CN1333827A - 合成cDNA的方法 - Google Patents

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Abstract

一种合成cDNA的方法,其特征在于,在存在一种具有逆转录活性的酶和不同于前面这个酶而具有3’－5’外切核酸酶活性的另一种酶的情况下进行逆转录反应。

Description

合成cDNA的方法
技术领域
本发明涉及一个合成cDNA的新方法和用于所述方法的试剂盒，它们对基因工程是非常有用。
背景技术
分析来自各种基因的mRNA分子对于阐明生物现象是非常重要的。来自逆转录病毒的一种RNA依赖性DNA聚合酶-所谓的逆转录酶的发现，已经使得利用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为现实。结果，分析mRNA分子的方法加快了它的进程。而且，现在利用逆转录酶分析mRNA分子的方法已经成为研究基因必不可少的实验方法。另外，这些已经应用于克隆技术和PCR技术的方法已经成为必不可少的技术，不仅应用于研究基因而且应用于各种各样的领域包括生物学、药学和农业。
然而，常规的逆转录方法存在许多问题，例如cDNA合成反应中断、无法合成长链cDNA、低保真度以及由于反应需要长时间而在反应的过程中损害RNA模板。
认为cDNA合成反应中断是由于作为模板的RNA形成二级结构所致。对于来自逆转录病毒的逆转录酶的最佳反应温度要低。在该温度下的反应中RNA形成复杂的二级结构。于是，cDNA合成反应在这种二级结构的位点中断。已经提出了一种利用耐热逆转录酶的方法来解决上面提到的问题。然而，这个方法的反应性并不是令人满意的。另外，尚不知道逆转录酶在逆转录反应中显现出校正活性，也不知道高保真性地合成cDNA的方法。
如上面所描述的，依照常规的方法难以高效、高保真度地合成cDNA。因此，需要一种更有效的合成cDNA的方法。
发明目的
考虑了上面所描述的现有技术作出本发明。本发明的主要目的是解决与现有技术相关的问题以及提供一种具有高反应效率和准确性的合成cDNA的方法。
发明概述
在下面概要说明了本发明。本发明的第一个方面涉及合成cDNA的方法，其特征在于，该方法包括在存在一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下进行逆转录反应。
本发明的第二个方面涉及扩增cDNA的方法，其特征在于该方法包括利用依照第一方面的方法合成的cDNA作为模板进行基因扩增反应。
本发明的第三个方面涉及用于合成cDNA的试剂盒，它包含一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶。
本发明的第四个方面涉及利用依照本方法第一方面合成的cDNA作为模板进行基因扩增反应来扩增cDNA的试剂盒，它包含一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶以及一种用于基因扩增反应的试剂。
本发明人已经发现，在cDNA合成反应中存在具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下，通过进行逆转录反应提高了cDNA合成的效率和保真度。因此，完成了本发明。发明详述
本发明的合成cDNA方法的一个主要特征是，在包含一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的逆转录反应系统中，利用RNA作为模板合成cDNA。
含有可以用于本发明方法的RNA的样品的实例包括但不限于来自生物的样品例如一个细胞、一个组织和血液以及可能包括有机体的样品例如食物、土壤和污水。样品可以是依照已知方法处理上面提到的样品而获得的含有核酸的制备物。可以用于本发明的制备物实例包括细胞破坏的产物，或是通过分离所述产物而获得的样品、所述样品中的总RNA、或是含有丰富的特殊RNA分子例如mRNA的样品。
能够应用于本发明方法的RNA包括但不限于样品中的RNA分子(例如总RNA、mRNA、tRNA和rRNA)以及特殊RNA分子(例如每一个都有共同碱基序列基元的RNA分子、利用RNA聚合酶获得的转录物和通过扣除方法浓缩的RNA分子)。任何能够制备用于逆转录反应的引物的RNA都可以应用。
在本发明中用于从模板RNA合成cDNA的引物并不是局限于特定的引物，只要它是其核苷酸序列互补于模板RNA的核苷酸序列并且可以在所用的反应条件下退火至模板RNA的寡核苷酸就可以。引物可以是寡核苷酸，例如Oligo(dT)或具有随机序列的寡核苷酸(随机引物)。
考虑到特异性退火，引物的长度优选为6个核苷酸或更多，更优选为10个核苷酸或更多。考虑到寡核苷酸的合成，引物的长度优选为100个核苷酸或更少，更优选为30个核苷酸或更少。例如，依照亚磷酰胺方法，利用Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪可以合成寡核苷酸。或者，包括磷酸三脂方法、H-膦酸脂方法和硫代膦酸脂方法在内的任何方法都可以用于合成寡核苷酸。寡核苷酸可以从生物样品中获得。例如，从用限制性内切核酸酶消化的天然样品制备的DNA中可以分离和制备寡核苷酸。考虑到从模板RNA合成cDNA，在逆转录反应混合物中引物的浓度优选为0.1μM或更大，更优选为0.5μM或更大。考虑到对反应的抑制作用，引物的浓度优选为10μM或更小，更优选为5μM或更小。
任何具有逆转录活性的酶都可以应用于本发明，只要它们具有利用RNA作为模板合成cDNA的活性。然而，在高温下具有逆转录活性的酶(即抗热逆转录酶)对于本发明的目的是优选的。可以应用的这类酶的实例包括来自栖热菌属(Thermus)细菌的DNA聚合酶(例如，TthDNA聚合酶)和来自芽孢杆菌属(Bacillus)嗜热菌的DNA聚合酶。在反应混合物中存在锰离子对于Tth DNA聚合酶逆转录活性的发挥是必不可少的。已知锰离子降低PCR中的保真度。因此，当使用Tth DNA聚合酶的逆转录反应混合物应用于PCR时，需要清除锰离子。来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶并不需要为了发挥它的逆转录活性而加入锰离子，以及在PCR中去除锰离子。关于这一点，来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶对于本发明是优选的。来自坚热芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的DNA聚合酶(在下文被称为Bca DNA聚合酶)和来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶(在下文被称为Bst DNA聚合酶)是优选的。这些酶对于所述反应来说并不需要锰离子。此外，当在高温条件下抑制模板RNA二级结构的形成时，它们可以应用于合成cDNA。
坚热芽孢杆菌是一种嗜热菌，它的最适生长温度大约是70℃。已知来自这种细菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依赖性DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA聚合酶活性(逆转录活性)、5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。
这种酶可以是从它的最初来源纯化而来的酶，或者是利用基因工程技术制造的重组蛋白。可以通过基因工程技术或其他方法对这种酶进行修饰，例如置换、缺失、添加或插入。这些修饰后的酶的实例包括BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)，这是一种缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，以及大片段的Bst DNA聚合酶(NeWEngland Biolabs)，这是一种缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的Bst DNA聚合酶。以上提到的这些缺乏它们的5’-3’外切核酸酶活性的酶可以特别优选用于本发明中。
具有逆转录活性的酶的使用量没有特别的限定。例如，该酶可以按常规逆转录反应的用量使用。为了使得cDNA合成反应更加有效地进行以及缩短反应时间，与常规方法用量相比，可以增加具有逆转录活性的酶的用量。例如，当利用BcaBESTDNA聚合酶以20μl的反应体积进行逆转录反应时，该酶在反应混合物中的量是0.5U或更多。考虑到cDNA合成反应的效率，优选为22U或更多，更优选为42U或更多。此中所描述的DNA聚合酶的活性是建立在对商品化酶的指标基础上的。在适合于DNA聚合酶的反应条件下，在30分钟内将10nmol总核苷酸掺入到酸不溶性沉淀中，的酶活性定义为1U。使用适合于每一种DNA聚合酶的模板DNA和反应温度。例如就BcaBESTDNA聚合酶而言，利用多聚脱氧(ATP-TTP)作为模板/引物，在60℃下在30分钟内将10nmol总核苷酸掺入到酸不溶性沉淀中的酶活性定义为1U。
本发明的合成cDNA的方法的特征在于，它包括在存在具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下，进行逆转录反应。在本发明中使用的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶并不是限制于特定酶，只要它具有这种活性。例如，可以利用具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。这些酶的实例包括α型DNA聚合酶，例如来自热球菌属(Pyrococcus)细菌的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)、Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)、KODDNA聚合酶(Toyobo)、Pwo DNA聚合酶(Boehringer)等)，和来自热球菌属(Thermococcus)细菌的DNA聚合酶(Vent DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)等)；以及pol I型DNA聚合酶，例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶(聚合酶I的Klenow片断等)和来自噬菌体的DNA聚合酶(T4 DNA聚合酶等)。优选地是利用显示出强烈的3’-5’外切核酸酶活性的α型DNA聚合酶。pol I型DNA聚合酶或α型DNA聚合酶是指依照氨基酸序列同源性分类的一系列酶。所述氨基酸序列的特性在Nucleic Acids Research，15：4045-4657(1991年)中有描述。
对于本发明的目的，要使用作用于与RNA杂交的DNA的3’末端的酶。另外，优选为在高温下显现出3’-5’外切核酸酶活性的酶。在这一方面，优选为来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶。以来自热球菌属(Pyrococcus)细菌的DNA聚合酶作为来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶的例子。
利用依照上面所描述的方法获得的cDNA作为模板进行核酸扩增反应，可以扩增cDNA。然而，它并不是要限制本发明，例如，聚合酶链式反应就用作核酸扩增反应。用于PCR的酶并不限制于特定的某一种酶。可以利用常规用于PCR的DNA聚合酶。依照上面所描述的方法获得的cDNA是由模板RNA高保真合成而来的。需要高保真性地进行PCR以便尽可能准确地从所述RNA复制所述序列。因此，例如来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶的具有高保真度的DNA聚合酶优选用于本发明的cDNA扩增。当具有3’-5’外切核酸酶活性的抗热DNA聚合酶(例如来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶)用于cDNA合成步骤时，在所述PCR步骤中也可以利用同样的酶。cDNA合成/扩增反应的保真度可以依照修正后的J.Cline等的方法(J.Cline等，Nucleic Acids Reasearch，24：3546-3551(1996年))来确定。
这种酶可以是从它的最初来源纯化而来的酶，或者是利用基因工程技术制造的重组蛋白。可以通过基因工程技术或其他方法对这种酶进行修饰，例如置换、缺失、添加或插入。具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶显现出校对活性，即使用RNA为模板，所述核对活性也可以有效的消除错误掺入到合成的cDNA中的碱基。因此，它可以用于高保真度地合成cDNA。考虑到cDNA合成的效率，20μl反应体积中的酶用量优选为1U或更少，更优选为0.5U或更少。考虑到校对活性，酶用量优选为0.01U或更多，更优选为0.02U或更多。
与传统的逆转录方法相比，通过利用本发明的方法，可以增加合成的cDNA的数量、可以合成更长的cDNA以及高保真度地合成cDNA。此外，与传统的方法相比，通过把本发明的方法与相关技术例如克隆技术和PCR技术结合起来，有可能制备cDNA文库或更有效地进行RT-PCR，因而允许更准确地分析由于低表达水平很难利用传统方法进行分析的mRNA。
本发明的合成cDNA的试剂盒是用于上面所描述的合成cDNA的方法的试剂盒。它是一种具有高保真度和高效性合成cDNA的试剂盒。包含具有逆转录活性的酶和前面所述的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的试剂盒可以作为这种试剂盒的实例。该试剂盒可以包括用于利用前面所述的酶进行cDNA合成反应的反应缓冲液、核苷酸和其他试剂。利用这样一种试剂盒可以有效地、高保真度地以及容易地合成cDNA。
本发明的扩增cDNA的试剂盒是用于上面所描述的扩增cDNA的方法的试剂盒。它是种个具有高保真度和高效性扩增cDNA的试剂盒。包含具有逆转录活性的酶和前面所述的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶以及用于进行基因扩增反应的试剂的试剂盒可以作为这种试剂盒的实例。当利用cDNA作为模板，把PCR用作基因扩增反应时，所述用于扩增反应的试剂包括抗热DNA聚合酶、反应缓冲液、核苷酸和其他试剂。利用这样一种试剂盒可以有效地、高保真度地以及容易地扩增cDNA。当具有3’-5’外切核酸酶活性的抗热DNA聚合酶(即来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶)用于cDNA合成步骤时，在所述PCR步骤中也可以利用同样的酶作为前面所述的扩增反应的DNA聚合酶。
实施例
下面的实施例进一步详细论述了本发明，但并不应该被认为限制了本发明的范围。
在下面的实施例中，各自酶的活性是依照酶所附的说明指示来表达。实施例1：制备RNA
除非另外说明，否则在下面的实施例中用到的RNA是利用TRIzol试剂(Life Technologies)并依照试剂所附的说明从培养的人U-937细胞(ATCC CRL-1593)中制备的。然后把浓度调节到0.66μg/μl。RNA的纯度为OD260/OD280＝1.7。实施例2：BcaBEST DNA聚合酶和Pvrobest DNA聚合酶的联合作用
在cDNA合成中加入具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的作用，可以利用来源于坚热芽孢杆菌并缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶(BcaBEST DNA聚合酶，Takara Shuzo)作为逆转录酶和来源于热球菌(Pyrococcus sp.)的DNA聚合酶(Pyrobest DNA聚合酶，TakaraShuzo)作为3’-5’外切核酸酶来检测。
利用BcaBEST RNA PCR试剂盒(Ver.1.1)(Takara Shuzo)进行cDNA合成反应。依照试剂盒所附指南制备含有下面所述的酶和Oligo(dT)的20μl体积的反应混合物。将反应混合物放入PCR热循环仪PERSONAL(Takara Shuzo)中，在60℃进行逆转录反应1分钟、2分钟、3分钟或4分钟。预定时间的反应完成后，在98℃加热反应物5分钟。
酶1：BcaBEST DNA聚合酶22U/反应系统
酶2：BcaBEST DNA聚合酶42U/反应系统
酶3：BcaBEST DNA聚合酶22U＋Pyrobest DNA聚合酶0.017U/反应系统
酶4：BcaBEST DNA聚合酶42U＋Pyrobest DNA聚合酶0.033U/反应系统
利用Pyrobest DNA聚合酶和每种逆转录反应混合物20μl进行PCR，扩增转铁蛋白受体的mRNA中一个4.4kb的区域。PCR是依照Pyrobest DNA聚合酶指南如下进行的。制备体积为100μl、每种包含上面提到的逆转录反应混合物20μl、用于扩增转铁蛋白受体的引物1(SEQ ID NO：1)和用于扩增转铁蛋白受体的引物2(SEQ ID NO：2)的反应混合物。将反应混合物放入PCR热循环仪PERSONAL中，然后进行PCR(94℃30秒钟、65℃30秒钟和72℃5分钟，进行30个循环)。
PCR完成后，利用琼脂糖L03(Takara Shuzo)把每8μl的所得的反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。在电泳和溴化乙锭染色检测后，利用荧光成像分析仪FMBIO II Multi-View(Takara Shuzo)以数字显示从琼脂糖凝胶发射出的荧光强度，来估计PCR产物的量。转换的所有样品的结果列于表1，将用酶1和逆转录反应时间3分钟的组合获得的RT-PCR扩增产物的荧光强度定义为1.00。表1
 反应时间  1分钟  2分钟  3分钟  4分钟
  酶1    n.d.   n.d.   1.00   1.27
  酶2    n.d.   1.03   2.05   2.05
  酶3    n.d.   n.d.   1.02   1.53
  酶4    n.d.   2.31   2.88   3.19
n.d.：检测不到
当利用22U或42U的BcaBEST DNA聚合酶时，通过加入具有3’-5’外切核酸酶活性的Pyrobest DNA聚合酶(表1中的酶3或酶4)提高了cDNA合成的效率。当利用42U的BcaBEST DNA聚合酶(表1中的酶4)时，这种效率的提高是特别的明显。
这些结果表明，在逆转录反应过程中加入具有3’-5’外切核酸酶活性的酶提高cDNA合成的效率，而且利用大用量的具有逆转录活性的酶可以进一步提高效率。
利用Boehringer的Titan RT-PCR试剂盒合成cDNA，作为对照实验。这种试剂盒包括AMV-RTase作为具有逆转录活性的酶和来自沃氏热球菌(Pyrococcus woesii)的Pwo DNA聚合酶作为具有3’-5’外切核酸酶活性的酶。
依照试剂盒所附指南在50℃进行cDNA合成反应30分钟。依照指南在94℃加热2分钟后，利用Taq DNA聚合酶/Pwo DNA聚合酶并依照试剂盒所附指南如下进行扩增转铁蛋白受体的mRNA中一个4.4kb区域的PCR：94℃进行30秒、55℃进行30秒和68℃进行4分钟，共10个循环；94℃进行30秒、55℃进行30秒和68℃进行4分钟5秒(第11个循环)；94℃进行30秒、55℃进行30秒和68℃进行4分钟10秒(第12个循环)；94℃进行30秒、55℃进行30秒和68℃进行4分钟15秒(第13个循环)；直到第25个循环，每个循环延长延伸步骤的时间5秒钟。
RT-PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。虽然逆转录反应进行了30分钟，但并没有检测到感兴趣的4.4kb扩增产物。实施例3：BcaBEST DNA聚合酶和Deep Vent DNA聚合酶的联合作用
检测利用来自热球菌(Pyrococcus sp.)GB-D的Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)作为具有3’-5’外切核酸酶活性酶的作用。
利用下面的酶按照实施例2中所描述的进行实验。
酶1：BcaBESTDNA聚合酶42U/反应系统
酶2：BcaBEST DNA聚合酶42U＋Deep Vent DNA聚合酶0.033U/反应系统
酶3：BcaBEST DNA聚合酶42U＋Deep Vent DNA聚合酶0.067U/反应系统
结果示于表2(将酶1和逆转录反应时间2分钟的组合获得的结果定义为1.00)表2
反应时间    1分钟   2分钟   3分钟   4分钟
   酶1    n.d.    1.0    2.4    2.4
   酶2    n.d.    1.5    4.7    7.6
   酶3    n.d.    2.3    5.0    8.9
n.d.：检测不到
这些结果表明，用Deep Vent DNA聚合酶代替Pyrobest DNA聚合酶作为具有3’-5’外切核酸酶活性的酶可以提高cDNA合成的效率。实施例4：Bst DNA聚合酶大片段和Pyrobest DNA聚合酶的联合作用
检测源于嗜热脂肪芽孢杆菌并缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶，大片段，New England Biolabs)用作具有逆转录活性酶的作用。
除了逆转录反应进行10分钟外，利用下面的酶按照实施例2中所描述的进行逆转录反应。
酶1：Bst DNA聚合酶大片段8U/反应系统
酶2：Bst DNA聚合酶大片段8U＋Pyrobest DNA聚合酶0.01U/反应系统
酶3：Bst DNA聚合酶大片段8U＋Pyrobest DNA聚合酶0.005U/反应系统
酶4：Bst DNA聚合酶大片段8U＋Pyrobest DNA聚合酶0.0033U/反应系统
进行扩增转铁蛋白受体的mRNA中一个2.4kb区域的PCR。除了在下面的反应条件下：94℃进行30秒、65℃进行30秒和72℃进行3分钟，共30个循环，利用扩增转铁蛋白受体的引物2(SEQ ID NO：2)和用于扩增转铁蛋白受体的引物3(SEQ ID NO：3)作为引物外，按照实施例2中所描述的进行PCR。结果示于表3(定义从酶1中获得的结果为1.00)表3
酶1   1.00
酶2   1.61
酶3   1.67
酶4   1.92
这些结果表明，当用Bst DNA聚合酶大片段代替BcaBEST DNA聚合酶作为具有逆转录活性的酶用于逆转录反应时，通过加入具有3’-5’外切核酸酶活性的酶可以提高cDNA合成的效率。实施例5：在cDNA合成中3’-5’外切核酸酶活性对保真度的作用
依照修改后的J.Cline等的方法(J.Cline等，Nucleic AcidsReasearch，24：3546-3551(1996年))，利用BcaBEST DNA聚合酶作为具有逆转录活性的酶和利用Pyrobest DNA聚合酶作为具有3’-5’外切核酸酶活性的酶，来检测在cDNA合成中3’-5’外切核酸酶活性对保真度的作用。
利用下面的SP6 RNA聚合酶(Takara Shuzo)合成的lacIOZα RNA被用作cDNA合成的模板RNA。
lacIOZα是大肠杆菌乳糖操纵子的一部分，它包括阻抑物区(I)、操纵基因区(O)和lacZα因子区(Z)。利用大肠杆菌基因组DNA作为模板以及lacIOZα-F引物(SEQ IDNO：4)和lacIOZα-R引物(SEQID NO：5)，通过PCR获得LacIOZα区的扩增片断。将获得的扩增片断(大约1.9kb)克隆到pSCREEN-TTM-1 T载体(Novagene)中，这个载体是一种具有SP6启动子的质粒，这样通过TA克隆就得到了一个lacIOZα区连接于SP6启动子下游的质粒。利用限制性酶Xho I(Takara Shuzo)消化质粒获得的线性DNA作为模板、利用竞争性RNA转录试剂盒(Takara Shuzo)和SP6 RNA聚合酶，如下从SP6启动子区合成RNA。
依照竞争性RNA转录试剂盒所附的指南，制备在50μl体积中含有200ng线性lacIOZα-pSCREEN-T DNA的反应混合物。反应混合物在37℃温育2小时以合成RNA。反应后，加入10U DNA酶I(TakaraShuzo)。混合物在37℃放置1小时以降解DNA。然后用酚/氯仿处理混合物，随后用乙醇沉淀法纯化所合成的RNA。把这样获得的1991个碱基的lacIOZα RNA用作模板进行下列的实验，这种RNA包含SP6启动子、阻抑物区(I)、操纵基因区(O)和lacZα因子区(Z)。
依照BcaBEST RNA PCR试剂盒所附指南制备反应混合物，每种反应混合物含有450ng的lacIOZα RNA、20pmol的lacIOZα-R引物和下面所述的酶，体积为20μl。将反应混合物放入PCR热循环仪PERSONAL(Takara Shuzo)中，在65℃温育1分钟。然后在30℃温育1分钟。在15分钟内将温度从30℃升至65℃。然后混合物在65℃温育15分钟进行逆转录反应，最后在98℃加热5分钟。
酶1：BcaBESTDNA聚合酶42U/反应系统
酶2：BcaBEST DNA聚合酶42U＋Pyrobest DNA聚合酶0.033U/反应系统
利用Pyrobest DNA聚合酶和每种逆转录反应混合物2.5μl进行PCR来扩增LacIOZα的1.9kb区。PCR是依照Pyrobest DNA聚合酶指南如下进行的。制备反应混合物，每种反应混合物包含上面提到的逆转录反应混合物之一2.5μl、lacIOZα-F引物和lacIOZα-R引物，体积为100μl将反应混合物放入PCR热循环仪PERSONAL中进行PCR(94℃下进行30秒钟、68℃下进行2分钟，共28个循环)。
PCR后，获得的反应混合物用酚/氯仿处理混合物，随后用乙醇沉淀，纯化扩增产物。扩增产物用限制性酶EcoR I(Takara Shuzo)处理后，将整个混合物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，把EcoR I处理的片断的条带切割下来，用EasyTrap(Takara Shuzo)回收EcoR I处理的片断。每一个这样获得EcoR I处理片断利用连接试剂盒ver.2(TakaraShuzo)与λgtl0 EcoR I臂(Takara Shuzo)连接起来。然后，每一连接混合物用Gigapack III金包装提取液(Stratagene)在外进行包装。
这样获得的包装混合物的连续稀释液每种100μl加入到100μl大肠杆菌DH5α(lacZAM15)的培养液(OD600＝1)中。混合物在37℃放置15分钟。将整个混合物加入到含有X-gal(1mg/ml)和IPTG(1.5mM)的0.7％LB软琼脂(IPTG(+))中，或者加入到含X-gal而不含IPTG的0.7％LB软琼脂(IPTG(-))中，将其混合，然后铺到LB平板上。平板在37℃培养过夜。计数形成的噬菌斑数。
如果在lacIOZ区的lacI中没有发生突变，则在缺乏IPTG时由于lacI编码的阻抑物的作用，β-半乳糖苷酶不表达，这样就会形成白色噬菌斑。在IPTG存在时，B-半乳糖苷酶表达，产生蓝色噬菌斑。另一方面，如果在lacIOZ区的lacI中引入突变，即使缺乏IPTG由于lacI编码的阻抑物的失活，β-半乳糖苷酶也会表达。结果，在IPTG(+)和IPTG(-)平板上形成蓝色噬菌斑。
   IPTG(+)     IPTG(-)
    无突变     蓝色     白色
    有突变     蓝色     蓝色
因此，在IPTG(-)平板上形成的蓝色噬菌斑表明它是突变克隆。如下面公式所示，通过用在IPTG(-)平板上形成的蓝色噬菌斑数除以在IPTG(+)平板上形成的蓝色噬菌斑数，确定突变率(mf)。
Figure A9981583900181
mf：突变率
结果示于表4。
表4
在IPTG(-)平板上形成的蓝色噬菌斑数 在IPTG(+)平板上形成的蓝色噬菌斑数  突变率(mf)
酶1         24       105     0.229
酶2         27       203     0.133
当只存在BcaBEST DNA聚合酶的情况下进行逆转录反应时，突变率(mf)是0.229。另一方面，当在存在BcaBEST DNA聚合酶和Pyobest DNA聚合酶的情况下进行逆转录反应时，突变率(mf)是0.133，这表明存在Pyobest DNA聚合酶时观察到的保真度要比缺乏Pyobest DNA聚合酶时的保真度高出大约2倍。
这些结果论证了在逆转录反应中存在具有3’-5’外切核酸酶活性的酶，不仅可以提高cDNA合成的效率，而且可以增加保真度。
工业应用性
本发明是一种可以用于合成cDNA的方法，它可以使合成具有反应高效性和高保真度。通过将本方法与相关技术例如克隆技术和PCR技术结合，与传统方法相比有可能更有效、更准确地来制备cDNA文库或进行RT-PCR，导致mRNA分析方法的改进。
序列表的独立文本
SEQ ID NO：1：设计的命名为引物1的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。
SEQ ID NO：2：设计的命名为引物2的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。
SEQ ID NO：3：设计的命名为引物3的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。
SEQ ID NO：4：设计的命名为lacIOZα-F的寡核苷酸引物，用于扩增大肠杆菌的lacIOZα区。
SEQ ID NO：5：设计的命名为lacIOZα-R的寡核苷酸引物，用于扩增大肠杆菌的lacIOZα区。
               序列表<110>Takaa Shuzo Co.Ltd.<120>cDNA合成的方法<130>661613<150>JP 10-337993<151>1998-11-27<160>5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的命名为引物1的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。<400>1caagctagat cagcattctc                                          20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的命名为引物2的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。<400>2gagactgtga gtagtgacac                                          20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的命名为引物3的寡核苷酸引物，用于扩增转铁蛋白受体mRNA。<400>3ccatcccatc atcttggtac                                          20<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的命名为lacIOZα-F的寡核苷酸引物，用于扩增大肠杆菌lacIOZα区。<400>4catagcgaat tcgcaaaacc tttcgcggta tgg                               33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的命名为lacIOZα-R的寡核苷酸引物，用于扩增大肠杆菌lacIOZα区。<400>5actacggaat tccacggaaa atgccgctca tcc                               33

Claims (21)

1.一种合成cDNA的方法，其特征在于，该方法包括在存在一种具有逆转录活性的酶和另一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下进行逆转录反应。
2.依照权利要求1的方法，其中具有逆转录活性的所述酶是抗热逆转录酶。
3.依照权利要求2的方法，其中具有逆转录活性的所述酶是来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶。
4.依照权利要求3的方法，其中具有逆转录活性的所述酶是来自来自坚热芽孢杆菌的DNA聚合酶或来自嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶。
5.依照权利要求1至4中任何一项的方法，其中具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶是DNA聚合酶。
6.依照权利要求5的方法，其中具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶是来自嗜热古细菌的α型DNA聚合酶。
7.一种扩增cDNA的方法，其特征在于，该方法包括利用依照权利要求1至6中任何一项所定义的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增反应。
8.依照权利要求7的方法，其中所述基因扩增反应是PCR。
9.依照权利要求8的方法，其中用于所述PCR的DNA聚合酶是与具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶相同的酶。
10.依照权利要求9的方法，其中用于所述PCR的所述DNA聚合酶是来自古细菌的α型DNA聚合酶。
11.一种用于cDNA合成的试剂盒，它含有一种具有逆转录活性的酶和另一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶。
12.依照权利要求11的试剂盒，其中具有逆转录活性的所述酶是抗热逆转录酶。
13.依照权利要求12的试剂盒，其中具有逆转录活性的所述酶是来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶。
14.依照权利要求13的试剂盒，其中具有逆转录活性的所述酶是来自坚热芽孢杆菌的DNA聚合酶或来自嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶。
15.依照权利要求11至14中任何一项的试剂盒，其中具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶是DNA聚合酶。
16.依照权利要求15的试剂盒，其中具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶是来自古细菌的α型DNA聚合酶。
17.利用依照权利要求1至6中任何一项所定义的方法合成的cDNA作为模板进行基因扩增反应来扩增cDNA的试剂盒，它含有一种具有逆转录活性的酶和另一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶以及一种用于所述基因扩增反应的试剂。
18.依照权利要求17的试剂盒，其中所述基因扩增反应是PCR。
19.依照权利要求18的试剂盒，它含有作为所述基因扩增反应的所述试剂用于所述PCR的DNA聚合酶。
20.依照权利要求19的试剂盒，其中所述PCR是利用一种具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶来进行的，并且具有3’-5’外切核酸酶活性的所述酶是与用于所述PCR的所述DNA聚合酶相同的酶。
21.依照权利要求20的试剂盒，其中具有3’-5’外切核酸酶活性的所述DNA聚合酶是来自古细菌的α型DNA聚合酶。
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