CN105154437A

CN105154437A - 用于多重pcr检测转基因作物的dpo引物组合及检测方法

Info

Publication number: CN105154437A
Application number: CN201510451711.5A
Authority: CN
Inventors: 付伟; 魏霜; 乾义柯; 王晨光; 刘中勇; 林利平; 鄞杰平; 朱水芳
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明提供一种用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合，所述DPO引物组合是以至少选自如下基因中的两种或两种以上的基因为靶基因设计的引物组合，所述基因为FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar。本发明还基于所述DPO引物组合建立了用于多重PCR联合毛细管电泳技术检测转基因作物的方法，可实现对转基因作物样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为转基因作物的检测提供了更有效的方法。

Description

用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法。

背景技术

多重PCR技术被广泛应用于转基因检测中，然而多重PCR使用的普通引物容易形成引物二聚体，且引物之间易存在竞争，这导致多重PCR的稳定性不佳。另外，多重PCR的产物分析主要依靠琼脂糖凝胶电泳，分辨率较低，操作费时。DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物技术的主要原理为：其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列包含6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5′和3′引物区域中有任何3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。DPO引物由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构。该技术的优点主要在于它增强了多重PCR的稳定性，避免了传统引物在多重PCR反应中的引物之间形成二聚体，增强了引物的特异性，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。另外，毛细管电泳技术的分辨率大大高于传统琼脂糖凝胶电泳，而且耗时短，为多重PCR产物的分析提供了新方法。

发明内容

本发明的目的是提供用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合，所述DPO引物组合是以至少选自如下基因中的两种或两种以上的基因为靶基因设计的引物组合，所述基因为FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar；所述DPO引物组合如下：

FMV35S-F：5′-CAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCIIIIIACAGAGTC-3′；

FMV35S-R：5′-ATTAGTGAGTGGGCTGTCAGGACAIIIIITTTCCACG-3′；

Cry1Ab-F：5′-GGCCAGGGAGTGTACCGCAIIIIIAGCAGCAC-3′；

Cry1Ab-R：5′-GCTCACGCTGCTGTTGCTGAAIIIIITGCGGAAC-3′；

NPTII-F：5′-TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAIIIIICCATCATG-3′；

NPTII-R：5′-GGGCATGCGCGCCTTGAIIIIIGCGAACAG-3′；

NOS-F：5′-CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGIIIIIGCGATGATTATC-3′；

NOS-R：5′-AGGTTGCGCGCTATATTTTGTTTIIIIICGCGTATTAAATG-3′；

CaMV35S-F：5′-TCCTACAAATGCCATCATTGCGIIIIIGGAAAGGC-3′；

CaMV35S-R：5′-ATCACATCAATCCACTTGCTTTGAIIIIITGGTTGGA-3′；

Pat-F：5′-CTGATATGGCCGCGGTTTGTIIIIICGTTAACCA-3′；

Pat-R：5′-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAATIIIIICTTGTGGT-3′；

Bar-F：5′-GGTCTGCACCATCGTCAACCACIIIIICGAGACAA-3′；

Bar-R：5′-GACGAGGTCGTCCGTCCACTIIIIIGGTTCCT-3′；

其中，I为次黄嘌呤。

FMV35S-F和FMV35S-R为检测FMV35S基因的DPO引物，产物大小为365bp；Cry1Ab-F和Cry1Ab-R为检测Cry1Ab基因的DPO引物，产物大小为276bp；NPTII-F和NPTII-R为检测NPTII基因的DPO引物，产物大小为223bp；NOS-F和NOS-R为检测NOS基因的DPO引物，产物大小为182bp；CaMV35S-F和CaMV35S-R为检测CaMV35S基因的DPO引物，产物大小为153bp；Pat-F和Pat-R为检测Pat基因的DPO引物，产物大小为118bp；Bar-F和Bar-R为检测Bar基因的DPO引物，产物大小为94bp。

本发明还提供用于七重PCR检测转基因作物的DPO引物组合，所述DPO引物组合是以FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar为靶基因设计的引物组合。

本发明还提供含有所述DPO引物组合的用于多重PCR检测转基因作物的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。

本发明还提供一种基于DPO引物的多重PCR检测转基因作物的方法，所述方法是利用上述用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合进行多重PCR检测转基因作物。

本发明还提供一种基于DPO引物的七重PCR检测转基因作物的方法，所述方法是利用上述用于七重PCR检测转基因作物的DPO引物组合进行七重PCR检测转基因作物。

具体地，所述方法包括以下步骤：1)提取待测转基因作物样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行多重PCR扩增反应；3)分析扩增产物。多重或七重PCR反应体系以50μL计为：

多重或七重PCR反应条件为：95℃15分钟；94℃30秒，60℃90秒，72℃90秒，共40个循环；72℃10分钟。

其中，步骤3)中采用毛细管电泳检测扩增产物。

本发明选择转基因作物中常见的7种筛查基因FMV35S、Cry1Ab、NPTII、CaMV35S、NOS、Pat和Bar，分别设计特异性DPO引物，并基于这些引物建立了用于多重PCR联合毛细管电泳技术检测转基因作物的方法，可实现对转基因作物样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为转基因作物的检测提供了更有效的方法。

附图说明

图1为本发明实施例2中七重DPO-PCR扩增产物的毛细管电泳检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因水稻TT51-1、转基因油菜GT73由中国检验检疫科学研究院提供。

实施例1用于七重PCR检测转基因作物的DPO引物组合的获得

以FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat、Bar基因为靶基因，设计并人工合成如下七重DPO-PCR检测DPO引物组合(I为次黄嘌呤)：

FMV35S-F：5′-CAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCIIIIIACAGAGTC-3′；

FMV35S-R：5′-ATTAGTGAGTGGGCTGTCAGGACAIIIIITTTCCACG-3′；

Cry1Ab-F：5′-GGCCAGGGAGTGTACCGCAIIIIIAGCAGCAC-3′；

Cry1Ab-R：5′-GCTCACGCTGCTGTTGCTGAAIIIIITGCGGAAC-3′；

NPTII-F：5′-TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAIIIIICCATCATG-3′；

NPTII-R：5′-GGGCATGCGCGCCTTGAIIIIIGCGAACAG-3′；

NOS-F：5′-CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGIIIIIGCGATGATTATC-3′；

NOS-R：5′-AGGTTGCGCGCTATATTTTGTTTIIIIICGCGTATTAAATG-3′；

CaMV35S-F：5′-TCCTACAAATGCCATCATTGCGIIIIIGGAAAGGC-3′；

CaMV35S-R：5′-ATCACATCAATCCACTTGCTTTGAIIIIITGGTTGGA-3′；

Pat-F：5′-CTGATATGGCCGCGGTTTGTIIIIICGTTAACCA-3′；

Pat-R：5′-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAATIIIIICTTGTGGT-3′；

Bar-F：5′-GGTCTGCACCATCGTCAACCACIIIIICGAGACAA-3′；

Bar-R：5′-GACGAGGTCGTCCGTCCACTIIIIIGGTTCCT-3′。

其中，FMV35S-F和FMV35S-R为检测FMV35S基因的DPO引物，产物大小为365bp；Cry1Ab-F和Cry1Ab-R为检测Cry1Ab基因的DPO引物，产物大小为276bp；NPTII-F和NPTII-R为检测NPTII基因的DPO引物，产物大小为223bp；NOS-F和NOS-R为检测NOS基因的DPO引物，产物大小为182bp；CaMV35S-F和CaMV35S-R为检测CaMV35S基因的DPO引物，产物大小为153bp；Pat-F和Pat-R为检测Pat基因的DPO引物，产物大小为118bp；Bar-F和Bar-R为检测Bar基因的DPO引物，产物大小为94bp。

实施例2七重DPO-PCR检测方法

1、DNA的提取

参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034的基因组DNA。

2、七重DPO-PCR扩增

采用FMV35S-F、FMV35S-R、Cry1Ab-F、Cry1Ab-R、NPTII-F、NPTII-R、NOS-F、NOS-R、CaMV35S-F、CaMV35S-R、Pat-F、Pat-R、Bar-F、Bar-R共14条七重DPO-PCR引物，按表1所示配制反应体系，DNA模板为转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034共4种转基因玉米品系的基因组DNA混合物。其中，采用多重PCR扩增试剂盒，内含10×MultiHotStart反应缓冲液、dNTPs(2.5mmol/L)、MultiHotStartDNA聚合酶，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为KT109。

表1七重DPO-PCR反应体系

多重DPO-PCR反应条件：95℃预变性15min；然后94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸90s，此条件下进行40个循环；最后72℃延伸10min。

3、七重DPO-PCR扩增产物的毛细管电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，取1μL的多重DPO-PCR扩增产物于Agilent2100Bioanalyzer上进行分析。

结果如图1所示，可清晰观察到7个峰，带条大小符合预期。表明本发明的七重DPO-PCR引物的可以快速有效地检测转基因作物。

实施例3七重DPO-PCR检测方法的特异性分析

1、DNA的提取

参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因水稻TT51-1、转基因油菜GT73的基因组DNA。

2、七重DPO-PCR扩增

采用实施例2的方法，分别以步骤1中提取的10种转基因作物品系的基因组DNA为模板进行七重DPO-PCR扩增，得到七重DPO-PCR扩增产物。

3、七重DPO-PCR扩增产物的毛细管电泳检测

七重DPO-PCR反应结束后，分别取1μL的七重DPO-PCR扩增产物于Agilent2100Bioanalyzer上进行分析。

结果如表2所示，转基因玉米TC1507检出CaMV35S、Pat这2个基因为阳性；转基因玉米MON863检出NOS、CaMV35S、NPTII这3个基因为阳性；转基因玉米BT176检出Cry1Ab、CaMV35S、Bar这3个基因为阳性；转基因玉米MON89034检出FMV35S、NOS、CaMV35S这3个基因为阳性；转基因大豆GTS40-3-2检出NOS、CaMV35S这2个基因为阳性；转基因水稻TT51-1检出Cry1Ab、NOS这2个基因为阳性；转基因油菜GT73检出FMV35S这1个基因为阳性。以上结果与已报道的文献(Developmentandvalidationofa48-targetanalyticalmethodforhigh-throughputmonitoringofgeneticallymodifiedorganisms)结果一致，证明该方法特异性高。

表2多重PCR检测转基因样品

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

LiX,WuY,LiJ,etal.DevelopmentandValidationofA48-TargetAnalyticalMethodforHigh-throughputMonitoringofGeneticallyModifiedOrganisms[J].Scientificreports,2015,5。

Claims

1.用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合，其特征在于，所述DPO引物组合是以至少选自如下基因中的两种或两种以上的基因为靶基因设计的引物组合，所述基因为FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar；所述DPO引物组合如下：

FMV35S-F：5′-CAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCIIIIIACAGAGTC-3′；

FMV35S-R：5′-ATTAGTGAGTGGGCTGTCAGGACAIIIIITTTCCACG-3′；

Cry1Ab-F：5′-GGCCAGGGAGTGTACCGCAIIIIIAGCAGCAC-3′；

Cry1Ab-R：5′-GCTCACGCTGCTGTTGCTGAAIIIIITGCGGAAC-3′；

NPTII-F：5′-TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAIIIIICCATCATG-3′；

NPTII-R：5′-GGGCATGCGCGCCTTGAIIIIIGCGAACAG-3′；

NOS-F：5′-CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGIIIIIGCGATGATTATC-3′；

NOS-R：5′-AGGTTGCGCGCTATATTTTGTTTIIIIICGCGTATTAAATG-3′；

CaMV35S-F：5′-TCCTACAAATGCCATCATTGCGIIIIIGGAAAGGC-3′；

CaMV35S-R：5′-ATCACATCAATCCACTTGCTTTGAIIIIITGGTTGGA-3′；

Pat-F：5′-CTGATATGGCCGCGGTTTGTIIIIICGTTAACCA-3′；

Pat-R：5′-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAATIIIIICTTGTGGT-3′；

Bar-F：5′-GGTCTGCACCATCGTCAACCACIIIIICGAGACAA-3′；

Bar-R：5′-GACGAGGTCGTCCGTCCACTIIIIIGGTTCCT-3′；

其中，I为次黄嘌呤。

2.根据权利要求1所述的DPO引物组合，其特征在于，所述DPO引物组合是以FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar为靶基因设计的引物组合。

3.含有权利要求1或2所述DPO引物组合的用于多重PCR检测转基因作物的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。

6.基于DPO引物的多重PCR检测转基因作物的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的DPO引物组合进行多重PCR检测转基因作物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测转基因作物样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行多重PCR扩增反应；

3)分析扩增产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，多重PCR反应体系以50μL计为：

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，多重PCR反应条件为：95℃15分钟；94℃30秒，60℃90秒，72℃90秒，共40个循环；72℃10分钟。

10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用毛细管电泳检测扩增产物。