CN104830984A - 瓜炭疽病菌的荧光pcr检测方法及所用引物和探针 - Google Patents

瓜炭疽病菌的荧光pcr检测方法及所用引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法的引物和探针，为以下两种：一、GAPDH基因：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’，5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；二、GS基因：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’，5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。本发明还同时提供了利用上述引物和探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法，当2种PCR均能检测到荧光时，判定为阳性。

Description

瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针
技术领域
本发明涉及瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针。
背景技术
瓜类炭疽病是瓜类作物生产中的重要病害之一，全国各地均有分布。发病时常造成幼苗猝倒，成株茎、叶枯死，瓜果腐烂，危害严重。西瓜和甜瓜易感病，黄瓜、冬瓜、瓠瓜、苦瓜次之，南瓜、西葫芦，丝瓜较抗病。
瓜炭疽病菌长距离传播主要依靠感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料。目前国内未见报道有关检测该病菌的荧光PCR特异性引物和探针。目前瓜炭疽病菌的检验方法主要是常规种子带菌检验。这种方法经验性较强，瓜炭疽病菌和其他近似病原菌在形态上较难区分。因此建立对瓜炭疽病菌快速、准确的检测方法至关重要。
本发明所设计参考文献具体如下：
[1]李怀方，刘凤权，黄丽丽主编.园艺植物病理学[M].中国农业大学出版社2011，172
[2]唐建辉，王伟.西瓜炭疽菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].安徽农业科学.2007，35(9):2566-2568,2658.
[3]尹玉琦，李国英主编.新疆农作物病害.[M]新疆科技卫生出版社1995，185
[4]唐建辉，王伟，王源超.西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测[J].中国农业科学.2006，39(10):2028-2035
[5]赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科
学.2004(4):35-37.
[6]葛建军,曹爱新,陈洪俊,Marice Moens.应用TaqMan探针进行马铃薯金线虫实时荧光PCR检测技术研究[J].植物保护.2009,35(4):105-109.
[7]伍永明,张祥林,罗明.西瓜细菌性果斑病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立[J].新疆农业大学学报.2006,29(3):68-72.
[8]纪冬,辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析[J].生物技术通讯.2009,(4):598-600.
[9]赵焕英,包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志.2007,16(4):292-497.
[10]纪冬,辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析[J].生物技术通讯.2009,(4):598-600.
[11]赵焕英,包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J].中国组织化学与细胞化学杂志.2007,16(4):292-497.
[11]林剑伟，阙友雄，陈天生，等.核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用[J].生物技术通讯.2007，18(2):292-294.
[12]段维军,郭立新.基于PCR技术的植物病原真菌检测技术研究进展[J].植物检疫.2008,22(6):385-389.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针；该方法具有特异性、稳定性和灵敏性都非常好的特点。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法及所用引物和探针；从GenBank查询所有瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相关序列，设计瓜炭疽病的特异性引物和TaqMan探针。
具体为如下两种：
一、针对GAPDH基因：
引物：
GAPDH-3：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’
GAPDH-4：5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；
TaqMan探针：
GAPDH-p：5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；
产物大小234bp；
二、针对GS基因：
引物：
GS-3：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’
GS-4：5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；
TaqMan探针：
GS-p：5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。
产物大小209bp。
本发明还同时提供了利用上述特异性引物和TaqMan探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法：包括以下步骤：
1)、提取待测植物材料(包括种子等)的DNA；
2)、PCR：
一、GAPDH基因：
25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+3.5μl，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；
反应程序为：95℃3min；(95℃15s，57.9℃1min，40个循环)；反应中止；
二、GS基因：
25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+3μl，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；
反应程序为：95℃3min；(95℃15s，56℃1min，40个循环)；反应中止；
备注说明：Mg2+具体为MgCl2；
3)、当步骤2)的2种PCR均能检测到荧光(Ct值小于40)时，判定为阳性，否则判定为阴性。
备注说明：
本发明使用的荧光PCR仪中温度梯度所用PCR为Eppendorf荧光PCR仪。确定退火温度后所用的荧光PCR仪为ABI公司7300。
rDNA-ITS是介于18SrDNA、5.8SrDNA、28SrRNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，被普遍用来进行真菌种间或种内的遗传相似性的分子系统研究。但是在瓜炭疽病菌的序列比对中该区段很难找到突变位点设计探针，本发明选择瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和glutamine synthase(GS)基因序列设计引物探针，通过对瓜上其他病害和瓜炭疽病菌的检测研究，结果表明该方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为GAPDH引物和探针不同退火温度Tm值对实时荧光PCR检测体系的影响(Fig1、The influence of different temperature melt on the Real-Time PCR system using GAPDH primersand probe)；
1：55.2℃；2：55.4℃；3：56℃；4：56.8℃；5：57.9℃；6：59.1℃；7：60.4℃；8：61.4℃；9：62.6℃；10：63.5℃；11：64℃；12：64.1℃；13：空白对照。
图2为GS引物和探针不同退火温度Tm值对的实时荧光PCR检测体系的影响(Fig2、The influence of different temperature melt on the Real-Time PCR system using GS primers andprobe)；
1：55.2℃；2：55.4℃；3：56℃；4：56.8℃；5：57.9℃；6：59.1℃；7：60.4℃；8：61.4℃；9：62.6℃；10：63.5℃；11：64℃；12：64.1℃；13：空白对照。
图3为GAPDH引物和探针不同Mg2+浓度对实时荧光PCR检测体系的影响(Fig3、Theinfluence of different Mg2+concentration on the Real-Time PCR system using GAPDH primers andprobe)；
1：0μl；2：0.5μl；3：1μl；4：1.5μl；5：2μl；6：2.5μl；7：3μl；8：3.5μl。
图4为GS引物和探针不同Mg2+浓度对实时荧光PCR检测体系的影响(Fig4、The influenceof different Mg2+concentration on the Real-Time PCR system using GS primers and probe)；
1：0μl；2：0.5μl；3：1μl；4：1.5μl；5：2μl；6：2.5μl；7：3μl；8：3.5μl。
图5为不同DNA浓度对GAPDH引物和探针实时荧光PCR检测体系的影响(Fig5、Theinfluence of different DNA concentration on the Real-Time PCR system using GAPDH primers andprobe)；
1：39.6ng(原液)；2：3.96ng(10-1)；3：396pg(10-2)；4：39.6pg(10-3)；5：3.96pg(10-4)；6：396fg(10-5)；7：39.6fg(10-6)；8：3.96fg(10-7)；9：0。
图6为不同DNA浓度对GS引物和探针实时荧光PCR检测体系的影响(Fig6、Theinfluence of different DNA concentration on the Real-Time PCR system using GS primers andprobe)；
1：39.6ng(原液)；2：3.96ng(10-1)；3：396pg(10-2)；4：39.6pg(10-3)；5：3.96pg(10-4)；6：396fg(10-5)；7：39.6fg(10-6)；8：3.96fg(10-7)；9：0。
图7为GAPDH引物和探针实时荧光PCR产物电泳检测结果(Fig7：Agarose gelelectrophoresis of Real time PCR-amplified products using GAPDH primers and probe)；
1：DL2000Marker；2：39.6ng(原液)；3：3.96ng(10-1)；4：396pg(10-2)；5：39.6pg(10-3)；6：3.96pg(10-4)；7：396fg(10-5)；8：39.6fg(10-6)；9：3.96fg(10-7)；10：0。
图8为GS引物和探针实时荧光PCR产物电泳检测结果(Fig8：Agarose gel electrophoresisof Real time PCR-amplified products using GS primers and probe)；
1：DL2000Marker；2：39.6ng(原液)；3：3.96ng(10-1)；4：396pg(10-2)；5：39.6pg(10-3)；6：3.96pg(10-4)；7：396fg(10-5)；8：39.6fg(10-6)；9：3.96fg(10-7)；10：0。
图9为GAPDH引物和探针实时荧光PCR方法对瓜炭疽病菌及其他病原菌检测(Fig9、Colletotrichum orbiculare and other strains were detected by the Real-Time PCR using GAPDHprimers and probe)；
1：Colletotrichum orbiculare-1；2：Colletotrichum orbiculare-2；3：Colletotrichumorbiculare-3；4：Colletotrichum orbiculare-4；5：Colletotrichum orbiculare-5；6：Colletotrichumorbiculare-6；7：Colletotrichum orbiculare-7；8：Colletotrichum orbiculare-8；9：Didymellabryoniae；10：Didymella bryoniae；11：Fusrium oxysporum f.sp.melonis；12：Colletotrichumlindemuthianum；13：Colletotrichum gloeosporiodes；14：Colletotrichum dematium；15：空白对照。
图10为GS引物和探针实时荧光PCR方法对瓜炭疽病菌及其他病原菌检测(Fig10、Colletotrichum orbiculare and other strains were detected by the Real-Time PCR using GS primersand probe)；
1：Colletotrichum orbiculare-1；2：Colletotrichum orbiculare-2；3：Colletotrichumorbiculare-3；4：Colletotrichum orbiculare-4；5：Colletotrichum orbiculare-5；6：Colletotrichumorbiculare-6；7：Colletotrichum orbiculare-1；8：Colletotrichum orbiculare-2；9：Didymellabryoniae；10：Didymella bryoniae；11：Fusrium oxysporum f.sp.melonis；12：Colletotrichumlindemuthianum；13：Colletotrichum gloeosporiodes；14：Colletotrichum dematium；15：空白对照。
图11为GAPDH引物和探针实时荧光PCR方法对样品进行检测(Fig11、The samples weredetected by the real-Time PCR using GAPDH primers and probe)；
1：带病病果；2：带病叶片；3：西瓜种子与病菌的混合样品；4：西瓜种子6949-1；5：甜瓜种子214-6434；6：西瓜种子214-6105；7：甜瓜种子6949-2；8：空白对照。
图12为GS引物和探针实时荧光PCR方法对样品进行检测(Fig12、The samples weredetected by the real-Time PCR using GS primers and probe)；
1：带病病果；2：带病叶片；3：西瓜种子与病菌的混合样品；4：西瓜种子6949-1；5：甜瓜种子214-6434；6：西瓜种子214-6105；7：甜瓜种子6949-2；8：空白对照。
图13为不同退火温度对PCR的影响；
1：DL2000Marker；2：57℃；3：58℃；4：59℃；5：60℃；6：61℃；7：62℃；8：空白对照。
图14为不同Mg2+浓度对PCR的影响；
1：DL2000Marker；2：0μl；3：1.1μl；4：1.2μl；5：1.3μl；6：1.4μl；7：1.5μl；8：1.6μl；9：1.7μl；10：1.8μl；11：1.9μl；12：2.0μl；13：2.1μl；14：2.2μl；15：2.3μl；16：2.4μl；17：2.5μl。
图15为不同dNTP浓度对PCR的影响；
1：DL2000Marker；2：0μl；3：0.3μl；4：0.5μl；5：0.8μl；6：1.0μl；7：1.3μl；8：1.5μl；9：1.8μl。
图16为不同引物浓度对PCR的影响；
1：DL2000Marker；2：0μl；3：0.2μl；4：0.4μl；5：0.6μl；6：0.8μl；7：1.0μl；8：1.2μl；9：1.4μl。
图17为不同Taq酶浓度对PCR的影响；
1：DL2000Marker；2：0μl；3：0.2μl；4：0.4μl；5：0.6μl；6：0.8μl；7：1.0μl；8：1.2μl；9：1.4μl；10：1.6μl；11：1.8μl；12：2μl。
图18为PCR灵敏度检测；
1：DL2000Marker；2：39.6ng(原液)；3：3.96ng(10-1)；4：396pg(10-2)；5：39.6pg(10-3)；6：3.96pg(10-4)；7：396fg(10-5)；8：39.6fg(10-6)；9：3.96fg(10-7)；10：0。
图19为采用PCR方法对瓜炭疽病菌及其他病原菌检测；
1：DL2000Marker；2：Colletotrichum orbiculare-1；3：Colletotrichum orbiculare-2；4：Colletotrichum orbiculare-3；5：Colletotrichum orbiculare-4；6：Colletotrichum orbiculare-5；7：Colletotrichum orbiculare-6；8：Colletotrichum orbiculare-7；9：Colletotrichum orbiculare-8；10：Didymella bryoniae；11：Didymella bryoniae；12：Fusrium oxysporum f.sp.melonis；13：Colletotrichum lindemuthianum；14：Colletotrichum gloeosporiodes；15：Colletotrichum dematium；16：空白对照。
图20为PCR方法对样品进行检测；
1：DL2000Marker；2：带病病果；3：带病叶片；4：西瓜种子与病菌的混合样品；5：西瓜种子6949-1；6：甜瓜种子214-6434；7：西瓜种子214-6105；8：甜瓜种子6949-2；9：空白对照。
图21为不同DNA浓度对对比例1的引物和探针实时荧光PCR检测体系的影响；
1：39.6ng(原液)；2：3.96ng(10-1)；3：396pg(10-2)；4：39.6pg(10-3)；5：3.96pg(10-4)；6：396fg(10-5)；7：39.6fg(10-6)；8：3.96fg(10-7)；9：0。
图22为对比例2的引物和探针实时荧光PCR方法对瓜炭疽病菌及其他病原菌检测；
1：Colletotrichum orbiculare-1；2：Colletotrichum orbiculare-2；3：Colletotrichumorbiculare-3；4：Colletotrichum orbiculare-4；5：Colletotrichum orbiculare-5；6：Colletotrichumorbiculare-6；7：Colletotrichum orbiculare-1；8：Colletotrichum orbiculare-2；9：Didymellabryoniae；10：Didymella bryoniae；11：Fusrium oxysporum f.sp.melonis；12：Colletotrichumlindemuthianum；13：Colletotrichum gloeosporiodes；14：Colletotrichum dematium；15：空白对照。
具体实施方式
实验1：
1材料与方法
1.1供试材料
实验中菌株的来源、寄主和分类地位等情况见表1。实验中检测所用的出口种子情况如表2所示。
表1、供试菌株的病原名称、寄主和来源地
表2、供试植株、种子情况一览表
备注说明：带菌种子是将西瓜种子与瓜炭疽病菌混合的带瓜炭疽病菌种子。具体制样方法：取0.1kg干净的西瓜种子放入两个广口瓶中，每份样50g，经高压灭菌后，接种PDA培养的瓜炭疽病菌菌块到其中一个广口瓶中，放置于25℃培养箱中培养10～15d，将该种子和另一份灭菌的50g西瓜种子按照1：5的比例混合制成带菌种子样品。
1.2主要仪器及试剂
HITACHI高速离心机，ND1000核酸检测仪，电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)，通用凝胶成像系统(Intas Gel Jet Imager)，Eppendorf多重控温荧光PCR仪，7300Real-Time PCRsystem(美国ABI公司)。
所用PCR试剂购于大连宝生物公司、核酸提取试剂盒等均购于天根生物工程公司；引物和探针均由鼎国生物工程公司合成。
1.3病原菌培养和处理
供试菌株在PDA培养基上28℃培养2-3天，取菌落边缘处接到PDA液体培养基中振荡(转速为100rpm～120rpm)，25℃培养3-4天，液体培养好的菌丝，在Miracloth膜上过滤，洗涤后待水分挥发干，用液氮研磨成粉状，待用。
1.4DNA提取
利用试剂盒北京天根生物公司新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-03)提取病菌总DNA和植株、种子基因组DNA。
1.5实时荧光PCR方法
本发明使用的荧光PCR仪中温度梯度所用PCR为Eppendorf荧光PCR仪。确定退火温度后所用的荧光PCR仪为ABI公司7300。
采用25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+0.5～3.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μL TaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL。
备注说明：Mg2+具体为MgCl2。
反应程序为：
GAPDH基因：95℃3min；95℃15s，57.9℃1min，40个循环。
GS基因：95℃3min；95℃15s，56℃1min，40个循环。
从GenBank查询所有瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相关序列，设计瓜炭疽病的特异性引物和TaqMan探针。
引物：
GAPDH-3：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’
GAPDH-4：5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；
TaqMan探针：
GAPDH-p：5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；
产物大小234bp。
引物：
GS-3：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’
GS-4：5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；
TaqMan探针：
GS-p：5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。
产物大小209bp。
1.6.1反应体系参数优化
使用瓜炭疽病菌ATCC14724样品DNA进行体系参数优化。实时荧光PCR进行两步反应，对GAPDH基因和GS基因的复性-延伸温度进行了优化，分别进行了55℃～64℃12个不同温度的测试(即，具体为：1：55.2℃；2：55.4℃；3：56℃；4：56.8℃；5：57.9℃；6：59.1℃；7：60.4℃；8：61.4℃；9：62.6℃；10：63.5℃；11：64℃；12：64.1℃；)；Mg2+浓度从0mmol/L到3.5mmol/L(指在25μL反应体系中的浓度)共8个均匀递增的浓度梯度(即，1：0μl；2：0.5μl；3：1μl；4：1.5μl；5：2μl；6：2.5μl；7：3μl；8：3.5μl)。
3.1.6.2灵敏度检测
为了确定该方法所能检测的最低核酸量，测定瓜炭疽病菌ATCC14724核酸样品浓度为19.8ng/μl，将此浓度进行10倍梯度稀释到10-7，浓度依次为：1.98ng/μl，198pg/μl，19.8pg/μl，1.98pg/μl，198fg/μl，19.8fg/μl，1.98fg/μl，模板加样量均采用2μl，对应的核酸量为：39.6ng，3.96ng，396pg，39.6pg，3.96pg，396fg，39.6fg，3.96fg，采用荧光PCR进行检测，同时将荧光PCR产物电泳进行检测。
1.6.3引物和探针特异性检测
使用上述表1所列的菌株对两对引物和两条探针的特异性进行检测。
1.6.4荧光PCR应用于样品检测
采用上述荧光PCR方法对田间采集的瓜炭疽病菌病果、叶片、瓜炭疽病菌种子和病菌混合样、西甜瓜出口种子进行检测。发病组织、种子样品液氮研磨后用试剂盒提取基因组DNA，采用荧光PCR检测。
2结果与分析
2.1实时荧光PCR条件优化
对PCR中的关键性两个条件(Tm值和Mg2+浓度)进行优化，为确定获得最大ΔRn值和最小循环阈(Ct)的Tm值和Mg2+浓度。
研究结果表明(如图1，2，3，4)，在本荧光PCR反应体系中，GAPDH最佳反应条件为：复性-延伸温度为57.9℃；Mg2+浓度为25μl体系3.5μl。GS最佳反应条件为：复性-延伸温度为56℃；Mg2+浓度为25μl体系3μl。
备注说明：
以下均以优化后的条件进行；DNA加样量控制在1-2μl/25μl。
2.2检测灵敏度
利用这两对引物对瓜上的其他菌株及近似菌株进行PCR检测，结果表明，该对引物有非常好的特异性，检测灵敏度达到1.584pg/μl。
将瓜炭疽病菌14724的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量19.8ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，按照优化后的体系进行荧光PCR检测，结果表明病菌DNA浓度越大Ct值越小，25μl体系中有39.6pg(10-3)的核酸量，虽然信号非常弱，但依然可以被检测到(如图5，6)，说明荧光PCR方法所能够检测的最低DNA浓度为1.584pg/μl。实时荧光PCR方法的产物采用琼脂糖凝胶进行检测，在10-1稀释倍数下还可以看到条带，但是10-2已无可识别条带(如图7，8)。说明实时荧光PCR方法较常规PCR后电泳方法的检测灵敏度高100倍。
2.3引物和探针特异性检测
采用荧光PCR方法对表1中所列的14个供试菌株进行检测，结果表明，瓜炭疽病菌的8个菌株都检测到荧光，Ct值均小于30，采用GAPDH基因检测Colletotrichum lindemuthianum没有荧光信号，但是采用GS基因检测时却出现强阳性信号，瓜上的其他病害和其他菌株均不产生荧光，因此该2对引物和探针共同检测才能有效地将瓜炭疽病菌及其他病原菌区分开来(图9、图10)，说明上述两对引物和TaqMan探针结合起来才具有很强的特异性。即，2种PCR均能检测到荧光(Ct值小于40)时，判定为阳性，否则判定为阴性。
备注说明：空白时，以三蒸水替代模板DNA。
2.4样品检测
使用上述两对引物和探针对田间采集的瓜炭疽病菌病果、叶片、瓜炭疽病菌种子和病菌混合样、4批西甜瓜种子进行检测，在田间采集样品(即，瓜炭疽病菌病果、叶片)和混合样品中检测到瓜炭疽病菌的存在(图11、12)。采用此对引物和探针对供试种子检测中没有检测到荧光信号，证明这4批种子中不含有瓜炭疽病菌，与常规分离检测结果一致。
实验2、普通PCR方法
1.1引物设计
从GenBank查询所有瓜炭疽病菌的相关序列，该病菌已报道的序列非常多，而且涉及多种功能基因，这些功能基因序列少则29条，多则149条，为设计特异性引物和探针提供了充足的信息。已报道的序列有ITS，beta-tubulin(TUB2)，chitin synthase 1(CHS1)gene，histone H3(HIS3)gene，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene，actin(ACT)gene，glutamine synthase(GS)gene，对这些已公布序列，经过大量的网上BLAST比对工作，发现无法仅仅通过一个基因就能够把瓜炭疽病菌和其近似菌株区别开，但是通过GAPDH基因和GS基因联合检测，能够把瓜炭疽病菌完全区别开，因此针对这两个功能基因设计两对引物和两条探针进行检测。
具体如下：
在GenBank上经过大量的网上BLAST比对工作，通过GAPDH基因和GS基因联合检测，能够把瓜炭疽病菌完全区别开。
瓜炭疽病菌双重引物PCR检测引物(产物大小159bp和294bp)
T-GAPDH-1:5'-CCCGGGATCTCTGGCA-3'
T-GAPDH-2:5'-GGTTAGCGGTTGTACCGTCTT-3'
T-GS-1:5'-GTCTGGTCCAGTTCTGTCAG-3'
T-GS-2:5'-GTGAAGAGTCAGTATCGTGACAT-3'
1.2普通PCR体系程序
本研究使用的PCR仪中温度梯度所用PCR为veriti 96PCR仪。
采用25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+1.7μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.4μL，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用灭菌水补足至25μL。
备注说明：即，T-GAPDH-1、T-GAPDH-2、T-GS-1、T-GS-2(10μmol/L)各0.4μL，总共1.6μL。
反应程序为：95℃5min；95℃15s，58℃30s，72℃30smin，40个循环，72℃延伸7min。
1.3普通PCR反应体系参数优化
使用瓜炭疽病菌ATCC14724样品DNA进行体系参数优化，对复性-延伸温度进行了优化，分别进行了57℃～62℃6个不同温度的测试；Mg2+浓度从0mmol/L到4.5mmol/L共16个均匀递增的浓度梯度。dNTP浓度从0mmol/L到0.18mmol/L共8个均匀递增的浓度梯度。10μmol/L引物加样量从0-1.4μL，以0.2μL递增。5U/μLTaq酶从0-2μL，以0.2μL递增。
因为本实验设计了两对引物，采用双重PCR进行检测，双重PCR较单重PCR对体系中各组分的要求更高，所以对该PCR中的每个组分进行条件和加样量的摸索。
首先对PCR中最关键性的两个条件(Tm值和Mg2+浓度)进行优化，研究结果表明(如图13，14)，57℃-62℃的退火温度范围，产物扩增结果相差非常大，选取58℃作为该对引物的退火温度，Mg2+浓度对双重PCR产生非常大的影响，加样量的大小直接决定产物的有无，1.2μl的加样量虽然引物二聚体最少，但是条带较弱，1.5μl的加样量条带也略弱，1.7μl和1.8μl的加样量条带最亮，所以25μl体系选取1.7μl的加样量。
dNTP浓度决定了扩增片段的长度，高浓度dNTP易产生错误碱基的掺入，浓度过低会降低反应产量。dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，从而影响聚合酶的活性。将dNTP浓度从0mmol/L到0.18mmol/L共8个均匀递增的浓度梯度(图15)。结果表明，当dNTP为1.0mmol/L和1.3mmol/L时条带最亮，引物二聚体最少，所以1.0mmol/L为dNTP最佳浓度。即25μL体系中加入的dNTP 1μL。
引物浓度对双重PCR体系的影响不是非常明显(图16)，0.2μl和0.4μl的加样量引物二聚体相对较少，引物浓度越大条带有减弱的趋势，所以10μM的引物在25μl体系中加0.2μl和0.4μl均可，选0.4μl作为10μM引物的加样量。
由图17可以看出Taq酶浓度对双重PCR影响非常大，浓度越大，反应体系没有目标条带，所以在25μL体系中TaqMan聚合酶(5U/μL)加样0.4μL。
3.1.5.4灵敏度检测
为了确定该方法所能检测的最低核酸量，测定瓜炭疽病菌ATCC14724核酸样品浓度为19.8ng/μl，将此浓度进行10倍梯度稀释到10-7，浓度依次为：1.98ng/μl，198pg/μl，19.8pg/μl，1.98pg/μl，198fg/μl，19.8fg/μl，1.98fg/μl，模板加样量均采用2μl，对应的核酸量为：39.6ng，3.96ng，396pg，39.6pg，3.96pg，396fg，39.6fg，3.96fg，采用荧光PCR进行检测，同时将荧光PCR产物电泳进行检测。
将瓜炭疽病菌14724的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量19.8ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，按照优化后的体系进行PCR检测，25μl体系中有3.96ng的核酸量就可以被检测到(如图18)，说明该方法所能够检测的最低DNA浓度为158.4pg/μl。，在10-1稀释倍数下有可见条带，10-2已无可见条带。说明该常规PCR方法的检测灵敏度为158.4pg/μl。
3.1.5.5引物的特异性检测
使用上述表1所列的菌株对引物的特异性进行检测。
采用PCR方法对表1中所列的14个供试菌株进行检测，结果表明，瓜炭疽病菌的8个菌株都有特异性条带，而瓜上的其他病害和其他菌株均无条带，因此该引物能有效地将瓜炭疽病菌及其他病原菌区分开来(图19)，说明上述引物有很强的特异性。
3.1.5.6普通PCR方法应用于样品检测
采用本实验所建立的PCR方法对田间采集的瓜炭疽病菌病果、叶片、瓜炭疽病菌种子和病菌混合样、西甜瓜出口种子进行检测。发病组织、种子样品液氮研磨后用试剂盒提取基因组DNA，采用PCR检测。
使用该引物对田间采集的瓜炭疽病菌病果、叶片、瓜炭疽病菌种子和病菌混合样、4批西甜瓜种子进行检测，在发病植物组织和混有病菌的样品中检测到瓜炭疽病菌的存在(图20)。采用此对引物对供试种子检测中没有检测到荧光信号，证明这4批种子中不含有瓜蔓枯病菌，与常规分离检测结果一致。
结论与讨论
本发明首次对瓜炭疽病菌进行了较为系统、深入的分子检测技术的研究。建立了快速、准确、灵敏的瓜炭疽病菌实时荧光PCR检测技术。成功地设计出了针对瓜炭疽病菌具有稳定点突变的特异性引物对GAPDH-3，GAPDH-4和TaqMan探针GAPDH-p，GS-3，GS-4和TaqMan探针GS-p，通过对荧光反应体系中的退火温度、Mg2+两个关键参数进行优化确定了最佳值，建立了实时荧光PCR检测方法，确定GAPDH最佳退火温度为57.9℃；Mg2+浓度为25μl体系3.5μl。GS最佳退火温度为56℃；Mg2+浓度为25μl体系3μl。
利用该方法对12株供试菌株进行了实时荧光PCR检测，结果表明本研究所设计的两对引物和两条探针能检测出瓜炭疽病菌菌株，而对照其他菌株和空白未检测到荧光信号，表明该引物和探针对瓜炭疽病菌具有很高的特异性；该对引物和探针具较高的灵敏度，能够达到158.4fg/μl，可见本研究建立的实时荧光PCR方法保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性。整个PCR检测时间大约40分钟，与普通PCR相比，极大缩短了检测的时间，同时无需后续的电泳检测。应用本研究建立的TaqMan探针实时荧光PCR方法对田间采集样品和种子混菌样品进行检测，检测出阳性样品，此结果与分离检测结果一致。本发明设计两条引物和两条探针的初衷就是必须两条结合使用才能共同鉴定，仅通过其中一条可能有部分菌株无法和瓜炭疽区分开来，会出现假阳性。
对比例1、
将引物改成如下：
Gl-1：5′-TGCCATCTCTTACCCATGTCTT-3′
Gl-2：5′-TTTTGAGGCGAGTCTGCG-3′
将TaqMan探针改成如下：
Gl-P1：5’FAM-CAATGCGTAGGAATTCCGATA-3’TAMRA。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，57.9℃1min，40个循环。
25μL反应体系中25mmol/L Mg2+为3.5μl(最佳值)。
其余内容等同于实验1。
其灵敏度检测结果如下：
将瓜炭疽病菌ATCC14724的DNA在核酸蛋白仪ND1000上测其DNA的含量19.8ng/μl，然后进行10倍梯度稀释到10-7，按照优化后的体系进行荧光PCR检测，结果表明病菌DNA浓度越大Ct值越小，25μl体系中有396pg(10-2)的核酸量，虽然信号非常弱，但依然可以被检测到(如图21)，说明荧光PCR方法所能够检测的最低DNA浓度为15.84pg/μl。说明本发明所用引物和探针较对比例1的引物和探针灵敏度高10倍。
对比例2、
将引物改成如下：
Gl-3：5′-ACACGTGTCGATGGGACG-3′
Gl-4：5′-TTGAACAAGTTGCAACGACA-3′
将TaqMan探针改成如下：
Gl-P2：5’FAM-CAATGCGTAGGAATTCCGATA-3’TAMRA。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，56℃1min，40个循环。
25μL反应体系中25mmol/L Mg2+为3μl(最佳值)。
其余内容等同于实验1。
其结果如下：
采用荧光PCR方法对表1中所列的14个供试菌株进行检测，结果表明，除了瓜炭疽病菌的8个菌株能检测到荧光信号，Ct值均小于30，Colletotrichum lindemuthianum，Colletotrichum gloeosporiodes，Colletotrichum dematium 3个炭疽菌株也能检测到荧光信号，因此该引物和探针不能有效地将瓜炭疽病菌及其他炭疽病区分开来(图22)，而本发明所用的引物和探针能将3株其他炭疽区别开来，说明本发明所用引物和探针较对比例1的引物和探针特异性高。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.用于瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法的引物和探针，其特征是：为以下两种：
一、GAPDH基因：
引物：
GAPDH-3：5’-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3’
GAPDH-4：5’-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3’；
TaqMan探针：
GAPDH-p：5’FAM-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3’TAMRA；
二、GS基因：
引物：
GS-3：5’-TTCGTTCTCGAACACGAT-3’
GS-4：5’-GAGACATGACGACCTTGTTC-3’；
TaqMan探针：
GS-p：5’FAM-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3’TAMRA。
2.利用根据权利要求1所述的引物和探针进行的瓜炭疽病菌的荧光PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：
1)、提取待测植物材料的DNA；
2)、PCR：
一、GAPDH基因：
25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+3.5μl，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；
反应程序为：95℃3min；95℃15s，57.9℃1min，40个循环；
二、GS基因：
25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg2+3μl，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，5U/μLTaqMan聚合酶0.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，TaqMan探针(10μmol/L)0.5μL，模板DNA:0.5-2μL，最终用三蒸水补足至25μL；
反应程序为：95℃3min；95℃15s，56℃1min，40个循环；
3)、当步骤2)的2种PCR均能检测到荧光(Ct值小于40)时，判定为阳性，否则判定为阴性。
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