KR101232878B1 - 깍지벌레류의 미토콘드리아 ｃｏｉ 유전자 ｄｎａ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머, 이를 포함하는 프라이머 세트 및 이를 이용하여 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 PCR 증폭하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 및 방법에 의하면 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩에 필요한 5′말단의 염기서열 부위를 매우 높은 성공률로 PCR 증폭하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 전방향 프라이머는 종래의 전방향 프라이머에 비해 매우 높은 PCR 성공률을 갖는다.

Description

깍지벌레류의 미토콘드리아 ＣＯＩ 유전자 ＤＮＡ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머{PCR Primer For Amplifying 5′End Region of Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit I Gene Used For DNA Barcoding of Scale Insect}

본 발명은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머, 이를 포함하는 프라이머 세트 및 이를 이용하여 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 PCR 증폭하는 방법에 관한 것이다.

DNA 바코딩(barcoding)이란 생물종을 신속하고 정확하게 판별하기 위하여 형태학적 분석을 보완하는 표준화된 방법으로서 생물종의 특정의 짧은 DNA 염기서열을 이용하는 것을 말한다. DNA 바코딩이란 용어가 공식적으로 사용된 것은 2003년 캐나다 구엘프대학의 P. Hebert가 영국왕립학회지에 발표한 논문 "Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc. R. Soc. B 270: 596-599." 에서 기원을 찾을 수 있으며 모든 진핵생물의 세포에 존재하는 미토콘드리아 DNA의 특정 염기서열, 사이토크롬 옥시다아제 서브유닛 I (COI, cytochrome oxidase subunit I)의 657 bp를 대상으로 하고 있다. 이 방법에 따라 모든 생물종에 대한 바코딩 데이타가 축적되어진다면 기존의 복잡한 분류학적 기술을 뛰어넘어 단순한 PCR과 염기서열분석만으로 생물종을 구분할 수 있게 될 것으로 예상하고 있다. 실례로 무척추동물의 알이나 유충, 지렁이나 선충 등 특정 형태적 특성에 의한 구분이 어려운 생물의 경우 종에 대한 분류, 동정이 거의 불가능한 경우가 많다. 그러나 진핵생물에 공통적으로 존재하는 미토콘드리아의 유전자를 대상으로 하는 DNA 바코딩의 방법은 생물의 발생단계에 영향을 받지 않을 뿐만 아니라 표본과 같은 오래된 조직이나 가공, 변형된 조직에서도 DNA를 추출할 수 있고 염기서열분석이 가능하다는 점에서 기존의 형태분류의 한계를 넘어선 새로운 동정수단으로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 생태학적 연구, 해충의 발생과 방제에 대한 기초자료 제공, 위해 해충의 검역수단, 환경모니터링, 변형 가공된 식품의 이력추적 등 다양한 분야에서 응용 가능한 높은 잠재력을 가지고 있다.

DNA 바코딩에서 가장 중요한 기술 중에 하나는 DNA 바코딩 영역을 PCR 증폭하기 위한 생물종에 공통으로 작용하는 PCR 프라이머(primer)를 디자인 하는 것이다. 실제, 생물군에 따라 다양한 서열을 가진 프라이머가 개발되어 있으며(1), 나비목의 경우 98％의 종 구분이 가능함을 보여주었다(2). 그러나 어떤 생물군의 경우 기존에 개발된 PCR 프라이머에 의해 DNA 바코드 영역의 증폭이 되지 않거나 PCR 성공 확률이 매우 낮은 경우가 존재한다. 그 예로서 노린재목 진딧물아목의 곤충인 깍지벌레의 경우 곤충의 COI DNA 바코딩에 널리 사용되는 LepF1/LepR1 프라이머나 LCO1490/HCO2198 프라이머(3)를 사용하였을 때 PCR 성공률이 20％ 미만으로서 효율적인 바코딩을 수행하는데 어려움이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 깍지벌레(scale insects)류의 DNA 바코딩(barcoding)을 위한 COI (cytochrome oxidase subunit I) 유전자 5′말단 영역의 PCR증폭에 사용되는 PCR용 전방향 프라이머를 새롭게 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 종래 사용되던 프라이머에 비해 COI DNA 바코딩 영역의 PCR 증폭 성공률이 현저하게 높은 전방향 프라이머를 성공적으로 설계하고 이의 성능을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제2서열 또는 제3서열을 갖는 깍지벌레(scale insect)류의 COI (cytochrome oxidase subunit I) DNA 바코딩(barcoding) 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "DNA 바코딩(DNA barcoding)"은 유기생물체의 DNA에서 매우 짧은 영역의 유전적 마커를 분석하여 상기 유기생물체가 어느 특정 종(species)에 속하는 가를 확인하는 분류학적 기술을 의미한다.

DNA 바코딩을 위한 바람직한 DNA 영역은 염기서열의 데이터베이스화가 가능하도록 표준화되어야 하고, 관심의 생물군의 대부분에서 흔히 존재하여야 하며, 종-특이적(species specific) PCR 프라이머가 없이도 염기서열분석이 가능하여야 하고, 현재 기술로도 쉽게 염기서열분석이 가능할 정도로 짧은 영역이어야 하며, 종(species)간에는 변이(variation)가 커야하나, 종 내부에서는 변이가 비교적 작아야 한다(4-6).

현재, DNA 바코딩을 위한 영역으로서는 동물을 비롯한 많은 진핵세포 생물에서 미토콘드리아 COI (cytochrome oxidase subunit I) 유전자가 제시되어 있으며, 식물에서는 rbcL 및 matK 엽록체 유전자의 연속이 제안되어 있다.

본 발명의 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머를 사용하면 깍지벌레류의 미토콘드리아 COI 유전자의 5′-영역의 649 bp를 매우 높은 효율로 증폭할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 전방향 프라이머는 28 종의 깍지벌레류 시료를 사용한 실험에서 90％ 이상의 PCR 증폭 성공률을 보인다. 이는 종래의 깍지벌레류 COI DNA 바코딩 증폭용 전방향 프라이머(예컨대, LepF1 또는 LCO1490)의 20％ 정도의 PCR 증폭 성공률에 비해 매우 높은 수준이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 전방향 프라이머와, 서열목록 제4서열 또는 제5서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역 증폭용 중합효소연쇄반응 전방향 프라이머는 종래에 사용되는 서열목록 제4서열 또는 제5서열의 역방향 프라이머와 쌍을 이루어 중합효소연쇄반응에 사용된다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 전방향 프라이머 또는 상기 프라이머 세트를 포함하는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 (a) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (b) DNA 중합효소; 및 (c) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.

본 발명의 검출 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformimimThermis flavusimThermococcus literalis 또는 Pyrococcus fuaqosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하는 방법을 제공한다: (a) 깍지벌레 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 전방향 프라이머와, 서열목록 제4서열 또는 제5서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계.

이하에서 본 발명의 방법을 각 단계로 나누어 상세히 설명한다.

단계 (a): 깍지벌레 시료로부터 지놈 DNA ( genomic DNA )를 추출하는 단계

DNA 바코딩 분석을 하고자 하는 깍지벌레 시료를 채집하고, DNA 추출전까지 에탄올에 보관한다. 에탄올에 보관된 깍지벌레 시료로부터 지놈 DNA (genomic DNA)를 추출한다. 지놈 DNA의 추출 또는 분리 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 프로테이나아제 케이(Proteinase K) 처리에 의한 조직의 분해 및 DNA 정제 키트 (DNeasy Blood & Tissue kit, Qiagen)를 사용하여 깍지벌레로부터 지놈 DNA를 분리 정제할 수 있다.

단계 (b): 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA 를 주형으로 하고, 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 전방향 프라이머와 서열목 록 제4서열 또는 제5서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행하는 단계

본 명세서에서 사용되는 용어 "중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)"은 핵산 중합효소의 연쇄적 반응에 의해 핵산 분자의 증폭, 특히 특정 DNA 부위를 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

중합효소연쇄반응은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산의 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'-말단 서열 및 3'-말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미 효소)하프라이머의 적합한 길이는 시점으로인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에프라라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 것으로서, 미토콘드리아내의 COI (cytochrome oxidase subunint I) 유전자의 특정 5′말단 영역을 증폭하기 위해 설계된 프라이머 세트이다.

본 발명에서 중합효소연쇄반응에서 상기 단계 (a)에서 추출한 지놈 DNA가 반응의 주형 DNA로서 사용된다.

다양한 DNA 중합효소가 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 발명에서 중합효소연쇄 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

중합효소연쇄 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 중합효소연쇄 반응에 의한 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응은 (i) 94℃에서 4분의 1사이클; (ⅱ) 94℃에서 30초, 45℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 5사이클; (ⅲ) 94℃에서 30초, 51℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 35사이클; 및 (ⅵ) 72℃에서 5분의 1사이클로 구성되는 열 사이클에 의해 수행된다.

단계 (c): 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계.

본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 이용하여 증폭된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열의 산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 DNA 산물을 분석한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 깍지벌레류의 미토콘드리아 COI 유전자 5′말단 영역의 649 bp의 염기서열을 분석함으로써, 시료 깍지벌레류의 종(species)을 분류할 수 있다.

본 발명은 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 전방향 프라이머, 이를 포함하는 프라이머 세트 및 이를 이용하여 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 PCR 증폭하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 및 PCR 방법에 의하면 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩에 필요한 5′말단의 염기서열 부위를 매우 높은 성공률로 PCR 증폭할 수 있다. 또한, 본 발명의 전방향 프라이머는 종래의 전방향 프라이머에 비해 매우 높은 PCR 성공률을 갖는다.

도 1은 7종의 깍지벌레 COI (cytochrome oxidase subunit I) DNA 바코딩을 위한 전방향 프라이머(forward primer)의 결합부위의 염기서열을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 깍지벌레 COI 바코딩 프라이머의 효율 검정한 실험결과를 보여준다. 본 발명에서 제작한 전방향 프라이머 PcoF1, PcoF2 또는 PcoF3와 종래 사용된 역방향 프라이머 LepR1의 프라이머세트를 사용하여 28종의 깍지벌레에 대해 COI 유전자를 증폭하였다. 본 발명의 전방향 프라이머를 사용한 PCR의 경우 약 90 ％ 이상의 성공률을 보인 반면, 종래의 전방향 프라이머, LepF1, C_tRWF 또는 LCO1490를 사용한 경우 20％ 미만의 PCR 증폭 성공률을 보인다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 깍지벌레 시료

본 발명에 사용된 깍지벌레 시료는 가루깍지벌레과 (Pseudococcidae) 깍지벌레과 (Diaspididae), 밀깍지벌레과 (Coccidae) 등에 속하는 곤충들로서 표 1에 나타나 있다. 사용된 시료는 2001 - 2009년 사이에 채집되었으며 수집한 성체 암컷은 사용 전까지 에탄올에 보관하였다. 시료의 형태학적 특징들은 이미 선행문헌에 의해 제공되어 있는 자료들을 토대로 확인하였다(7, 8).

2. PCR 프라이머의 설계

깍지벌레류의 COI DNA 바코딩을 위한 PCR용 전방향 프라이머는 본 연구자들이 수행한 사전 연구결과로부터 확보한 Pseudococcus comstocki, Crisicoccus matsumotoi, Planococcus kraunhiae, Phenacoccus aceris, Phenacoccus solani, Planococcus citri, Heliococcus kurilensis의 COI 유전자의 5′영역의 DNA 서열로부터 상동성 조사를 행하여 새로운 전방향 프라이머, PcoF1, PcoF3 및 PcoF5를 제작하였다(표 2 참조).

프라이머 명칭	프라이머 염기서열a
PcoF1 (서열목록 제 1 서열)	5'-CCTTCAACTAATCATAAAAATATYAG-3'
PcoF3 (서열목록 제 2 서열)	5'-CCTTCAACTAATCACAAAAATATYAG-3'
PcoF5 (서열목록 제 3 서열)	5'-CCTTCAACTAATCATAAAAACATYAG-3'

^a Y= T or C

3. 지놈 DNA 추출 및 COI 유전자 5′말단 영역의 증폭

각각의 깍지벌레로부터 총 지놈 DNA (total genomic DNA)를 DNeasy Tissue kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 제조자 제공의 프로토콜에 따라 추출하였다. 정제한 DNA를 100 μl의 증류수로 용출시키고, 미토콘드리아 COI 유전자의 5′말단 649 bp 부위를 증폭하였다.

간략하게 설명하면, 미토콘드리아 COI 유전자 5' 영역의 서열은 PcoF1 및 LepR1 [5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3'(서열목록 제 4 서열)]을 사용하여 증폭하였다. PCR은 2.5 mM MgCl₂, 2.5 pmol의 각각의 프라이머, 2.5 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 30-50 ng의 DNA 및 1 U의 Taq DNA 중합효소를 함유하는 20 μl 반응액을 마이크로 튜브내에서, 94℃에서 4분의 1사이클; 94℃에서 30초, 45℃에서 30초, 및 72℃에서 2분의 5사이클; 94℃에서 30초, 51℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 35사이클;및 72℃에서 5분의 열-사이클(thermo-cycle) 프로파일을 사용하여 수행하였다. 위의 PCR 조건은 PCR PreMix (MaximTMPCR PreMix(i-taq), iNtRON Biotechnlogy Co.) 형태로 제공되는 제품을 사용하여 수행할 수도 있다. 증폭된 단편 산물은 1.5％ 아가로스젤에서 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, EtBr)로 염색하여 시각화하였다.

실험결과

1. 깍지벌레류 COI DNA 바코딩을 위한 전방향 프라이머의 제작

DNA 바코딩을 위한, 곤충 미토콘드리아의 COI (cytochrome oxidase subunit I) 유전자에 대한 5′영역의 서열을 확보하기 위해 종래 사용되고 있는 전방향 프라이머 C_tRWF1와 역방향 프라이머 LepR1을 이용하여 깍지벌레류의 지놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭을 행한 결과, 7 종의 깍지벌레에 대해서만 증폭 반응이 일어남을 확인하였다. 이러한 PCR 증폭율은 약 20％ 정도의 성공율로서 PCR 증폭 효율성이 매우 낮은 것이었다(도 2).

본 발명자들은 높은 효율의 COI DNA 바코딩에 사용되는 PCR 산물을 얻기 위해 새로운 PCR 프라이머를 제작하였다. 즉, 깍지벌레로부터 얻은 COI DNA 바코딩용 PCR 프라이머 결합 부위의 염기서열의 상동성을 조사하여, 곤충 및 여러 무척추동물에서 전방향 프라이머로 널리 사용되는 LepF1 또는 LCO1490 프라이머의 서열과 비교하였다. 그 결과, 3′말단 영역에서 깍지벌레 서열들은 기존의 프라이머 서열과 비교하여 공통적으로 두 개의 G 염기가 A 염기로 치환된 것을 발견하였다(도 1 참조).

상기 차이점에 착안하여 새로운 전방향 프라이머 PcoF1을 제작하였다(상기 표 2 참조). 제작된 전방향 프라이머는 LepF1 프라이머와 일부 서열에서 상동성이 존재하지만, 3′말단으로부터 2번째, 8번째 염기가 G 염기에서 A 염기로 치환됨으로써 깍지벌레 COI 유전자 5′말단 영역에 대한 특이적 프라이머로서 높은 효율의 PCR 증폭을 가능케 할 수 있었다. 또한 프라이머 결합 영역의 서열 다양성에 기초하여 PcoF1과 높은 서열 상동성을 가지는 다른 2개의 프라이머 PcoF3과 PcoF5를 유사한 방식으로 추가로 제작하였다.

2. 깍지벌레류 COI DNA 바코딩을 위한 PCR 증폭

제작된 깍지벌레류 특이적 정방향 프라이머 PcoF1을 통상적인 곤충 COI DNA 바코딩의 역방향 프라이머인 LepR1 프라이머와 조합하여 PCR 반응을 수행하였을 때 조사된 28종의 깍지벌레류 대부분에 대해 약 650 bp 크기의 명확한 PCR 증폭산물을 생성하였다(도 2 참조). PcoF1 프라이머 대신 PcoF3 프라이머 또는 PcoF5 프라이머를 사용하였을 때에도 성공적인 PCR 증폭이 가능하며 이를 통하여 본 발명자들이 개발한 프라이머가 깍지벌레류의 미토콘드리아 COI 유전자의 5′영역의 DNA 바코딩을 위한 PCR 정방향 프라이머로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Assembling DNA barcodes. Analytical protocols. deWaard, J. R., N. V. Ivanova, M. Hajibabaei, and P. D. N. Hebert., 2008. Methods Mol Biol 410: 275-93

2. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Hajibabaei M, Janzen DH, Burns JM, Hallwachs W, Hebert PDN., Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103(4):968-971

3. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R., Mol Mar Biol Biotechnol 1994, 3(5):294-299

4. "A DNA barcode for land plants". PNAS 106 (31): 12794-12797

5. Kress WJ, Erickson DL (2008). "DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics". PNAS 105 (8): 2761-2762

6. Renaud Lahaye et al. (2008-02-26). "DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots". Proc Natl Acad Sci USA 105 (8): 2923-2928

7. Kwon, G. M., E. Danzig, and K. T. Park. 2003a. Taxonomic notes of the family Pseudococcidae (Sternorrhyncha) in Korea. II. Tribe Pseudococcini. Insecta Koreana 20: 393-424

8. Kwon, G. M., E. Danzig, and K. T. Park. 2003b. Taxonomic notes of the family Pseudococcidae (Sternorrhyncha) in Korea. I. Tribes Phenacoccini, Rhizoecini, and Sphaerococcini. Insecta Koreana 20: 103-124

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology National Plant Quarantine Service <120> PCR Primer For Amplifying 5' End Region of Mitochondrial Cytochrome Oxidase Subunit I Gene Used For DNA Barcoding of Scale Insect r <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 1 ccttcaacta atcataaaaa tatyag 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 ccttcaacta atcacaaaaa tatyag 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 3 ccttcaacta atcataaaaa catyag 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 taaacttctg gatgtccaaa aaatca 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (4)

1. 서열목록 제1서열을 갖는 깍지벌레(scale insect)류의 COI (cytochrome oxidase subunit I) DNA 바코딩(barcoding) 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 전방향 프라이머.
   
2. 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머와, 서열목록 제4서열 또는 제5서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 전방향 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응 키트.
   
4. 다음의 단계를 포함하는 깍지벌레류의 COI DNA 바코딩 영역을 증폭하는 방법:
   (a) 깍지벌레 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머와, 서열목록 제4서열 또는 제5서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계.
   

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