JP3910015B2 - cDNAの合成方法 - Google Patents
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Description
本発明は遺伝子工学分野において有用な、新規のcDNA合成方法、並びに該方法に使用されるキットに関する。
発明の背景
生命現象を解明するためには、様々の遺伝子のmRNA分子の解析が非常に重要である。レトロウイルス由来のRNA依存性DNAポリメラーゼ、即ち逆転写酵素の発見により、RNAを鋳型にcDNAを合成する逆転写反応が可能となり、mRNA分子の解析法は長足の進歩を遂げ、逆転写酵素を用いたmRNA分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。更に該方法はクローニング技術やPCR技術にも応用され、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等、幅広い分野において不可欠の技術となっている。
しかしながら、従来の逆転写方法には、cDNA合成反応が途中で止まってしまう、長いcDNAが合成出来ない、フィデリティーが低い、反応に要する時間が長いため反応の進行中に鋳型RNAが損傷を受けてしまう等の多くの問題点があった。
cDNA合成反応が途中で止まってしまうのは、鋳型となるRNAが形成する二次構造のためと考えられる。レトロウイルス由来の逆転写酵素の反応至適温度は低いため、反応時にRNAが複雑な二次構造を形成し、このような二次構造の部位でcDNA合成反応は止まってしまう。この問題点を解決する方法として、耐熱性の逆転写酵素を用いる方法が提案されている。しかし、該方法は反応性において満足できるものではない。また、逆転写酵素の逆転写反応における校正活性は知られておらず、フィデリティーの高いcDNA合成方法も知られていない。
このように従来の技術ではcDNA合成を効率良く高いフィデリティーで行うことは困難であり、より効率の良いcDNA合成方法が求められていた。
発明の目的
本発明は前記従来技術に鑑みて行われたものであり、本発明の目的は、従来技術の問題点を克服し、反応効率が高く、かつ正確なcDNA合成を行う方法を提供することにある。
発明の要旨
本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写活性を行うことを特徴とするcDNAの合成方法に関する。
本発明の第2の発明は、第1の発明の方法によって合成されたcDNAを鋳型として遺伝子増幅反応を実施することを特徴とするcDNAの増幅方法に関する。
本発明の第3の発明は、cDNAを合成するためのキットに関し、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含有することを特徴とするcDNA合成キットに関する。
本発明の第4の発明は、cDNAを増幅するために用いられるキットに関し、第1の発明の方法によって合成されたcDNAを鋳型として遺伝子増幅反応を実施し、cDNAを増幅するために用いられるキットであって、逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含有することを特徴とするcDNA増幅キットに関する。
本発明者らは、cDNA合成反応において、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写反応を行うことによりcDNAの合成効率、並びにフィデリティーが上昇することを見出し、本発明を完成した。
発明の詳細な説明
本発明のcDNA合成方法は、RNAを鋳型とし、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含んだ逆転写反応系によってcDNAを合成することを大きな特徴とする。
本発明の方法に使用することができるRNAを含む試料には特に限定はないが、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全RNA、あるいは特定のRNA分子群、例えば、mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。
本発明の方法に適用することができるRNAとしては特に制限はなく、試料中の全RNA、mRNA、tRNA、rRNA等のRNA分子群、あるいは特定のRNA分子群(例えば、共通の塩基配列モチーフを有するRNA分子群、RNAポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたRNA分子群)が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のRNAが挙げられる。
本発明において鋳型RNAからのcDNA合成に使用されるプライマーは、鋳型RNAに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型RNAに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーはオリゴ(dT)等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド(ランダムプライマー)であっても良い。
前記プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは6ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは10ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは100ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは30ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばABI社(Applied Biosystem Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミタイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したDNAの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作成しても良い。前記プライマーの逆転写反応液中の濃度は、鋳型RNAからのcDNA合成の観点から、好ましくは0.1μM以上であり、更に好ましくは0.5μM以上であり、反応阻害の観点から、好ましくは10μM以下であり、更に好ましくは5μM以下である。
本発明に用いられる逆転写活性を有する酵素としては、RNAを鋳型としたcDNA合成活性を有するものであれば特に限定はないが、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素(すなわち、耐熱性の逆転写酵素)が好適である。このような酵素としては、例えばサーマス(Thermus)属細菌由来DNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ等)、好熱性バチルス(Bacillus)属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。Tth DNAポリメラーゼの逆転写活性を発揮させるためには、反応液中にマンガンイオンの存在が必須である。マンガンイオンはPCR反応においてはフィデリティーの低下を招くことが知られており、Tth DNAポリメラーゼでの逆転写反応液をPCRに使用する場合には、マンガンイオンを除去する必要がある。好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼの場合は、逆転写活性のためのマンガンイオンの添加およびPCRにおけるその除去は必要ではない。このような観点から、本発明には好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼが好ましく、更にバチルス・カルドテナクス(Bacillus caldotenax)由来DNAポリメラーゼ(以下、Bca DNAポリメラーゼと記載する)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のDNAポリメラーゼ(以下、Bst DNAポリメラーゼと記載する)が好ましい。これらの酵素は反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型RNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成することが出来る。
バチルス・カルドテナクスは生育至適温度が約70℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のBca DNAポリメラーゼは、DNA依存DNAポリメラーゼ活性、RNA依存DNAポリメラーゼ活性(逆転写活性)、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、該改変された酵素として例えば5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたBca DNAポリメラーゼであるBcaBEST DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたBst DNAポリメラーゼであるBst DNA Polymerase,Large fragment(New England BiolabS社製)等が挙げられる。5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した上記酵素は本発明に特に好適に使用できる。
前記逆転写活性を有する酵素の使用量は、特に限定はないが、例えば従来の逆転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。また、従来よりも逆転写活性を有する酵素の量を増加させることにより、より効率の高いcDNA合成反応を行う事が出来、反応時間を短縮する事も出来る。例えばBcaBEST DNAポリメラーゼを用いて反応液量20μlで逆転写反応を行う場合、反応液中の該酵素量は0.5U以上であり、cDNA合成効率の観点から、好ましくは22U以上であり、更に好ましくは42U以上である。なお、本明細書に記載のDNAポリメラーゼの活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、当該DNAポリメラーゼに適した反応条件において、30分間に10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1Uと定義する。鋳型となるDNAや反応温度はDNAポリメラーゼに応じて適したものが使用される。例えば、上記BcaBEST DNAポリメラーゼの場合、ポリデオキシ(ATP−TTP)を鋳型/プライマーとして用い60℃において30分間に10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を1Uと定義する。
本発明のcDNA合成方法は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で逆転写反応を行うことを特徴とする。本発明に用いられる3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、該活性を有していれば特に限定はなく、例えば3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用することができる。このような酵素としては、ピロコッカス(Pyrococcus)属細菌由来DNAポリメラーゼ(Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene社製)、Pyrobest DNAポリメラーゼ(宝酒造社製)、Deep Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)、Pwo DNAポリメラーゼ(Boehringer社製)等)やサーモコッカス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社製)等)等のα型DNAポリメラーゼ、大腸菌由来DNAポリメラーゼ(ポリメラーゼI、クレノーフラグメント等)、バクテリオファージ由来DNAポリメラーゼ(T4 DNAポリメラーゼ等)等のポルI型DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくは強い3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示すα型DNAポリメラーゼが用いられる。尚、ポルI型DNAポリメラーゼ、α型DNAポリメラーゼはともにそのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、そのアミノ酸配列上の特徴はヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research)、第15巻、第4045−4657頁(1991)に記載されている。
本発明の目的のためには、RNAとハイブリッドを形成したDNAの3’末端に作用する酵素が使用され、更に、高温で3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示す酵素が好適である。以上の観点から超好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼが好ましい。超好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼとしては、例えばピロコッカス属細菌由来DNAポリメラーゼが挙げられる。
上記方法で得られたcDNAを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、cDNAを増幅することが出来る。核酸増幅反応としては、特に限定するものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法が使用される。PCR法に使用される酵素に特に限定はなく、通常のPCRに使用されるDNAポリメラーゼを使用することが出来る。上記方法で得られたcDNAは鋳型RNAから高いフィデリティーで合成されたものであり、該RNA由来の配列を出来るだけ正確に複製する観点から、PCRも高いフィデリティーで行われることが望まれる。このため、本発明のcDNAの増幅にはフィデリティーの高いDNAポリメラーゼ、例えば好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼが好適に使用される。更に、cDNAの合成工程において3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性のDNAポリメラーゼ(例えば、好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼ)が使用される場合には、該酵素をそのままPCR工程において使用することも可能である。cDNA合成/増幅反応のフィデリティーは、J.Clineらの方法(J.Clineら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research)、第24巻、第3546〜3551頁、(1996))を改変した方法に基づいて測定することができる。
これらの酵素はその本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質のいずれであっても良い。また、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良い。3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、RNAを鋳型とした場合にも、合成されるcDNAに誤って取り込まれた塩基を除去するのに有効な校正活性を示すことからフィデリティーの高いcDNA合成が可能である。前記酵素の使用量は、ポリメラーゼ活性として、反応液20μl中、cDNA合成効率の観点から好ましくは1U以下であり、更に好ましくは0.5U以下であり、校正活性の観点から好ましくは0.01U以上であり、更に好ましくは0.02U以上である。
本発明の方法を用いれば、従来の逆転写方法に比べ、cDNA合成量を増加させることができ、また、従来よりも長い鎖長のcDNAの合成が可能であり、更に、フィデリティーの高いcDNA合成が可能である。また、本方法を関連する技術、例えばクローニング技術、PCR技術等と組合わせることにより、従来よりも効率の良いcDNAライブラリー作製、RT−PCR等が可能であり、これにより、従来困難であった発現量の少ないmRNAのより正確な解析が可能となる。
本発明のcDNA合成キットは、上記cDNA合成方法に用いられるキットであり、フィデリティーの高いcDNA合成を効率よく行うためのキットである。このようなキットとしては、上記の逆転写活性を有する酵素及び3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含有するもの等が挙げられる。該キットは、前記酵素を用いたcDNA合成反応に使用する反応緩衝液、ヌクレオチドやその他の試薬を含有するものであっても良い。このようなキットを使用することによって、効率が良く、フィデリティーの高いcDNA合成を容易に行うことができる。
本発明のcDNA増幅キットは、上記cDNA増幅方法に用いられるキットであり、フィデリティーの高いcDNA増幅を効率よく行うためのキットである。このようなキットとしては、上記の逆転写活性を有する酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素並びに遺伝子増幅反応を行うための試薬を含有するものが挙げられる。cDNAを鋳型とする遺伝子増幅反応としてPCRを用いる場合、増幅反応に使用する試薬としては、耐熱性のDNAポリメラーゼ、反応緩衝液、ヌクレオチドやその他の試薬、が挙げられる。このようなキットを使用することによって、効率が良く、フィデリティーの高いcDNA増幅を容易に行うことができる。上記のように、cDNAの合成工程において3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性のDNAポリメラーゼ(例えば、好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼ)が使用される場合には、該酵素をそのままPCR工程における増幅反応のためのDNAポリメラーゼとして使用することも可能である。
実施例
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
尚、下記実施例において、各酵素の活性は各酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。
実施例1 RNAの調製
以下の実施例に使用するRNAは、特に断らない限り、ヒト培養細胞U−937(ATCCCRL−1593)からトライゾール試薬(ライフテック社製)を使用し、該試薬添付の説明書記載の操作により調製後、濃度を0.66μg/μlに調製したものである。RNAの純度は、OD260/OD280=1.7であった。
実施例2 BcaBEST DNAポリメラーゼ及びPyrobest DNAポリメラーゼの組合わせによる効果
cDNA合成における3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の添加の効果を、逆転写酵素として5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチルス・カルドテナクス由来DNAポリメラーゼ(BcaBEST DNAポリメラーゼ 宝酒造社製)、3’−5’エキソヌクレアーゼとしてピロコッカス スピーシーズ(Pyrococcus sp.)由来DNAポリメラーゼ(Pyrobest DNAポリメラーゼ 宝酒造社製)を用いて検討した。
cDNA合成反応はBcaBEST RNA PCR Kit(Ver.1.1)(宝酒造社製)を使用して行った。当該キットのマニュアルに従って、下記に記載の酵素とオリゴdT(oligo dT)プライマーを含む反応液20μlを調製した。これらの反応液をPCRサーマルサイクラー パーソナル(宝酒造社製)にセットし、60℃で1分、2分、3分、4分で逆転写反応を行い、各々の反応時間の後、98℃、5分間の熱処理を行った。
酵素1 BcaBEST DNAポリメラーゼ 22U/反応系
酵素2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U/反応系
酵素3 BcaBEST DNAポリメラーゼ 22U+Pyrobest DNAポリメラーゼ0.017U/反応系
酵素4 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U+Pyrobest DNAポリメラーゼ 0.033U/反応系
次にPyrobest DNAポリメラーゼを用いて、上記逆転写反応液20μlをサンプルとしてトランスフェリンレセプターmRNA中の4.4kbを標的とするPCRを行った。PCRはPyrobest DNAポリメラーゼのマニュアルに従って、上記逆転写反応液20μl、トランスフェリンレセプター増幅用プライマー1(配列番号1)及びトランスフェリンレセプター増幅用プライマー2(配列番号2)を含む100μlの反応液を調製し、PCRサーマルサイクラー パーソナルにセットし、94℃、30秒〜65℃、30秒〜72℃、5分を1サイクルとした30サイクルのPCRを実施した。
PCR後、得られた反応液の8μlをアガロースL03(宝酒造社製)を使用した1%アガロースゲル電気泳動に供した。PCR産物の量は、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色した後、蛍光イメージアナライザーであるFMBIO II Multi−View(宝酒造社製)にて蛍光の強度を数値化して評価した。酵素1、逆転写反応時間3分の条件で得られたRT−PCR増幅産物の蛍光強度を1.00として全サンプルについての値を換算した結果を表1に示す。
BcaBEST DNAポリメラーゼ 22U、42U何れの場合も、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するPyrobest DNAポリメラーゼを添加する事により、cDNA合成効率が上昇した(表1、酵素3および4)。又、その効率の上昇はBcaBEST DNAボリメラーゼを42U使用した場合(表1、酵素4)、特に顕著であった。
これらのことから、逆転写反応時に3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する事でcDNA合成効率が上昇する事が示された。更に、逆転写活性を有する酵素を大量に用いる事で更に効率が高まる事が示された。
対照実験として、ベーリンガー社製のTitan RT−PCR Kitを使用したcDNA合成を行った。該キットは逆転写活性を有する酵素としてAMV−RTase、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としてピロコッカス・ウォエシイ(Pyrococcus woesii)由来のPwo DNAポリメラーゼを含んでいる。
該キットのマニュアルにしたがって50℃、30分のcDNA合成反応を行なった。次いでマニュアルに従って94℃、2分間の熱処理を行なった後、トランスフェリンレセプターmRNA中の4.4kbを標的とするPCRを該キットのマニュアルにしたがって、Taq DNAポリメラーゼ/Pwo DNAポリメラーゼを用いて行なった。94℃、30秒〜55℃、30秒〜68℃、4分を1サイクルとしたPCRを10サイクル行った後、94℃、30秒〜55℃、30秒〜68℃、4分5秒(11サイクル目)、94℃、30秒〜55℃、30秒〜68℃、4分10秒(12サイクル目)、94℃、30秒〜55℃、30秒〜68℃、4分15秒(13サイクル目)、のように、伸長ステップの時間を1サイクル毎に5秒ずつ長くしたPCRを25サイクル行なった。
RT−PCR産物は1%アガロースゲル電気泳動に供したが、逆転写反応を30分間行なっているにも関わらず、ターゲットである4.4kbの増幅産物は検出されなかった。
実施例3 BcaBEST DNAポリメラーゼとDeep Vent DNAポリメラーゼとの組合わせの効果
3’−5’エキンヌクレアーゼ活性を有する酵素として、ピロコッカス スピーシーズGB−D由来のDeep Vent DNAポリメラーゼ(ニューイングランド バイオラボ社製)を用いた場合の効果を検討した。
下記の酵素を使用し、実施例2と同様の実験を行った。
酵素1 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U/反応系
酵素2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U+Deep Vent DNAポリメラーゼ0.033U/反応系
酵素3 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U+Deep Vent DNAポリメラーゼ 0.067U/反応系
得られた結果を表2に示す。(酵素1、逆転写反応時間2分での結果を1.0とした。)
以上の結果より、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素としてPyrobest DNAポリメラーゼに代えてDeep Vent DNAポリメラーゼを用いた場合にも、cDNA合成効率が上昇することが示された。
実施例4 Bst DNA polymerase,Large fragmentとPyrobest DNAポリメラーゼの組合わせの効果
逆転写活性を有する酵素として、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたバチルス・ステアロサーモフィラス由来DNAポリメラーゼ(Bst DNA polymerase,Large fragment ニューイングランド バイオラボ社製)を用いた場合の効果を検討した。
下記の酵素を使用し、逆転写反応時間を10分とした以外は実施例2と同様に逆転写反応を行った。
酵素1 Bst DNA polymerase,Large fragment 8U/反応系
酵素2 Bst DNA polymerase,Large fragment 8U+pyrobest DNAポリメラーゼ 0.01U/反応系
酵素3 Bst DNA polymerase,Large fragment 8U+Pyrobest DNAポリメラーゼ 0.005U/反応系
酵素4 Bst DNA polymerase,Large fragment 8U+Pyrobest DNAポリメラーゼ 0.0033U/反応系
次に、トランスフェリンレセプターmRNA中の2.4kbを標的とするPCRを行った。プライマーとしてトランスフェリンレセプター増幅用プライマー2(配列番号2)及びトランスフェリンレセプター増幅用プライマー3(配列番号3)を用い、反応条件を94℃、30秒〜65℃、30秒〜72℃、3分の温度サイクルを30サイクルとした以外は、実施例2と同様に行った。得られた結果を表3に示す。(酵素1での結果を1.00とした。)
以上の結果より、逆転写活性をもつ酵素としてBcaBEST DNAポリメラーゼに代えてBst DNA polymerase,Large fragmentを用いた逆転写反応の場合にも、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加する事でcDNA合成効率が上昇することが示された。
実施例5 cDNA合成におけるフィデリティーに対する3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の効果
cDNA合成におけるフィデリティーに対する3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の効果を、逆転写活性を有する酵素としてBcaBEST DNAポリメラーゼ、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素としてPyrobest DNAポリメラーゼを用いて、J.Clineらの方法(J.Clineら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research)、第24巻、第3546〜3551頁、(1996))を改変した方法に基づいて検討した。
cDNA合成の鋳型RNAとしては、SP6 RNAポリメラーゼ(宝酒造社製)によって以下のように合成したlacIOZαRNAを使用した。
lacIOZαは大腸菌(E.coli)ラクトースオペロンの一部であり、リプレッサー領域(I)、オペレーター領域(O)、lacZα因子領域(Z)を含む。
大腸菌のゲノムDNAを鋳型としてlacIOZα−Fプライマー(配列番号4)、及びlacIOZα−Rプライマー(配列番号5)を用いたPCRを行い、lacIOZα領域の増幅断片を得た。得られた増幅断片(約1.9kb)をSP6プロモーターを持つプラスミドpSCREEN−TTM−l T−Vector(Novagen社製)にTAクローニングし、SP6プロモーターの下流にlacIOZα領域が結合したプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素Xho I(宝酒造社製)で消化して得られた直鎖状DNAを鋳型として用い、Competitive RNA Transcription Kit(宝酒造社製)を使用して、以下のようにSP6 RNAポリメラーゼを用いてSP6プロモーター領域からのRNA合成を行った。
Competitive RNA Transcription Kitのマニュアルに従って、直鎖状lacIOZα−pSCREEN−T DNA 200ngを含む反応液50μlを調製し、37℃で2時間反応させ、RNAを合成した。反応後、DNase I(宝酒造社製)を10U添加し、さらに37℃で1時間静置しDNAを分解させた。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により合成RNAを精製した。このようにして得られた1991ベースのlacIOZαRNA(SP6プロモーター、リプレッサー領域(I)、オペレーター領域(O)、lacZα因子領域(Z)を含む)を鋳型RNAとして用いて、以下の実験を行った。
BcaBEST RNA PCR Kitのマニュアルに従って、lacIOZαRNA 450ng、lacIOZα−Rプライマー 20pmol、及び下記に記載の酵素を含む反応液20μlを調製した。これらの反応液をPCRサーマルサイクラー パーソナル(宝酒造社製)にセットし、65℃で1分間、30℃で1分間保温した後、15分かけて温度を30℃から65℃まで上昇させ、その後65℃で15分間保温して逆転写反応を行い、最後に98℃、5分間の熱処理を行った。
酵素1 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U/反応系
酵素2 BcaBEST DNAポリメラーゼ 42U/反応系+Pyrobest DNAポリメラーゼ 0.033U/反応系
次にPyrobest DNAポリメラーゼを用いて、上記逆転写反応2.5μlをサンプルとして、lacIOZα領域1.9 kbを標的とするPCRを行った。PCRはPyrobest DNAポリメラーゼのマニュアルに従って、上記逆転写反応液2.5μl、lacIOZα−Fプライマー、lacIOZα−Rプライマーを含む反応液100μlを調製し、PCRサーマルサイクラー パーソナルにセットし、94℃、30秒〜68℃、2分を1サイクルとした28サイクルのPCRを実施した。
PCR後、得られた反応液をフェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿し、増幅産物を精製した。この増幅産物を制限酵素EcoR I(宝酒造社製)で処理した後、全量をアガロースゲル電気泳動し、泳動後、EcoR I処理断片のバンドを切り出し、EasyTrap(宝酒造社製)を用いてEcoR I処理断片を回収した。このEcoR I処理断片とλgt10 EcoR I Arms(宝酒造社製)をLigation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて連結させ、Gigapack Ill gold packaging extract(Stratagene社製)を用いてインビトロパッケージング(in vitro packaging)を行った。
得られた各パッケージング溶液を段階希釈した稀釈液100μlを、大腸菌(E.coli)DH5α株(lacZΔM15)培養液(OD600=1)100μlに添加し、37℃で15分間静置した。次のこの培養液全量をX−gal(1mg/ml)及びIPTG(1.5mM)を含む0.7%LBソフトアガー(soft agar)(IPTG(+))、又はX−galを含みIPTGを含まない0.7%LBソフトアガー(IPTG(−))に加え、混和後LBプレート上に重層した。このプレートを37℃で一晩培養し、出現したプラーク数を数えた。
lacIOZ領域のlac Iに変異がない場合、lac Iにコードされているlacレッサーの働きによりIPTG非存在下ではβガラクトシダーゼが発現せず、白いプラークを生じ、IPTG存在下で初めてβガラクトシダーゼが発現し、青いプラークを生じる。一方、lacIOZ領域のlac Iに変異が導入された場合、lac Iコードされているリプレッサーがその活性を失い、IPTG非存在下においてもβガラクトシダーゼが発現するため、ITPO(+)、IPTG(−)何れのプレートにおいても青いプラークを生じる。
従って、IPTG(−)プレートに生じる青プラークは変異が導入されたクローンであり、変異率(mf)は下記式に示すようにIPTG(−)プレートに生じた青プラーク数をIPTG(+)プレートに生じた青プラーク数で除することによって求めることができる。
結果を表4に示す・
逆転写反応をBcaBEST DNAポリメラーゼのみの存在下で行った場合の変異率(mf)が0.229であるのに対して、逆転写反応をBcaBEST DNAポリメラーゼ及びPyrobest DNAポリメラーゼの存在下で行った場合の変異率(mf)は0.133であり、Pyrobest DNAポリメラーゼが存在しない場合の約2倍のフィデリティーを示した。
このことから、逆転反応時に3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を存在させることでcDNAの合成効率のみならずフィデリティーも上昇することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明は、反応効率が良く、かつフィデリティーが高いcDNA合成を可能にする方法である。本方法は、関連する技術、例えばクローニング技術、PCR技術等と組合わせることが可能であり、このことによって従来よりも効率の良く、かつ正確なcDNAライブラリー作製、RT−PCR等が可能となり、mRNAの解析方法の向上をもたらす。
【配列表】
Claims (11)
- 好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼの存在下で逆転写反応を行うことを特徴とするcDNAの合成方法。
- 逆転写活性を有する酵素が、バチルス・カルドテナクス由来のDNAポリメラーゼ又はバチルス・ステアロサーモフィラス由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項1記載のcDNAの合成方法。
- 請求項1または2記載の方法で合成されたcDNAを鋳型として遺伝子増幅反応を実施することを特徴とするcDNAの増幅方法。
- 遺伝子増幅方法がPCRであることを特徴とする請求項3記載のcDNAの増幅方法。
- PCRのためのDNAポリメラーゼが3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼと同じであることを特徴とする請求項4記載のcDNAの増幅方法。
- cDNAを合成するためのキットであって、好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素とは異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼを含有することを特徴とするcDNA合成キット。
- 逆転写活性を有する酵素がバチルス・カルドテナクス由来のDNAポリメラーゼ又はバチルス・ステアロサーモフィラス由来のDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項6記載のcDNA合成キット。
- 請求項1または2記載の方法で合成されたcDNAを鋳型として遺伝子増幅反応を実施し、cDNAを増幅するために用いられるキットであって、好熱性バチルス属細菌由来の逆転写活性を有する酵素、及び、該酵素と異なる酵素であって3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼ、並びに遺伝子増幅反応のための試薬を含有することを特徴とするcDNA増幅キット。
- 遺伝子増幅反応がPCRであることを特徴とする請求項8記載のcDNA増幅キット。
- 遺伝子増幅反応のための試薬としてPCRのためのDNAポリメラーゼを含有することを特徴とする請求項9記載のcDNA増幅キット。
- PCRが3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼで行われ、該3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性古細菌由来のα型DNAポリメラーゼとPCRのためのDNAポリメラーゼとが同一であることを特徴とする請求項10記載のcDNA増幅キット。
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