CN104328205A - 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立 - Google Patents

谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通过LAMP技术从谷子籽粒中快速检测谷子白发病菌的方法。该技术根据谷子白发病病原菌 Sclerospora graminicola 18SrDNA序列设计了2对LAMP特异性引物，通过琼脂糖凝胶电泳法和SYBR GreenⅠ荧光染料显色法判定结果，对种子中的病原菌进行检测。本发明建立的谷子白发病菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、快速、经济，为谷子种子携带白发病菌的检测构建了一个新的技术平台，具有较高的实际应用价值。

Description

谷子白发病菌LAMP快速检测方法的建立
技术领域
本发明属于植物真菌分子生物学检测技术领域，具体涉及用LAMP技术对谷子白发病菌进行检测。
背景技术
谷子白发病在我国主要谷子栽培区普遍发生，一般导致减产1%-5%，严重的达50%以上。其症状随生长时期的变化而不同。谷子自开始萌芽一直到成熟，各期随时发生不同的症状。若谷子在种子萌芽期被病原菌侵染，则幼苗在不及伸达土面时就发生变色弯曲，随后被腐生菌侵害，最终腐烂。待抽穗时，病株抽出的穗呈深褐色，并伴有各种形式的畸形。病穗上的花也畸形发展，内外颖伸长卷曲作角状或叶状，使穗上长出许多丛生的叶状侧生枝，病穗变得疏松并包含小而扭曲的绿色叶片，形成绿穗。病穗的花器发育成叶片状蘖，雄蕊和雌蕊不能正常发育。病穗部分不结子实。
谷子白发病病原菌最早是在轮枝狗尾草（Setaria verticillata）上发现的，当时被命名为Protomyces graminicola，后来发现它是霜霉菌科的一个新属，Sclerospora，因此命名为Sclerospora graminicola。谷子白发病菌的寄主包括禾本科作物如谷子，高粱，甘蔗等，以及禾本科牧草如金狗尾草，青狗尾草，狼尾草，草原梯牧草等。谷子白发病菌有两个世代，无性生殖世代即游动孢子囊世代，有性生殖世代即卵孢子世代。白发病菌的菌丝生长在细胞间隙，侧生的圆形吸盘伸到细胞里面吸取营养，起初产生游动孢子囊梗，在其上产生游动孢子囊。发育到一定阶段后，菌丝产生精子器和藏卵器，交配后形成卵孢子。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是日本学者Notomi等人于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增技术。该技术针对靶基因的6个特定区域设计内外2对特异性引物，利用具有链置换作用的DNA聚合酶在恒温条件下特异的扩增靶序列，具有特异性强、灵敏性高、经济、简单的特点。目前，LAMP技术已广泛应用于食品及农业等领域。例如何旭峰等人建立了一种基于LAMP技术，从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫的方法，为象耳豆根结线虫的监测和防治提供技术支持（何旭峰等，植物罹病组织中象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法.中国农业科学,2013，46(3)：534-544）；黄丽等人利用LAMP技术对柑橘黄龙病田间疑似样品进行了检测，LAMP阳性检出率为52.4%，而常规PCR为37.1%（黄丽等，柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立与应用.果树学报,2012，29(6)：1121-1126）。由于谷子白发病的初侵染源主要是带病的种子，因此控制种子是最经济有效防治该病的方法。本研究基于LAMP技术，建立了一种从谷子种子中快速检测谷子白发病菌的方法，该方法的建立有利于控制谷子白发病的发生。
发明内容
本发明基于18S rDNA基因建立了一种谷子白发病菌的LAMP快速检测方法。 
本发明的具体步骤是：
1、PCR扩增谷子白发病菌18S rDNA序列
提取谷子白发病菌基因组DNA，根据植物病原真菌18S rDNA基因区通用引物LROR(5'-ACCCGCTGAACTTAAGC -3')和LR5(5'-TCCTGAGGGAAACTTCG -3')扩增谷子白发病菌18S rDNA基因，扩增后的特异性片段切胶回收，通过克隆转化把插入目的片段的克隆送上海生工进行测序。最终，获得1159bp的谷子白发病菌18S rDNA特异性片段SEQ ID No.1。测序结果与NCBI上所公布的藻界卵菌门18S rDNA基因具有高同源性，因此克隆得到的基因为谷子白发病菌18S rDNA基因序列。
2、LAMP特异性引物设计
根据谷子白发病菌18S rDNA序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了两对特异性引物序列SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，序列如下：
SEQ ID No.2   F3：GCGTGCGTGTACTATGGC
SEQ ID No.3   B3：GTTGTAGGCACCTCAGTCC
SEQ ID No.4  FIP：GGCGTCCCACCACAATACAGGCTTTTTGGCTGCGCTTGG
SEQ ID No.5  BIP：ACCGCGGGAAATGACTACCGAAACCACAACTACTCGTCCAC。
3、引物特异性检测
应用特异性引物对谷子白发病菌以及谷粒上常带的其它真菌即谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）、谷瘟病菌（Pyricularia setariae）、谷子纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、粟粒黑穗病菌（Ustilago crameri）、粟胡麻斑病菌（Bipolaris setariae）、粟弯孢霉病菌（Curvularia lunata）和粟灰斑病菌（Cercospora setariae）提取的基因组DNA进行LAMP扩增。
LAMP反应体系为：25.0μL，其中，外引物F3和B3（10μM）各0.5μL，内引物FIP和BIP（10μM）各4.0μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，甜菜碱（5mmol/L）1.0μL，Bst DNA聚合酶（8U/μL）1.0μL，10×DNA聚合酶buffer 2.5μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）6.5μL；扩增条件为65℃条件下温育60min，80℃下反应10min。
反应结束后，分别用凝胶电泳法和SYBR GreenⅠ荧光染料显色法判定引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳法：取5μL LAMP扩增产物，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，在凝胶成像系统中观察，出现特征性梯状条带为阳性，未出现条带为阴性；SYBR GreenⅠ荧光染料显色法：向LAMP扩增产物中加入1μL 100×SYBR GreenⅠ，混匀后肉眼观察颜色变化，产生绿色为阳性反应，橙色则为阴性反应。
4、LAMP扩增和常规PCR扩增灵敏性比较
将提取的谷子白发病菌基因组DNA用NanoDrop 1000测定浓度后，按10倍梯度稀释成8个浓度（10ng/μL ~ 1fg /μL），用于LAMP扩增灵敏度的检测。LAMP反应体系为和扩增条件同上。
同时，以上述稀释DNA为模板，以F3和B3为引物，进行常规PCR扩增，作为对照。反应体系为：PCR反应的体系为：25.0μL，其中2×Taq MasterMix 12.5μL，上下游引物10μM各1.0μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）9.5μL；PCR反应程序为： 95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min共进行35个循环；72℃延伸10min。
扩增结束后，取LAMP扩增和PCR扩增各浓度梯度产物5μL在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，经EB染色后，使用凝胶成像系统观察结果。
5、谷粒中谷子白发病菌的检测
分别取田间谷子白发植株所结病种子，病种子与健康种子不同比列混合样品以及健康谷子种子，根据CTAB的方法提取谷粒基因组DNA，进行LAMP检测。
本发明的优点在于：以18S rDNA作为靶基因，通过系列试验，建立了高效快速的从谷粒中检测谷子白发病菌的LAMP检测方法。该检测方法的建立对谷子种子白发病菌的监测和白发病的防控具有重要意义。
本发明的有益效果主要体现在：
(1) 特异性强：两种检测方法结果都显示，谷子上常见的其它7种病原菌均未检测到阳性结果，只有谷子白发病菌产生阳性结果；
(2) 灵敏度高：通过倍比稀释谷子白发病菌基因组DNA进行灵敏度检测，LAMP技术可检测到最低白发病菌NDA浓度为10fg /μL，比常规PCR高出100倍；
(3) 快速、便捷：LAMP反应结束后，可以通过添加SYBR GreenⅠ荧光染料的方法直接观察反应结果，全部过程只需1.5h，大大缩短了检测时间；
(4) 成本低廉：由于LAMP技术不需要PCR仪、凝胶电泳以及凝胶电泳成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成反应，适合普通实验室及田间大批量检测。
附图说明
图1：引物特异性检测结果图；其中A为电泳检测结果，B为SYBR GreenⅠ荧光染料检测结果；图中：M为DL2000 DNA Marker， 1、2为谷子白发病菌， 3为谷子锈菌， 4为谷瘟病菌， 5为谷子纹枯病菌， 6为粟粒黑穗病菌， 7为粟胡麻斑病菌， 8为粟弯孢霉病菌， 9为粟灰斑病菌， 10为阴性对照。
图2：谷子白发病菌灵敏性电泳检测图；其中A为LAMP扩增结果，B为PCR扩增结果；图中，M为DL2000 DNA Marker，1-8DNA浓度分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1 pg/μL、100 fg /μL、10 fg /μL、1 fg /μL，9为阴性对照。
图3：谷粒中谷子白发病菌检测图；其中A为电泳检测结果，B为SYBR GreenⅠ荧光染料检测结果；图中：M为DL2000 DNA Marker，1，2，4，8健康植株所结谷子种子，3，5为发病植株所结病种子, 6为1粒病种子与49粒健康种子混合研磨样品,7为1粒病种子与99粒健康种子混合研磨样品，9为阴性对照。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但以下描述对本发明的保护范围不构成任何意义上的限定，仅仅做示例说明。
实施例1：
谷子白发病菌18S rDNA序列的扩增
（1）谷子白发病菌DNA的提取
a) 取适量真菌，加液氮快速研磨成粉末。将粉末转移到1.5mL离心管中，加入0.5 ml的抽提缓冲液（100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA, 2%SDS），65℃水浴15min。期间振荡器上震荡,每次2 min连续3次；
b) 冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（v：v=24:1），颠倒混匀，4℃，12000rpm离心15 min；
 c）取上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（v：v=24:1），颠倒混匀，4℃，12000rpm离心15 min；
d）取上层水相至另离心管中,加入0.6体积的异丙醇,颠倒混勾,-20°C放置10 min
e）4℃，12000rpm 离心10 min。收集沉淀弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀两次；
f）待沉淀自然风干后，溶解于50μL TE缓冲液中。
（2）以引物对LROR和LR5扩增谷子白发病菌基因组DNA。
PCR反应的体系为：25.0μL，其中2×Taq MasterMix 12.5μL，上下游引物10μM各1.0μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）9.5μL；PCR反应程序为： 95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min共进行35个循环；72℃延伸10min。扩增产物电泳后经EB染色用BioRad凝胶成像系统成像。
（3）结果显示，可以扩增出单一的条带，片段大小在1100bp左右。将特异性片段切胶后用胶回收试剂盒回收DNA，然后连接到pMD-19T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在添加了氨苄抗性的LB培养基中37℃过夜培养，挑选克隆并通过PCR法鉴定阳性克隆，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序分析。测得序列为SEQ ID No.1，序列在 NCBI 经 Blast 分析，与珍珠粟白发病菌及其他藻界卵菌门真菌18S rDNA序列同源性94%-99%之间，由此确定扩增片段为谷子白发病菌18S rDNA基因序列。
实施例2：
引物的特异性检测
选择其它7种谷粒上常见的病原菌谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）、谷瘟病菌（Pyricularia setariae）、谷子纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、粟粒黑穗病菌（Ustilago crameri）、粟胡麻斑病菌（Bipolaris setariae）、粟弯孢霉病菌（Curvularia lunata）和粟灰斑病菌（Cercospora setariae）进行引物特异性的验证，具体步骤为：
（1）提取这几种真菌的基因组DNA为模板，提取方法与谷子白发病菌DNA的提取方法相同。
（2）根据谷子白发病菌18S rDNA序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了两对LAMP特异性引物外引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；内引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，具体序列如下：
SEQ ID No.2   F3：GCGTGCGTGTACTATGGC
SEQ ID No.3   B3：GTTGTAGGCACCTCAGTCC
SEQ ID No.4  FIP：GGCGTCCCACCACAATACAGGCTTTTTGGCTGCGCTTGG
SEQ ID No.5  BIP：ACCGCGGGAAATGACTACCGAAACCACAACTACTCGTCCAC。
（3）应用LAMP特异性引物对谷子白发病菌基因组DNA、其它7种谷子真菌基因组DNA和阴性对照进行LAMP扩增。25.0μL反应体系为：外引物F3和B3（10μM）各0.5μL，内引物FIP和BIP（10μM）各4.0μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，甜菜碱（5mmol/L）1.0μL，Bst DNA聚合酶（8U/μL）1.0μL，10×DNA聚合酶buffer 2.5μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）6.5μL；扩增条件为65℃条件下温育60min，80℃下反应10min。
（4）扩增产物的检测
扩增产物使用两种方法进行检测，琼脂糖凝胶电泳法：取5μL LAMP扩增产物，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，在凝胶成像系统中观察，出现特征性梯状条带为阳性，未出现条带为阴性；SYBR GreenⅠ荧光染料显色法：向LAMP扩增产物中加入1μL 100×SYBR GreenⅠ，混匀后肉眼观察颜色变化，产生绿色为阳性反应，橙色则为阴性反应。
结果显示，在图1A中只有谷子白发病菌DNA的LAMP扩增产物出现特征性梯状条带，其它7种真菌及阴性对照都未出现条带；图1B中，也只有白发病菌DNA的LAMP扩增产物颜色反应为绿色，其它7种真菌及阴性对照都为橙色。结果说明引物的特异性很好，可以用于谷子白发病菌的特异性分析。 
实施例3：
LAMP检测灵敏性分析
（1）模板的制备
将提取的谷子白发病菌基因组DNA梯度稀释为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100 fg /μL、10 fg /μL、1 fg /μL 8个浓度梯度。
（2）LAMP反应
以稀释好的DNA为模板进行LAMP反应，同时设置阴性对照。反应体系和扩增条件与实施例2相同；
同时，以F3和B3为引物，以稀释好的DNA为模板进行常规PCR扩增，作为对照。反应体系为：PCR反应的体系为：25.0μL，其中2×Taq MasterMix 12.5μL，上下游引物10μM各1.0μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）9.5μL；PCR反应程序为： 95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min共进行35个循环；72℃延伸10min。
（3）反应产物的检测
扩增结束后，取LAMP扩增和PCR扩增各浓度梯度产物5μL在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，经EB染色后，使用凝胶成像系统观察结果。
结果显示，利用LAMP技术，能够检测到的最低白发病菌DNA浓度为10 fg /μL（图2A），而利用PCR扩增，能够检测到的最低浓度为1pg/μL（图2B）。LAMP扩增比PCR扩增的检测灵敏度提高了100倍。
实施例4：
谷子种子携带谷子白发病菌的检测
（1）谷子种子样本的制备
一共准备9个样品，4个样品为从健康植株采集的种子，每个样品100粒；2个样品为从田间表现白发症状植株上采集病种子，每个样品100粒；2个样品为1粒病种子分别与49粒和99粒健康种子混合样品，还有1个阴性对照。
（2）谷子种子白发病菌DNA的提取
a）将谷子种子用液氮研碎，将粉末转于离心管中，以4mL/g比例加入CTAB提取缓冲液(事先在65℃水浴，100mM Tris-HCl(pH=8.0)，20mM EDTA，1.4M NaCl，2%CTAB，2%β–巯基乙醇），摇动粉末均匀分散于提取液中，65℃水浴40min；
b）冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻混匀，4℃ 12000rpm离心15 min
c）取上清，加入等体积的异丙醇(事先在-20℃预冷)，-20℃放置30min
d）4℃ 12000rpm 离心15 min
e）倒掉上清，75%乙醇清洗1-2次，风干DNA
f）用250μL TE缓冲液溶解DNA，37℃水浴锅中放置2h，4℃保存备用。
（3）将提取到的各个样品基因组DNA分别进行LAMP扩增，使用琼脂糖凝胶电泳法和SYBR GreenⅠ荧光染料显色法检测反应结果，检测方法同实施例2。
结果显示，LAMP反应对健康种子检测不到白发病菌，而病种子及其与健康种子混合样品均检测到白发病菌，由此可见种子携带白发病菌携带率为1%时，可以利用该方法进行快速诊断。（图3A, B）。
谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）18S rDNA序列片段：
1 ACCCGCTGAA CTTAAGCATA TTAATAAGCG GAGGAAAAGA AACTAACAAG
51 GATTCCCCTA GTAACGGCGA GTGAAGCGGG ATGAGCTCAA GCTTAAAATC
101 TCCATACAAA TTTTGTATGG CGAATTGTAG TCTATAGAGG CGTGATCAGT
151 GTGGCAACTT GGGATAAGTT CCTTGGAAGA GGACAGCATC GAGGGTGATA
201 CTCCCGTTCA TTCTTGAGTT GCTTATGCGT ACGATCCGTT TTCTTTGAGT
251 CGCGTTGTTT GAGAATGCAG CGCAAAGTAG GTGGTAAATT CCATCTAAAG
301 CTAAATATTG GTGCGAGACC GATAGCATAC AAGTACCGTG AGGGAAAGAT
351 GAAAAGAACT TTGAAAAGAG AGTTAAAGAG TACCTGAAAC TGCTGAAAGG
401 TAACCGAATC GTTTCCAGTG TCTATAATCT GCGATATATT TCATCGGCGA
451 ATGTGTGCGT GCGTGTACTA TGGCAGCGGC TTTTTGGCTG CGCTTGGTAT
501 GTGTGCTGTG CTTCCTTGCT GGTGCCCTGT ATTGTGGTGG GACGCCAATG
551 TCAGTTCGTA AACCGCGGGA AATGACTACC GAGGAGGTAA GGCTTACGCT
601 TGCGTTTGTC TGTTATATCT TGGTGGACGA GTAGTTGTGG TTGGGACTGA
651 GGTGCCTACA ACGTGCTTTT GAGTGGGACT GCGTCTCCGT GTGCGCCGTG
701 TGCGGATAGC TTGCTATATG CGTGTGGTTG TGTATGGATT GATGCGGACT
751 TTAACTTGTT GCCGTTCGGG ACGTTGGCGA AATGGAGCGA TTTGACCCGT
801 CTTGAAACAC GGACCAAGGA GTCTAACATG TGTGCAAGTG TTAGGGTGTC
851 GAAACCCGGA CGCGTAATTA ACGTGAAGGG CAGCGCAAGC TGTCTGAGGT
901 AGGAAACGTT GCGGACTTCG GTCTGCGATG TGGCACTATC GACCGATCAT
951 GAACCTTCGT GGTGAAAGAT TTGAGTTTGA GCACATATGT TGGTACCCGA
1001 AAGATGGTGA ACTATGCCTG AGTAGAGTGA AGCCAGGGGA AACTCTGGTG
1051 GAAGCTCGTA GCGATTCTGA CGTGCAAATC GATCGTTGAA CTTGGGTATA
1101 GGGGCGAAAG ACTAATCGAA CCATCTAGTA GCTGGTTCCC TCCGAAGTTT
1151 CCCTCAGGA
 
谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）LAMP反应的特异性外引物上游引物F3：
GCGTGCGTGTACTATGGC
 
谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）LAMP反应的特异性外引物的下游引物B3：
GTTGTAGGCACCTCAGTCC
 
谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）LAMP反应的特异性内引物的上游引物FIP：
GGCGTCCCACCACAATACAGGCTTTTTGGCTGCGCTTGG
 
谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）LAMP反应的特异性内引物的下游引物BIP：
ACCGCGGGAAATGACTACCGAAACCACAACTACTCGTCCAC
 

Claims (4)

1.一种谷子白发病菌的LAMP快速检测方法，其特征在于该检测方法包括以下步骤： 
（1）根据谷子白发病菌的18S rDNA序列设计LAMP特异性引物；
（2）LAMP扩增及扩增产物的检测；
（3）LAMP引物的特异性检测；
（4）LAMP扩增和PCR扩增灵敏性比较；
（5）谷子种子携带白发病菌的检测。
2.根据权利要求1所述的谷子白发病菌的LAMP快速检测方法，其特征在于：所述的LAMP特异性引物序列如下：
F3：GCGTGCGTGTACTATGGC
B3：GTTGTAGGCACCTCAGTCC
FIP：GGCGTCCCACCACAATACAGGCTTTTTGGCTGCGCTTGG
BIP：ACCGCGGGAAATGACTACCGAAACCACAACTACTCGTCCAC 。
3.根据权利要求1所述的谷子白发病菌的LAMP快速检测方法，其特征在于：所述的LAMP反应体系为：25.0μL，其中，外引物F3和B3（10μM）各0.5μL，内引物FIP和BIP（10μM）各4.0μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，甜菜碱（5mmol/L）1.0μL，Bst DNA聚合酶（8U/μL）1.0μL，10×DNA聚合酶buffer 2.5μL，DNA模板1.0μL，dH2O（灭菌蒸馏水）6.5μL；扩增条件为65℃条件下温育60min，80℃下反应10min。
4.根据权利要求1所述的谷子白发病菌的LAMP快速检测方法，其特征在于：所述的LAMP扩增产物的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法和SYBR GreenⅠ荧光染料显色法；所述琼脂糖凝胶电泳法：取5μL LAMP扩增产物，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，在凝胶成像系统中观察，出现特征性梯状条带为阳性，未出现条带为阴性；SYBR GreenⅠ荧光染料显色法：向LAMP扩增产物中加入1μL 100×SYBR GreenⅠ，混匀后肉眼观察颜色变化，产生绿色为阳性反应，橙色则为阴性反应。
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