CN104593504A - 一种27个植物转基因位点复合pcr扩增荧光检测试剂盒 - Google Patents
一种27个植物转基因位点复合pcr扩增荧光检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，热启动快速Taq酶，27对引物混合物及超纯水。本发明只需对植物基因组DNA样本进行约80min的核酸扩增，即可检测是否存在试剂盒包含的转基因位点，适用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定，是一种快速、简便、经济、高效的转基因成分检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该系统可以用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定。
背景技术
转基因技术是指将人工分离并修饰过的基因导入生物体基因组中，引起生物体的可遗传的性状修饰，得到转基因生物体(genetically modified organism，GMO)。转基因作物具有其抗虫、抗病、高产等特性，被认为可引导第二次绿色革命。
迄今全球有至少28个国家在种植转基因作物，种植面积已超过1.7亿公顷，2012年转基因种子的销售额达到了150亿美元。各个国家和地区对转基因作物及其深加工产品中的转基因成分都有严格的检测标准和要求，转基因检测的市场巨大。快速、准确、灵敏的检测方法将成为主流，特别对于目前的新品种不断流入市场，一些未知信息的样本检测，往往需要多个试剂盒才能完成，不仅浪费了时间，还浪费了宝贵的样本。因此，本项目针对目前市场上转基因检测试剂盒检测指标单一、假阴性率较高的现状，特别是对于未知信息的样本，力求开发出一种多指标的检测手段，极大的提升检出率，保证人们的食品知情权。
目前检测转基因成分主要有基于外源蛋白的检测和基于外源插入DNA的检测两大类。基于外源蛋白的检测主要有ELISA法与试纸条法，由外源蛋白制备得到相应单抗或多抗，以此检测产品中是否含有该特异性蛋白。与DNA为基础的检测方法相比较，该方法处理简单，具有快速、简便等特点，但准确性与灵敏度不够。基于外源插入DNA的检测方法有PCR技术与基因芯片技术，目前PCR技术是最主要的转基因检测方法。
发明内容
本发明的目的是：提供一种通过复合扩增27个转基因位点的系统，快速、准确地检测植物基因组中插入的外源片段，鉴定转基因品系；利用聚合酶链式反应在一个体系中同时扩增多个转基因位点，提出一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒。
技术方案：
一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，包括有用于扩增如下27个转基因位点的引物：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb、NPTII、GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Bt11、TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、pe3-pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2及CV127。
所述引物序列及其在扩增体系中的浓度优选如下：
表1用于扩增各转基因位点的引物序列及其在扩增体系中浓度
优选地，所述引物中，至少有一条引物的5’端被标记，标记方式可采用放射性同位素标记、荧光标记等。
进一步地，所述引物可以分为三组进行荧光标记，优选分组方式如下：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb和NPTII为第一组；GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176和Bt11为第二组；TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、pe3-pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2和CV127为第三组。
优选地，以上各组转基因位点的引物使用6-FAM、HEX、TAMRA中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
上述试剂盒的扩增体系组成为：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和BSA，Taq酶，27对引物混合物及超纯水；该试剂盒的PCR扩增体系pH值为8.0～9.0，镁离子浓度为1.5～3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200～300μM，BSA在PCR扩增体系中的终浓度为0.1～1mg/mL，Taq酶的用量为0.1～0.4U/μL。
该试剂盒用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定。
使用上述试剂盒的PCR扩增步骤优选如下：(1)配制PCR扩增体系于ep管中，并置于PCR仪上；(2)设置PCR仪的扩增程序，具体如表2所示；(3)扩增后的样品在4℃条件下避光保存；
表2PCR仪扩增程序
上述扩增产物在遗传分析仪上荧光检测的步骤优选如下：
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Maker SIZ-500组成上样混合物[(0.5μLAGCU Maker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司，制备方法参照专利CN101307226))×进样数+(12μL去离子甲酰胺)×进样数]。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物混合，涡旋混匀后，2000r/min离心2分钟，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
对上述分型结果进行分析的步骤是：用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。
扩增产物采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
有益效果
1、本发明涉及一种采用荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定。
2、本发明可以同时检测多个转基因位点，快速、高效检测出转基因成分。
3、本发明采用多色凝胶电泳检测，结果更加准确、灵敏。
附图说明
图1是本发明试剂盒对玉米标准品BT11分型结果图；
图2是本发明试剂盒对玉米标准品BT176分型结果图；
图3是本发明试剂盒对玉米标准品MON88017分型结果图；
图4是本发明试剂盒对玉米标准品MON863分型结果图；
图5是本发明试剂盒对玉米标准品NK603分型结果图；
图6是本发明试剂盒对玉米标准品TC1507分型结果图；
图7是本发明试剂盒对玉米标准品GA21分型结果图；
图8是本发明试剂盒对大豆标准品MON89788分型结果图；
图9是本发明试剂盒对大豆标准品GTS40-3-2分型结果图；
图10是本发明试剂盒对大豆标准品CV127分型结果图；
图11是本发明试剂盒对油菜标准品RT73分型结果图；
图12是本发明试剂盒对大米标准品TT51分型结果图；
图13是本发明试剂盒实施例样本一分型结果图；
图14是本发明试剂盒实施例样本二分型结果图；
图15是本发明试剂盒实施例样本三分型结果图；
图16是本发明试剂盒实施例样本四分型结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中所涉及的各转基因片段的序列可以通过NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov)及上海市转基因生物与食品安全专业技术服务平台(http://shgmo.sjtu.edu.cn/FoodSafety)查询。
实施例1：
一、样品DNA的抽提
采用CTAB法提取样本种子粉末DNA，具体步骤如下：
(1)CTAB溶液60℃预热30分钟；
(2)称取0.2g种子粉末于1.5mL离心管中，加入700ul CTAB溶液，震荡，60℃水浴30分钟；
(3)加入700μL氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒混混匀，室温条件下12000rpm离心10分钟；
(4)吸上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，室温条件下12000rpm离心10分钟；
(5)吸上清，加入0.8倍体积的异丙醇，轻柔混匀，冰浴20分钟；
(6)12000rpm离心10分钟，弃上清，吸干水分；
(7)加入70％乙醇500μL，吹打沉淀，12000rpm离心1分钟，弃上清，吸干水分；
(8)重复步骤7一次；
(9)将沉淀物晾干，待乙醇完全挥发；
(10)加入30μL TE缓冲液溶解沉淀，所得溶液即为样本DNA溶液。
测定并记录所得DNA溶液在260nm和280nm的紫外光吸收率，OD260值应该在0.05-1的区间内，OD260nm/OD280nm比值应介于1.4-2.0之间，根据OD260值计算DNA浓度，依据测得的浓度将DNA溶液稀释到30ng/μL，-20℃保存备用。
二、荧光标记复合扩增体系的优化和建立
设计引物时，需要在引物设计软件中反复调试，确保所有引物具有适中的长度、具有相似的物理学特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量适中、并保证引物之间不形成二聚体。此外，某些转基因位点之间同源性较高，因此需要保证每对引物的特异性；同时应考虑在复合扩增体系中，引物对不同扩增模板的适用性，保证不同模板扩增时，都满足试剂盒均衡性要求。最终确定的引物序列以及扩增产物的理论大小如表3所示。
表3引物序列及扩增产物理论大小
经过反复试验，最终确定同时分析27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，PCR扩增体系组成如下：
表4本发明PCR扩增体系
| 组分 | 体积 |
| Reaction Mix | 10.0μL |
| 基因组DNA | 1μL(30ng/μL) |
| 27个转基因位点对应的引物混合物 | 5μL |
| 热启动Taq酶(5U/μL) | 1μL |
| sdH2O | 补足至25.0μL |
其中所述的Reaction Mix为MgCl27.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs7.5mM，BSA 2mg/mL。
其中27个转基因位点对应的引物及其在反应体系中的终浓度如表1所示。
将所述27个转基因位点对应的引物分为三组进行荧光标记，具体为：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb和NPTII为第一组，该组转基因位点对应引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TAMRA中任一种；GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176和Bt11为第二组，该组转基因位点对应引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、pe3-pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2和CV127为第三组，该组转基因位点对应引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；该试剂盒还设有内标，其选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
试剂盒的扩增步骤如下：
(1)配制PCR扩增体系于ep管中，并置于PCR仪上；
(2)设置PCR仪的扩增程序，具体如表2所示；
(3)扩增后的样品在4℃条件下避光保存；
PCR仪的扩增程序为：(1)初始变性：95℃，2分钟；(2)热循环：30个循环：94℃30秒，59℃50秒，72℃50秒；(3)终延伸：72℃，10分钟；(4)保温：4℃维持。
上述扩增产物在遗传分析仪上荧光检测的步骤为：
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Maker SIZ-500组成上样混合物[(0.5μLAGCU Maker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司，制备方法参照专利CN101307226))×进样数+(12μL去离子甲酰胺)×进样数]。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物混合，涡旋混匀后，2000r/min离心2分钟，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快采用单道毛细管电泳进行检测；用遗传分析仪检测分析。
对上述分型结果进行分析：用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。
三、结果分析
在扩增程序中设置一个阴性对照组、一个阳性对照组及一个空白对照组。其中阴性对照是指用非转基因样本提取的DNA作为PCR反应体系的模板，阳性对照是指用转基因品系标准品作为PCR反应体系的模板，空白对照是指用sdH2O代替模板DNA，平行重复一次。如果阳性对照扩出转基因峰，阴性对照只扩出內源峰，且空白对照不出峰，表明PCR反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。在PCR反应体系正常工作的前提下，若样本两次重复的检测结果不一致，则需要重新进行检测。
图1～12中显示的是对植物样本的标准品进行扩增的效果，从图中可以看出，本试剂盒对于各个标准品的扩增产物与预期片断大小一致，证明了该试剂盒的可靠性。
在此基础上，对样本1～4的扩增图谱见图13～16。检测结果为：样本一为转基因玉米品种，检测出转基因玉米GA21、MON88017、TC1507、NK603和BT11的混合品系；样本二为非转基因玉米品种，未检测出转基因成分；样本三为转基因大豆，检测出转基因大豆GTS40-3-2品系；样本四为转基因油菜，检测出转基因油菜RT73、Ms8、Rf3的混合品系。以上检测结果的扩增片断大小与理论值一致，且与标准品扩增结果一致，扩增产物之间相互无干扰、无非特异峰出现，该试剂盒可以同时对混合样本进行测定。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司、浙江省检验检疫科学技术研究院
<120> 一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒
<130>
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
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Claims (9)
1.一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下27个转基因片断的引物：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb、NPTII、GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Bt11、TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、pe3-pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2及CV127。
2.根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的引物序列是：NOS，SEQ ID NO.1～2；BAR，SEQ ID NO.3～4；Pat，SEQ ID NO.5～6；CaMV35S，SEQ ID NO.7～8；FMV35S，SEQ ID NO.9～10；CP4-EPSPS，SEQ ID NO.11～12；CryIAb，SEQ ID NO.13～14；NPTII，SEQ ID NO.15～16；GA21，SEQ ID NO.17～18；Zein，SEQ ID NO.19～20；MIR604，SEQ ID NO.21～22；Mon88017，SEQ ID NO.23～24；Mon863，SEQ ID NO.25～26；TC1507，SEQ ID NO.27～28；NK603，SEQ ID NO.29～30；BT176，SEQ ID NO.31～32；Bt11，SEQ ID NO.33～34；TT51，SEQ ID NO.35～36；Ms8，SEQ ID NO.37～38；Lectin，SEQ ID NO.39～40；Mon89788，SEQ ID NO.41～42；pe3-pepcase，SEQ ID NO.43～44；Rf3，SEQ ID NO.45～46；Sps，SEQ ID NO.47～48；Rt73，SEQ ID NO.49～50；GTS-40-3-2 SEQ ID NO.51～52；CV127，SEQ ID NO.53～54。
3.根据权利要求1或2所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO.1～2：0.06μM；SEQ ID NO.3～4：0.2μM； SEQ ID NO.5～6：0.24μM；SEQ ID NO.7～8：0.096μM；SEQ ID NO.9～10：0.2μM；SEQ ID NO.11～12：0.3μM；SEQ ID NO.13～14：0.064μM；SEQ ID NO.15～16：0.06μM；SEQ ID NO.17～18：0.24μM；SEQ ID NO.19～20：0.24μM；SEQ ID NO.21～22：0.064μM；SEQ ID NO.23～24：0.18μM； SEQ ID NO.25～26：0.22μM；SEQ ID NO.27～28：0.18μM；SEQ ID NO.29～30：0.18μM；SEQ ID NO.31～32：0.033μM；SEQ ID NO.33～34：0.2μM；SEQ ID NO.35～36：0.15μM；SEQ ID NO.37～38：0.05μM；SEQ ID NO.39～40：0.3μM；SEQ ID NO.41～42：0.24μM；SEQ ID NO.43～44：0.25μM； SEQ ID NO.45～46：0.26μM；SEQ ID NO.47～48：0.24μM；SEQ ID NO.49～50：0.07μM；SEQ ID NO.51～52：0.2μM；SEQ ID NO.53～54：0.3μM。
4.根据权利要求3所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增27个转基因片断的引物中，至少有一条引物的5’端被标记。
5.根据权利要求4所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述引物5’端被荧光标记。
6.根据权利要求5所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述引物分为三组进行荧光标记，NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb和NPTII为第一组；GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176和Bt11为第二组；TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、pe3-pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2和CV127为第三组。
7.根据权利要求6所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，每组引物使用6-FAM、HEX、TAMRA中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
8.根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成为：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和BSA，Taq酶，27对引物混合物及超纯水。
9.根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增体系pH值为8.0～9.0，镁离子浓度为1.5～3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200～300μM，BSA在所述PCR扩增体系中的终浓度为0.1～1mg/mL，Taq酶的用量为0.1～0.4U/μL。
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