CN106755403A - 一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子标记鉴定领域，具体公开了一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，两类口虾蛄种群包括口虾蛄的南方群体和北方群体，特定引物组由正向引物CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG和反向引物CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC、CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG组成，利用特定引物组对南方群体与北方群体的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物的电泳谱图显示：南方群体的DNA仅在近500 bp处扩增出一条特异亮带，北方群体的DNA在近300 bp和近500 bp处各扩增出一条特异亮带，从而准确、简单的鉴别两类口虾蛄种群。

Description

一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法
技术领域
本发明涉及分子标记鉴定领域，具体涉及一种利用特定引物组鉴别口虾蛄的南方群体和北方群体的方法。
背景技术
口虾蛄属于虾蛄科下的口虾蛄属，为我国重要的经济种类。中国沿海的口虾蛄种群因地理、海流等因素在长江入海口处隔离为南方群体和北方群体两个种群，其外部形态特征十分相似，因而无法从外部形态上准确区分这两个种群。
分子遗传标记可快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于分析水产生物种质鉴定与群体遗传特性的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗传信息，操作方法简单、结果分析方便。
中国专利CN1680601A，专利名称中国明对虾微卫星三重PCR家系识别技术，公告日期2009年7月8日，公开了一种利用三个引物RS1101、RS0683、H081组成的PCR技术对中国明对虾家系进行识别的方法，三个引物对应的碱基序列分别为：RS1101的正向序列CGAGTGGCAGCGAGTCCT，反向序列TATTCCCACGCTCTTGTC；RS0683的正向序列为ACACTCACTTATGTCACACTGC，反向序列为TACACACCAACACTCAATCTCC；H081的正向序列为ACAAACACATTCTGTCCATT，反向序列为GATAGAGAGGTCAACAAACG。利用此三重PCR技术，经过常规PCR扩增一次性获得三个微卫星位点上的中国明对虾个体的遗传信息，进而通过这些不同个体间显示的这种遗传信息的差异来对它们进行区分和识别。但是该三重PCR家系识别技术作为对中国明对虾家系的特定识别，无法有效鉴别开口虾蛄的南方群体和北方群体。
发明内容
针对无法通过外部形态准确区分口虾蛄的南方群体和北方群体，而上述专利中的中国明对虾微卫星三重PCR家系识别技术也无法有效鉴别口虾蛄的南方群体和北方群体的问题，本发明的目的在于提供一种特定的引物组并利用该特定引物组通过合适的PCR扩增途径扩增鉴别上述两类口虾蛄种群的方法。
本发明提供如下的技术方案：
一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，所述两类口虾蛄种群包括生活在长江入海口以南中国沿海海域的南方群体、生活在长江入海口以北中国沿海海域的北方群体，所述特定引物组由一条正向引物CR1和两条反向引物CR2、CR3组成，对应的碱基序列分别为：
CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG；
CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC；
CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG。
作为本发明的优选，利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法包括以下步骤：
（1）利用南方群体的或北方群体的口虾蛄个体样品制备样本DNA；
（2）将包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物电泳检测并通过凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。
作为本发明的优选，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500 bp处出现一条特异亮带的为南方群体，PCR扩增产物分别在近300 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带的为北方群体。
作为本发明的优选，样本DNA由经苯酚/氯仿抽提法从口虾蛄个体样品的50～100mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100(l双蒸水中制得。
作为本发明的优选，PCR扩增体系的体积为25 (l，其组成分别为：10×buffer 2.5(L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的CR1 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的CR2 1.3 (l、浓度为10 (mol/L的CR3 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2(l、余量为H2O。
作为本发明的优选，PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94 ℃下保温3 min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，其中每个温度循环包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
作为本发明的优选，电泳检测条件为：琼脂糖凝胶质量浓度为1.5%、电泳电压140V、电泳时间20 min。
本发明的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法基于分子生物学原理，根据口虾蛄的南方群体和北方群体的基因组DNA的序列差异设计三条特异引物：正向引物CR1、反向引物CR2和反向引物CR3，并利用特异引物对南方群体与北方群体的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经过凝胶电泳检测所得的电泳谱图显示：口虾蛄的南方群体的PCR扩增产物仅在近500 bp处出现一条特异亮带，而北方群体的PCR扩增产物在近300 bp和近500 bp处分别出现一条特异亮带，从而准确、简单、快捷的区分两类口虾蛄种群。
本发明的有益效果如下：
本发明设计特定引物组对两类口虾蛄种群的样本DNA进行PCR扩增并电泳检测，利用电泳谱图中出现的明显差异可以准确的区分口虾蛄的南方群体和北方群体，而且具有准确、灵敏、操作简单、快速、高效的优点。
附图说明
图1是两类口虾蛄种群的基因组DNA经特定引物组PCR扩增后的PCR扩增产物的电泳谱图。
图中口虾蛄的北方群体的PCR扩增产物在近300 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，南方群体的PCR扩增产物在近500 bp处出现一条特异亮带。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明：
实施例1
一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，两类口虾蛄种群包括生活在长江入海口以南中国沿海海域的南方群体，例如舟山群岛海域或镇江海域的口虾蛄种群，生活在长江入海口以北中国沿海海域的北方群体，例如连云港海域或大连海域的口虾蛄种群，特定引物组由一条正向引物CR1和两条反向引物CR2、CR3组成，对应的碱基序列分别为：
CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG；
CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC；
CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG。
该利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法包括以下优选步骤：
（1）提取基因组DNA：利用口虾蛄的南方群体或北方群体的口虾蛄个体样品制备样本DNA，优选将口虾蛄个体样品的50～100 mg背部肌肉经苯酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并将提取后的基因组DNA溶于100 (l双蒸水中制得样本DNA。
（2）PCR扩增：将包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增，制取样本DNA的PCR扩增产物，其中PCR扩增体系的体积为25 (l，其组成优选为：10×buffer 2.5 (L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的CR1 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的CR21.3 (l、浓度为10 (mol/L的CR3 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2 (l、余量为H2O。PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94 ℃下保温3 min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，其中每个温度循环包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
（3）电泳检测：将PCR扩增产物置于琼脂糖凝胶质量浓度为1.5%的TBE溶液中进行电泳试验，电泳电压为140V，电泳时间为20 min。利用凝胶成像系统对电泳结果拍照、记录并读带，对电泳结果进行判定。
对电泳谱图的结果的判定依据如下：如图1所示，当PCR扩增产物的电泳谱图仅在近500 bp处出现一条特异亮条带时为口虾蛄的南方群体；当PCR扩增产物的电泳谱图分别在近300 bp和近500 bp处各出现一条特异亮条带时口虾蛄的北方群体。
本发明采用特定引物组扩增两类口虾蛄种群的基因组DNA，凝胶电泳检测的电泳谱图显示出清晰的条带差异，可准确、简便的区分口虾蛄的南方群体和北方群体。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法
<130> JWE163558
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaaatagaa aacaaatagc cag 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cataatttat cctatcaaga taatc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattatcttg ataggataaa ttatg 25

Claims (7)

1.一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，所述两类口虾蛄种群包括生活在长江入海口以南中国沿海海域的南方群体、生活在长江入海口以北中国沿海海域的北方群体，其特征在于，所述特定引物组由一条正向引物CR1和两条反向引物CR2、CR3组成，对应的碱基序列分别为：
CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG；
CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC；
CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG。
2.根据权利要求1所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，包括以下步骤：
（1）利用南方群体或北方群体的口虾蛄个体样品制备样本DNA；
（2）将包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物电泳检测并通过凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。
3.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，其特征在于，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500 bp处出现一条特异亮带的为南方群体，PCR扩增产物分别在近300 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带的为北方群体。
4.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，其特征在于，样本DNA由经苯酚/氯仿抽提法从口虾蛄个体样品的50～100 mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100(l双蒸水中制得。
5.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，其特征在于，PCR扩增体系的体积为25 (l，其组成分别为：10×buffer 2.5 (L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的CR1 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的CR2 1.3 (l、浓度为10(mol/L的CR3 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2 (l、余量为H2O。
6.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94 ℃下保温3 min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，其中每个温度循环包括：94 ℃保持45s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
7.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两类口虾蛄种群的方法，其特征在于，电泳检测条件为：琼脂糖凝胶质量浓度为1.5%、电泳电压140V、电泳时间20 min。
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