KR102304789B1 - 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법 - Google Patents

백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102304789B1
KR102304789B1 KR1020200181789A KR20200181789A KR102304789B1 KR 102304789 B1 KR102304789 B1 KR 102304789B1 KR 1020200181789 A KR1020200181789 A KR 1020200181789A KR 20200181789 A KR20200181789 A KR 20200181789A KR 102304789 B1 KR102304789 B1 KR 102304789B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nie
carpidae
seq
pcr
detecting
Prior art date
Application number
KR1020200181789A
Other languages
English (en)
Inventor
문정숙
박지형
김근식
윤주덕
박종성
강동원
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020200181789A priority Critical patent/KR102304789B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102304789B1 publication Critical patent/KR102304789B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 PCR 프라이머인 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머세트를 이용하여 백조어에 특이적인 표적 서열을 증폭함으로써 다른 담수어류와 백조어를 식별하는 방법에 관한 것이다. 또한 서열번호 3, 4 프라이머 세트 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응((Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 통해 환경수로부터 백조어를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법{PCR primer set for environmental DNA detection of Culter brevicauda and method using the same}
본 발명은 백조어 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백조어 특이적인 염기서열로 구성된 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머세트를 이용하여 백조어에 특이적인 표적 서열을 증폭함으로써 다른 담수어류와 백조어를 식별하는 방법에 관한 것이다.
또한 서열번호 3, 4 프라이머 세트 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 수행을 위한 백조어 검출용 프라이머-프로브 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 환경수로부터 백조어를 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 연구종인 백조어(Culter brevicauda)는 잉어목 Cypriniformes 잉어과 Cyprinidae 강준치아과 백조어속에 속하는 어류로 우리나라에서는 낙동강, 금강, 영산강에 분포하고 있다.
일반적으로 백조어는 강준치(Erythroculter erythropterus)와 형태적으로 매우 유사하지만, 복부 비늘 및 융기연의 유무, 측선 비늘수의 차이 등으로 구분할 수 있다. 큰 강 중·하류에 흐름이 거의 없는 곳에 주로 서식하며, 주 먹이원은 수서곤충, 갑각류, 소형어류 등으로 알려져 있다. 최근 경쟁종(강준치)의 인위적 이입, 하천 공사, 하굿둑 건설, 수질오염 등으로 인해 개체수 및 서식지가 급감하여 환경부에서는 2012년 멸종위기 야생생물 Ⅱ급으로 지정하여 법적 보호를 하고 있으며, 국가생물적색자료집(2020)에서는 준위협(Near Threatened, NT)종으로 지정되어 있다.
백조어는 과거 낙동강, 금강, 영산강 중·하류 및 댐호, 저수지 등에 비교적 넓게 분포하였으나, 현재는 일부 구간에만 서식하는 것으로 조사되어 서식범위가 매우 협소해진 상황이다. 특히 최근에는 남아 있는 개체군의 수도 크게 줄어들어 서식지를 알아내기에도 큰 어려움이 있다.
최근 물속의 환경 DNA (environmental DNA ; eDNA)를 분석해 어떤 종이 서식하고 있는지를 예측할 수 있는 기술이 개발되어 많은 연구자들이 이용하고 있다. 환경 DNA는 살아있는 생물에서 추출하는 DNA가 아닌 서식하는 주변 환경에서 수집된 유기물로서, 어류의 경우 대표적으로 점액, 분비물, 비늘 등으로부터 DNA를 확보하여 염기서열 분석을 통해 식별하는 방법을 의미한다.
따라서 환경수만을 샘플링하여 발견한 DNA 조각으로부터 특정유전자를 증폭하여 분석함으로써 하천 내 어떤 생물이 살고 있는지 알아낼 수 있는 방법이기 때문에, 직접 채집하지 않고도 목적하는 생물의 서식여부를 알아 낼 수 있어 채집자의 기술에 의존하지 않으며, 노동집약적인 방식에 비해 비용이나 신뢰성면에서 희귀종의 번식지나 서식지를 확인하는데 매우 효과적인 방식이다. 다만, 개체군의 크기가 매우 적거나 생체량이 작은 희귀종의 경우에는 민감도가 높은 분석법을 이용해야 한다.
환경유전자를 분석하는 방법은 메타바코딩(metabarcoding), 메타지놈(metagenome), 종 특이 마커(species-specific PCR)이 있다. 대부분 매우 소량이 발생하는 환경유전자의 특성상 메타바코딩과 종 특이 마커 PCR이 주로 이용되고 있다.
메타바코딩은 환경수 내에 살고 있는 다양한 종을 알아내는데 주로 이용하고 있으나, 분석비용이 비싸고 시간이 오래 걸리는 단점을 가지고 있다. 반면 종 특이 마커 PCR은 개발하는데 시간과 비용이 들지만 한번 개발해놓으면 민감도가 높고 불과 수 시간 안에 분석이 가능한 장점을 가지고 있다.
따라서 멸종위기종 개체군의 서식여부를 확인하고 검증하는데 있어서는 종 특이 마커 PCR이 유리한 측면이 많다. 이와 같은 방법을 이용할 시 백조어의 서식가능성이 있는 하천수를 대상으로 적용하면 백조어의 잠재적 서식지를 확인할 수 있으며, 높은 농도로 검출된다면 상대적 출현량을 도출할 수도 있다.
본 발명은 환경수에서 백조어 검출의 특이도와 민감도를 향상시키고자 백조어 검출용 특이 프라이머 세트와 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 수행을 위한 프로브를 고안하고, 이를 이용해 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 확립하였다.
한국등록특허 10-0806208호 한국등록특허 10-1232878호
본 발명은 상기 기술의 문제점을 해결하기 위해 도출한 것으로, 본 발명의 목적은 환경수에서 백조어의 유전자를 검출할 수 있는 특이성과 민감도가 우수한 특이 프라이머 세트와 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 프로브를 제공하는 것에 그 목적이 있다.
또한 염기서열 결정이나 전기영동을 해야하는 번거로움과 과정을 줄이며 특이성이 높고, 정량분석이 가능하도록 우수한 프라이머 세트와 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 프로브를 이용하여 백조어 특이 실시간 중합효소연쇄반응 수행 방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
게다가 본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 통해 단 시간 내에 정확하게 백조어 시료를 검출하는 검출용 키트를 제공함으로써 식별 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 백조어 검출용 프라이머 세트는 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어 검출용 프라이머-프로브 세트는 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어 검출용 키트는 전술한 프라이머-프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어를 검출하는 중합효소연쇄반응 방법은 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어를 검출하는 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 혼합물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어를 검출하는 방법은 환경수로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열의 프라이머 세트와 서열번호 5로 기재되는 염기서열의 프로브가 포함된 프라이머-프로프 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행한 후, 프로브에서 방출하는 형광을 감지하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어를 검출하는 방법은 PCR로 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭시킨 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 전기영동으로 확인하는 단계는 343~345 bp 밴드가 검출되면 백조어로 판정하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 백조어를 검출하는 방법은 상기 실시간 PCR을 수행할 때 최대 사이클 수 이하에서 CT(critical threshold)가 나타나는 것을 특징으로 한다.
한편, 전술한 프라이머와 프로브는 백조어 미토콘드리아 COB(cytochrome b) 유전자에 특이적이며, 프로브는 택맨(TaqMan) 프로브로써 5' 말단은 리포터인 형광표지 인자(FAM 등)로, 3' 말단은 억제자(quencher) 물질(TAMRA 등)로 이루어져 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머세트와 함께 이용하는 것이 바람직하다.
또한 프로브가 PCR 과정 중 어넬링(annealing) 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하며, 연장(extension) 단계에서 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 프로브만 분해되어 형광표지 인자가 프로브에서 유리되어 억제자에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명은 백조어 검출에 우수한 특이성과 민감도로 신속하게 검출할 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 통해 전기영동 단계를 생략할 수 있어 오염가능성이 줄어들며, 정량분석이 가능한 장점이 있다.
또한 백조어의 서식가능성이 있는 하천수를 대상으로 적용하면 백조어의 잠재적 서식지를 확인할 수 있으며, 높은 농도로 검출된다면 상대적 출현량을 도출할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 어류 조직시료 100개를 대상으로 미토콘드리아 cytochrome b (COB) 유전자의 PCR 증폭반응을 수행한 대표적 결과를 보여주는 전기영동사진이다.
도 2는 담수어류 미토콘드리아 COB 유전자의 DNA 염기서열정보를 해독하고 그 정보를 비교하기 위해 적성된 매트릭스의 이미지이다.
도 3은 백조어 게놈DNA 농도별 실시간 PCR 증폭반응의 검량선(r 2=1.000)을 보여준다.
도 4는 담수어류 40종들을 대상으로 한 백조어 특이적 실시간 중합효소연쇄반응용 분자마커의 특이성 검증 결과로, 백조어 positive control은 백조어 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드 1×103 copies/μl의 농도를 의미한다.
도 5는 국내 서식하는 27종 어류의 게놈 DNA 20 ng과 양성 시료로 백조어 게놈 DNA 20 ng을 대상으로 실시간 PCR 증폭반응을 수행한 백조어 종 특이 마커의 특이성 검증 결과이다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
이하 실시예 및 도면을 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 백조어 검출용 프라이머세트와 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머-프로브 세트에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머-프로브 세트의 염기서열은 백조어 종내에서 뉴클레오티드 간 차이가 없으며, 다른 종과는 차이점을 보이는 특정 변이를 포함하여 백조어 종의 미토콘드리아 COB 염기서열을 특이적으로 분석하는 분석능을 가진다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 통한 백조어 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머와 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 백조어 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 검출방법은 보다 상세하게는 분리된 시료로부터 DNA를 얻는 단계, 상기 DNA에 대해 미토콘드리아 COB 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하는 단계 및 프로브에서 방출하는 형광을 감지하는 단계를 포함하는 백조어 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 동정방법으로 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)은 특별하게 한정되지 않고, 공지인 여러 개량방법 중 하나일 수 있다. 일 예로, 프라이머 세트, DNA 주형 이외에 Tris-HCl, KC1, MgCl2, dNTP, 및 TaqDNA 폴리머라아제 등의 시약류를 혼합해서 RT-PCR 용액으로 한다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 백조어 검출용 키트는 PCR에 의한 동정방법에 활용이 가능하며, 구체적으로 이에 포함되는 시약은 dNTP, MgCl2, Taq polymerase, Tris-HC1, 글리세롤, DMSO, 포지티브 컨트롤용 DNA, 네거티브 컨트롤용 DNA, 증류수 등을 들 수 있다.
상기 시약은 키트에 각각 독립으로 포장되어 제공되거나, 2종 이상의 시약이 혼합된 형태로 제공될 수 있으며, 키트에 포함된 각각의 시약 농도에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하는데 대해서 가능한 범위일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는, 바람직한 RT-PCR 조건에 대한 정보만이 첨부되어도 좋고, 프라이머 세트만을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 잉어과 어류 유전시료 확보
1) 어류 4종 총 100개의 지느러미 시료를 확보하였다.
2) DNA 추출용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0; 125 mM NaCl; 10 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS; 8 M Urea) 600 μl와 Proteinase K 용액(20 mg/ml) 6 μl를 넣고 문헌과 동일한 과정으로 유전시료를 확보하였다.
3) Spectrophotometer를 이용하여 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 확인한 결과는 표 1에 제시된 바와 같다.
확보한 어류 40종 총 100개 조직시료 및 게놈 DNA 추출 결과
번호 학명 국명 분류군 게놈 DNA
농도
(ng/μl)		 A260/280
NIE-001 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 434.7 1.82
NIE-002 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 968.3 1.86
NIE-003 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과 313.9 1.86
NIE-004 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 316.5 1.84
NIE-005 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 275.1 1.77
NIE-006 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과 201.5 1.75
NIE-007 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과 558.2 1.82
NIE-008 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과 165.1 1.90
NIE-009 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 130.8 1.84
NIE-010 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 86.1 2.18
NIE-011 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 391.7 1.87
NIE-012 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 648.0 1.84
NIE-013 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 1191.4 1.86
NIE-014 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과 93.5 2.04
NIE-015 Phoxinus oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과 66.1 1.86
NIE-016 Phoxinus oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과 1204.0 1.87
NIE-017 Channa argus 가물치 농어목 가물치과 211.0 1.81
NIE-018 Channa argus 가물치 농어목 가물치과 3813.9 1.87
NIE-019 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과 433.9 1.87
NIE-020 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과 465.9 1.88
NIE-021 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과 2939.7 1.86
NIE-022 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과 443.9 1.81
NIE-023 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과 81.3 2.13
NIE-024 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과 95.3 2.11
NIE-025 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 78.4 2.05
NIE-026 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 709.7 1.86
NIE-027 Silurus asotus 메기 메기목 메기과 270.9 1.83
NIE-028 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 286.6 1.86
NIE-029 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 528.3 1.88
NIE-030 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과 123.2 1.88
NIE-031 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 604.5 1.89
NIE-032 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 540.0 1.89
NIE-033 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과 292.1 1.91
NIE-034 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 100.6 1.76
NIE-035 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 1338.9 1.90
NIE-036 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과 799.2 1.91
NIE-037 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 1204.8 2.00
NIE-038 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 469.5 1.97
NIE-039 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과 304.9 2.00
NIE-040 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 264.4 1.99
NIE-041 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 1987.2 2.04
NIE-042 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과 140.9 1.94
NIE-043 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과 183.7 1.96
NIE-044 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과 68.8 1.64
NIE-045 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 240.2 1.97
NIE-046 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 498.7 2.03
NIE-047 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과 66.4 1.96
NIE-048 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 570.8 1.90
NIE-049 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 67.0 1.94
NIE-050 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과 468.1 1.94
NIE-051 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1958.8 2.00
NIE-052 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1851.6 2.07
NIE-053 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과 799.0 1.95
NIE-054 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과 338.0 1.99
NIE-055 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 1319.5 1.88
NIE-056 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 317.4 1.96
NIE-057 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과 88.5 1.72
NIE-058 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과 774.6 1.86
NIE-059 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 178.1 1.85
NIE-060 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 711.2 1.97
NIE-061 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과 195.0 1.88
NIE-062 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 522.4 1.98
NIE-063 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 224.4 1.97
NIE-064 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 140.3 1.77
NIE-065 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과 154.9 1.88
NIE-066 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과 737.4 1.98
NIE-067 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 646.0 1.96
NIE-068 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 574.5 2.02
NIE-069 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과 531.6 1.98
NIE-070 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 266.7 1.95
NIE-071 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 448.9 1.96
NIE-072 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과 1426.7 2.06
NIE-073 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과 1956.7 2.00
NIE-074 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과 501.3 1.95
NIE-075 Culter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 1239.7 1.97
NIE-076 Culter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 378.5 1.95
NIE-077 Acheilognathus yamatsutae 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 471.7 1.95
NIE-078 Acheilognathus yamatsutae 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과 744.2 2.04
NIE-079 Tachysurus nitidus 밀자개 메기목 동자개과 3009.9 1.96
NIE-080 Tachysurus nitidus 밀자개 메기목 동자개과 1787.6 1.89
NIE-081 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과 504.9 2.00
NIE-082 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과 295.3 1.95
NIE-083 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과 260.7 1.88
NIE-084 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과 384.9 2.01
NIE-085 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과 623.2 1.98
NIE-086 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과 492.3 1.98
NIE-087 Sarcocheilichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 57.7 2.03
NIE-088 Sarcocheilichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과 106.6 2.06
NIE-089 Acheilognathus rhombeus 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과 53.9 2.04
NIE-090 Acheilognathus rhombeus 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과 88.9 2.19
NIE-091 Nipponocypris koreanus 참갈겨니 잉어목 잉어과 피라미아과 1435.0 2.00
NIE-092 Nipponocypris koreanus 참갈겨니 잉어목 잉어과 피라미아과 696.6 1.97
NIE-093 Opsarichthys uncirostris amurensis 끄리 잉어목 잉어과 피라미아과 451.6 1.90
NIE-094 Opsarichthys uncirostris amurensis 끄리 잉어목 잉어과 피라미아과 71.6 2.09
NIE-095 Erythroculter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 82.9 1.95
NIE-096 Erythroculter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과 105.7 1.89
NIE-097 Hemiculter eigenmanni 치리 잉어목 잉어과 강준치아과 202.8 2.01
NIE-098 Culter brevicauda 백조어 잉어목 잉어과 강준치아과 89.7 1.98
NIE-099 Culter brevicauda 백조어 잉어목 잉어과 강준치아과 125.7 1.82
NIE-100 Culter brevicauda 백조어 잉어목 잉어과 강준치아과 69.5 1.99
(실시예 2) 일반 PCR 증폭과 정제
1) 새로 설계된 PCR 프라이머 조합들을 이용하여 어류 100개체의 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 전체 또는 백조어 특이적인 영역을 증폭하기 위해 이용한 앞쪽 프라이머의 염기서열은 5'-GATCCTRCAAAYTCYTAGTTAACAGCTA-3'였으며, 뒤쪽 프라이머의 염기서열은 5'-TGRAATCCTARTTGHGWGGG-3'였다. 이를 포함해 AccuPower® PCR PreMix & Master Mix(Bioneer, 대한민국)를 이용하여 표 2에 제시된 바와 같이 PCR 반응액을 조제하였다.
PCR 반응액
Reagent
AccuPower® PCR MasterMix 10 μl
Genomic DNA (20 ng/μl) 1 μl
Forward primer (5 pmol) 1 μl
Reverse primer (5 pmol) 1 μl
Nuclease-free water 7 μl
Total 20 μl
2) ProFlex PCR System (Life Technologies, USA)을 이용하여 표 3에 제시된 바와 같은 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다. 이때 PCR 기계가 초기변성반응(initial denaturation)이 일어나는 온도(95℃)에 도달했을 때 모든 PCR 반응용액이 포함된 PCR 튜브를 PCR 증폭기에 넣어 PCR 증폭반응을 시작하는, 즉 hot-start PCR 증폭반응을 수행하였다.
PCR 증폭 조건
Temperature Time No. cycles
Initial denaturation 95°C 5 min 1
Denaturation 95°C 30 s 35
Annealing 55°C 30 s
Elongation 72°C 1 min
Final elongation 72°C 5 min 1
Storage 4°C ∞ 1
3) AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer, 대한민국)의 사용자 매뉴얼에 따라 PCR 증폭산물을 정제하였다.
4) 추출된 게놈DNA를 대상으로 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 PCR 증폭반응을 수행하였던 결과 도 1에서 제시된 바와 같이 모든 시료들에서 성공적으로 예상되는 크기의 PCR 증폭산물들이 확인되었다.
(실시예 3) DNA 서열정보 해독과 분석
1) (주)마크로젠에 PCR 증폭산물들의 DNA 서열정보의 해독을 의뢰하였다. 해독된 DNA 서열정보는 BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit. html)를 이용하여 오류를 수정하고 적절히 잘라낸(trimming) 후 콘티그(contig)를 만드는 편집을 진행하였다.
2) 유전자은행에서 확보한 염기서열을 포함한 매트릭스는 도면 2에서 제시된 바와 같다. 모든 개체들에서 총 1,140 bp의 COB유전자 염기서열을 성공적으로 확보할 수 있었다. 백조어 염기서열과 유전자은행에 등록되어 있는 염기서열들 간 비교분석 결과, 우리나라에서 사용하는 Culter brevicauda와 단계통군을 이루지 않고, Chanodichthys ilishaeformis(Acc. No.: KU200257), Chanodichthys erythropterus (Acc. No.: MH797055), Cultrichthys compressocorpus(Acc. No.: KJ546417) 등과 단계통군을 이루고 있었다. 이는 분류학적 혼란에 따른 학명의 통일성이 부족한 결과이거나 유전자은행에 염기서열을 등록할 때 오동정한 종에 대한 정보를 잘못 기입한 것으로 판단된다.
3) COB 염기서열 매트릭스를 비교 분석하여 백조어 종 특이 마커를 개발하기 위해 앞쪽 프라이머 6개, 뒤쪽 프라이머 6개와 탐침자(probe) 5개를 설계하였다. 증폭 범위를 기준해서 프라이머 12조합을 대상으로 PCR 증폭 반응을 수행한 결과 annealing 온도 60℃에서 모든 조합에서 증폭 반응이 원활하게 이루어졌으며, 증폭의 효율성과 증폭 산물의 크기가 적절한 3∼8번 조합을 선택하였다. 그 중 효율성이 가장 좋고, 백조어에서만 증폭이 가능한 백조어 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 최종 선발하였는데 이는 표 4에서 제시한 바와 같다.
백조어 검출용 PCR 프라이머 및 프로브 정보
이름 염기서열(5'→3') 비고
Cbr-0547f TTCCTATTACCATTCATCGTCA 백조어 검출용
PCR 프라이머 세트
(서열번호 3, 4)
Cbr-0891r GGTACCACCATTAGGACTAAAATA
Cbr-0602rp Cy5-GGTTGTTCGAGCCTGTTTCGT-BHQ3 택맨(TaqMan) 프로브
(서열번호 5)
(실시예 4) 환경수 시료 확보
1) (시료명 : 죽산보, 승촌보, 황룡강) 백조어가 서식하고 있는 것으로 알려져 있는 영산강 3지점에서 하천수 1000ml를 채수하여 보관하였다.
(실시예 5) 환경DNA 추출 및 실시간 중합효소연쇄반응
1) DNeasy Tissue & Blood Kit (Qiagen, 미국)을 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 환경DNA를 추출하였다.
2) 실시간 중합효소연쇄반응의 검량선을 작성하기 위해 백조어 검출용 프라이머 세트와 최적의 결합온도(64℃)에서 백조어 종특이적 형광 탐침자를 이용하여 순수 백조어 게놈 DNA 농도별 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이 때 백조어 미토콘드리아 COB 유전자 영역의 플라스미드를 1×106 copies/μl의 농도에서 10배씩 6번 희석하여 실시간 중합효소연쇄반응에 사용하였다.
3) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위해 AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix & Master Mix (Bioneer, 대한민국)를 이용하여 표 5에서 제시한 바와 같이 PCR 반응액을 조제하였다.
백조어 검출을 위한 실시간 중합효소연쇄반응액
Reagent
AccuPower® Plus DualStar™ qPCR PreMix&Master Mix 10 μl
Genomic DNA or environmental DNA 2 μl
Forward primer (5 pmoles) 1 μl
Reverse primer (5 pmoles) 1 μl
Probe (5 pmoles) 1 μl
Nuclease-free water 5 μl
Total 20 μl
4) QuantStudio5 (Life Technologies, USA)을 이용하여 표 6에서 제시한 바와 같은 조건으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 조건
Temperature Time No. cycles
Initial denaturation 95°C 2 min 1
Denaturation 95°C 15 sec 35
Annealing/elongation 64°C 1 min
5) 그 결과 실시간 PCR 증폭반응을 통해 확인한 CT값은 도 3에서 보는 바와 같이 백조어 게놈 DNA의 농도에 반비례하여 높아지는 것을 확인할 수 있었다(r 2=1.000). 따라서 정량분석이 가능한 것으로 판단되었다.
6) 백조어를 비롯한 어류 40종(표 7)을 대상으로 백조어 검출용 프라이머 세트와 탐침자의 특이성을 검증하였던 결과는 도 4에서 알 수 있듯이, 백조어에서만 실시간 중합효소연쇄반응이 확인되어 그 특이성이 검증되었으며, CT값 35까지 base line이 안정적이었다.
또한 도 5에서 확인할 수 있듯이, 백조어와 치리 게놈에서만 실시간 중합효소연쇄반응이 확인되었을 뿐 다른 어류의 게놈 DNA에서는 어떠한 양성반응도 나타나지 않았다.
백조어 양성시료의 CT값은 19.038로 낮게 나타났으나, 치리 게놈DNA 20ng의 CT값은 37.919로 높게 나타났고, 본 발명에서 백조어 환경DNA 검출 결과 4월과 9월에 조사된 평균 CT값은 36.08이였으며, 이를 표준시료로 환산 시 1.58 copies였고, 게놈DNA로 환산 시에는 약 0.2 pp 수준이다.
따라서 극미량이 발생하는 환경DNA의 특성과 치리의 게놈DNA 20 ng를 이용한 실시간 PCR결과 높은 CT값을 기준으로 0.2 pg의 치리 DNA가 양성으로 반응할 수 있는 예상 CT값은 54이상으로 백조어 종 특이 마커를 이용하여 조사할 때 치리의 환경 DNA가 양성반응을 보일 확률은 매우 낮은 것으로 판단된다. 따라서 종 특이성이 매우 높았으며, 위음성(false-negative)으로 인해 발생할 수 있는 오류가 없음을 의미하였다.
백조어 특이적 실시간 중합효소연쇄반응용 분자마커의 특이성 검증을 위해 사용되었던 담수어류 40종의 목록
시료명 학명 국명 분류군
NIE-001 Misgurnus anguillicaudatus 미꾸리 잉어목 미꾸리아과
NIE-004 Cyprinus carpio 잉어 잉어목 잉어과 잉어아과
NIE-007 Pseudogobio esocinus 모래무지 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-010 Acheilognathus lanceolatus 납자루 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-013 Zacco platypus 피라미 잉어목 잉어과 피라미아과
NIE-016 Moroco oxycephalus 버들치 잉어목 잉어과 황어아과
NIE-018 Channa argus 가물치 농어목 가물치과
NIE-020 Coreoperca herzi 꺽지 농어목 꺽지과
NIE-023 Odontobutis interrupta 얼룩동사리 농어목 망둑어과
NIE-025 Pseudobagrus fulvidraco 동자개 메기목 동자개과
NIE-027 Silurus asotus 메기 메기목 메기과
NIE-030 Anguilla japonica 뱀장어 뱀장어목 뱀장어과
NIE-033 Arctoscopus japonicus 은어 바다빙어목 바다빙어과
NIE-036 Mugil cephalus 숭어 숭어목 숭어과
NIE-039 Oryzias latipes 송사리 동갈치목 송사리과
NIE-042 Gasterosteus aculeatus aculeatus 큰가시고기 큰가시고기목 큰가시고기과
NIE-045 Monopterus albus 드렁허리 드렁허리목 드렁허리과
NIE-047 Cottus poecilopus 독중개 쏨뱅이목 독중개과
NIE-050 Microphysogobio jeoni ?瘟歷早? 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-053 Gobiobotia naktongensis 흰수마자 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-056 Gobiobotia macrocephala 꾸구리 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-059 Pseudopungtungia nigra 감돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-061 Gobiobotia brevibarba 돌상어 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-064 Microphysogobio koreensis 모래주사 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-067 Pseudopungtungia tenuicorpa 가는돌고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-070 Repomucenus olidus 강주걱양태 농어목 돛양태과
NIE-072 Squalidus japonicus 몰개 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-075 Microphysogobio yaluensis 돌마자 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-078 Coreoleuciscus aeruginos 참쉬리 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-080 Erythroculter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과
NIE-082 Acheilognathus yamatsute 줄납자루 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-084 Leiocassis nitidus 밀자개 메기목 동자개과
NIE-086 Carassius carassius 붕어 잉어목 잉어과 잉어아과
NIE-088 Siniperca scherzeri 쏘가리 농어목 꺽지과
NIE-090 Pseudobagrus emarginatus 대농갱이 메기목 동자개과
NIE-092 Sarcochelichthys czerskii 중고기 잉어목 잉어과 모래무지아과
NIE-094 Paracheilognathus rhombea 납지리 잉어목 잉어과 납자루아과
NIE-095 Erythroculter erythropterus 강준치 잉어목 잉어과 강준치아과
NIE-097 Hemiculter eigenmanni 치리 잉어목 잉어과 강준치아과
NIE-098 Culter brevicauda 백조어 잉어목 잉어과 강준치아과
7) 순수 백조어 게놈DNA (20 ng/μl), 백조어 시험용 환경DNA 시료(eDNA test), 백조어 사육수(사육수)로부터 추출한 환경 DNA 시료를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 표 8에 제시된 바와 같이 백조어 게놈DNA는 CT값 19.10에서 확인되었으며, 백조어 시험용 환경수 시료는 죽산보 CT값 33.26, 승촌보 CT값 34.63, 황룡강 CT값 34.77에서 확인되었다.
작성한 검량선에 대입하여 환산하면 백조어 게놈DNA는 플라스미드 농도로 20,612 copies/μl, 백조어 시험용 환경수 시료는 플라스미드 농도로 죽산보 3 copies/μl, 승촌보 1 copies/μl, 황룡강 1 copies/μl에 해당하였다.
환경수 시료들의 실시간 PCR 결과표
번호 시료명 Ct 값 플라스미드 환산값(copies/ul) 검출**
1 죽산보 33.26 3 ○
2 승촌보 34.63 1 ○
3 황룡강 34.77 1 ○
4 Positive control
(백조어 DNA 20ng)		 19.10 20.612 ○
5 Negative control
(3차 증류수)		 ND* 0.000 -
*ND: Not detected, **검출 판단기준: 검출: ○, 미검출: -
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> PCR primer set for environmental DNA detection of Culter brevicauda and method using the same <130> 00-0000 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Culter brevicauda <400> 3 ttcctattac cattcatcgt ca 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Culter brevicauda <400> 4 ggtaccacca ttaggactaa aata 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Culter brevicauda <400> 5 ggttgttcga gcctgtttcg t 21

Claims (8)

  1. 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 백조어 검출용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 백조어 검출용 프라이머-프로브 세트.
  3. 제2항의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 백조어 검출용 키트.
  4. 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 혼합물을 이용해 백조어를 검출하는 중합효소연쇄반응 방법.
  5. 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 혼합물을 이용해 백조어를 검출하는 실시간 중합효소연쇄반응 방법.
  6. 환경수로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고,
    서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 염기서열의 프라이머 세트와 서열번호 5로 기재되는 염기서열의 프로브가 포함된 프라이머-프로프 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행한 후, 프로브에서 방출하는 형광을 감지하여 백조어를 검출하는 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    PCR로 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭시킨 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 전기영동으로 확인하는 단계는 343~345 bp 밴드가 검출되면 백조어로 판정하는 것을 특징으로 하는 백조어를 검출하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 실시간 PCR을 수행할 때 최대 사이클 수 이하에서 CT(critical threshold)가 나타나는 것을 특징으로 하는 백조어를 검출하는 방법.
KR1020200181789A 2020-12-23 2020-12-23 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법 KR102304789B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200181789A KR102304789B1 (ko) 2020-12-23 2020-12-23 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200181789A KR102304789B1 (ko) 2020-12-23 2020-12-23 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102304789B1 true KR102304789B1 (ko) 2021-09-24

Family

ID=77914774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200181789A KR102304789B1 (ko) 2020-12-23 2020-12-23 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102304789B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100806208B1 (ko) 2006-08-04 2008-02-22 (주)지노첵 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR101232878B1 (ko) 2010-05-18 2013-02-13 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) 깍지벌레류의 미토콘드리아 ｃｏｉ 유전자 ｄｎａ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100806208B1 (ko) 2006-08-04 2008-02-22 (주)지노첵 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR101232878B1 (ko) 2010-05-18 2013-02-13 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) 깍지벌레류의 미토콘드리아 ｃｏｉ 유전자 ｄｎａ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: MH797055.1 Chanodichthys erythroptrus CY127 cytb 서열 *
GenBank: MN105126.1 Chanodichthys erythroptrus 미토콘드리아 서열 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morikawa et al. A new method for sex determination based on detection of SRY, STS and amelogenin gene regions with simultaneous amplification of their homologous sequences by a multiplex PCR
CN111926116A (zh) 快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用
CN110129456A (zh) 一种对虾抗弧菌分子标记组合及其在育种中的应用
WO2022068215A1 (zh) 凡纳滨对虾抗弧菌相关est-str标记及其特异性引物和检测方法
KR102304789B1 (ko) 백조어 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 백조어 검출방법
KR102471928B1 (ko) 좀수수치 환경유전자 검출용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법
KR102293200B1 (ko) 흰수마자 검출용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법
KR102471933B1 (ko) 여울마자 환경유전자 검출용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법
CN111733256A (zh) 一种基于Cytb基因片段的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法
Tosi et al. Y-chromosomal markers suitable for noninvasive studies of guenon hybridization
CN111926090A (zh) 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒
CN112522422A (zh) 一种基于coi基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法
CN113355460A (zh) 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用
CN106755403A (zh) 一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法
Moriya et al. Comparison of synthetic DNA templates with authentic cDNA templates in terms of quantification by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
CN115181803A (zh) 检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用
Kohout et al. Discrimination between four Simocephalus species from Slovakia using a PCR-RFLP technique
CN116516019A (zh) 一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、试剂盒及其应用
KR102121954B1 (ko) 고추의 오이모자이크바이러스 감염 판별용 프라이머 세트
KR102546048B1 (ko) 진균 감염 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법
KR20200104718A (ko) 로타바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20240055233A (ko) 모래주사 종 식별용 pcr 프라이머 세트와 프로브 및 이를 이용한 실시간 pcr 방법
KR102639686B1 (ko) 고래류 확인 및 종 식별을 위한 실시간 pcr 프라이머 및 프로브
CN108950020B (zh) 细粒棘球绦虫线粒体nd6基因的应用
CN112680441B (zh) 一种检测4种紫花苜蓿rna病毒的成套试剂与方法

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant