭ ＭｇＣ１□、 ０
．０１％ゼラチン、 ０．２ｓ＋ＭｄＡＴＰ、 ０．
２ｍＭ ｄＣＴＰ、 ０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＴＴＰ。
２．５ｕｎｉｔｓ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ、 １．Ｏｐ ＭずつのプライマーＤＮＡであった
。Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは全酒造製を
用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは前述の２つのプラ
イマー（ユニバーサルプライマーとリバースプライマー
）を用いた。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｏ＋ｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の反応機はＰｅｒｋｉｎＥｉ
ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のものを用いた。反応は、熱変性
は９４℃で、アニーリングは６０℃で、ポリメラーゼ反
応は７２℃で順次行なった。これらの一連の反応は３０
回繰り返した。
ｓｅ、 １．Ｏｐ ＭずつのプライマーＤＮＡであった
。Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは全酒造製を
用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは前述の２つのプラ
イマー（ユニバーサルプライマーとリバースプライマー
）を用いた。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｏ＋ｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の反応機はＰｅｒｋｉｎＥｉ
ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のものを用いた。反応は、熱変性
は９４℃で、アニーリングは６０℃で、ポリメラーゼ反
応は７２℃で順次行なった。これらの一連の反応は３０
回繰り返した。
反応後の解析は、反応液の一部をアガロース電気泳動を
行なうことによって実施した。この結果、第１図に示す
ように、すべての場合において、それぞれのプラスミド
に含まれている挿入断片に対応する長さのＤＮＡ断片が
特異的に増幅されていた。
行なうことによって実施した。この結果、第１図に示す
ように、すべての場合において、それぞれのプラスミド
に含まれている挿入断片に対応する長さのＤＮＡ断片が
特異的に増幅されていた。
実施例２
混合系でのプラスミドの直接検出
実施例１で用いたプラスミドを含む大腸菌を５つ混合し
、同様の実験を行った。それぞれのコロニーから菌体を
取り、反応溶液に懸濁した。これを実施例１の方法でＰ
ＣＲを行った。
、同様の実験を行った。それぞれのコロニーから菌体を
取り、反応溶液に懸濁した。これを実施例１の方法でＰ
ＣＲを行った。
混合プラスミドＤＮＡとして表２に示すものを用いた。
表２
実験番号 プラスミド名 増幅が期待される
断片の長さ１ ｐＳＳ３Ｃ，ｐＵｃ１９． ｐＵｃ
１９． ３．４ｋｂｐ、 ０．１ｋｂｐｐＵｃ
１９． ｐＵｃ１９ ２ ｐＲＰ４−３． ｐＵｃ１９． ｐＵｃ１９．
２．６ｋｂｐ、 ０．１ｋｂｐρＵＣ１９，ｐ
Ｌ］ｃ１９ ３ ｐＲＰ４−８．ｐｔｌｃ１９．ｐｔｌｃ１９．
１．５ｋｂｐ、０．１ｋｂｐｐｌＪｃ１９．
ｐＵｃ１９ ４ ＰＲＰＩ−４，ρＵＣ１９，ｐＵｃ１９．
０．６ｋｂｐ、 ０．１ｋｂρｐＵｃ１９．ρＬＩ
Ｃ１９ その結果は第２図に示す通りであり、菌体の混合を行っ
てもそれぞれのプラスミドＤＮＡを検出することができ
た。一部の断片については、時には強く増幅されないこ
ともあったが、検出不可能な断片はなかった。
断片の長さ１ ｐＳＳ３Ｃ，ｐＵｃ１９． ｐＵｃ
１９． ３．４ｋｂｐ、 ０．１ｋｂｐｐＵｃ
１９． ｐＵｃ１９ ２ ｐＲＰ４−３． ｐＵｃ１９． ｐＵｃ１９．
２．６ｋｂｐ、 ０．１ｋｂｐρＵＣ１９，ｐ
Ｌ］ｃ１９ ３ ｐＲＰ４−８．ｐｔｌｃ１９．ｐｔｌｃ１９．
１．５ｋｂｐ、０．１ｋｂｐｐｌＪｃ１９．
ｐＵｃ１９ ４ ＰＲＰＩ−４，ρＵＣ１９，ｐＵｃ１９．
０．６ｋｂｐ、 ０．１ｋｂρｐＵｃ１９．ρＬＩ
Ｃ１９ その結果は第２図に示す通りであり、菌体の混合を行っ
てもそれぞれのプラスミドＤＮＡを検出することができ
た。一部の断片については、時には強く増幅されないこ
ともあったが、検出不可能な断片はなかった。
従ってこの方法は混合系でも応用が可能であることが明
らかとなった。
らかとなった。
実施例３
合成プライマーを用いたプラスミドの直接的検ｐＵＣプ
ラスミド以外のプラスミドにクローン化されていて、上
記のプライマーをＰＣＲプライマーとして用いることが
できない場合、特定の塩基配列に対応する配列を有機合
成し、これをＰＣＲプライマーとして、用いることがで
きるものと考えられる。
ラスミド以外のプラスミドにクローン化されていて、上
記のプライマーをＰＣＲプライマーとして用いることが
できない場合、特定の塩基配列に対応する配列を有機合
成し、これをＰＣＲプライマーとして、用いることがで
きるものと考えられる。
ｐＲＰ４−３はイネ葉緑体遺伝子の一部をｐＵｃ１９に
挿入することによって得られたプラスミドＤＮＡである
（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、 Ｒｅｐｒ、。
挿入することによって得られたプラスミドＤＮＡである
（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、 Ｒｅｐｒ、。
ス、 ２８４ （１９８９））。この挿入断片の塩基配
列はすでに明かとなっているので（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏｌ。
列はすでに明かとなっているので（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 ２１７．１８５ （１９８
９） ）、この配列の一部に対応する塩基配列２０塩基
を有機合成した。これを一方のプライマーとし、もう一
方のプライマーを前述のユニバーサルプライマーを用い
て、実施例１および実施例２の方法に準じて実験を行っ
た。
９） ）、この配列の一部に対応する塩基配列２０塩基
を有機合成した。これを一方のプライマーとし、もう一
方のプライマーを前述のユニバーサルプライマーを用い
て、実施例１および実施例２の方法に準じて実験を行っ
た。
プラスミドＤＮＡとして表３に示すものを用いた。
表３
実験番号 プラスミド名 増幅が期待される断片の長さ
１ ｐＵｃ１９ なし２
ｐＲＰ４−３ １．１ｋｂｐ３
ρＲＰ４−３． ｐＵｃ１９ １．１ｋｂｐ
この場合、ＰＯＣｌ２のユニバーサルプライマーとｐＲ
Ｐ４−３の中のプライマー配列の間１．１ｋｂρが増幅
されることが期待された。またｐＲＰ４−３の中のプラ
イマー配列はベクターなどの他のプラスミドＤＮＡには
存在しないことから、ｐＲＰ４−３のみが特異的に検出
できるものと考えられた。
１ ｐＵｃ１９ なし２
ｐＲＰ４−３ １．１ｋｂｐ３
ρＲＰ４−３． ｐＵｃ１９ １．１ｋｂｐ
この場合、ＰＯＣｌ２のユニバーサルプライマーとｐＲ
Ｐ４−３の中のプライマー配列の間１．１ｋｂρが増幅
されることが期待された。またｐＲＰ４−３の中のプラ
イマー配列はベクターなどの他のプラスミドＤＮＡには
存在しないことから、ｐＲＰ４−３のみが特異的に検出
できるものと考えられた。
実験の結果は第３図に示す通りであり、目的とする長さ
を有する断片のみが増幅され、その他のプラスミドに由
来する配列は全く増幅がみられなかった。
を有する断片のみが増幅され、その他のプラスミドに由
来する配列は全く増幅がみられなかった。
従って、この方法は多くの微生物菌体から、特定のプラ
スミドＤＮＡを有する菌株を迅速に選択するために、非
常に有効であることが証明された。
スミドＤＮＡを有する菌株を迅速に選択するために、非
常に有効であることが証明された。
第１図は実施例１において実験番号１〜５の反応液のア
ガロース電気泳動の結果を示す図で、第２図は実施例２
において実験番号１〜５の反応液のアガロース電気泳動
の結果を示す図で、第３図は実施例３において実験番号
１〜３の反応液のアガロース電気泳動の結果を示す図で
ある。 第 １ 図 代理人 弁理士 戸 １）親 男 箒 図 第 図
ガロース電気泳動の結果を示す図で、第２図は実施例２
において実験番号１〜５の反応液のアガロース電気泳動
の結果を示す図で、第３図は実施例３において実験番号
１〜３の反応液のアガロース電気泳動の結果を示す図で
ある。 第 １ 図 代理人 弁理士 戸 １）親 男 箒 図 第 図
Claims (3)
- （１）ポリメラーゼ連鎖反応を行う反応液中に微生物菌
体を添加し、これを加熱処理することによって微生物菌
体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめることを特徴とする
ポリメラーゼ連鎖反応液中へＤＮＡ成分を直接的に得る
方法。 - （２）ポリメラーゼ連鎖反応を行う反応液中に微生物菌
体を添加し、これを加熱処理することによって微生物菌
体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られた反応液中
のＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼと、特定のＤＮＡ断
片の両端部と効率よく対合することができる２本の相向
かい合うプライマーＤＮＡ断片を用いて特定のＤＮＡ断
片を増幅せしめることを特徴とする微生物菌体からの遺
伝子断片の単離法。 - （３）ポリメラーゼ連鎖反応を行う反応液中に微生物菌
体を添加し、これを加熱処理することによって微生物菌
体より菌体内のＤＮＡを浸出せしめ、得られた反応液中
のＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼと、特定のＤＮＡ断
片の両端部と効率よく対合することができる２本の相向
かい合うプライマーＤＮＡ断片を用いて特定のＤＮＡ断
片を増幅せしめることを特徴とする微生物菌体中の遺伝
子の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22119090A JPH04104790A (ja) | 1990-08-24 | 1990-08-24 | 微生物菌体からの遺伝子断片の単離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22119090A JPH04104790A (ja) | 1990-08-24 | 1990-08-24 | 微生物菌体からの遺伝子断片の単離法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04104790A true JPH04104790A (ja) | 1992-04-07 |
Family
ID=16762889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22119090A Pending JPH04104790A (ja) | 1990-08-24 | 1990-08-24 | 微生物菌体からの遺伝子断片の単離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04104790A (ja) |
-
1990
- 1990-08-24 JP JP22119090A patent/JPH04104790A/ja active Pending
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