CN105112409B - 检测转基因玉米mon810和mir604的多重dpo-pcr引物组合及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO‑PCR引物组合，所述引物组合的序列分别如Seq ID No.1‑4所示。本发明还基于所述引物组合建立了检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO‑PCR方法，可实现对转基因作物样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为转基因玉米MIR604和MON810的检测提供了更有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物组合及方法。
背景技术
多重PCR是指在一个反应管内加入多对引物同时对多个靶基因进行扩增，可以实现对样品的高通量检测，目前已经被广泛应用于转基因物种的检测。由于在PCR反应体系内加入了多对引物，体系复杂，稳定性不高，限制了其使用。DPO(Dual primingoligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火温度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物组合。
本发明的另一目的是提供检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法。
为了实现本发明目的，本发明根据转基因玉米MIR604和MON810的旁侧序列，设计了如下检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物组合：
MON810-F：5′-CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3′(Seq ID No.1)；
MON810-R：5′-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3′(Seq ID No.2)；
MIR604-F：5′-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3′(Seq ID No.3)；
MIR604-R：5′-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3′(Seq ID No.4)；
其中，I为次黄嘌呤。
MON810-F和MON810-R为检测转基因玉米MON810的引物，产物大小为266bp；MIR604-F和MIR604-R为检测转基因玉米MIR604的引物，产物大小为127bp。
本发明还提供含有所述引物组合的用于多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。
更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
本发明进一步检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法，即利用所述引物组合进行多重DPO-PCR检测转基因作物。
具体地，所述方法包括以下步骤：1)提取待测转基因作物样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行多重DPO-PCR扩增反应；3)分析扩增产物。
多重DPO-PCR反应体系以50μL计为：
其中，Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液；Mix 1和Mix 2购自TaKaRa公司，货号为RR060A。
多重DPO-PCR反应条件为：94℃1分钟；94℃30秒，45℃～60℃90秒，72℃90秒，共40个循环；72℃10分钟。
优选地，多重DPO-PCR反应条件为：94℃1分钟；94℃30秒，60℃90秒，72℃90秒，共40个循环；72℃10分钟。
前述的方法，步骤3)中采用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，转基因玉米MON810的扩增产物大小为266bp，转基因玉米MIR604的扩增产物大小为127bp。
本发明根据转基因玉米MIR604和MON810的旁侧序列，分别设计特异性DPO-PCR引物，并基于这些引物建立了检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法，可实现对转基因作物样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为转基因玉米MIR604和MON810的检测提供了更有效的方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，1：转基因玉米MIR604；2：转基因玉米MON810；3：转基因玉米MIR604、MON810。
图2为本发明实施例3中多重DPO-PCR引物组合的灵敏度电泳检测结果。其中，1-5：两种转基因玉米DNA模板量依次为50ng、5ng、0.5ng、0.05ng和0.005ng。
图3为本发明实施例4中多重DPO-PCR引物组合的退火温度敏感实验的电泳检测结果。其中，1-4：退火温度分别为45℃、50℃、55℃和60℃。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因水稻TT51-1、转基因油菜GT73由中国检验检疫科学研究院提供。
实施例1检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法
一、多重DPO-PCR引物组合的设计
根据转基因玉米MIR604和MON810的旁侧序列，设计了如下检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物组合(引物序列中的I为次黄嘌呤)：
MON810-F：5′-CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3′(Seq ID No.1)
MON810-R：5′-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3′(Seq ID No.2)
MIR604-F：5′-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3′(Seq ID No.3)
MIR604-R：5′-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3′(Seq ID No.4)
其中，MON810-F和MON810-R为检测转基因玉米MON810的引物，产物大小为266bp；MIR604-F和MIR604-R为检测转基因玉米MIR604的引物，产物大小为127bp。
二、检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法
1、DNA的提取
参照试剂盒说明操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA。
2、多重DPO-PCR扩增
采用MON810-F、MON810-R、MIR604-F和MIR604-R共4条多重DPO-PCR引物，分别以如下3组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：
组1以转基因玉米MON810的基因组DNA为模板；
组2以转基因玉米MIR604的基因组DNA为模板；
组3以转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA为模板。
多重DPO-PCR反应体系如表1所示。其中，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液；Mix1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1购自TaKaRa公司，货号为RR060A。
多重DPO-PCR反应条件：94℃预变性1min；然后94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸90s，在此条件下进行40个循环；最后72℃再延伸10min。
表1多重DPO-PCR反应体系
3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
多重DPO-PCR反应结束后，取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。
结果如图1所示，组1(转基因玉米MON810)的PCR扩增产物含有1条带，大小为266bp；组2(转基因玉米MIR604)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为127bp；组3(转基因玉米MON810和MIR604)的PCR扩增产物含有2个条带，大小为266bp和127bp。说明本发明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效地检测转基因玉米MON810和MIR604。
实施例2多重DPO-PCR引物的特异性检测
1、DNA的提取
参照试剂盒说明操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米MON810、转基因玉米MIR604、转基因玉米TC1507、转基因玉米MON863、转基因玉米BT176、转基因玉米MON89034、转基因大豆GTS40-3-2、转基因水稻TT51-1、转基因油菜GT73的基因组DNA。
2、多重DPO-PCR扩增
采用实施例1中步骤二的检测转基因玉米MON810和MIR604的方法，分别以步骤1中提取的9种转基因品系的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，得到多重DPO-PCR扩增产物。
3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果。
结果如表2所示，从9种样品中顺利检出转基因玉米MON810和转基因玉米MIR604，其余转基因品系均无扩增，说明该方法特异性好。
表2多重DPO-PCR检测转基因样品的结果
| 样品 | MON810 | MIR604 |
| 转基因玉米MON810 | + | － |
| 转基因玉米MIR604 | － | + |
| 转基因玉米TC1507 | － | － |
| 转基因玉米MON863 | － | － |
| 转基因玉米BT176 | － | － |
| 转基因玉米MON89034 | － | － |
| 转基因大豆GTS40-3-2 | － | － |
| 转基因水稻TT51-1 | － | － |
| 转基因油菜GT73 | － | － |
实施例3多重DPO-PCR引物组合的灵敏度检测
1、DNA的提取
参照试剂盒说明操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA。并将得到的基因组DNA进行10倍稀释，分别制备得到浓度为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL和0.005ng/μL的转基因玉米810的基因组DNA和浓度为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL和0.005ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA。
2、多重DPO-PCR扩增
采用实施例1的步骤二中的检测转基因玉米MON810和MIR604的方法，分别以如下5组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：
组1：以50ng/μL的转基因玉米MON810基因组DNA(1μL)和50ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA(1μL)为模板；
组2：5ng/μL的转基因玉米MON810基因组DNA(1μL)和5ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA(1μL)为模板；
组3：0.5ng/μL的转基因玉米MON810基因组DNA(1μL)和0.5ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA(1μL)为模板；
组4：0.05ng/μL的转基因玉米MON810基因组DNA(1μL)和0.05ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA(1μL)为模板；
组5：0.005ng/μL的转基因玉米MON810基因组DNA(1μL)和0.005ng/μL的转基因玉米MIR604的基因组DNA(1μL)为模板。
3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果。
结果如图2所示，本发明多重DPO-PCR引物组合具有较高的灵敏度，可检测出样品中仅含有0.5ng的微量DNA。
实施例4多重DPO-PCR引物组合的退火温度敏感性检测
1、DNA的提取
参照试剂盒说明操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA。
2、多重DPO-PCR扩增
以步骤1获得的转基因玉米MON810和MIR604的基因组DNA为模板，采用实施例1的步骤二中的同时检测转基因玉米MON810和MIR604的方法，用不同的退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃)分别进行PCR扩增，其余反应条件不变，分别得到多重DPO-PCR扩增产物。
3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测
多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。
结果如图3所示：电泳检测结果显示用不同的退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃)进行PCR扩增得到的PCR扩增产物均含有大小为266bp和127bp的片段，无非特异性扩增条带，说明本发明的多重DPO-PCR引物对退火温度不敏感。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.用于检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合如下：
MON810-F：5′-CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3′；
MON810-R：5′-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3′；
MIR604-F：5′-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3′；
MIR604-R：5′-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3′；
其中，I为次黄嘌呤。
2.含有权利要求1所述引物组合的用于多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。
5.检测转基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物组合进行多重DPO-PCR检测转基因作物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测转基因作物样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行多重DPO-PCR扩增反应；
3)分析扩增产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，多重DPO-PCR反应体系以50μL计为：
其中，Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液；Mix 1和Mix 2购自TaKaRa公司，货号为RR060A。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，多重DPO-PCR反应条件为：94℃1分钟；94℃30秒，45℃～60℃90秒，72℃90秒，共40个循环；72℃10分钟。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，退火温度为60℃。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，转基因玉米MON810的扩增产物大小为266bp，转基因玉米MIR604的扩增产物大小为127bp。
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